JPS6069085A - デイフイシジンおよび誘導体抗菌物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ここで一般に１デイフイシジン“（ｄｉｆｆ
ｉｃｉｄｉｎ　）　と呼ばれる新規抗菌化合物およびそ
の誘導化合物、および該化合物を製造、単離および精製
する工程に関するものである。ここで用いられているよ
うに、新造名称である１デイフイシジン１は、下記構造
式１の化合物を示す（式中、Ｒ１は水素であり、ｌζ８
及びＲｂは下記に列挙した意味を有し、各種のその塩を
与える）。それに対応して、１ゝオキシデイフイシジン
ｌの名称は、ここで用いられるように　Ｒ１が水酸基で
ＲａおよびＲ，が指示された意味を有する下記構造式Ｉ
の化合物を意味する。この新規抗菌性化合物は、メリー
ランド州、ロックビルにある米国標準菌株保存施設（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｆｕｒｅＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ　）　に寄託され各々ＡＴＣＣ３９３７４お
よび３９３２０と指定されたバチリス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）ＭＢ３５７５お
よびＭＢ４４８８の微生物培養により得られる。

本発明の新規抗菌性化合物ディフィシジンおよび誘導体
化合物は好気性および嫌気性微生物に対して抗菌活性を
有する。これらは、グラム陽性およびグラム陰性細菌感
染の治療に、非経口的に用いることができる。

プロチシン（ｐｒｏｔｉｃｉｎ　）　は、燐を含む強度
に不飽和な無定形化合物で、広い抗菌スペクトルを有し
、特にグラム陰性感染菌に有効と記載されている既知の
抗菌性化合物である。

この物質は、バチルス・リケンホルミス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）　の形として同
定された菌株の発酵によシ生産されたと言われる。その
製造、特性、および抗菌活性についてのより詳細な記載
は、以下の参考文献中に見出し得る＝（１）プレフエ　
ピー（ｐｒａｖｅ、　Ｐ、　）ほかアンチビオチツクス
誌（Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）２５　（１）　：
第１−３頁、１９７２年；（２）フエルテシー　エル（
Ｖｅｒｔｅｓｙ、　Ｌ　）　、アンチビオチツクス誌（
Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔ　）　２５　（１）　：第４−１
０頁、１９７２年；（３）ニスマン　ジー（Ｎｅ　ｓ　
ｊｍａｎ　ｎ　。

Ｇ、）ほか、ナラ−ルビラセンシャット（Ｎａｔｕｒｗ
ｉｓｓｅｎｓｃｂａｆｔｅｎ）　５９　（２）　：第８
１−８２頁、１９７２年：（４）ドイツ特許公開公報第
２、０３５．８１２号フエルテシー　エル（Ｖｅｒｔｅ
ｓｙ　、　Ｌ）ほか１バチリス　リへニホルミスからの
プロチシンの製造“’　（Ｐｒｏｔｉｃｉｎｆｒｏｍ　
ｒ３ａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）“
ファルプベルケ　ヘキスト社、１９７０年７月１８日；
および（５ン英国特許第１．３５０．２７１号、バチル
ス　リへニホルミスの醗酵によるプロチランの製造（Ｐ
ｒｏｔｉｃｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ）ファルプベルケ　ヘキスト社（Ｆａｒｂｗｅ
ｒｋｅ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ａ、　Ｇ、　）。

１９７４年４月１８日（ケミカルアフ゛ストラクト８１
　：　４８５３１　ｙ、ｐ　３０　ｂ、１９７４年参照
）。

１、かじながら、特異抗生物質化合物プロチシンについ
て繰返し参照しても、上述の参考文献では単一化合物を
特徴づけることは出来ず、またそこに示されているスペ
クトル・データは数種の可能な化合物に矛盾しないもの
である。−に述のフエルテシーの文献（２）は、二重結
合のただ一つにのみ一つのメチル基が存在することを記
載しているのに対し、本発明の化合物は、そのようなメ
チル基を２個有しているので、本発明のＲ１が水酸基で
ちる新規抗菌性化合物（オキシディフィシジン）は上記
文献中に記載されたいわゆるプロチジンとは、化学的に
異なるものである。他方　Ｒ１が水素である本発明での
新規抗菌性化合物（ディフィシジン）は、それが異なる
力子量を有していることから、文献中の化合物とは容易
に区別される。

ディフィシジンは化学的には、構造式Ｉに図示されるよ
うに、不斉中心をＣ４、Ｃ５、Ｃ１５、およびＣ２１に
有する２２員大環状ポリエンラクトン燐酸エステルであ
る。

見れば判るように、構造式ｌ中には２つの主要化合物が
ある。一つの化合物は、■Ｌ′が水素のものであって、
既に指摘したように、以後は”ディフィシジン“と記す
。もう一方の化合物はＲ１が水酸基のものであって、以
後は１オキシデイフイシシンと記す。

本発明に従って、以下の構造式を有する新規抗菌性化合
物ディフィシジンおよびその誘導体が与えられる： １ 式中、ＲａおよびＲ６は、水素；アルカリ金属およびア
ルカリ土類金属陽イオン；アンモニウム；および置換ア
ンモニウムからなる群よシ・独立的に選択された置換基
であり　Ｒ１は水素捷たは水酸基である。

アンモニウム陽イオンは、既知の方式によって、好まし
くは、例えば低級アルキル基によりｉ４換され得る。

ディフィシジンが製造され、さらにモノお６びジ−カリ
ウム塩の平衡を変える燐酸カリウム塩として用いられる
。この塩の形は、製造が容易であること、および低１〕
ＩＩ下で存在する酸型（Ｉｔ、−Ｒ，＝Ｈ）が恐らく不
安定なことから採用されたものである。

ディフィシジンおよびその誘導体は、メリーランド州、
ロックビルの米国標準菌株保存施設（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｆｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
に寄託されたバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　Ｂ　３５７５およびＭＢ４４
８８の微生物培養により製造することができる。

これらはそこから各々受託番号ＡＴＣＣ３９３７４およ
び３９３２０で無制限に入手し得る。

該バチルスあるいはその変種および変異株は、微生物培
養ら一般的に用いられる栄養培地あるいは朱子−溶液を
用いた寒天スラント試験管またはエルレンマイヤー・フ
ラスコあるいはファーメンタ−中の深部培養条件下にお
いて、よく知られた微生物手法に従って培養することが
できる。

本発明においては、ティフィシジンおよびその誘導体は
、微生物、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　ＡＴＣＣ３９３２０を好気
条件下、約２８℃の温度で培養中に生産される。栄養培
地の組成は、広範囲に変化させることができる。必須の
同化可能な栄養成分は、炭素源、窒素源、燐、硫黄、マ
グネシウム、カルシウム、および塩素を含む無機物源で
ある。培養は中性ｐＨ条件好ましくは、約６．０から７
，０の条件が最も生産的である。

典型的な炭素源には、グルコース、デキストリン、澱粉
、グリセロールなどを含む。典型的な窒素源は植物粉（
大豆、綿実、トウモロコシなど）肉粉または動物性ペプ
トン、醸造可溶物（ｄｉａｔｉｌｌｅｒｓ　５ｏｌｕｂ
ｌｅｓ　）　、カザミノ酸、酵母細胞、種々の加水分解
物（カゼイン、酵母、大豆、など）、酵母核酸、および
アミノ酸を含む。

ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、
およびカルシウムの塩酸、硝酸、硫酸、炭酸、および燐
酸塩の如き無機塩類は必須無機元素の供給源を提供する
。栄養培地は鉄、ｔｌｌｔ、マンガン、亜鉛、及びコバ
ルトのような、ＶＩＱ々の微邦元素をも含む。

培養中に過剰な発泡が生じたときは、発酵の前または途
中で、発酵培地中に、植物油、ラード油、およびポリプ
ロピレングリコールのような消泡剤を添加することがで
きる。ディフィシジンの最大収量は、約２０ないし１２
０時間以内に到達され、培養に依存している。発酵の接
種ダネは、Ｗ、濁液、スラント、凍結細胞、または凍結
乾燥物から供給され得る。

上述の通常培養法に加えて、メソド　インマイクロバイ
オロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　）第２巻〔アカデミツク出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ
ｐｒｅｓｓ　）ロンドン−ニューヨーク〕、１９７０年
、第２５９−３２８頁に記載されているような連続法を
用いることもできる。そのような糸では、菌を長期間自
然変異あるいは他の崩壊が顕著になることなく定當状態
を保つことができる。

ディフィシジンおよびその誘導体の生産のために、本発
明がバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）　ＡＴＣＣ３９３７４％るいは３９３２
０を使用することのみに限定されるのではないことが理
解されるべきである。

菌がデ・ｆフィシジンおよびその誘導体を生産している
限りは、該微生物から生じた自然または人工の変異株ま
たはバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｉｉｓ　ＡＴＣＣ３９３°７４　まだは２９３２０
の他の変種の使用を包含することが特に望捷れ、また意
図されている。バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｊｌｉｓ　）変異株の人工的な生産は、Ｘ
−線または紫外線（ＵＶ）照射の如き通常の操作、また
は、ナイトロジエン・マスタード、ニトロングアニジン
、樟脳などのような化学変異剤の利用、または組換えＤ
ＮＡ工学手法などにより達成することができる。

バチルス・ズブチリス（Ｂａｃ目１ｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）ＡＴＣＣ３９３２０の形態学的および生理学的性
質は以下のようである： 形態ニゲラム陽性、空胞のない栄養桿菌で末端は円形；
平均の大きさ０．９　Ｘ　２．３〜２．６μ；単細胞本
。桿菌は運動性あり。

好気条件下で胞子形成。胞子は０．５×１．０μ（平均
の大きさ）、卵形ないし円筒形、多く中央部に形成、胞
子のう は膨まず。

集落の外観二 平たん、円状で外縁は不規則、表面は 滑らかでない。集落がなくなるに従っ て外縁は不透明になる。肉汁表面で光 沢なく、シわのある全面薄膜形成、ト リブチカーゼ大豆寒天上で色素生産な し。２８℃、３７℃で生育、６０’Ｃで生育せず。

陽性反応二 カタラーゼ、フオゲスープロスカウエ ル（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ　）　、ゼラチン
、硝酸塩還元。クエン酸の利用、グルコ ース、アラビノース、マンニトール、 キシロース、ソルビトール、およびス クロースからの酸生成、澱粉加水分解。

陰性反応： ウレアーゼ、インドール、プロピオン 酸の利用。アルギニン・ジヒドロラー ゼ、ラムノースおよびメリビオースか らの酸生成、嫌気性寒天中（穿刺また は嫌気ジャー中での平板培養）で非生 育、嫌気条件下肉汁または硝酸肉汁中 で非生育。

ベルゲイ（Ｂｅｒｇｅｙ　）　のマニュアル・オブデイ
ターミナテイプ　バクテリオロジー（Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｄｅｆｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ入第８版、［つ・ｆリアムス・アンド・ウィルキ
ンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　）　］
　、１９７４年、およびゴルデン・アール・イー（Ｇｏ
ｒｄｏｎ。

λＦ、、）、ハイネム・ダブリュー・シー（Ｈａｙｎｅ
ｓ、　Ｗ、　Ｃ，）およびパンク・シー・エイチ（Ｐａ
ｎｇ、　Ｃ，Ｉ（、）　（１９７碑）　、ザ・ギナス・
バチルス（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）
　、アグリカルチャーモノグラフ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　）　Ａ４２７、ニー・ニス
、デパートメント・オブ・アグリカルチャー（Ｕ、　＆
　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ、ｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ｅ　）　、［ワシントン・ディー・シー　（Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ　、　Ｄ、　Ｃ，）　〕　中の培養記載との
比較の結果は、ＭＢ４４８８／ＡＴＣＣ３４３２０が既
知種バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）の株であることを示す。

ＡＴＣＣ３９３７４の形態学的および生理学的性質は、
以下に述べる微生物の集落の外観に関する点を除くと上
に示したＡＴＣＣ３９３２０のものと同じである： 集落の外観：２４時間で盛シ上った円形、ムコイド。集
落が古くなるに従って外縁が乾燥不透明および不規則に
なる。中央ムコイド領域は乾燥し続け、不透明化および
しわがよる。

肉７１表面上で光沢なく、シわのある全面薄膜形成。ト
リブチカーゼ太豆寒天上で色素生成なし。２８℃、３７
℃で生育、６０℃で非生育。

ディフィシジンおよびその誘導体の生産Ａ、抗菌性化合
物ディフィシジンおよびその誘導体、捷たけそれらの塩
の一つの、しかしその中ではオキシディフィシジンが大
きな割合で生産されるような、製造方法は、ディフィシ
ジンおよびその誘導体を形成し、バチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ａ　ＴＣ
Ｃ３９３２０株に属する微生物を炭素源、窒素源、栄養
塩、および微量元素を含む栄養水溶液により、２０°乃
至４０℃の範囲の温度で２４乃至１２０時間、栄養溶液
が可成りの量のディフィシジンおよびその誘導体を含む
ようになるまで培養すること、その後、培８液からディ
フィシジンおよびその誘導体を分離し、必要なら薬学的
に許容される塩基を用いて塩に変換することを含む。

培養中に、栄養培地のｐＨ値は、中性からやや酸性に変
る；一般に緩衝液の添加は不要であるが、予防策として
用いることも出来る。

望ましい収量が２〜４日後に得られるので、培養をこの
期間後に適当に停止する；その時栄養溶液は多量のオキ
シディフィシジンを含んでいる。ＡＴＣＣ３９３２０培
養はディフィシジンに比してよシ多くのオキシディフィ
シジンを生産するが、全体の力価は以下に述べるＡＴＣ
Ｃ３９３７４培養よシ低いことが認められた。

１３　、抗菌性化合物デ・「フィシジンおよびその誘導
体、まだはそれらの薬学的に許容される塩基との塩の一
つ、しかしその中ではディフィシジンがよシ大きな割合
で生産されるもう一つの、そしてよシ好ましい製造方法
は、ディフィシジンおよびその誘導体を形成し、バチル
ス　ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　）ＡＴＣＣ３９３７４株に属する微生物を、炭素源、
窒素源、栄養塩および特にコバルトを含有する微量元素
を含む栄養水溶液により、栄養溶液が可成−シの量のデ
ィフィシジンおよびその誘導体を含むまで２０°乃至４
０℃の範囲で２４乃至１２冑時間培養し、その後培養液
からディフィシジンおよびその誘導体を分離し必要なら
薬学上許容される塩基との塩に変換することを含む。

既に指摘したように、バチルス・ズブチリス（１１ａｃ
Ｎ１ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＡＴＣＣ３９３７４
株を用いる方法が同様に好ましい。何故なら、オキシデ
ィフィシジンより大きな割合のディフィシジンを生成し
、上記“Ａ＃に述べた方法で用いたバチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｔ）ｔｉｌｉｓ　）　ＡＴＣ
ｏ　３９３２０微生物より高力価を生成することが認め
られたからである。

コバルトの添加、例えば０．１９　／　−１％は該微生
物によるディフィシジンの優先的な生産を起こさせ、生
産されるオキシディジジン量に対し重量比で３二１の大
きさにまでなることが認められた。種々の水溶性のコバ
ルト塩を用いることができる。例えば、好んで用いられ
るのは塩化コバルト６水和物である。

同様に、コバルト存在下で燐酸塩を例えば１００　ｐｐ
ｍ添加すると、オキシディフィシジンの生産に比し、バ
チルス・ズブチリス（１’３ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ　）培養によるディフィシジンの優先的な生産
が起こることが認められた。他方、オキシディフィシジ
ンの優先的な生産はマンガン、例えば塩化マンガン４水
和物を例ムば０．０２５　ｆ　／　Ｌ添加することによ
り行なわれる。しかし、これらの知見は予備的な性格の
ものであり、望まれるかも知れない、ディフィシジンか
まだはオキシディフィシジンの生産に影響を及ばず目的
で培地に有利な操作を加える可能性があることを示すも
のとしてのみ含まれているものである。

ディフィシジンおよびその誘導体の分離ディフィシジン
およびその誘導体を分離するために菌の培養液を先ず遠
心分離により清澄にする。しかし、ディフィシジンおよ
びその誘導体の可成りの部分は、細胞部分に残留するこ
とになる。この粗製品をＸＡＤ−２およびＩＩ　Ｐ　−
２０樹脂のような有機系ポリマー樹脂およびリクロプレ
プ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ　）　ＲＰ−１８樹脂および
フォトマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）のＯＤＳ樹脂（共にＣ
ｌ８Ｈ３７残基が化学的に結合した外層をもった珪酸で
ある）のような珪酸系ポリマー樹脂のような適当な吸着
剤を用いぞクロマトグラフィーにより精製する。ディフ
ィシジンおよびその誘導体は、吸着剤から適当な極性溶
媒またはその混合物により溶出され、次いで、ディフィ
シジンおよびその誘導体の水性抽出が行なわれる。ディ
フィシジンおよびオキシディフィシジンは次に高速液１
本クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により相互に、
そして、構造的な関連化合物から分離される。

ディフィシジンおよびその誘導体の有効抗菌量は、哺乳
動物で５　ｍｙ　／　Ｋｑから２０１ｎｙ／Ｋｒの程度
と考えられる。ディフィシジンおよびその誘導体は、グ
ラム陰性およびグラム陽性感染症の治療に有効であシ、
静脈内、筋肉内、または皮下に単独あるいは製剤担体と
の組み合せで投与し得る。最終的な投与経路および量は
臨床医によシ決定され、患者の独自の条件に基くべきで
ある。

ディフィシジンおよびその誘導体と、適当な製剤担体と
の組み合わせは、薬剤士の領域でよく知られている方法
によりなされる。例えば、皮下（Ｓ、Ｃ，）投与の目的
では、ディフィシジンおよびその誘導体の溶液は一般に
例えば無菌水溶液またはアルコール溶液を用いる。この
溶液は、必要なら適当に緩衝化されるべきであり、稀釈
液は先ず、食塩まだはグルコースで等張にしておくこと
ができる。

これらの水溶液およびアルコール溶液は静脈内（ｉ、ｖ
、）注射としても適当である。

以Ｔの例は、バチルス・スブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉｌｉｓ　）　ＡＴＣＣ
３９３２０およびＡＴＣＣ３９３７４からのディフィシ
ジンおよびオキシディフィシジンの製造および単離を説
明するものである。

実施例１ １、１１　Ａ　Ｉ＋工程 ＡＴＣＣ３９３２０（ＭＢ　４４８８　）　培養、凍結
乾燥管は培養の脱脂乳懸濁液０．１５　ｍｌを含む１、
０　ｍｅアンプル中に凍結乾燥した状態で保持されてい
る。

２、曝Ｂ　ＩＩ工程 容器：フラスコ当り５０　ｔｒＩｅ培地を含む邪魔板３
個つき２５〇−容エルレンマイ ヤーフラスコ、 培地：　正量／１４・る１１ デキストロース　１１／を 可溶性澱粉　１０ｆ／を 牛肉エキス　３１／ｌ アルダミン（Ａｒｄａｍｉ　ｎｅ　）　Ｉ’１１　５　
ｆ　／　ＩＮＺ−アミンＥ型　５９／１ Ｍｇ５０４７Ｈ２００，０５ｆ／１ １．３４Ｍ燐酸緩衝液　０．０２％体積／体積ＣａＣ０
３（ｐＨを７．０−７．２に調整後）　０．０５％燐酸
緩衝液 Ｊ（Ｉ（２Ｐ０４　９１　ｆ　／　Ｌ Ｎａ２１１ＰＯ４９５ｔｌ　Ｌ 接種材料： 凍結乾燥管（Ｌｙｏ　ｔｕｂｅ　）　１本の内容物を各
１Ｂ“フラスコ中へ インキュベーション： ２２０　ＲＰ　Ｍで回転する約５ａｎ（２’）回転盤か
らなる回転振盪機上で２８ ℃２４時間 無菌性： 平板塗抹およびグラム染色 ３、＠　ｃ　１７エ程 容器：　５００　ｍｌ培地を含む邪魔板３個っき２リツ
トル容エルレンマイヤーフラ スコ、 培ＪＩＪｌ二ｔゝＢ”工程と同じ 接１重月　ｔｌ　： １１　Ｂ“工程からの１０１ｄ インキュベーションニ １１　Ｂ”工程と同じ 無菌性： ゝゝＢ“工程表同じ ４、ＸＩＥ“工程 ■’　７５０リツトル容ステンレス　スチール　ファー
メンタ− 培地： デキストリン　４０　？／ｌ ツルラック（Ｓｏｌｕｌａｃ）　７　ｔ／Ｌアルダミン
（Ａｒｄａｍｉｎｅ）　ＹＥＰ　５グ／を塩化コバルト
　５０　ｍｇ／　、ｌ− ポリグリ：１−ＪＬ、２０００　１ｍ１ｌｔ前−殺菌　
ｐＨ７，３ ８ｍ：ｒｚｘｃ　２０分 接、ｌ１Ｔｉ材Ｆｌ　： ″Ｃ１工程１リットル ２１ユ２しヨ辷ヨ亀血血山：　５０１　’Ｊットル温度
＝２８℃ 通気二約１４１リットル／分（５０Ｆ　Ｍ　）（３０時
間）次に約１７０リツトル ／分（６ＣＦＭ） 攪ＰＩ！　：　１３０　ＲＰ　Ｍ　（１２時間）次に１
ＯＲＰＭ 旦　：約０．９１Ｋｆ／ｃｎＶ（１３Ｐ　Ｓ　Ｉ　）消
泡剤： ポリグリコール２０００ 循環時間： ９２時間 無菌性： 顕微鏡検定および２８℃および３７ ℃で平板塗抹 生理： ０　６．５　４．　５５　３８０ ９　６．０　５　４０　２００ ２１　−　１４　８０　２１０ ３３　６．４　−　１０５　２２０ ４５　６．４　−　７０　２５０　１０．８５７　’６
．３　−　１５　１８０　７．９６９　６．４　−　１
０２１０　− ８１　６．０　４　２５２５０　７．４９３　６．０　
２　６５　２７５　６．６実施例２ 実施例１で記載された発酵ノ＼ツチカラノ約４２０リッ
トルの全培養液（ｐＨ５，９）は、９２時間目に収穫し
た。培養液をシャープレス遠心機を用いて清澄化した。

４１６１ノツトルの清澄培養液を５００　ｍｅの４Ｎ塩
酸によりｐＨ５，Ｏに合せ、次いで、４リットル／分で
３８リツトルのロームアンドハース社のアンバーライト
ＸＡＤ−２樹脂に吸着させた。樹脂を４リットル／分で
１２０リツトルの冷たい蒸留脱イオン水により洗浄した
。抗菌複合体は、１６０リツトルの酢酸エチル４リット
ル／分により樹脂から溶出した。溶出液の下部水層は除
去廃棄した。溶出液を無水硫酸ナトリウム上で３０分間
攪拌し、乾燥した。乾燥剤を′Ｊ−１過により除去し、
ηゴ液を真空下で２６５リツトルに濃縮した。濃縮液に
１リツトルの水を加え、緩やかに攪拌しつつ１３０ｍｅ
の２．５Ｎ水酸化ナトリウムにより下部水層の１）１１
を８．５に調整した。混合物を２分間激しく攪拌した。

層を分離させた。下部水性抽出液を別容器に移し、上部
有機層を各回５００ｒｎｌの水と抽出の間ｐＨを８．５
にするのに十分な２．５Ｎ水酸化ナトリウムにより２回
抽出した。

３つの水性抽出液を併せ、ｐｉ＋　６．９に調整した。

抽出′ｅ、ｆ）４は２．４リツトルであった。２．１リ
ツトルの抽出後酢酸エチル溶液は、９４１の総置体を含
んでいた。

ディフィシジンおよびオキシディフィシジンは、水性抽
出物中、および水抽出後酢酸エチル区分の両方に種々の
量で存在した。下記Ｂ工程は、水抽出後酢酸エチルから
のディフィシジンおよびオキシディフィシジンの、単離
を述べる。下記Ｃ工程は水性抽出液からのディフィシジ
ンの単離を述べる。Ｄ工程は別の単離法および対応する
分析評価を述べる。

Ｂ、ディフィシジンおよびオキシディフィシジンの単離 上記へ工程からの２．１リツトル水抽出後酢酸工チル分
画の０．４　ｍｅ試料を油状残渣まで蒸発させ、０．７
ｍｌの７＝３メタノール−０，０１Ｍ燐酸カリウムＩ）
１１７．０中に取った。その溶液０、４　ｍｌを同一溶
媒中、２８℃でデュポン・ゾルパックス（Ｄｕｐｏｎｔ
　Ｚｏｒｂａｘ　）　ＯＤＳカラム〔内径４．６ｍｍ（
ＩＤ）　Ｘ　２５ａ＋＋）、１０ミクロン、上でクロマ
トグラフにかけた。流速は１　ｍｅ　／分で、カラム溶
出液は、１０ｍｍ光路長のフローセル（ｆｌｏｗ　ｃｅ
ｌｌ　）およびハネウェル・エレクトリック（Ｈｏｎｅ
ｙｗｅｌｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ　）　の１９５記録
機を備えたラボラトリ−・データー・コントロール・ス
ペクトラ・モニター（Ｌａｂ６ｒａｔｏｒｙ　Ｄａｔａ
　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳｐｅｃｔｒａＭｏｎｉＬｏｒ　）
　Ｉ紫外線検出機を用いて２７５　ｎｍでモニターした
。溶出液を０．５　ｒｎ１分画で集め、ビブリオ　パー
コラスト（Ｖｊｂｒｉｏ　ｐｅｒｃｏｌａｕｓ）ＭＢ　
１２７２に対する寒天平板拡散法で検定した。

表Ｖは生物検定の結果を要約したものである。

表Ｖのデータは、水抽出後酢酸エチル中に２つの異なっ
た抗菌物質の存在を示す。１１および１２分画の活性は
抗菌性オキシディフィシジンによるものである。６１−
６５分画の活性は抗菌性ディフィシジンによるものであ
る。

表　１ カラム分画の試験管内ビブリオパーコランス（Ｖｊｂｒ
ｉｏ　ｐｅｒｃｏｌａｎｓ　）　生物検定の結果１−１
０　０ １１　２３　ピーク１３３６秒　オキシディフィシジ１
２　１９ ６１　１２ ６２　１２ ６３　１２　ピーク２　１８４４秒　ディフィシジン成
分６４　１２ ６５　１２ ６Ｇ−１２００ ＊　寒天平板拡散、約９．５　ｍｍ　（３／　８′）平
板上に４ｏμを上記Ａ工程からの併合水性混合抽出液２
４リツトル（総置体６６ｙ）は溶は込んでいる酢酸エチ
ルの大部分を除くために２．１リツトルに濃縮した。濃
縮物は０．２２　Ｌの０２１Ｍ燐酸カリウムｐｌ＋　７
．０で稀釈し、５０７ｎｅ　／分で１リツトルのミツビ
シ・ダイアイオン（ Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｄｉａｉｏｎ　）　ＨＰ　−２
０樹脂上に吸着させた。樹脂を３リツトルの蒸留水、３
リン　ットルの１：１メタノール−ｏ、ｘＭ燐酸カリウ
ＡｐＨ７，０１３リットＪ１．、（Ｄ６５　：　３５）
’９７−ルー燐酸緩衝液、および３リツトルの９＝１メ
タノール−蒸留水で連続的に洗浄した。

抗菌性複合体は５０ｍ１／分で、３．９リツトルのメタ
ノールで溶出し、１．４５リツトルの先駆分画と２．４
５リツトルの濃厚分画として集めた。先駆部分にはオキ
シディフィシジンが豊富であり、一方濃厚分画にはディ
フィシジンが豊富であった。濃厚区分（総置体０．５５
７）は５０　ｍｅまで濃縮し、１１６　ｍｅの０．１Ｍ
燐酸カリウムｐｌ＋　７．０で稀釈した。溶液は、イー
・メルク・リクロプレップ（Ｅ、　ＭｃｒｃｋＬｉＣｂ
ｒｏｐｒｅｐ　）　ＲＰ　−１８，２５−４０ミクロン
樹脂の７４　ｍｅＯカラムに５ｉ／分でチャージした。

カラムは、メタノール濃度を漸増さぜるメタノール−水
混合物で連ゎ°じ的に展開した（表Ｖｌ　）。ｂｌｔ　
ｍ　ｌｓｌ：　５　ｍｅ　／　分、分画ｕ　各７．５１
１１ｅてあった。

表　１１ リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ　）　ＲＰ　−
１８上でのｉｎディフィシジン成分のクロマトグラフィ
ー １−２７　ＣＩ　メタノール−水　７．５ゴ／分画２８
７６０　５５：４５メタノール−水　７．５　ｒｎｌ！
７分画６１−９５　６０：４０メタノール−水　７．５
　ｍｅ　／分画９６−１３０　６５：３５メタノール−
水　７．５ｎｅ１分画１３１−１９０　７０：３０メタ
ノール−水　７．５ゴ／分画分画の高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）分析および生物検定に基き、抗菌
物舛が分画１０９−１２１に溶出し、この分画は表Ｉの
ピーク２（ディフィシジン成分）と同じ高速液体クロマ
トグラフィー保持時間を示Ｌ　ｆｃ。分画１０９−１２
１を粗ディフィシジン成分濃厚区分として併合１７た一 濃厚区分を８．２　ｍｅに−６１て濃！ｉ４　Ｌ／　、
０．９　ｍｅのＩＭクエン酸ナトリウムＩ）１１５．４
　：はよびＧ、　１　ｍｅのメタノールで稲沢し／こ。

この溶液を４二〇メタノール−０，１Ｍクエン酸ナトリ
ウムｐＨ５，５中イー・メルク・リクロプレツプ（Ｅ。

Ｍｅｒｃｙ＜　ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ　）　ＲＰ　−１
８樹脂２５−４０ミクロンの１７ｍｆ！のカラム上に２
ゴ／分で吸着させた。カラムを同一流速で３０　ｍｅの
４二６メタノールークエン酸緩衝液で洗浄した。カラム
を次に７５：２５メタノール−クエン酸（分画１−３５
）および８：２メタノール−クエン酸（分画３６−７０
）で展開した。全分画は２ｎｅであった。薄層クロマト
グラフィー（ＴＬＣ）および紫外線（ＵＶ）分析に基き
、分画４２−６５を併せ、６ｒｎｌＫａ縮した。得られ
た白色懸濁液を、５ｄの０．１Ｍ燐酸カリウムｐＨ７，
２および不溶物質が再溶解するのに充分な量のメタノー
ル（７ｍｌ　）で稀釈した。その溶液を以下の方式で脱
塩した。

この溶液を３ニアメタノール−０，１Ｍ燐酸カリウムｐ
Ｈ７，Ｏ中の８ｄのりクロプレツブ（ＬｉＣｈｒｏｐｒ
ｅｐ　）　ＲＰ　−１８樹脂上に吸着させた。この樹脂
を２４　ｍｅの３ニアメタノール燐酸緩衝液および２４
〃Ｉ“の３ニアメタノール−蒸留水で連続的に洗浄した
。ディフィシジン成分は３０ｍｇの９：１メタノール−
蒸留水で溶出した。溶出液は８１：１９メタノール−０
，１Ｍクエン酸ナトリウムｐｕ　５．５中室温下デユポ
ン・ゾルパックス（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　）Ｏ
ＤＳカラム〔内径４．６　ａｍ　（ＩＤ）　Ｘ　２５ａ
ｎ　］を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析
した。流速は２ｍ／分であった。溶出液の２７５　ｎｍ
　における紫外線吸収の約９４％はディフィシジン成分
（保持時間３７９秒）に帰因するものであった。保持時
間４１８秒の不純物は、２７５ｎｍ吸収の残りの６％に
対応した。その不純物はりクロプレツブＲＰ−１８樹脂
上で注意深くクロマトグラフィーを行なうことにより除
去した。次に上記３０ｍｅの溶出液を濃縮してメタノー
ルを除きＩＭクエン酸ナトリウムＩ）ＩＩ　５．４およ
びメタノールで８−１最終溶液組成４：６メタノールー
〇、１Ｍクエン酸ナトリウムにした。この溶液を１７ｍ
のりクロプレツブＲＰ１８樹脂に仕込んだ。カラムを７
５：２５メタノール−〇、ＩＭクエン酸ナトリウムＩ’
１１５．５　（分画１−３１、各２　ｍｅ　）　、およ
び８：２メタノール−クエン酸（分画３２−７２、各２
〃Ｉ）で、２７７分で連続的に溶出した。高速液内クロ
マトグラフィー分析に基き、分画４１−５４を濃厚区分
１として併合した。濃厚区分のｐＨを。

種水酸化ナトリウムで１．５単位増大させた。

外れの区分５５−７２は併せて溶媒組成４：６メタノー
ル−０，１Ｍクエン酸にまで濃縮し上述のように１７ｍ
ｇのりクロプレツブＲＰ−１８クロマトグラフにかけた
。適当な分画を濃厚区分２として併合した。溶液のｐＨ
を１．５単位増大させた。濃厚区分ｌおよび２をθ１せ
濃縮してメタノールを除き、０．１Ｍ燐酸カリウムでＩ
）１１８．０に調整した。得られた１０ＦｎＩ！の不透
明溶液に、試料を透明にするのに充分な量のメタノール
（７，５ｍ　）を加えた。この溶液を８　ｍｌのりクロ
プレツブＲＰ−１８樹脂に吸着さぜることにより脱塩し
た。樹脂を５０ｍｇの３：７メ５’　／　−ル０．　Ｉ
　Ｍ燐酸カ！Ｊ　’７　ム１ｕ１１７．０および３０　
ｍｅの３ニアメタノール−蒸留水で連続的に洗浄した。

次に、樹脂を３０　ｒｙｅの９：ｌメタノール−水で溶
出した。溶出液は、約２１ηの実質上純粋なディフィシ
ジンを含んでいた。

上述Ａ部の水抽出後酢酸エチル溶液２．１リットル中の
１．７リツトルを４０℃で油状にまで濃縮し、９：１メ
タノール−勢で９１５　ｔｎｅに稀釈した。不溶物を遠
心分離により取シ除いた。澄明な遠心分離液を、９：１
メタノール−水で充填したＤＥＡＥ・セファデックス八
−２５（アセテート・サイクル）６００ゴのカラムに２
０ｍｇ１分で吸着させた。この樹脂を４リツトルの９二
１メタノール−水で洗浄した。粗ディフィシジン成分を
樹脂から９＝１メタノール−水中３％塩化アンモニウム
で溶出し、その間一連の１００　ｍ１分画を集めた。

４５０　ｒｎｅの濃厚区分、分画７−１０は高速液体ク
ロマトグラフィー検定によりディフィシジンｌ　Ｇ　０
７＋１７を含んでいた。濃厚区分を９１６　ｔｎｅの水
で稀釈し、１８０＋ｎｇのダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ
　）　ＩＩ　Ｐ　−２０樹脂に１８　ｍｅ　７分で吸着
させることにまり脱塩した。樹脂を６００　ｍｅの水、
６００　ｍｅの０．１Ｍ燐酸カリウムｌ）ＩＩ　７．５
および再度６００　ｍｅの水で連続的に洗浄した。メタ
ノールによる樹脂の溶出で１７の総置体を含む２０８　
ｎｄｌの抗生物質濃厚区分を与えた。試料を１００ｎｒ
ｅＫ濃縮し、２３３ｍ１の０．０５　Ｍ燐酸カリウムｐ
１１７で稀釈し、１９０　〃ｔのりクロブレツブＲＰ−
１８樹脂、２５−４０ミクロンのカラム上に仕込んだ。

次いで、１：１メタノール−０，０５Ｍ燐酸カリウムｐ
１１７．１０ゴ／分で（分画ｊｌ　−４０）続いて５０
％メタノールから９０％メタノール緩衝液の直線勾配に
より（分画４ｌ−２８０）溶出した。全分画は各１０ｍ
１であった。高速液１本クロマトグラフィー検定および
ヒフリオパーコランス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｒｃｏｌａ
ｎｓ　）に対する生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）　寒天
平板拡散検定に基き分画２２２−２３７をまとめた。

１５４　ｍｅの濃厚区分は１１５　ｍｅｔｅ）ディフィ
シジンを含んでいた。試料を１７０　ｍｅの０．０５Ｍ
燐酸カリウム１）ＩＩ　７で稀釈し、９５ｍ（！のフォ
トマン・パーティシル（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｉｓ
ｉｌ　）Ｍ２Ｏ１０／２５０ＤＳ−３カラム（内径２、
２　ｏｎ　Ｘ　２５　ａｎ　）、１０ミクロン、上に吸
着させた。カラムを１０ｎｔ１分で５５：３５メタノー
ル−０，０５Ｍ燐酸カリウムｐＨ７（分画１−８９）、
７０：３０メタノール−緩衝液（分画９ｏ−ｉ４９）、
および７５：２５メタノール−緩衝液（分画１５０−２
３０）で連続的に溶出した。全分画は各５ｍｌであった
。

分画１８０−２２０を併合し、３４ゴにまで蒸発させた
。得られたミルク状の懸濁液が透明になるのに充分な量
のメタノール（１１ｎ１ｇ）を添加した。その溶液を２
ｍｅ１分で１８〃Ｉのダイアイホン）ｉ　Ｐ　−２０樹
脂上に吸着させた。

樹脂を４．０ｄの３＝７メタノールー水で洗浄した。樹
脂をメタノールで溶出し、本質的に純粋なディフィシジ
ン・カリウム塩８３■を含む濃厚区分を得た。水からそ
の抗生物質を凍結乾燥することにより、白色無定形固体
を得た。それについて以下に述べる分析結果が得られた
。

一水、メタノールおよびエタノールのような低級アルコ
ールに可溶 一〇、１重量パーセント水溶液のＩ）１１６．９２３５
　ｎｍ　８６６ ２６３　ｎｍ　３１６ ２７３　ｎｍ　４１５ ２８３　ｎｍ　、　３２８ マススペクトルテータ 品分１１＋’ｌ能ｆｆ４１ｈ１−訓により、トリメチル
シリル化の際、試オー１は分子式Ｃ３，ＩＩ、、　０６
Ｐ　：分子量５４４（ジーＴＭＳ９導咋、ｍ／ｚ　６８
８．３７４４　）に対応するジーＴ　Ｍ　Ｓ訪導体（Ｍ
　ＴＭＳｐ　）としてｍ　／　ｚ　６８８．３７４１の
位置に分子イオンを示しだ。陰イオンＦ　Ａ　Ｂ　［Ｆ
ａｓｔ　Ａｔｏ、ｍＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ高速原子衝
′Ｊ賢：ｌ］分析の結果ハソの分子量算定（観察（Ｍ　
−Ｈ）　、ｍ　／　ｚ５４３）を確証しだ。

’ＩＩＮＭＲスペクトル スペクトルは第１図のように測定された。

スペクトルは２０％ＣＤ３０Ｄ／ＣＤ偽　中２２℃（約
５　ｍＷ　／　０．３５　ｍｅ　）　３００　ＭＨｚ　
で記録されており、ケミカルシフトは内部標準テトラメ
チルシランをゼロｐｐｍとした相対値ｐｐｍで示されて
いる。

”’ＣＮＭＲケミカルシフト スペクトルは、２０％ＣＤ−〇Ｄ／ｃＤ偽中５℃で記録
された。ケミカルシフトは内部標準テトラメチルシラン
（ＴＭＳ）のダウンフイーノしドにｐｐＨ＋で表示され
ている。ｌＩＲＭ　Ｓデータと一致して、３１個の炭素
原子は以下のケミカルシフトで認められだ：　ｌ　６．
８．１８．７．２０６０．２３．２．２４．９．３０．
７（２ｘ）。

３２．７．３５．９．３９．０．３９．５．４１．５．
７１．７．７４．２．１１１．７．１１５．４．１２０
．７．１２３．６．１２４．２．１２５．０．１２６．
１．１２７．０．１２７．２．１２９．７．１３３．２
．１３３．７．１３４．６．１３９．１．１４１．１．
１４６．２．１７２．７　ｐｐｍ０実施例３ 培地の調製 培地Ａは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁することに
よ！ｌｌ調製した。５０＃＋７！のこの懸７蜀液を邪魔
板３個つき２５０ｒｎｅフラスコおよび５００　ｍｅを
邪魔板３個つき２０００ｍｇ容フラスコに分配した。フ
ラスコは綿栓し、１２１℃１．約１．２６Ｋｆ／ｃａｃ
　１８　Ｐ　Ｓ　Ｉ　）で３０分間オートクレーフし／
ζ０　。

培地Ｂは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁することに
より調製した。ｐＨは指示されているように調製し、こ
の培地９５１ノツトルを１４リツトルのニュー・ブラン
スフ゛イック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ　Ｂｒｕ
ｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）　のミクロフェ
ルレム（Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）ファーメンタ−１ＭＦ−
１１４型にイ士込んだ。

ファーメンタ−を無攪拌、１２１℃、約１．２６ＫＶ／
ｃｎ！　（１８Ｐ　Ｓ　Ｉ　）で１２０分…］オートク
レーブした。オートクレーブ後、培地を機械的に攪拌、
通気し、２８℃に冷却した。

培地Ｃは以下に挙げた成分を蒸留水ｃｌ＋にｐ、Ｂ濁し
、沸騰するまで加熱し、’１８Ｘ１５０＋ｎｍ試験管に
１２ｍ１分配することによシ調製した。

試験管を１２１℃、約１．２６Ｋｇ／Ｃｎ１（１８ＰＳ
　Ｉ　）ｆ２　ｏ分間オートクレーブの後、試験？Ｉ゛
を傾斜状に置き、培地がスラントに固化するようにした
。

ＡＴＣＣ３９３７４培養の凍結乾燥試験管を無菌的に培
地Ａの邪魔板３個つき２５０　ｍｅ容フラスコに接種し
、２２０ＲＰＭ２８℃で２４時間インキュベートした。

このタネ培養をＣ培地のスラント１２本に接種するのに
用いた。一度接種した後、スラントを９６時間２８℃で
インキュベートし、冷蔵した。上述のように調製したス
ラントの一部を培地Ａの２５０　ｍｅフラスコに接種す
るのに用いた。フラスコは２２０ＲＰＭ２８℃で２４時
間インキュベートした。この第１段階タネフラスコの３
俤を培地Ａの２０００　ｒｎｌフラスコの接種に用い、
これも又２２０ＲＰＪ　２８℃で２４時間インキュベー
トした。この第２段階タネ・フラスコを直接ファーメン
タ−の接種に、あるいは第３段階のタネの接種に用いる
ことができる。第３段階のタネを用いる際は第２段階の
タネの３％を培地Ａのもう−りの２０００　ｍｅフラス
コへの接種に用いた。第３段階のタネを２８℃、２２０
１０〕Ｍで２４時間インキュベーション後、そのフラス
コを用いて・培地Ｂ含有ファーメンタ−へ接種した。

ティフィシジンおよびオキシディフィシジンの生産 」二連のように調製し、前述の第２または第３段階のタ
ネ・フラスコを接種した培地Ｂを含むファーメンタ−を
２８℃、３００−４０ＯＲＰ　Ｍ、　０．３　ｖｖｍ空
気下でインキュベートした。発泡制御の必要があるので
無菌ポリグリコールＰ−２０００を添加した；ファーメ
ンタ−中のポリグリコールｐ−２０００の全量は１係（
ｖ／ｖ）を越えなかった。発酵は８８時間で終了した。

ファーメンタ−から引き出した試料をメタノール（全培
養液１部にメタノール２部を加える）で抽出し、産物形
成を高速液体クロマトグラフィーにより検定した。試料
の様相、２つの発酵の平均値を表１１１に示す。収穫し
たファーメンタ−は、処理する寸で４−１０℃に貯蔵し
た。

培地Ａ：　’ｉ／ｌ トリブチカーゼペプトン　２５ スクロース　１０ 太豆粉　ｌＯ 可溶性澱粉　１０ ＣａＣＯ５ｉ　。

グルコース　５ 牛肉エキス　１ 麦芽エキス　１ 酵母エキス　１ コーンステイープリカー　０，５ （Ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　Ｌｉｑｕｏｒ　）大豆油　ｏ
、　ｉ 大豆トリブチカーゼ　０．１ １）１１６．８（そのまま） 培地Ｂニ アミ− デキストリン　４０ ツルラツク（５ｏｌｕｌａｃ　）　７ 酵母エキス　５ Ｃｏα、−６Ｈ２００，０５ ホ＋Ｊ　クリ：］　−ルＰ−２０００５ｍｇ／Ｌ培地Ｃ
： ｆ／Ｌ 寒　天　２０ 麦芽エキス　ｌＯ デキストロース　４ 酵田エキス　４ Ｉ’１１７．０ 表　Ｉｌｌ ディフィシジンおよびオキシディフィシジンの１４−リ
ットル発酵の活性の様相 １６　’　９．２　１２．２ ２Ｂ　２５．６　６１．１ ４０　２７．２　６１．８ ５３　４１．４　１１６．４ ６４　４６．５　１３２．７ ８Ｂ　５５．４　１４９．２ これらの発酵結果は生産されたディフィシジン：オキシ
ディフィシジンの比が約３：１である点で異常と思われ
る。この比が約１：１に観察されるのがより普通である
。

実施例４ ディフィシジンの単離 上述の実施例３で記載された発酵分からの約１１リツト
ルの全培養液（ｐＨ６，５）を約８８時間口に収穫した
。培養液ｐＨを水酸化ナトリウム水溶液で７．３に調整
した。培養液に４．８リツトル量のイソプロパツールを
添加した。完全に攪拌した後、培養液を遠心分離で清澄
にしだ。１４．４リツトルの清澄培養液状オ」を１００
＋ｎｌ／分で１リツトルのドウエクス（Ｄｏｗｅｘ　）
　Ｉ　Ｘ　２　（（ＩＪ−）樹脂５０−１００メツシユ
に吸着させた。樹脂を２リツトルの蒸留水で洗浄し、１
００１ｎ１．７分で９＝１メタノール−水中、３％塩化
アンモニウムにより溶出した。溶出物を８本の５００−
分画に集めた。１．５リツトルの濃厚区分（分画２−４
）を３リツトルの水で稀釈し１．１００　ｍ１７分で夕
゛イアイオンＨＰ　−２０樹月旨の１リツトＪレカラム
上に吸着させた。樹脂を２リツトルの３＝７メタノール
ー水、１．５リツトルの０．１Ｍ燐酸カリウムＩ）１１
７および２リツトルの水で連続的に洗浄した。樹脂をメ
タノールで溶出し、２．５７の２９チ純度のディフィシ
ジンを得た。

溶１１旨１ｋを：３０　ｍｅに０縮した。籏縮液１０　
ｍｅ（２５０ｍｇディフィシジン）を０．０５　Ｍ燐酸
カリウムｌ）Ｉ＋　７．１で１５．４　ｎｔに稀釈し、
カール・フィッシャー（Ｋａｒｌ　Ｆｉｓｈｅｒ　）分
析により分析した試Ｊｉｉ口」」の含水量を５０襲にし
た。

１５、４　ｍｌの試料をｌ：１メタノール−０，０５Ｍ
燐酸カリウムｐＨ７，１中１００　ｒｎｌのセファデッ
クスＬ　Ｈ−２０樹脂でクロマトグラフにかけた。流速
は２．５＋ｎｌ／分であった。ディフィシジンは保持時
間１，７５力ラム体積で溶出しプこ。２　Ｑ　Ｏｍｅの
濃厚区分を１５０　ｎｔの水で稀釈し、８ｍｅ　７分で
、３ニア）’５１）−／Ｌ−水で平衡化した８　０　ｍ
ｌ、のダイアイオンＨＰ　−２０に吸着させた。樹脂を
１００　ｒｎｌの３ニアメタノール−水で洗浄し、２０
０＋＋＋ｇのメタノールで溶出した。溶出液雌厚区分は
８０　ｍｌで、２５６１ｎｇの５６チ純度ディフィシジ
ンを含んでいた。溶出液４０　ｎｔ量を４ゴに濃縮し、
０、０３　Ｍ燐酸カリウムｐ１１７で８．２　ｍｅに稀
釈し、６５　：　３５メタノール−０，０３Ｍ燐酸カリ
ウム緩衝液で平衡化しておいた９　５　ｍｅのフォトマ
ン・パーティシルＭ２０　１０／２５　０ＤＳ−３カラ
ム（１０ミクロン）上に仕込んだ。

カラムを７５：２５メタノール−緩衝液で溶出し、溶出
液を一連の１０　ｍｅ分画に集めた。

分画３１から４０を併合し、３０チ以下のメタノールを
含む溶液にまで濃縮し、２．５ｍ１１分で２．５　ｍｌ
のダイアイオンＨＰ　−２０樹脂上に吸着させた。樹脂
を１００　ｍｌの３ニアメタノール−水で洗浄した。メ
タノールでの溶出により５４■のほとんど純粋なディフ
ィシジンを得た。抗菌物質は分解を最小にするだめに一
８０℃でメタノール中に保存した。一部を水から凍結乾
燥し、物理化学的特性測定用の試別とした。’Ｉ−ＩＮ
ＭＲスペクトルおよびマス・スペクトルはこの産物が上
記の実施例２のＤ工程で評価した産物と同一であること
を示　し２　プこ　。

実施例５ オキシディフィシジンの製造 オキシディフィシジンの製造に３つの異なる発酵過程を
用いた。

Ａ＊に’ｉ’；地の調製 以下に述べる培地Ａは、下に挙げた成分を蒸留水に溶ｊ
Ｑ’「シ、滅菌前に濃塩酸または５０チ水酸化ナトリウ
ムによりｐＨを７．０と７．２との間に調整することに
よって調製した。この培地５０ゴを邪魔板３個つき２５
０ｒｎ１．容振盪フラスコに分配し、５００ｍ（Ｉの同
一培地を邪魔板３個つき２０００ｍ１容振盪フラスコに
分配した。フラスコを綿栓し、オートクレーブ中で１２
１℃で２５分間加熱することにより滅菌し、室温にまで
冷却した。

培地Ａ チ デキストロース　０．１ 可溶性澱粉　１．０ 牛肉エキス　０．３ アルダミン（Ａｒｄａｍｉ　ｎｅ　）ｐＨ０，５ＮＺア
ミンＥ型　０．５ Ｍｇ５０４・７１１２０　０．００５ 燐酸緩衝液（１）２．０　ｍｅ ＣａＣＯ，、（２）０．０５係 （１）燐酸緩衝液 チ ＫＨ２ｐｏ、　９．１ ＮａＪＩＰＯ４９，５ ｐＨ−７，７０ （２）　ｌ）Ｉ＋を適当なレベルに調整した後添加以下
に述べる培地Ｂは、ニュー・プランスブイツク・サイエ
ンティフック（Ｎｅｗ１３ｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅ
ｎｔｊｆｉｃ　）　の栄養滅菌器Ｎ５−２０型中で、以
下に挙げた成分を蒸留水に）冒濁、滅菌前に濃塩酸また
は５０チ水酸化ナトリウムで１ｕ１１を７．２および７
．４の間に調整し、１２１℃、約１．２６　ｈ／ｃａｌ
（１平方インチ当り１８ポンド）で２０分の加熱で滅菌
することにエリ調製した。１４リツトルの電（眞的に組
合せたニューＯプランスブイツク・サイエンティフィッ
クのミクロフエルム（Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）ファーメン
タ−１ＭＦ−１１４型をジャー中１００　ｍｅの蒸留水
と共にオートクレーブ内で１２１℃、約１．２６　Ｋｇ
　／　ｃ＋＋ｔ　（−平方インチ当り１８ボンド）で９
０分間加熱することにより滅菌した。栄養滅菌器からの
９．５リツトルの冷却培地Ｂを滅菌ファーメンタ−中に
無菌的に移し温度を約２８℃に調整した。

培地Ｂ チ デキストリン　４．０ 醸造可溶物　０．７ 酵母エキス　０．５ ＣｏＣｔ２　・６Ｈ４００，００５ 培養の展開 バチルス　ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＡＴＣＣ３９３２０の凍結乾燥体を無菌的に開
き、」二連のように２５０　ｔｎｅの培地Ａを含むフラ
スコへの接種に用いた。フラスコは、２２０　ｒｐｍ回
転振盪機上で２８℃２４時間インキュベートした。タネ
は引続き第１のフラスコから１５ｍ／！ずつを培地Ａを
含む２０００ｎｒｅ振盪フラスコ３本に無菌的に移すこ
とにより増殖させた。その２０００　ｍｅ振盪フラスコ
を２２０℃四回転振盪機上で２８℃２４時間インキュベ
ートした。タネ工程における最終ｐ１１測定値は、７．
２０から８．３５の範囲であった。

製造 ２０００ｍｇフラスコ１本を用いて、前述のように調製
した１４リツトル容器の各々へ接種した。接種直後にフ
ァーメンタ−の条件を２８℃（２７，９乃至２８．３℃
）、３００ｒｐｍおよびＫｄＷが２．３５　Ｘ　１０−
’　ｇｒａｍ、　ｍｏｌｅｓ０２　／ｍｅ／　ｈ　ｒ　
／　ａ　ｔ　ｍに相当する２リットル／分通気に設定し
た。発酵の間に発泡制御のために必要に応じポリグリコ
ールＰ−２０００を添加したが、０．０４％を越すこと
はなかった。

接種７７時間後に攪拌および通気を、ＫｄＷが１．３　
Ｘ　１０　”−’　ｇｒａｍ、　ｍｏｌｅｓ　Ｏ２／ｍ
ｅ／　ｈｒ／ａｔ＋ｎに相当する２　００　ｒｐｍおよ
び１リットル／分に減じた。ファーメンタ−をインキュ
ベーション８９時間後に収穫した。ファーメンタ−ｊ１
過培養液試料について抗菌およびｐＨ分析を行なった。

そのデータを以下に示す＝０　６．６６　０ １７　７．２０　２６ ２９　７．２２　３５ ４１　７．０８　３４ ５３　７．０８　３５ ６５　６．６５　２８ ７７　６．４５　２９ ８９　６．３５　２９ （１）約１２．５　ｍｍ　（１，／２　″）からの阻止
領域ｍｍ。

５０μｔ／平板 Ｂ、　培地調製および培養の展開は上のＡに述べたのと
同じである。

生産 ２０００−フラスコ１本を用いて、前述のように調製し
た１４リツトル容器の各々に接種した。接種直後にファ
ーメンタ−の条件を２８℃（２８，０乃至２８．３℃）
、３００ｒｐｍおよびＫｄｗが２．３５　Ｘ　１０−’
　ｇｒａｍ、　ｍｏｌｅｓ０２　／　ｍｅ　／　ｈｒ　
／　ａｔｍに相当する２リットル／分通気に設定した。

発酵中に発泡制御のだめに必要に応じてポリグリコール
Ｐ−２０００を添加したが、０．０４％を越すことはな
かった。ファーメンタ−を接種後４１時間に収穫した。

ファーメンタ−濾過培養液試料について抗菌およびｐＨ
分析を実施した。そのデータを以下に示す： Ｑ　６．６４　０ １７　６．４０　０ ２９　６．３８　３５ ４１、　６．４５　３２ （１）約１２．５　ｍｍ　（１／２つ平板からの阻止領
域■５０μｔ／平板 Ｃ０培地調製は上のＡに述べたのと同じである。

培養の展開 バチルス・ズフーチリス（Ｂａｃｉｌｌｔ＋ｓ　５ｕｌ
ｊｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ３９３２０の凍結乾燥菌体を無
菌的に開き、上述のように、２５０Ｉｎｅの培地Ａを含
むフラスコへの接種に用いた。フラスコは２２０　ｒｐ
ｍ回転振盪機上で２８℃２４時間インキュベートした。

タネは引続き第１のフラスコから２　ｍｅずつを培地Ａ
を含む振盪フラスコ４本に無菌的に移すことにより増殖
させた。

これら４本のフラスコは２２０　ｒｐｍ回転振盪機上で
、２８℃２４時間インキュベートした。

２４時間後、４本のフラスコをまとめて１５ｍｅずつを
培地Ａを含む２０００　ｍｅ振盪フラスコ４本に無菌的
に移した。これら２０００　ｍｅフラスコを２２　Ｏｒ
ｐｍ回転振盪機上で２８℃２４時間インキュベートした
。タネ工程における最終ｐ１１測定値は７．２１から８
．３５の範囲であった。

生産 ２０００　ｎｔフラスコ１本を用いて、前述のように調
製した１４リットルファーメンタ−容器の各々へ接種し
た。接種直後にファーメンタ−の条件を２８℃（２７，
５から２８．２℃）４００　ｒｐｍおよびＫｄｗが３．
８　Ｘ　１０−’　ｇｒａｍ。

ｍｏｌｅｓ　０２／　ｍｅ、／　ｈｒ　／　ａｔｍに相
当する３リットル／分に設定した。発酵中に発泡制御の
ために必要に応じてポリグリコールＰ　−２０００を添
加したが、０．２３％を越えることはなかった。接種６
５時間後に攪拌を２０　Ｏｒｐｍに低下させ、Ｉ（ｄｗ
を１．７５　Ｘ　ｌ　Ｏ’　ｇｒａｍ。

ｍｏｌｅｓ　Ｏ２／　ｍｅ　／　ｈｒ　／　ａｔｍ　Ｖ
Ｃ減少さぜた。ファーメンタ−を接種８９時間後に収穫
した。

４つのハツチを０１合し、回分倶給式（ｂａＬｃｌ＋−
ｆｅｄ　）シャープレス遠心°分前機テ３０．００　Ｏ
ｒｐｍて遠心分１ζ１］シた。上７（′７′、企もう２
回遠心分離し、清１ｆ７な」二ｌ（Σをイ！Ｉだ。ファ
ーメンタ−９１過」８養液試別について抗菌およびｐＨ
分析を行なった。

４本の１４リツトル・バッチの平均値のデータは以下の
通りであった： ０　６．９３　５．８ １７　６．５７　１９．８ ２９　６．３８　２７．７ ４１　６．０７　２６．７ ５３　Ｇ、１１　２６．７ ６５　５．９６　２７．０ ７７　（ｉ、５０　２７．５ ８９　６．０５　２６．５ （１）約１２．５　ａｍ　（１／２つ平板からの阻止領
域酬、５０μＶ平板オキシテイフイシジンの１１１．削
及び精製上記実施例５に記載した、同一条件で生育さぜ
／こ１４リツトル発酵４本からの全培ｊＷ液をイノ１合
し、ターボシャープレス遠心分離機にかけた。清澄遠心
上澄２８．３リツトルを濃塩酸でＩ）１１４．８に調整
し、２．１リツトルのローム・アンド・ハース社のアン
バーライトＸＡＤ−２樹脂上に吸着させた。次に樹脂を
同じ流速で８リツトルの水により洗浄した。抗生物質活
性分を樹脂から６リツトルの酢酸エチルで溶出し、１つ
の分画に集めた。溶出液は約０．８リツトルの暗色水性
下層を含んでおり、これを取除き廃棄した。酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで簡単に乾燥し、次に４００ｍ
１まで濃縮した。

粗抗菌成分を、酢酸エチル濃縮物を攪拌しつつ、２．５
Ｎ水酸化ナトリウムで水層のｐＨを８．５に至らせつつ
１５０　ｔｎｌ、の水を用いて水へ逆抽出した。ｙＪ＜
　！４Ｌ抽出物を除去し、水抽出後の耐酸エチルを再び
ｐＨ８，５の１００ｍ／の水で抽出した。最終の第３回
ロノ１ｕ１１８．５　（ｆ）　７０　ｍｅの水での抽出
の後、３つの水性抽出物を併合し、ｌ３１１８．５に調
整した。最終体積は３６０　ｍｅ試別を一８０℃で凍結
保存した。

Ｂ、はとんど純粋なオキシディフィシジンの単離 上記Ａ工程からの併合水性抽出物を融解し、２０５　ｍ
ｅに濃縮し、１５ゴのＩＭ燐酸カリウムｐ１１７で緩衝
化した。この溶液２１５　ｍｌ量を流速２０ｍ１１分で
５００　ｍｌ、のダイアイオンＩＩ　Ｐ　−２０に吸着
させた。樹脂を１．５リツトルの水、１．５リツトルの
１＝１メタノール−０，１Ｍ燐酸カリウムｐＨ７および
１．５リツトルの６５二３５メタノール−０，１Ｍ燐酸
カリウムｐ１１７で段階的に洗浄した。オキシディフィ
シジンを９：１メタノール−水で樹脂から溶出した。溶
出物を２０ｒｎｅ分画で集め、高速液体クロマトグラフ
ィーにより検定した。分分画２０から３５をイＪ（ぜ、
５０　ｍｅに濃縮（１）シＡ二。ｐｌ＋　７．　’５　
：高速液体クロマトグラフィー検定によりオキシディフ
ィシシン４３０　ｍＶ。

（１）の４９　ｍｌ量（４２１ｒｎｇオキシディフィシ
ジン）を１＝４メタノール−水中リクロプレツプ１０）
−１８樹脂〔イー・メルク（ＬＭｅｒｃｋ）２５−４０
ミクロン）　ｌ　７０　ｍｌのカラムに仕込んだ。先ず
、カラムを流速約３．５ｍｅ　７分で２５０　ｍｅの１
：４メタノール−水により溶出した。溶出物は廃棄した
。カラムを次に同じ流速で１＝１メタノール−水により
溶出した。一連の２０　ｍｅ分画を集めた。紫外線及び
高速液体クロマトグラフィー検定に基き、分ｉ＋ｊｊ　
２７から３８をほとんど純粋なオキシディフィシシンと
して併合した。−８０℃における保存中の凍結を防ぐた
めに、その分画に１００　ｍｌのメタノールを添加し、
メタノール濃度を６５チにした。最終体積３６０　ｍｌ
で３７８ｍｇのほとんど純粋なオキシディフィシジンを
含む。

試別は一８０℃で保存した（１■）。

薄層クロマトグラフィ゛−シスチムニフォトマン（Ｗｈ
ａｔｍａｎ　）　ＫＣ１ｇＦ逆相平板９：１メタノール
−０，１Ｍクエン酸ナトリウムＩ）１１６．０ ５〜／　ｍｅのオキシディフィシジン水溶液（上記１３
工程からの試Ｉｔ　（１１）　）　１００　ａｔに１０
　ａｔ　（７）０．２５　ＭＴ　ＲＩ　Ｓ塩酸緩衝液お
よび５μｔの子牛腸粘膜アルカリ性フォスファターゼ（
２０００単位／　ＩＩξｅ１ピー・エル・バイオケミカ
ルス社（Ｐ−Ｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ、）
）を添加した。２８℃で６０分間インキュベーションし
た後に大部分のオキシディフィシシン（Ｒｆ　Ｏ，５９
）　は、燐酸検出用のハーネ（Ｈａ＋ｌｅ’ｓ　）試薬
に陰性の新物質（Ｒｆ　０．３８　）　に変換していた
。

Ｄ、物理化学的および生物学的特性解析のだめのほとん
ど純粋なオキシディフィシジンの単離 上記実施例５に述べたオキシディフィシジン生産生物に
関する発酵研究の結果から良好な抗生物質力価を有する
３つの培養液が得られた。

バッチ　全培養液体積　ｐＨ １６，７リツトル　６．３ ２　６　リットル　６．２ ３　７．３リツトル　６．１ 粗オキシデイフイシジンを以下の手法により各々のバッ
チよりそれぞれ単離した。全培養液（６−７リツトル）
を濃塩酸でｐｔ＋　４．８に調整した。後続のＸＡＤ−
２吸着段階でカラムをつめる可能性をさけるために培養
液を遠心分離にかけ、細胞体を除くのが有利であること
が認められた。しかし、全培養液から、直接オキシディ
フィシジンをＸＡＤ−２樹脂に吸着させることが可能で
あることが示された。培養液（清澄化したものまたは全
部）を７０−７分で７００−のローム・アンド・ハース
社のＡｎｂｅｒｌｉｔｅ　Ｘ　Ａ　Ｄ　２樹脂上に吸着
さぜた。樹脂を２．５リツトルの水で洗浄した。

粗オキシディフィシジンを２．５リツトルの酢酸エチル
で溶出した。酢酸エチル溶出液の下部水層を廃棄しだ；
上層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、約３００ｍｅＶ
Ｃ濃縮した。酢酸エチル濃縮物はＢ段階で述べたように
ｐｌ＋　８．５で１００　ｍｅ、　５０　ｔｎｅおよび
３０　ｍｌｌの水で連続的に逆抽出した。併合した水性
抽出物をｐＨ６，８に調整し、−８０℃で保存した。

バッチ１．２、および３の水１４Ｌ抽出は、溶は込んで
いる酢酸エチルを除くために各々１５０−２００　ｍｅ
　Ｋ　９縮した後、併合した。

その溶液を１０ｒｎｅのＩＭ燐酸カリウムＩ）Ｉ＋　７
で緩衝化し、流速２０ｄ／分でダイアイオンＩＩ　Ｐ　
−２０樹脂上に吸着させた。カラムを１．４リツトルの
０．１　Ｍ燐酸カリウムｐＨ７，１，４リツトルのｌ：
１メタノール−０，１Ｍ燐酸カリウムｐＨ７で連続的に
洗浄した。次にカラムを２０　ｌｎｅ　７分で９：１メ
タノール−水により溶出した。溶ＩＪｉ物を体積各２２
０＋ｎ（。

１００　ｍｅ、　２００　ｍｅ、および２１０１１Ｉｅ
の５分画（分画１−５）に集めた。高速液体クロマトグ
ラフィー検定およびビブリオ・パーコランス（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　＄　）　に対する寒天平版拡散検定に基き、分画
３および４をオキシディフィシジン区分（ＩＩＩ　）と
して併せた；高速液体クロマトグラフィー検定によシ約
３５０クオキシデイフイシジン。

試別（ＩＩＩ　）を４５ｍｅＶＣ儂縮し、ｐｌ１７．０
に調整した。濃縮物を水中のりクロプレツブＲＰ−１８
樹脂（イー・メルク、２５−４０ミクロン）　１７　Ｏ
Ｉｉｅカラム上に仕込んだ。カラムを先ず４５０ゴの水
で洗浄した。カラムをさらに６００　ｍｅの１：１メタ
ノール−水で次いで１．１リツトルの６５：３５メタノ
ール−水で溶出した。溶出液を２０ｍ７４分画で集めた
。

紫外線及び高速液体クロマトグラフィー検定に基き、分
画２８−４２を併合した。−８０℃保存中の凍結を防ぐ
目的で貯めた分画（」Ｖ）に１００　ｍｌ、のメタノー
ルを添加した。体積３８０ｍ１．試別を凍結乾燥し、２
３８■のほとんど純粋なオキシディフィシジン（Ｖ）を
得た。窒素下−８０℃で保存した。

Ｅ、オキシディフィシジン（試Ｆ１．Ｖ）の物理化学的
！１′ケ性 紫外線スペクトル（０，１Ｍ燐酸カリウム中）２３５　
ｎｍ　７５０ ２６６　ｎｍ（ｓｈ）　３０４ ２７５　ｎｍ　３７６ ２８４　ｎｍ（ｓｈ）　３０７ （ＩＶ　）から（Ｖ）への凍結乾燥の間に、オキシディ
フィシジンの１０−１５％の分解が生じ得る証拠がある
。（Ｖ）の凍結乾燥重量と（ＩＶ　）の紫外線分析に基
いて、Ａｉ”ｍ （２７５ｎｍ　）　−４３８が算定される。

マススペクトルデータ 高分解能質量測定り、電子筒１１８マス・スペクトル（
Ｅ　Ｉ　−ＭＳ　）は、分子式”ｌ　Ｈ４１０３（割算
値４（ｉ２．３１３４）に対応する＋ Ｍ−Ｈ，、ＰＯ４イオンをｍ　／　ｚ　４６２．３０９
５に与えた。高質量領域の他の有意なイオンはｍｌｚ４
４４．３８１、および３４９に生じた。トリメチルシリ
ル化の際、試別は分子式ｃ、、）Ｈ４，ｏ７ｐ　（分子
量５６０）（トリーＴＭＳ誘導体の割算値ｍ　／　ｚ　
７７６．４０８９　）に対応するトリーＴＭＳ訪導本（
Ｍ　−７ＭＳ３）としてｍ　／　ｚ　７７６．４１００
の位置に分子イオンを示したａｔノーＴ　Ｍ　Ｓ　（ｍ
ｏｎｏ−ＴＭＳ　）誘導体としてｍｌｚ４６２．３８１
および３４９に相当する適切なＥＩ−ＭＳを確証する他
の有意なイオンおよびその対応する正確な質量値および
分子式は以下のようである： 実測値　計算値　分子式 ５式％ スペクトルは、ＣＤ、ＯＤ／ＣＤα、（約１：１）中、
０℃（１２１１Ｎｉ１０．３５ｍ）で記録された。

ケミカルシフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ　）内
部標準のダウンフィールドにｐｐｍで与えられている。

マス・スペクトル・データと一致して、３１個の炭素原
子は以下のケミカルシフトで認められている： １６．３、ｉ　６．７．１８．８．２４．１．２６．１
．３１．３（２ｘ）、３３．５．３６２．４１．８．４
６．６．７２．５．７４．５．７５．２、ｌ　１４．１
．１１５．４．１２１．３．１２’４．８．１２５．０
（２Ｘ）、１２５．２．１２６．６．１２７３．１２９
．４．１３３．９．１３４．０．１３７．１．１３．９
．ｏ、１４１．２．１４４．６１．１７、．３．５ＰＰ
”。

３３．５および７２．５　ｐｐｍのピークは、゛燐酸基
の３１１）　とのカップリングによって二重線として出
現している。

スペクトルは第２図のように測定された。

スペクトルは、Ｊ　００　ＭＨｚ　ｚ　ＣＤ３０　Ｄ　
／ＣＤα３（約１：１）中θ℃（約４１ｎｇ１０．３５
ｍ６）で記録された。ケミカルシフトは内部テトラメチ
ルシランをゼロｐｐｍとした相対値ｐｐｍで示されてい
る。

薄層クロマトグラフィーデータ ーフォトマンＫＣ，８Ｆ逆相平板 ９：１メタノール−０，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ
６，ＯＲｆ　＝　０．５９ −視覚化の方法 １）短紫外線光下の照明 ２）燐酸エステルにだいするハーネ（Ｈａｎｅ’ｓ）試
薬（モリブデン酸アンモニウム− Ｈｃｅｏ＊　）噴霧 マススペクールの結果は、抗生物質オキシディフィシジ
ンの分子式をＣ，、１１，，０７Ｐ　（分子量５６０）
と確定した。トリス（トリメチルシリル）−オキシディ
フィシジンの分子イオンからＨ，ＰＯ４・２　ＴＭＳ　
が容易に消失することは燐原子が、燐酸モノエステルと
して存在することを示唆する。このことは、ハーネ試薬
試験（薄層クロマトグラフィー）陽性および上記Ｃ段階
に示したアルカリ性フォスファターゼによりオキシディ
フィシジンが容易に失活することで支持される。ＮＭＲ
デークは、オキシディフィシジンの構造が燐酸に加えて
以下のものを含むことを示唆する。

−８つのオレフィン結合、その中２つは末端のメチレン −１つのエステル寸たはラクトン機能 −１つの水酸基および −１つの環

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２において得られたディフィシジンの’
Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２０％ＣＤ３０Ｄ／ＣＤＣｅ３
中、２２℃、３００　ＭＨｚ）である。 第２図は実施例６において得られたオキシディフィシジ
ンの”ＩＩ−ＮＭＩζスペクトル〔ＣＤ３０Ｄ／ＣＤｃ
７！３（約１＝１）中、０℃、３００　ＭＨｚ　）であ
る。 出願人　：　メルク　エンド　カムパニーインコーポレ
ーテッド ｐ続補正書 昭和５９年８月１３日 ４、￥訂庁長官志賀　学殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１２００４５号 ２、発明の名称 ディ、イ、、７および揃鷲１１にＭＷＷＢ２補正をする
者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 （１）明細書第７０頁第２行目の ｒ２００ｍＣ１および２１０ｍｌ１ｌ」をｒ２００ｍ６
．２００ｍｆｆ、および２１０ｍＩ！Ｊと訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １９式 （式中、ＲａおよびＲｂが水素；アルカリ金属およびア
   ルカリ土類金属陽イオン：アンモニウム；および置換ア
   ンモニウムからなる群より独立的に選択された置換基で
   あり、まだＲ１は水素または水酸基である）を有する化
   合物。 ２、Ｒ’が水素である特許請求の範囲第１項に記載の化
   合物ディフィシジン。 ３、Ｉｔ’が水酸基である！［８許請求の範囲第１項に
   記載の化合物オキシディフィシジン。 ４、水性栄養培地中、制御されたむ気条件下におけるバ
   チルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ目ｉｓ
   　）　ＡＴＣＣ３９３２０の培養を包含する特許請求の
   範囲第１項に記載の化合物の製造方法。 ５、水性栄養培地中、制御された好気条件下におけるバ
   チリス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
   ｓ　）　ＡＴＣＣ３９３７４の培養を包含する特許請求
   の範囲第１項に記載の化合物の製造方法。 ６、特許請求の範囲第１項記載の化合物の有効抗菌量と
   、薬学的に許容される担体とを含んでいる細菌増殖ＰＪ
   ｉＬＬ用の薬学的組成。 ７、特許請求の範囲第１項記載の化合物の有効抗菌量を
   静脈内、筋肉内、もしくは皮下に投与することからなる
   哺乳動物における細菌感染症の治療方法９． ８、下記の化学的および物理学的／ｌ、、ｌｌ性をイｊ
   する化合物ディフィシジンニ ー水、メタノールおよびエタノールの如き低級アルコー
   ルに可溶； 一爪量濃度０．１％の水溶液のｐＨ６，９；２３５　ｎ
   ｍ　８６６ ２６３　ｎｍ　３１６ ２７３　ｎｍ　４１５ ２８３　ｎｍ　３２８ マススペクトルデータ 高分解能質量測定により、トリメチルシリル化の際、試
   料は、分子式ｃ３．　■１４．＋　Ｏａ　Ｐ　：分子量
   ５４４（ジーＴＭＳ誘導体の言１算値、ｍ／Ｚ６８８．
   ３７４４）に対応するジーＴ十 ＭＳ誘導体（Ｍ　−ＴＭＳ、）として、ｍ　／　Ｚ　６
   ８８．３７４１の位置に分子イオンを示し、陰イオン高
   速原子雨季分析の結果は、その分子量算定（観察（Ｍ　
   −Ｈ）　’−１ｍ　／　Ｚ　５４３　）をｆ１１′証し
   た、’ＩＩＮＭＩζスペクトル スペクトルは第１図に示され、スペクトルは２０　％　
   ＣＤ３０Ｄ／ＣＤＣ４，中、２２℃（約５ｍ７　／　０
   ．３５　ｍｅ　）　３００　ＭＩＩｚ　で記録されてお
   υ、ケミカルシフトは内部テトラメチルシランをゼロｐ
   ｐｍとした相対値ｐｐｍで示されている、 ”ＣＮＭＩ七ケミカルシフト スペクトルは、２０チＣＤ３ｏＤ／ｃＤα３　中、５℃
   で記録され、ケミカルシフトは内部テトラメチルシラン
   （’Ｉ’ＭＳ）標準値のダウンフィールドにｐｐｍで表
   示されていてＨＲＭＳデータと一致して、３１個の炭素
   原子は、以下のケミカルシフトで認められだ：１６．８
   ．１８．７．２０．０．２３．２．２４．９．３０．７
   （２Ｘ）、３２，７．３５．９．３９．０゜３９．５．
   ４１．５．７１．７．７４．２．１１１．７．１１５．
   ４、１２０．７、　Ｌ２３．６、１２４．２．１２５．
   ０、１２６．１、１２７．０、１２７．２．１２９．７
   、１３３．２、１３３．７、１３４．６．１３９．１、
   １４１．１、１４６．２、１７２．７ＰＰｍ。 ９、　下記の化学的および物理学的特性を示す化合物オ
   キシディフィシジン： ２３５ｎｍ　７５０ ２６６ｎｍ（ｓｂ）　３０４ ２７５ｎｍ　３７６ ２８４ｎｍ（ｓｈ）　３０７ （１■）から（Ｖ）への凍結乾燥の間に、オキシディフ
   ィシジンの１０−１５％の分解が生じていると思われる
   証拠がちシ、凍結乾燥した（Ｖ）の重量および（１ｖ）
   のＵＶ分析に基くと、Ａｉｃｅ、（２７５ｎｍ）　−４
   ３８が算出される、 イオン衝撃マス・スペクトル（Ｅｌ− ＭＳ）は、高分解能質量測定によると、Ｍ　−Ｈ３ＰＯ
   ４イオンを分子式ｃ３．　Ｉ（４２０３（４６２，３１
   ３４と計算）に対応するｍ／ｚ４６２、３０９５位に示
   し、高質量域における他の有意なイオンは、ｍ／ｚ４４
   ４．３８１および３４９に出現しており、トリメチルシ
   リル化の際は試別は分子式Ｃ３１１４４５０７Ｐ　（分
   子量５（３０）　ｌ’リーＴＭＳ誘導体での算定値ｍ　
   ／　ｚ　７７６．４０８９　）に対応するトリーＴＭＳ
   誘導体（Ｍ　−ＴＭＳ３　）　として、ｍ　／　Ｚ　７
   ７６．４１００位に分子イオンを示し、尼ノーＴＭＳ誘
   導体としてｍ　／　ｚ　４６２．３８１および３４９に
   相当する適切なＥｌ−ＭＳを確証するＡ包の有意なイオ
   ンおよびその対応する正確な質量値および分子式は以下
   の通りである： 実測値　割算値　分子式 ５３４．３５２８　５３４．：３５２９　Ｃ３１１Ｌ１
   ２０３・ＴＭＳ＋４５３．２８８１　４５３．２８２５
   　Ｃｚ５Ｈ３３０３・ＴＭＳ。 ４２１．２９９８　４２１．２９２７　Ｃ２５Ｈ３：＋
   Ｏ・’ｒＭｓ　。 ２９９．０６（ｉ９　２９９．０７２０　ｎ３ｐｏ４−
   ’ｒＭｓＪ−ｃｎ３＊ＴＭＳ＝Ｓ　１ｃ３１１Ｂ １３ｃ　ＮＭＲケミカルシフト スペクトルは、ＣＤ３０Ｄ／ＣＤ偽（１：１）中、０℃
   （１２ｍｇ／　０．３５　ｍｅ　）で記録され、ケミカ
   ルシフトは、内部テトラメチルシラン（Ｔ　Ｍ　Ｓ　）
   　標準のダウンフィールドにｐｐｍで与えられていて、
   マス・スペクトル・データと一致して３ｉａの炭素原子
   は以−トのケミカルシフトで認められている：１６．３
   ．１６．７．１８．８．２４．１．２　Ｇ、１．３１．
   ３（２ｘ　）、３３．５．３６．２．４１．８．４６．
   ６．７２．５．７４．５．７５．２．１１４．１．１１
   ５．４．１２１．３．１２４．８．１２５．０（２ｘ）
   、１２５．２．１２６．６．１２７．３．１２９．４．
   １３３．９．１３４．０．１３７．１．１３９．０、１
   ４１．２、１４４．６、１７３．５ｐｐ”。 ３３．５および７２．５　ｐｐｍのピークは、燐酸基の
   ３１ｐ　とのカップリングによって二重線として出現し
   ている、 ”ＩＩＮＭＲスペクトル スペクトルは第２園に示され、スペクトルは、３００　
   ＭＨｚ　、ＣＤ３０Ｄ／ＣＤα３（約１＝１）中、０℃
   （約４　’ＩＱ　／　０．３５１ｎｌ　）で記録され、
   ケミカルレフトは、内部テトラメチルシランをゼロｐｐ
   ｌＴ＋とした相対値ｐｐｍで示されている。