HU191108B - Process for the production oc components of complex no. m 9026 - Google Patents

Description

(57) KIVONAT

A találmány tárgya eljárás M 9026 jelű antibiotikum-komplex, annak 1., 2. és 3. komponense előállítására Micromonospora NRRL 15118 törzs süllyesztett-levegőztetett fermentációjával.

A találmány szerinti antibiotikumok mikroba-ellenes és daganat-ellenes hatással rendelkeznek.

191 108

A találmány tárgya eljárás az előzetesen M 9026-tal jelzett antibiotikum-csoport, az M 9026 komplex fermentációs úton történő előállítására, valamint az

12. és 3. jelű komponenseknek a keverékből tisztán Iőrlénő előállítására.

Λ szabadalmi leírásban szereplő M 9026 antibiotikumot egy eddig ismeretlen, a rendszertani vizsgálatok szerint a Micromonospora nemzetségébe tartozó baktériumfaj tenyészlevéből állítjuk elő.

A Nangul-ban (India) gyűjtött törzs egy tenyészetét az 1982. július 30-í Budapesti Egyezmény rendelkezései alapján NRRL 15 118 sorszám alatt helyeztük letétbe az Agricultural Research Culture Collection-nél (NRRL): 1815 N. Universitv Street, Peoria, Iliionis 61601, USA.

Az M 9026 antibiotikum-komplex, az M 9026 antibiotikum i., 2. faktor és az M 9026 antibiotikum 3. faktor hasonlósága miatt, valamint a leírás megkönnyítése érdekében, a találmány ismertetése során ha az aktivitásokkal vagy az előállítási és tisztítási eljárásokkal foglalkozunk, az „M 9026 vegyületek” vagy „M 9026” antibiotikumok kifejezés alatt az M 9026 antibiotikum-komplexből kiválasztott vegyületet az M 9026 antibiotikum 2. komponenst és az M 9026 antibiotikum 3. komponenst értjük.

Az M 9026 vegyületek in vitro gátolják bizonyos, különösen Gram pozitív patogén baktériumok növekedését és úgy találták, hogy hatásosan gátolják daganatsejtek növekedését, mind in yitro tenyészetekben, mind emlősökben in vivő kísérletek során.

Az NRRL 15 118 Micromonospora sp. törzs jellemzőit az alábbiakban adjuk meg:

Morfológia

Az NRRL 15 118 Micromonospora sp. törzs jól nő különböző táp-agarakon zabliszt agaron a telepek 2—3 mm átmérőjűékre nőnek, körvonaluk szabályos, felszínük gyűrött. A légmicélium mindig hiányzik. Mikroszkópos megfigyelések szerint a micélium hosszú, elágazó, normális átmérőjű (0,6 pm). Nagy mennyiségben keletkeznek ovális és kerek spórák, átmérőjük 0,7-1,0 μιτι. A nyeletlen spórák közvetlenül a micélium-fonalból állnak ki és Főleg szimpodiálisan elágazó spóratartón keletkeznek.

A spórák és spóratartók megfigyelését Lucdemann szerint végeztük (Intern. J. Syst. Bact. 21, 240-247, 1971) rázott-lombíkos folyadéktenyészetből.

Tenyésztési jellemzők

Az I. táblázatban a Shirling és Gottlieb által javasolt különböző standard táptalajokon (Intcr. J. Syst. Bact. 16 313—340, 1966), valamint a Waksinan által ajánlott más táptalajokon (The Actinomycetes, Vol. ΙΓ, William and Wilkins Co. 1961) tenyésztett Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs tenyésztési jellemzőit közöljük.

Ezeket a tulajdonságokat 7—14 napos 30 °C-on történő inkubálás után határoztuk meg.

1. táblázat

A Micromonospora sp. NRRL 15 118 tenyésztési jellemzői

Táptalaj	Tenyésztési jellemzők
2. táptalaj (élesztőkivonat-maitóz	Nincs növekedés
agar) 3. táptalaj	közepes növekedés durva,
(zabliszt agar)	világos narancs-barnás színű felület 12 E 8'
4. táptalaj	bőséges növekedés, durva.
(szervetlen sók-keményítő agar)	narancsszínű felület 11 F 11
5. táptalaj	gyenge növekedés, lapos
(glicerin-aszparagin agar)	átlátszótól narancsig változó fényű
6. táptalaj	közepes növekedés ráncos,
(pepton-élesztőkivonat-vas agar)	borostyán színű 12 D 9
7. táptalaj	gyenge növekedés lapos,
(tirozin agar)	átlátszó
Zabliszt agar	bőséges növekedés, durva,
(Waksinan szerint)	narancsszínű feketés felület, nyirkos
Hickey és Tresner agar	bőséges növekedés gyűrött, barnás
Czapek glükóz agar	nincs növekedés
Glükóz-aszparagin agar	gyenge növekedés lapos, átlátszótól világos narancsig változó színű
Táp-agar	közepes növekedés, durva, narancs 10 T 9
Burgonyás agar	bőséges növekedés, ráncos, narancsszínű feketés felület, nyirkos
Bennett agar	bőséges növekedés, durva, narancsszínű barnás felület
Kalcium-malát agar	gyenge növekedés, lapos átlátszó
Fölözött-tej agar	közepes növekedés, durva narancsszínű 11 C 10
Czapek agar kalcium-	gyenge növekedés, lapos,
karbonáttal	áttetszőtől narancsig változó színű
Czapek agar	gyenge növekedés, lapos, áttetszőtől narancsig változó színű
Pepton-glükóz agar	közepes növekedés, ráncos, narancsszínű II G 8
Emerson agar	közepes növekedés, durva narancs barnás felület
Burgonya-szelet	nincs növekedés
Burgonya-szelet	közepes növekedés, ráncos,
kalcium-karbonáttal	piszkos-narancs színű

A színek meghatározását Maerz és Paul módszerével végeztük (Maerz, A. and M. Reg. Paul 1950. A dictionary of colors 2¹¹ Ed., Mc Grow-Hill Book Companv, Inc. New York).

A ta'ptalajok száma, lia jeleztük, megfelel a Shírling és Gottlieb által leírtnak (Intern. J. Svst. Bact. 16 313-340,1966).

A II. táblázatban a Luedemann által leírt táptalajon (liitcr. .1. Syst. Bacl. 21, 240 247, 1971) megbatározott szénfonás hasznosítást mutatjuk be, míg a III. táblázatban a Micromonospora sp. NRRL 15 118 fiziológiai jellemzőit.

II. táblázat

Különböző szénforrások hasznosítása

Szénforrás	Hasznosítás
Arabínóz	+
Xilóz	-1
Glükóz	4·
Fruktóz	+
Mannóz	+
Mannit	—
Inozit	—
Ramnóz	—
Szacharóz	+
Laktóz	+
Raffinóz	4-
Cellulóz	—
Szalicin	—
Melibóz	4-
Galaktóz	+
Ribóz	—
Dulcit	—
Glicerin	—
Cellobióz	+
Trehalóz	4
Oldható keményítő	4
+ hasznosítás
— nincs hasznosítás
± gyenge hasznosítás
111. táblázat
Fiziológiai tulajdonságok
Vizsgálat	Eredmény
Keményítő hidrolízis	pozitív
Kénhidrogén-fejlesztés	pozitív
Melanin termelés	negatív
Tirozináz reakció	negatív
Kazein hidrolízis	pozitív
Kalcium-in alát hidrolízis	negatív
Nitrát-redukció	pozitív
Lakmusz tej	koaguláija
Zselatin elfolyósítás	pozitív

Más szervezetekhez hasonlóan az M 9026 antibiotikumot termelő Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs tulajdonságai változhatnak. A törzsből például mesterséges mutánsok és variánsok állíthatók elő különböző ismert mutagcnnel történő kezeléssel, például UV sugarakkal, Röntgen-sugarakkal, mikrohullámmal, radioaktív sugarakkal és vegyszerekkel, például salétromos savval, N-metil-N'-mtro-N-nitrozoguanidiimcl és számos más anyaggal. Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs összes M 902(, antibiotikumokat termelő természetes és mesterséges variánsát és mutánsát a Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzzsel azonosnak tekintjük és a találmány körébe tartozónak gondoljuk.

Az M 9026 antibiotikumok előállítására a Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzset vagy ennek egy megfelelő mutánsát vagy variánsát hasznosítható szénforrást, nitrogént és szervetlen sókat tartalmazó vizes tápoldatban süllyesztett-levegőztetett körülmények között tenyésztjük. Az említett tenyésztő közeg a fermentációs szakmában általában használt számos táptalaj bármelyike lehet, bár bizonyos tenyésztő közegek előnyösebbek lehetnek. Így például előnyösen használható szénforrás a glükóz, keményítő, maltóz, szacharóz, galaktóz, cellobióz, raffínóz, fruktóz, dextrin, melasz és hasonlók. Más, használható szénforrás lehet a mogvoróolaj, kukorica-olaj, szójaolaj, halolaj és hasonlók.

Az előnyösen használható nitrogén-források közé tartoznak az élesztő-kivonalok, aminosavak, kaz.cin-hidrolizátum, húskivonat, szójaliszt, peptonok és hasonlók.

Más használható nitrogén-forrás lehet a zabliszt, mogyoróliszt, szójaliszt, szójadara, gyapotinag-liszt és hasonlók.

A tenyészlében használható szervetlen sók azok a szokásos oldható sók lehetnek, amelyekből nátrium, kálium, vas, cink, kobalt, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, nitrát, foszfát és hasonló ionok keletkeznek. A baktérium növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges nyomelemeket is beletehetjük a tenvészlébe. Ezek a nyomelemek általában a baktérium növekedési igényeit kielégítő mennyiségben fordulnak elő szennyező anyagként a tenyészlé többi komponensében.

Szükséges lehet, hogy kismennyiségű (pl. 0,2 ml/1) habgátló anyagot, például polipropilén-glíkolí vagy szilikon-származékot arljimk nagy térfogatú fermentációkhoz, ha a habzás nehézséget okoz.

Nagyobb mennyiségű M 9026 antibiotikumok előállítása során az antibiotikumot termelő törzset rendszerint rázott lombikban előtenyésztjük, majd ezt a tenyészetet használjuk üveg fermentorok oltására. Az előtenyésztéshez használt táptalaj lehet azonos a termelő-táptalajjal, de más táptalaj is használható.

Az M 9026-ot termelő törzs nő 25 °C és 37 °C között, előnyösen alkalmazhatjuk a 26 °C és 30 °C közötti hőmérséklet-tartományt. A fermentlé pH-ját általában 6,0 és 8,5 között kell tartani. Az üvegfermentorokat használó süllyesztett-levegőztetett tenyésztési folyamatok során általánosan elfogadott eljárásként steril levegőt buborékoltatnak át a tenyészlén. Hogy a baktérium kielégítően növeked3

191 108 jók, a termelő tartályon keresztül előnyösen olyan mennyiségű levegőt buborékol tatunk, hogy az elegendő legyen több mint 20 %-os oldott-oxigén szint fenntartásához.

A fermentáció során az antibiotikum-termelést követhetjük a fermentléből és/vagy a micélium-kivonatból vett minták antibiotikus aktivitásának mérésével. Erre a célra az M 9026 antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmusok használhatók. Egy különösen jól használható organizmus a Staphylococcus aureus. Más hasznos mérő-organizmusok lehetnek azok a sejtek, amelyekről ismert, hogy érzékenyek az említett antibiotikumok citotoxikíis aktivitására.

A biológiai vizsgálatot könnyen elvégezhetjük az agar-diffúziós módszerrel agarlemezeken vagy vékonvréteg-bioautográfi ával.

A maximális antibiotikum aktivitás a fentiekben körvonalazott fermentációs körülmények között általában az inkubálás 48-72. órájában jelenik meg.

Süllvesztett-levegőztetett fermentációs körülmények között történt előállítás után az M 9026 antibiotikumokat a fermentációs iparban használt módszerekkel nyerhetjük ki a fermentléből, például oldószeres extrakcióval, ellenáramú extrakcióval, szerves kicsapószerek alkalmazásával, oszlop-kromatográfiával, vékoiiyrclcg-kroniatográíiával és hasonlókkal, majd tovább tisztíthatjuk oldószeres átkristályosítással, folyadék-kromatográfiával, nagynyomású folyadék-kromatográfiával, fordított fázisú folyadék-kromatográfiával és hasonlókkal.

Az M 9026-ot termelő szervezetek fermentációja során előállított antibiotikumok a tenyészlében és/vagy a micélium-tömegben találhatók.

Ennélfogva az M 9026 antibiotikumok kinyerésére előnyösen alkalmazható a szűrt fermentlé és a micélium-tömeg külön-külön extrakciója.

A micéliumot szűréssel eltávolítva az M 9026 antibiotikumokat megfelelő szerves oldószerrel extrahálva nyerhetjük ki a szíírletből. Az extrakciót általában a szűrlet pH-jának 3,5 és 8,5 közé állítása után végezzük el, előnyösen pH 6,0-7,5 között, még előnyösebben pH 7,0-en.

Az alkalmazható szerves oldószerek az M 9026 antibiotikumokat oldó, de vízben nem oldódó oldószerek, jellemző, de nem korlátozó példák a következők: rövid szénláncú alkanolok, például metanol, etanol, propanol és hasonlók, rövid szénláncú haloalkánok, például kloroform, diklórmetán, klóretán és hasonlók, rövid szénláncú alkil-észterek, például etilacetát, butilacetát, propilacetát, etilpropionát, etilbutirát és hasonlók, valamint ketonok, például mctilctil-keton és hasonlók.

Az extraktumokat kis térfogatra sűrítjük és a kicsapódó szilárd anyagot szűréssel kinyerjük. A kicsapódás teljessé tehető egy második, az M 9026 antibiotikumokat nem oldó szerves oldószer hozzáadásával, például petroléterrel, etiléterrel vagy hasonlóval.

Ezzel szemben a kiszűrt micéliumot vízzel mossuk és a fentiekben említett, az M 9026 antibiotikumok extrahálására alkalmas oldószerek egyikében szuszpendáljuk. Keverés után a keveréket leszűrjük és a szerves oldószert kihajtjuk a szíírletből. A megmaradó vizes elegy pH-ját ezután 3,5-8, előnyösen 6 és 7 közé állítjuk és a fermentlére leírt módon extraháljuk.

A kapott M 9026 antibiotikumokat tovább tisztíthatjuk ismert tisztítási eljárásokkal, előnyösen vékonvréteg-kromatográfiát vagy oszlopkromatográfiát alkalmazva.

Töltetként aluiníniuin-oxid, szilikagél, ioncserélő gyanták, például Dowex^R gyanták, cellulóz, Sephadex^R és hasonlók használhatók előnyösen.

A találmány előnyös kivitelezése során az M 9026 komplex tisztítását szilikagél oszlopon végezzük, eluálószerként poláris oldószer, például rövid szciiláncú alkanol, rövid szénláncú halo-alkán, például kloroform és bázisos anyag, például ammónium-hidroxid elegyét alkalmazva.

A találmány még előnyösebb kiviteli formájában kloroformunetanol-ammónia 66:30:4 arányú elegyét használjuk eluálásra.

A fentiekben meghatározott biológiai vizsgáló rendszerben mikroba-ellenes hatást mutató eluátumfrakciókat összegyűjtjük és az M 9026 antibiotikum komplexet kinyerjük a fentiekben leírt technikák egyike szerint.

Az M 9026 2. és 3. komponensének elválasztását több ismert módszerrel is elvégezhetjük, ezek lényegében kromatográfiás eljárásokon alapszanak.

Oldószeres extrakciót, oldószeres kicsapást ellenáramú extrakciót és hasonló eljárásokat is használhatunk.

Másik előnyös kiviteli mód szerint oszlopkromatográfiát alkalmazunk; előnyösen szilikagélt használunk töltetnek és az előnyösen alkalmazható eluáló elegy poláris oldószerből, például rövid szénláncú alkoholból és kis polaritású oldószerből, például rövid szénláncú halo-alkánból áll. Az előnyös eluáló elegy összetétele kloroform-metanol 9:1 arányban.

Az ehiátum frakcióit összegyűjtjük, vizsgáljuk a fentiekben említett biológiai módszerrel és a megfelelő frakciókat összeöntjük.

Az M 9026 antibiotikum 2. és 3. komponensét az M 9026 komplexnek az extrakciós elegyből történő kinyerésére leírt módszerek egyikének alkalmazásával nyerjük ki.

Az M 9026 antibiotikum komplex és az M 9026 antibiotikum komplex 1., 2., 3. jelű komponenseinek fiziko-kémiai tulajdonságai.

Λί 9026 antibiotikum komplex

A nujolban felvett infravörös elnyelési spektruma az 1. ábrán látható.

A következő elnyelési maximumok (cm’¹) figyelhetők meg:

3260 (széles)', 3060, 2730, 1735, 1720 (váll), 1650, 1630, J545, 1515, 1495, 1300, 1260, 1210, 1170, 1090, 1030, 980, 940, 830, 760, 720, 700.

Az ultraibolya spektrum metanolban terminális elnyelést mutat 215 nm-nél és a kísérő rajzok között a 2. ábrán látható.

191 108

Az Μ 9026 antibiotikum 1. komponense

Az M 9026 1. komponense kristályos szilárd anyag, olvadáspontja 235 C.

Oldódik kloroformban, metanolban, kevéssé oldódik acetonban, szénhidrogénekben, nem oldódik vízben.

Elem-analízissel a következő százalékos összetételt kapjuk: szén 68,83 %; hidrogén 8,7 %; nitrogén

5.56 %; oxigén (a különbség alapján) 16,91 %.

A nujolban felvett infravörös elnyelési spektrumot a kísérő rajzok között a 3. ábrán mutatjuk be.

A következő elnyelési maximumok figyelhetők meg: 3670, 3550, 3460, 3320, 3100, 3080, 3040, 2740, 1720, 1660, 1630, 1545, 1500, 1260, 1245, 1220, 1190, 1140, 1090, 1040, 985, 950, 895,750,

725.700.

Az ultraibolya spektrum metanolban terminális elnyelést mutat 215 nm-nél (2. ábra).

A mágneses magrezonancia (4. ábra) a következő jellegzetes csúcsokat tartalmazza:

δ 0,70-0,73 (2d, 6H, J=6,5), 0,83 (d, 6H, J=7), 1,0-2,0 (m, 4H), 1,06 (m, III), 1,24 (d, 311, J=6,5),

1.5- 2,0 (m, 211), 1,66 (t sept, 1II,J=7,5), 1,98 (ddd, 2H, J=7,5—7,5—1); 2,49 (ddd, IH, IH, J=7—10; 2,5), 3,00 (d, 2H; J=7,5), 3,91 (dddd, IH, J=9; 8;

2.5- 9,5), 4,08 (dd, IH), 4,32 (ddq, IH; J=2,5-10),

4.57 (dt, IH; J=8), 5,69 (dt, IH, J=15), 6,15 (d, IH), 6,22 (d, IH), 6,73 (dt, IH), 7,18 (m, 5H).

A tömegspektrum az 5. ábrán látható. A főcsúcsok a következők (az első szám az. m/z arány, a második, zárójelben levő pedig a viszonylagos mennyiség százalékban):

486 (35); 91 (18); 111 (81); 120 (37); 216 (18); 217 (19); 230 (70); 231 (34); 258 (100); 344 (48); 372 (8,3); 395 (3,5); 486 (2,6); 471 (1,1).

Az M 9026 antibiotikum 2. komponense

Az M 9026 2. komponense szürkés-fehér por, olvadáspontja 280 °C fölött van.

Oldódik metanolban, etanolban, acetonban, etil-acetátban, kloroformban, gyengén oldódik acetonitrilben, nem oldódik vízben, petroléterben, etilétcrben.

Elem-analízis során a következő közelítő százalékos összetételt kaptuk (számos meghatározás átlagaként): szén 68,82 %; hidrogén 9,04 %; nitrogén 5,70 %; oxigén (a különbség alapján) I 7,09 %.

A nujolban felvett infravörös elnyelési spektrumot a 6. ábrán látjuk a kísérő rajzok között.

A következő elnyelési maximumok figyelhetők meg:

3340, 3295,3070,2730,1720,1670,1655,1630, 1540, 1500, 1270, 1240, 1215, 1190, 1140, 1090,

1040.980.945.760.720.700.

Az ultraibolya spektrum metanolban terminális elnyelést mutat 215 nm-nél (lényegében megegyeznek a 2. ábrával).

A mágneses magrezonancia spektrumban (7. ábra) a következő jellegzetes csúcsok vannak:

δ 0,78 (d, 6H; J=7), 0,87 -0,90 (2d, 6Π; J=6,5),

1,4-2,0 (m, 8H), 1,24 (d, 3H; >6,5), 1,27 (d, 3H; J=7), 1,92 (ddd, 2H, >7,5-7,5-1), 2,60 (ddd, IH;

>2,5-711), 3,27 (dq, IH; J=9), 4,08 (dddd, IH, >9; 9-9-2), 4,14 (dd, IH), 4,38 (ddq, IH, >2-11). 4,54 (dd, IH, J=8), 5,62 (dt, IH, >15), 6,13 (d, IH), 6,60 (dt, IH), 7,23 (m, 5H). 7,27 (d, IH).

A löincgspcklruinof a 8. ábrán mutáljuk be. A lő csúcsok a következők (az első szám az m/z arány, a második, zárójelben levő pedig a viszonylagos menynviség százalékában):

500 (9), 105 (28), 1 11 (78), 134 (40), 230 (12), 231 (20), 244 (82), 245 (34), 272 (100), 358 (42), 386 (18), 395 (34), 482 (6), 485 (3).

A Merck 60 F 254 szilikagél vékonyréteg lemezen a következő Rf értékeket kapjuk: 0,54 ha futtatószerként diklórmetán:metanol 95:1 arányú elegyét használjuk, 0,76 ha futtatószerként diklórmetán:metanol 9:1 arányú elegyét használjuk.

Az M 9026 antibiotikum 3. komponense

Az M 9026 3. komponense fehér kiislályos anyag, olvadáspontja körülbelül I 10 °C (Kofler).

Elem-analízissel a következő százalékos összetételt kapjuk: szén 67,01 %, hidrogén 9,24 %, nitrogén 5,52 %, oxigén (különbség alapján) 18,33 %.

A CDC1₃ -bán felvett infravörös elnyelési spektrum a 9. ábrán látható. Az elnyelési maximumok a következők:

3700, 3610, 3420, 3300, 3040, 29(,0, 2935, 2.880, 1730, 1665, 1635, 1600, 1500, 1455, 1435, 1370, 1275,1235,1200,1170.

Az ultraibolya spektrum terminális elnyelést mutat metanolban 215 nm-nél (2. ábra).

A mágneses magrezonancia spektrum a 10. ábrán látható, a következő jellegzetes csúcsokkal:

δ 0,88 (d, 6H; >7), 0,91 0,94 (2d, 6H, >7),

1,4-2,0 (m, 8H), 1,16 (d, 3H; J=6,5), 1,31 (d, 311, >7), 1,99 (ddd, 2H, >7-7-1), 2,49 (ddd, IH, >2,5; 7-11), 3,07 (b, IH), 3,34 (dq, IH; >8), 3,68 (S, 3H), 3,70 (m, IH), 3,75 (dd, IH, >10), 3,88 (b, IH), 4,01 (dddd, J=9, J=2—11), 4,54 (dd, III, >9), 5,62 (dt, III, >15), 6,16 (d, III), 6,52 (d, IH), 6,65 (dt, IH), 7,27 (m, 5H).

A tömeg-spektrumot a '8a. ábrán mutatjuk be. A. fő csúcsok a következők (az első szám az m/z irány, a második, zárójelben levő pedig a viszonylagos ucnnviség százalékban):

532 (0,6), 105 (28), 111 (76), 134(40),230(12), 231 (20), 244 (82), 245 (34), 272 (100), 358 (40), 386 (6), 395 (5), 427 (7), 482 (2), 500 (1,2).

A Merck 60 F 254 szilikagél vékonyréteg lemezen a következő Rf értékeket kapjuk: 0,41, ha futtatószerként diklórmetán-metanol 95:1 arányú elegyét használjuk és 0,63, ha futtatószerkent diklórmetánmetanol 9: | arányú elegyét használjuk.

Az M 9026 komplex és 1., 2., 3. jelű komponensei in vitro antimikrobáiis hatással rendelkeznek, különösen Gram-pozitív baktériumokkal szemben.

A IV. táblázatban az M 9026 MIC értékeitmutatjuk be. Az eredmények nagyon hasonlóak, ha az M 9026 antibiotikum 2. és 3. komponensét vizsgáljuk.

191 108

IV. táblázat

Törzsek	MIC Azg/ml
Staphylococcus aureus	ATCC 6538	0,1
Staphylococcus aureus Tour	0,05
Staphylococcus aureus Tour
(Difco P táptalaj + 30 %
borjú szérűin)		12,5
Straptococcus hacinolyticusC 203	0,2
Diplococcus pneumoniae	UC41	0,4
Clostridium perfringens	1SS 30543	12,5
Proteus vulgáris X 19 H	ATCC 881	>100
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 10145> 100
Candida albicans	SKF 2270	100
Trichophyton
metangrophytes	SKF 17410	>100
Mvcobacterium tub.
H37Rv	ATCC 9360	12,5
Mvcoplasma gallisepticum
H21	C.Z.B.	0,1
Tiíchomoiias vaginái is		100

Az M 9026 antibiotikum komplex és 2., valamint 3. komponense citotoxikus hatással rendelkeznek in vitro és daganatgátló hatással rendelkeznek in vivő kísérletekben.

In vitro kísérletek

HL 60 sejtek szuszpenzióját 20 % borjú magzat szérummal, 50 pg/ml gentamicinnel és 2 mM L-glutaminnal kiegészített RPMI 1640 táptalajban tartjuk fent (S. J. Collins et al.; Natúré, 270, 347- 349, 1977) 37 °C-on 5 % széndioxiddal dúsított, nedvesített légkörben.

A vizsgálni kívánt anyagokat 10 % metanolban oldjuk, majd steril sóoldatban 1000 üg/ml végkoncentrációra hígítjuk.

Az M 9026 komplex IC₅₀ értéke (azaz a kontrolihoz képest a sejtek növekedését 50 %-ban gátló koncentráció) 0,1-0,25 pg/inl volt.

Azonos körülmények között az M 9026 antibiotikum 2. jelű komponensének IC₅₀ értéke 0,5-5 Mg/ml volt, az M 9026 3. jelű komponenséé körülbelül 0,05 jUg/ml. A sejtnövekedés gátlásának mértékéül a ³Il-Iiinídiii beépülés gállását használtuk. Acliuoínycin Ü és cikloheximid volt a pozitív kontroll. IC₅₀ értékük a fenti körülmények között körülbelül 0,05 μ g/ml, illetve 0,25 μg/ml volt.

In vivő kísérletek

A találmány szerinti vegyületek daganat-ellenes hatására vonatkozó előzetes vizsgálatot P₃₈₈ daganatos egereken végeztük. A kísérleteket lényegében a National Cancer Institute előiratai alapján végeztük (Geran és mtsai, Cancer Chem. Rep. III. rész, 3 17, 197).

Ebben a vizsgálatban 10⁶ daganalscjlct juttatunk inraperitonálisan CDFi egerekbe. A vizsgált anyagot karboximetil-cellulózban szuszpendáljuk, majd órával a daganat beültetése után kezdődően, 1-5 napig tartó kezelés során naponta egyszer intraperitonáiisan beinjekciózzuk. A kontroll egerek nem kapnak hatóanyagot. A kezelt és kezeletlen egerek túlélési idejét feljegyezve, a kísérletekben kapott eredményeket a kontroll túlélési-idő százalékában fejezzük ki (T/C):

Kezelt csoport átlagos túlélési ideje

---------------------------------------------X 100

Kontroll csoport átlagos túlélési ideje

A 100-nál nagyobb érték azt mutatja, hogy a kezelt csoport átlagos túlélési ideje a kontroll csoporthoz képest megnőtt. A vizsgálat eredményeinek értékelése során az NCI követelményei szerint a T/O 125 értéket mutató anyagokat tekintjük további tanulmányozásra érdemesnek.

mg/kg dózisban az M 9026 antibiotikum komplex T/C értéke 153 volt, míg az M 9026 3-as komponens T/C értéke 168 volt.

Pozitív kontrollként 5-fluoro-uracilt használva 60 mg/kg dózisban 168-as T/C élléket kaplunk.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek mikroba- és daganat-ellenes hatással rendelkeznek. Ennélfogva ezek a vegyületek gyógyászatilag aktív anyagokként használhatók. Felhasználás céljából ezeket a hatóanyagokat a kezelésre szoruló betegek szájon át vagy parenterálisan történő kezelésére alkalmas, ismert gyógyászati keverékekbe keverjük.

A szájon át történő adagolásra alkalmas készítmények lehetnek por, kapszula, tabletta, szirup stb. formában, általánosan elfogadott eljárásokkal és a szakterületen jól ismert hordozó- és adalékanyagokkal készülnek.

A jelen esetben előnyösen alkalmazható parenterális adagolás céljára a találmány szerinti hatóanyagot felületaktív anyagok és más gyógyászatilag elfogadható töltőanyagok hozzáadásával vagy anélkül, fiziológiailag elfogadható hordozóban (például steril víz és/vagy olajok) készült injektálható oldat vagy szuszpenzió dózisok formájában adagoljuk. A felhasználható olajra jellemző példa a petróleum, állati vagy szintetikus eredetű, pl. mogyoróolaj, szójaolaj, szezám-olaj és ásványolaj. Általában kétszer desztillált, pirogén-mentes víz, sóoldat, vizes dextróz és rokon cukor-oldatok, etanol és glikolok, például propilén vagy polietiién-glikolok használhatók injektálható oldalok folyékony hordozójaként. Ezeket a készítményeket használatra kész oldatok formájában, vagy előnyösen a száraz oldható terméket az oldószerrel csak közvetlenül használat előtt elegyítő formában használhatjuk. Ez utóbbi esetben az aktív komponens általában liofilezve van.

Parenterális adagolás esetén a gyógyászatilag hatásos napi adag 0,5—20 mg/testtömeg-kilogramm között van.

A hatóanyagok napi többszöri adagolása kívánatos lehet és változik a beteg állapotával és az adagolás módjával,

A hatóanyagokat adagolhatjuk nyújtott liatasú injekció vagy beültetett preparátum formájában, mely lehetővé teszi az aktív adalékanyag állandó, egyenletes felszabadulását. Az aktív adalékanyagot tablet-611

191 108 tákká vagy kis hengerekké préselhetjük és bőr alá vagy izomba beültethetjük. A beültetett készítményekben használható semleges anyagok lehetnek biológiailag lebontható polimerek vagy szintetikus szilikonok, például a Dow Corning Corporation által gyártott Silastic szilikongumi.

A találmány tárgya eljárás gyógyászati készítmény előállítására, a találmány szerinti hatóanyagot a farmakológiailag elfogadható hordozókkal keverve.

A következő példákban a szakember számára ismertetjük a szabadalmi eljárás gyakorlati végrehajtását.

Az ultraibolya és látható spektrumokat PerkinElmer 320 UV/Vis spektrométerrel vettük fel.

A tömeg-spektrometriás adatokat egy Hitachi-Perkin-Elmer RMU-6L tömegspektrométerrel vettük fel.

A mágneses magrezonancia spektrumokat CDCI₃ban, belső standardként TMS-t használva vettük fel 270 MHz-en egy Bruker W1I-270 spektrométerrel.

1. példa

A Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs fermentációja

A Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs tenyészetét előtenyésztjük a következő összetételű táptalajban, rázott lombikban növesztve a törzset:

élesztő, kivonat 5 g húskivonat , 3 g tripton 4 g glükóz 1 g keményítő 24 g kalcium-karbonát 4 g csapviz 1000 ml-re feltölteni.

A lombikokat 48 órán át 30 °C-on tartjuk és az előtenyészetet használjuk 1 liter, következő összetételű táptalajt tartalmazó üvegfermentor oltására:

élesztő, kivonat 2 g kazein-hidrolizátum 4 g húskivonat 2 g glükóz 10 g keményítő 20 g kalcium-karbonát 3 g csapvíz lOOOml-re feltölteni.

A fermentációt süllyeszlett-levegőztetett körülmények között, kevertetve, 26-30 °C között hajtjuk végre. A p!I-t 6,0 és 8,5 között tartjuk. Az antibiotikum aktivitást Staphylococcus aureus teszt-organizmust alkalmazva időnként mikrobiológiailag, az agardiffúziós módszerrel ellenőrizzük. A legmagasabb aktivitást 72 óra után érjük el.

2. példa

Az M 9026 antibiotikum-komplex kinyerése

Az 1. példa szerint előállított fermentlevet leszűrjük. A szőriét pH-ját 7-re állítjuk és kétszer extraháljuk azonos térfogatú etil-acetáttal. A szerves exlraktumokat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson az eredeti térfogatnak körülbelül egy századára sűrítjük. A keletkező csapadékot szűréssel kinyerjük.

lla etil-étert adunk az anyalúghoz., ugyanabból az anyagból további mennyiséget kapunk. Szülés után a kinyert szilárd anyagot csökkentett nyomáson, szobahőmérsékleten szárítjuk, így kapjuk a nyers M 9026 antibiotikum-komplexet.

3. példa

Az M 9026 antibiotikum 1. jelű komponensének kinyerése

A fermentlé szűrésével kapott micélium-tömeget vízzel mossuk, a pH-t körülbelül 7,0-re állítjuk és a keverékei metanolban szuszpendáljuk, majd 20 percig kevertetjük. A keveréket leszűrjük és a metanolt ki desztilláljuk a szőriéiből. Az így nyert vizes fázis pH-ját 7,0-re állítjuk és a fermentlére leírt módon etilacetáttal extraháljuk.

A nyert M 9026 antibiotikum 1 .jelű komponensét a 4. példában a 2. és 3. komponensre leírt módon tisztíthatjuk. Fizikai-kémiai tulajdonságait az előbbiekben ismertettük.

Hasonló eredményeket kapunk, ha a fenti eljárásban az etilacetátot kloroformmal vagy metil-etil-ketonnal helyettesítjük.

4. példa

Az M 9026 antibiotikum komplex tisztítása

1,5 g, az 1. példa szerint előállított nyers komplexet 10 ml eluáló elegyben oldunk és 120 g Kiesel-gél 60-ból (70-230 mesh, ASTM, Merck) kloroform metanol: ammónia 66:30:4 arányú elegyben készített szilikagél kromatográfiás oszlopra visszük.

Az oszlopot 60:30:4 térfogatarányú kloroformmetanol: ammónia eleggyel kifejlesztjük és 15 ml-es frakciókat szedünk.

Az oszloptól lejövő minden egyes frakciót IIL 60 sejtek, Staphylococcus aureus vagy Biieillus sublilisszal szemben aktivitásra megvizsgálunk, valamint vékonyréteg-kromatográfiás bioautográfiával, Staphylococcus aureust használva kimutató organizmusként. A frakciókat aktivitásuk alapján egyesítjük. Az egyesített, besűrített frakciókhoz díetilétert adunk a tisztított M 9026 antibiotikum komplex kicsapására. Ebben az utolsó lépésben diizopropil-étert vagy petrolétert is használhatunk.

Ennek a terméknek fizikai-kémiai tulajdonságait a fentiekben ismertettük.

5. példa

Az M 9026 antibiotikum 2. és 3. komponensének elválasztása

A 4. példában előállított 340 mg tisztított M 9026 komplexet 5 ml diklórmetán:metanol 9:1 térfogatarányú elegyében oldjuk.

-713

191 108

Az így kapott oldatot, 30 g Kiesel-gélbó'l (70-230 mesh ASTM, Merck) 9:1 térfogatarányú diklórmetán: metanol elegyben készített szilikagél kromatográfiás oszlopra visszük.

Ugyanezt az clcgycl használjuk az oszlop előhívására, 15 ml-es frakciókat szedünk.

Az oszlopról lejövő minden egyes frakciót megvizsgálunk HL 60 sejtek, Staphylococcus aureus vagy Bacillus subtilis-szal szembeni aktivitásra, vagy vékonyréteg kiOinalográliával, illetve vékonyrétcgkromatográliás bioautográfiával, kimutató organizmusként Staphylococcus aureust vagy Bacillus subtilist alkalmazva. A frakciókat a komponens-tartalom és a mutatott aktivitás alapján egyesítjük. Minden egyesített frakciót csökkentett nyomáson besűrítünk. Minden sűrítményt etiléterhez adunk a kívánt komponens kicsapására. Az eljárás alapján egymás után három Tő komponenst lehet elválasztani, melyeket 1., 2. és 3. komponensnek nevezünk.

Fizikai-kémiai tulajdonságaikat az előbbiekben leírtuk.

Szabadalmi igénypontok

Claims (5)

1. Eljárás M 9026 antibiotikum komplex, melynek nujolban felvett infravörös elnyelés spektrumában 3260 (széles), 3060, 2730, 1735, 1720 (váll), 1650, 1630, 1545, 1515, 1495, 1300, 1260, 1210, 1170, 1090, 1030 , 980, 940, 830, 760, 720 és 700 cm ¹ -nél található elnyelési maximum, valamint az M 9026 antibiotikum 1. komponense, melynek olvadáspontja 235 °C, nujolban felvett infravörös elnyelési spektrumában 3670, 3550, 3460, 3320, 3IÓ0, 3080, 3040, 2740, 1720, 1660, 1630, 1545, 1500, 1260, 1245, 1220, 1190, 1140, 1090, 1040, 985, 950, 895, 750, 725 és 700 cm'¹ -nél található elnyelési maximum, és mágneses magrezonancia spektruma az alábbi jellegzetes csúcsokat mutatja: delta 0,70-0,73 (2d, 6H, J=6,5), 0,83 (d, 6H, J=7), 1,0-2,0 (m, 4H), 1,06 (m, 1H), 1,24 (d, 3H,J=6,5),

1.5- 2,0 (m,2íi), 1,66 (t sept, 111,.1=7,5), 1,98 (ddd, 211, J=7,5—7,5 —1), 2,49 (ddd, JH, 1H, J=7-10; 2,5), 3,00 (d, 2H, J=7,5), 3,91 (dddd, 1H, J=9; 8;

2.5- 9,5), 4,08 (dd, 1H), 4,32 (ddq, 1H; J=2,5-10), 4,57 (dt, 1H; J=8), 5,69 (dt, 1H, J=15), 6,15 (d, Hl), 6,22 (d, Hl), 6,73 (dt, Hl), 7,18 (m, 5Π), az M 9026 antibiotikum 2. komponense, melynek olvadáspontja 280 °C fölött van, nujolban felvett infravörös elnyelési spektrumában 3340, 3295, 3070, 2730, 1720, 1670, 1655, 1630, 1540, 1500, 1270, 1240, 1215, 1190, 1140,1090,1040,980,945,760, 720 és 700 cm’¹ -nél található elnyelési maximum, és mágneses magrezonancia spektruma az alábbi jellegzetes csúcsokat mutatja; delta 0,78 (d, 611, J=7), 0,87-0,90 (2d, 6H, J=6,5), 1,4-2,0 (in, 811), 1,24 (d,

3H, J=6,5), 1,27 (d, 3H, J=7), 1,92 (ddd, 2H, J= =7,5-7,5-1), 2,60 (ddd, 1H, J=2,5-711), 3,27 (dq, 1H, J=9),

4,08 (dddd, 1H, J=9-9-2), 4,14 (dd, 1H), 4,38 (ddq, 111, J=2-l l), 4,54 (dd, 1H, J=8), 5,62 (dt, 1H, K=15), 6,13 (d, lH),6,60(dt, 111), 7,23 (m,

5H), 7,27 (d, 1H), és/vagy az M 9026 antibiotikum 3. komponense, melynek olvadáspontja ~l 10 °C, CDCI_s-baii felvett infravörös elnyelési spckli urnában 3700,3610, 3420, 3300, 3040, 2960, 2935, 2880, 1730, 1665, 1635, 1600, 1500, 1455, 1435, 1370,1275,1235,1200 és 1170 cm¹-nél található elnyelési maximum, és mágneses magrezonancia spektruma az alábbi jellegzetes csúcsokat mulatja: delta 0,88 (d, 611, J=7), 0,9| 0,94 (2d, 611, J =7), 1,4-2,0 (m, 811), 1,16 (d, 3H, J=6,5), 1,31 (d,3H,J=7), 1,99 (ddd, 2H, 1=7-7-1), 2,49 (ddd, 1H, 1=2,5; 7-11), 3,07 (b, lH),3,34(dq, 1H, J = 8), 3,68 (s, 3H), 3,70 (in, 1H), 3,75 (dd, 1H, J=10), 3,88 (b, 1H), 4,01 (dddd, J=9,1=2-11), 4,54 (dd, 1H, 1=9), 5,62 (dt, 1H, 1=15), 6,16 (d, 1H), 6,52 (d, 111), 6,65 (dt, 111), 7,27 (m, 511) előállítá-