JPH0460474B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0460474B2 JPH0460474B2 JP59120045A JP12004584A JPH0460474B2 JP H0460474 B2 JPH0460474 B2 JP H0460474B2 JP 59120045 A JP59120045 A JP 59120045A JP 12004584 A JP12004584 A JP 12004584A JP H0460474 B2 JPH0460474 B2 JP H0460474B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- methanol
- liters
- water
- resin
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 20
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 6
- -1 alkaline earth metal cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 105
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 47
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 46
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 46
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 41
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 23
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 23
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 8
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical class C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- ZXWHANCSQZVZCM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;methanol Chemical compound OC.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O ZXWHANCSQZVZCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 4
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 4
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 4
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 4
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 108010037973 proticine Proteins 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241001453268 Comamonas terrigena Species 0.000 description 3
- ZUWUQYGHRURWCL-UHFFFAOYSA-N Difficidin Natural products CC1CC=CC=CC=CCCCC(OP(O)(O)=O)C(C)=CC=CCC(CCC(C)=CC=C)OC(=O)CC1=C ZUWUQYGHRURWCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- ZUWUQYGHRURWCL-XUIVTPDHSA-N [(4e,6e,12z,14z,16e)-7,19-dimethyl-2-[(3e)-3-methylhexa-3,5-dienyl]-20-methylidene-22-oxo-1-oxacyclodocosa-4,6,12,14,16-pentaen-8-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CC1C\C=C\C=C/C=C\CCCC(OP(O)(O)=O)\C(C)=C\C=C\CC(CC\C(C)=C\C=C)OC(=O)CC1=C ZUWUQYGHRURWCL-XUIVTPDHSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000297434 Stenotarsus subtilis Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 2
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical compound COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000006227 trimethylsilylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000293679 Boraria media Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000178041 Ceropegia media Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000723346 Cinnamomum camphora Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 description 1
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 1
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 1
- GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L cobalt chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Co+2] GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000002038 ethyl acetate fraction Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 208000027096 gram-negative bacterial infections Diseases 0.000 description 1
- 208000027136 gram-positive bacterial infections Diseases 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000010699 lard oil Substances 0.000 description 1
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
- C07F9/65525—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a seven-(or more) membered ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/08—Oxygen as only ring hetero atoms containing a hetero ring of at least seven ring members, e.g. zearalenone, macrolide aglycons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ここで一般に“デイフイシジン”
（difficidin）と呼ばれる新規抗菌化合物およびそ
の誘導化合物、および該化合物を製造、単離およ
び精製する工程に関するものである。ここで用い
られているように、新造名称である“デイフイシ
ジン”は、下記構造式の化合物を示す（式中、
R1は水素であり、Ra及びRbは下記に列挙した意
味を有し、各種のその塩を与える）。それに対応
して、“オキシデイフイシジン”の名称は、ここ
で用いられるように、R1が水酸基でRaおよびRb
が指示された意味を有する下記構造式の化合物
を意味する。この新規抗菌性化合物は、メリーラ
ンド州、ロツクビルにあるブタペスト条約第２条
（）の国際寄記当局である米国標準菌株保存施
設（American Type Culfure Collection）に寄
託され各々ATCC39374および39320と指定された
バチリス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
MB3575およびMB4488の微生物培養により得ら
れる。 本発明の新規抗菌性化合物デイフイシジンおよ
び誘導体化合物は好気性および嫌気性微生物に対
して抗菌活性を有する。これらは、グラム陽性お
よびグラム陰性細菌感染の治療に、非経口的に用
いることができる。 プロチシン（proticin）は、燐を含む強度に不
飽和な無定形化合物で、広い抗菌スペクトルを有
し、特にグラム陰性感菌性に有効と記載されてい
る既知の抗菌性化合物である。この物質は、バチ
ルス・リケンホルミス（Bacillus
licheniformis）の形として同定された菌株の発
酵により生産されたと言われる。その製造、特
性、および抗菌活性についてのより詳細な記載
は、以下の参考文献中に見出し得る：(1)プレフエ
ピー（Prave，P.）ほかアンチビオツクス誌
（J.Antibiotics）25(1)：第１−３頁、1972年；(2)
フエルテシー エル（Vertesy，L.）、アンチビ
オチツクス誌（J.Antibiot）25(1)：第４−10頁、
1972年；(3)エスマン ジー（Nessmann、G.）ほ
か、ナツールビツセンシヤツト
（Naturwissenschaften）59(2)：第81−82頁、
1972年；(4)ドイツ特許公開公報第2035812号フエ
ルテシー エル（Vertesy，Ｌ）ほか“バチリス
リヘニホルミスからのプロチシンの製造”
“（Proticin from Bacillus lichenirormis）”フ
アルプベルケ ヘキスト社、1970年７月18日；お
よび(5)英国特許第1350271号、バチルス リヘニ
ホルミスの醗酵によるプロチシンの製造
（Proticin Produced by Bacillus
licheniformis fermentation）フアルプベルケ
ヘキスト社（Farbwerke Hoechst A.G.）、
1974年４月18日（ケミカルアブストラクト81：
48531y、p30b、1974年参照）。 しかしながら、特異抗生物質化合物プロチシン
について繰返し参照しても、上述の参考文献では
単一化合物を特徴づけることは出来ず、またそこ
に示されているスペクトル・データは数種の可能
な化合物に矛盾しないものである。上述のフエル
テシーの文献(2)は、二重結合のただ一つにのみ一
つのメチル基が存在することを記載しているのに
対し、本発明の化合物は、そのようなメチル基を
２個有しているので、本発明のR1が水酸基であ
る新規抗菌性化合物（オキシデイフイシジン）は
上記文献中に記載されたいわゆるプロチジンと
は、化学的に異なるものである。他方、R1が水
素である本発明での新規抗菌性化合物（デイフイ
シジン）は、それが異なる分子量を有しているこ
とから、文献中の化合物とは容易に区別される。 デイフイシジンは化学的には、構造式に図示
されるように、不斉中心をC4、C5、C15、およ
びC21に有する22員大環状ポリエンラクトン燐酸
エステルである。 見れば判るように、構造式中には２つの主要
化合物がある。一つの化合物は、R1が水素のも
のであつて、既に指摘したように、以後は“デイ
フイシジン”と記す。もう一方の化合物はR1が
水酸基のものであつて、以後は“オキシデイフイ
シジンと記す。 本発明に従つて、以下の構造式を有する新規抗
菌性化合物デイフイシジンおよびその誘導体が与
えられる： 式中、RaおよびRbは、水素；アルカリ金属お
よびアルカリ土類金属陽イオン；アンモニウム；
および置換アンモニウムからなる群より独立的に
選択された置換基であり、R1は水素または水酸
基である。 アンモニウム陽イオンは、既知の方式によつ
て、好ましくは、例えば低級アルキル基により置
換され得る。 デイフイシジンが製造され、さらにモノおよび
ジ−カリウム塩の平衡を変える燐酸カリウム塩と
して用いられる。この塩の形は、製造が容易であ
ること、および低PH下で存在する酸型（Ra＝Rb
＝Ｈ）が恐らく不安定なことから採用されたもの
である。 デイフイシジンおよびその誘導体は、メリーラ
ンド州、ロツクビルの米国標準菌株保存施設
（American Type Culfure Collection）に寄託
されたバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）MB3575およびMB4488の微生物培養に
より製造することができる。これらはそこから
各々受託番号ATCC39374および39320で無制限に
入手し得る。 該バチルスあるいはその変種および変異株は、
微生物培養ら一般的に用いられる栄養培地あるい
は栄養溶液を用いた寒天スラント試験管またはエ
ルレンマイヤー・フラスコあるいはフアーメンタ
ー中の深部培養条件下において、よく知られた微
生物手法に従つて培養することができる。 本発明においては、デイフイシジンおよびその
誘導体は、微生物、例えばバチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCC39320を好気条件下、
約28℃の温度で培養中に生産される。栄養培地の
組成は、広範囲に変化させることができる。必須
の同化可能な栄養成分は、炭素源、窒素源、燐、
硫黄、マグネシウム、カルシウム、および塩素を
含む無機物源である。培養は中性PH条件好ましく
は、約6.0から7.0の条件が最も生産的である。 典型的な炭素源には、グルコース、デキストリ
ン、澱粉、グリセロールなどを含む。典型的な窒
素源は植物粉（大豆、綿実、トウモロコシなど）
肉粉または動物性ペプトン、醸造可溶物
（distillers solubles）、カザミノ酸、酵母細胞、
種々の加水分解物（カゼイン 酵母、大豆、な
ど）、酵母核酸、およびアミノ酸を含む。 ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネ
シウム、およびカルシウムの塩酸、硝酸、硫酸、
炭酸および燐酸塩の如き無機塩類は必須無機元素
の供給源を提供する。栄養培地は鉄、銅、マンガ
ン、亜鉛、及びコバルトのような種々の微量元素
をも含む。 培養中に過剰な発泡が生じたときは、発酵の前
または途中で、発酵培地中に、植物油、ラード
油、およびポリプロピレングリコールのような消
泡剤を添加することができる。デイフイシジンの
最大収量は、約20ないし120時間以内に到達され、
培養に依存している。発酵の接種ダネは、懸濁
液、スラント、凍結細胞、または凍結乾燥物から
供給され得る。 上述の通常培養法に加えて、メソド インマイ
クロバイオロジー（Methods in Microbiology）
第２巻〔アカデツク出版（Academic Press）ロ
ンドン−ニユーヨーク〕、1970年、第259−328頁
に記載されているような連続法を用いることもで
きる。そのような糸では、菌を長期間自然変異あ
るいは他の崩壊が顕著になることなく定常状態を
保つことができる。 デイフイシジンおよびその誘導体の生産のため
に、本発明がバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）ATCC39374あるいは39320を使用する
ことのみに限定されるのではないことが理解され
るべきである。菌がデイフイシジンおよびその誘
導体を生産している限りは、該微生物から生じた
自然または人工の変異株またはバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilisATCC39374または
29320の他の変種の使用を包含することが特に望
まれ、また意図されている。バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）変異株の人工的な生産
は、Ｘ−線または外線（UV）照射の如き通常の
操作、または、ナイトロジエン・マスタード、ニ
トロソグアニジン、樟脳などのような化学変異剤
の利用、または組換えDNA工学手法などにより
達成することができる。 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39320の形態学的および生理学的特性 ATCC39320の形態学的および生理学的性質は
以下のようである： 形態：グラム陽性、空胞のない栄養桿菌で末端は
円形；平均の大きさ0.9×2.3〜2.6μ；単細
胞体。桿菌は運動性あり。好気条件下で胞
子形成。胞子は0.5×1.0μ（平均の大きさ）、
卵形ないし円筒形、多く中央部に形成、胞
子のうは膨まず。 集落の外観： 平たん、円状で外縁は不規則、表面は滑ら
かでない。集落がなくなるに従つて外縁は
不透明になる。肉汁表面で光沢なく、しわ
のある全面薄膜形成、トリプチカーゼ大豆
寒天上で色素生産なし。28℃、37℃で生
育、60℃で生育せず。 陽性反応： カタラーゼ、フオゲス−プロスカウエル
（Voges−Proskauer）、ゼラチン、硝酸塩
還元。クエン酸の利用、グルコース、アラ
ビノース、マンニトール、キシロース、ソ
ルビトール、およびスクロースからの酸生
成、澱粉加水分解。 陰性反応： ウレアーゼ、インドール、プロピオン酸の
利用。アルギニン・ジヒドロラーゼ、ラム
ノースおよびメリオビースからの酸生成、
嫌気性寒天中（穿刺または嫌気ジヤー中で
の平板培養）で非生育、嫌気条件下肉汁ま
たは硝酸肉汁中で非生育。 ベルゲイ（Bergey）のマニユアル・オブデイ
ターミナテイプ バクテリオロジー（Manual of
Deferminative Bacteriology）、第８版、〔ウイ
リアムス・アンド・ウイルキンス（Williams＆
Wilkins）〕、1974年、およびゴルデン・アール・
イー（Gordon，R.E.）、ハイネム・ダブリユー・
シー（Haynes，W.C.）およびパンク・シー・エ
イチ（Pang，C.H.）（1973年）、ザ・ギナス・バ
チルス（The Genus Bacillus）、アグリカルチ
ヤーモノグラフ（Agriculture Monograph）No.
427、ユー・エス・デパートメント・オブ・アグ
リカルチヤー（U.S.Department of
Agriculture）、〔ワシントン・デイー・シー
（Washington，D.C.）〕中の培養記載との比較の
結果は、MB4488／ATCC34320が既知種バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）の株であ
ることを示す。 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39374の形態学的および生理学的特性 ATCC39374の形態学的および生理学的性質は、
以下に述べる微生物の集落の外観に関する点を除
くと上に示したATCC39320のものと同じであ
る： 集落の外観：24時間で盛り上つた円形、ムコイ
ド。集落が古くなるに従つて外縁が乾燥不透明
および不規則になる。中央ムコイド領域は乾燥
し続け、不透明化およびしわがよる。肉汁表面
上で光沢なく、しわのある全面薄膜形成。トリ
プチカーゼ大豆寒天上で色素生成なし。28℃、
37℃で生育、60℃で非生育。 デイフイシジンおよびその誘導体の生産 Ａ 抗菌性化合物デイフイシジンおよびその誘導
体、またはそれらの塩の一つの、しかしその中
ではオキシデイフイシジンが大きな割合で生産
されるような、製造方法は、デイフイシジンお
よびその誘導体を形成し、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）ATCC39320株に属す
る微生物を炭素源、窒素源、栄養塩、および微
量元素を含む栄養水溶液により、20゜乃至40℃
の範囲の温度で24乃至120時間、栄養溶液が可
成りの量のデイフイシジンおよびその誘導体を
含むようになるまで培養すること、その後、培
養液からデイフイシジンおよびその誘導体を分
離し、必要なら薬学的に許容される塩基を用い
て塩に変換することを含む。 培養中に、栄養培地のPH値は、中性からやや
酸性に変る；一般に緩衝液の添加は不要である
が、予防策として用いることも出来る。望まし
い収量が２〜４日後に得られるので、培養をこ
の期間後に適当に停止する；その時栄養液は多
量のオキシデイフイシジンを含んでいる。
ATCC39320の培養はデイフイシジンに比して
より多くのオキシデイフイシジンを生産する
が、全体の力価は以下に述べるATCC39374培
養より低いことが認められた。 Ｂ 抗菌性化合物デイフイシジンおよびその誘導
体、またはそれらの薬学的に許容される塩基と
の塩の一つ、しかしその中ではデイフイシジン
がより大きな割合で生産されるもう一つの、そ
してより好ましい製造方法は、デイフイシジン
およびその誘導体を形成し、バチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）ATCC39374株に属
する微生物を、炭素源、窒素源、栄養塩および
特にコバルトを含有する微量元素を含む栄養水
溶液により、栄養養液が可成りの量のデイフイ
シジンおよびその誘導体を含むまで20゜乃至40
℃の範囲で24乃至120時間培養し、その後培養
液からデイフイシジンおよびその誘導体を分離
し必要なら薬学上許容される塩基との塩に変換
することを含む。 既に指摘したように、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCC39374株を用いる方
法が同様に好ましい。何故なら、オキシデイフイ
シジンより大きな割合のデイフイシジンを生成
し、上記“Ａ”に述べた方法で用いたバチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）ATCC39320微
生物より高力価を生成することが認められたから
である。 コバルトの添加、例えば0.1ｇ／、は該微生
物によるデイフイシジンの優先的な生産を起こさ
せ、生産されるオキシデイフイシジン量に対し重
量比で３：１の大きさにまでなることが認められ
た。種々の水溶性のコバルト塩を用いることがで
できる。例えば、好んで用いられるのは塩化コバ
ルト６水和物である。 同様に、コバルト存在下で燐酸塩を例えば
100ppm添加すると、オキシデイフイシジンの生
産に比し、バチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）培養によるデイフイシジンの優先的な
生産が起こることが認められた。他方、オキシデ
イフイシジンの優先的な生産はマンガン、例えば
塩化マンガン４水和物を例えば0.025ｇ／添加
することにより行なわれる。しかし、これらの知
見は予備的な性格のものであり、望まれるかも知
れない、デイフイシジンかまたはオキシデイフイ
シジンの生産に影響を及ぼす目的で培地に有利な
操作を加える可能性があることを示すものとして
のみ含まれているものである。 デイフイシジンおよびその誘導体の分離 デイフイシジンおよびその誘導体を分離するた
めに菌の培養液を先ず遠心分離により清澄にす
る。しかし、デイフイシジンおよびその誘導体の
可成りの部分は、細胞部分に残留することにな
る。この粗製品をXAD−２およびHP−20樹脂の
ような有機系ポリマー樹脂およびリクロプレプ
（LiChroprep）RP−18樹脂およびフオトマン
（Whatman）のODS樹脂（共にC18H37残基が化
学的に結合した外層をもつた珪酸である）のよう
な珪酸系ポリマー樹脂のような適当な吸着剤を用
いぞクロマトグラフイーにより精製する。デイフ
イシジンおよびその誘導体は、吸着剤から適当な
極性溶媒またはその混合物により溶出され、次い
で、デイフイシジンおよびその誘導体の水性抽出
が行なわれる。デイフイシジンおよびオキシデイ
フイシジンは次に高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）により相互に、そして、構造的な関連
化合物から分離される。 デイフイシジンおよびその誘導体の有効抗菌量
は、哺乳動物で５mg／Kgから20mg／Kgの程度と考
えられる。デイフイシジンおよびその誘導体は、
グラム陰性およびグラム陽性感染症の治療に有効
であり、静脈内、筋肉内、または皮下に単独ある
いは製剤担体との組み合せで投与し得る。最終的
な投与経路および量は臨床的により決定され、患
者の独自の条件に基くべきである。 デイフイシジンおよびその誘導体と、適当な製
剤担体との組み合わせは、薬剤士の領域でよく知
られている方法によりなされる。例えば、皮下
（S.C.）投与の目的では、デイフイシジンおよび
その誘導体の溶液は一般に例えば無菌水溶液また
はアルコール溶液を用いる。この溶液は、必要な
ら適当に緩衝化されるべきであり、稀釈液は先
ず、食塩またはグルコースで等張にしておくこと
ができる。これらの水溶液およびアルコール溶液
は静脈内（i.v.）注射としても適当である。 以下の例は、バチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）ATCC39320およびATCC39374から
のデイフイシジンおよびオキシデイフイシジンの
製造および単離を説明するものである。 実施例 １ ATCC39320を用いたデイフイシジンおよびオ
キシデイフイシジンの製造 １ “Ａ”工程 ATCC39320（MB4488）培養、凍結乾燥管は培
養の脱脂乳懸濁液0.15mlを含む1.00mlアンプル
中に凍結乾燥した状態で保持されている。 ２ “Ｂ”工程 容器：フラスコ当り50ml培地を含む邪魔板３個
つき250ml容エルレンマイヤーフラスコ、 培地： 重量／体積 デキストロース １ｇ／ 可溶性澱粉 10ｇ／ 牛肉エキス ３ｇ／ アルダミン（Ardamine）PH ５ｇ／ NZ−アミンＥ型 ５ｇ／ MgSO47H2O 0.05ｇ／ 1.34M燐酸緩衝液 0.02％体積／体積 CaCO3（PHを7.0−7.2に調整後） 0.05％ 燐酸緩衝液 KH2PO4 91ｇ／ Na2HPO4 95ｇ／ 接種材料： 凍結乾燥管（Lyo tube）１本の内容物を各
“Ｂ”フラスコ中へ インキユベーシヨン： 220RPMで回転する約５cm（2″）回転盤から
なる回転振盪機上で28℃24時間 無菌性： 平板塗抹およびグラム染色 ３ “Ｃ”工程 容器：500ml培地を含む邪魔板３個つき２リツ
トル容エルレンマイヤーフラスコ、 接地：“Ｂ”工程と同じ 接種材料： “Ｂ”工程からの10ml インキユベーシヨン： “Ｂ”工程と同じ 無菌性： “Ｂ”工程と同じ ４ “Ｅ”工程 容器：750リツトル容ステンレス スチール
フアーメンター 培地： デキストリン 40ｇ／ ソルラツク（Solulac） ７ｇ／ アルダミン（Ardamine）YEP ５ｇ／ 塩化コバルト 50mg／ ポリグリコール2000 １ml／ 前−殺菌 PH 7.3 殺菌：121℃ 20分 接種材料： “Ｃ”工程１リツトル フアーメンター容積A.I.：501リツトル 温度：28℃ 通気：約141リツトル／分（5CFM）（30時間）
次に約170リツトル／分（6CFM） 撹拌：130RPM（12時間）次に110RPM 圧：約0.91Kg／cm2（13PSI） 消泡剤： ポリグリコール2000 循環時間： 92時間 無菌性： 顕微鏡検定および28℃および37℃で平板塗抹 生理： 【表】 実施例 ２ デイフイシジンおよびオキシデイフイシジンの
単離および精製 Ａ 抗菌複合体の予備的単離 実施例１で記載された発酵バツチからの約420
リツトルの全培養液（PH5.9）は、92時間目に収
穫した。培養液をシヤープレス遠心機を用いて清
澄化した。416リツトルの清澄培養液を500mlの
4N塩酸によりPH5.0に合せ、次いで、４リツト
ル／分で38リツトルのロームアンドハース社のア
ンバーライトXAD−２樹脂に吸着させた。樹脂
を４リツトル／分で120リツトルの冷たい蒸留脱
イオン水により洗浄した。抗菌複合体は、160リ
ツトルの酢酸エチル４リツトル／分により樹脂か
ら溶出した。溶出液の下部水層は除去廃棄した。
溶出液を無水硫酸ナトリウム上で30分間撹拌し、
乾燥した。乾燥剤を過により除去し、液を真
空下で2.65リツトルに濃縮した。濃縮液に１リツ
トルの水を加え、緩やかに撹拌しつつ130mlの
2.5N水酸化ナトリウムにより下部水層のPHを8.5
に調整した。混合物を２分間激しく撹拌した。層
を分離させた。下部水性抽出液を別容器に移し、
上部有機層を各回500mlの水と抽出の間PHを8.5に
するのに十分な2.5N水酸化ナトリウムにより２
回抽出した。３つの水性抽出液を併せ、PH6.9に
調整した。抽出液量は2.4リツトルであつた。2.1
リツトルの抽出後酢酸エチル溶液は、94ｇの総固
体を含んでいた。 デイフイシジンおよびオキシデイフイシジン
は、水性抽出物中、および水抽出後酢酸エチル区
分の両方に種々の量で存在した。下記Ｂ工程は、
水抽出後酢酸エチルからのデイフイシジンおよび
オキシデイフイシジンの単離を述べる。下記Ｃ工
程は水性抽出液からのデイフイシジンの単離を述
べる。Ｄ工程は別の単離法および対応する分析評
価を述べる。 Ｂ デイフイシジンおよびオキシデイフイシジン
の単離 上記Ａ工程からの2.1リツトル水抽出後酢酸エ
チル分画の0.4ml試料を油状残渣まで蒸発させ、
0.7mlの７：３メタノール−0.01M燐酸カリウム
PH7.0中に取つた。その溶液0.4mlを同一溶媒中、
28℃でデユポン・ゾルバツクス（Dupont
Zorbax）ODSカラム〔内径4.6mm（ID）×25cm〕、
10ミクロン、上でクロマトグラフにかけた。流速
は１ml／分で、カラム溶出液は、10mm光路長のフ
ローセル（（flow cell）およびハネウエル・エレ
クトリツク（Honeywell Electronik）の195記録
機を備えたラボラトリー・データー・コントロー
ル・スペクトラ・モニター（Laboratory Data
Control Spectra Monitor）紫外線検出機を用
いて275nmでモニターした。溶出液を0.5ml分画
で集め、ビブリオ パーコラスト（Vibrio
percolaus）MB1272に対する寒天平板拡散法で
検定した。表は生物検定の結果を要約したもの
である。 表のデータは、水抽出後酢酸エチル中に２つ
の異なつた抗菌物質の存在を示す。11および12分
画の活性は抗菌性オキシデイフイシジンによるも
のである。61−65分画の活性は抗菌性デイフイシ
ジンによるものである。 【表】 Ｃ 抗菌性デイフイシジンの分離―方法１ 上記Ａ工程からの併合水性混合抽出液2.4リツ
トル（総固体66ｇ）は溶け込んでいる酢酸エチル
の大部分を除くために2.1リツトルに濃縮した。
濃縮物は0.22Lの0.1M燐酸カリウムPH7.0で稀釈
し、50ml／分で１リツトルのミツビシ・ダイアイ
オン（Mitubishi Diaion）HP−20樹脂上に吸着
させた。樹脂を３リツトルの蒸留水、３リツトル
の１：１メタノール−0.1M燐酸カリウムPH7.0、
３リツトルの65：35メタノール−燐酸緩衝液、お
よび３リツトルの９：１メタノール−蒸留水で連
続的に洗浄した。抗菌性複合体は50ml／分で、
3.9リツトルのメタノールで溶出し、1.45リツト
ルの先駆分画と2.45リツトルの濃厚分画として集
めた。先駆部分にはオキシデイフイシジンが豊富
であり、一方濃厚分画にはデイフイシジンが豊富
であつた。濃厚区分（総固体0.55ｇ）は50mlまで
濃縮し、116mlの0.1M燐酸カリウムPH7.0で稀釈
した。溶液は、イー・メルク・リクロプレツプ
（E.Merck LiChroprep）RP−18、25−40ミクロ
ン樹脂の74mlのカラムに５ml／分でチヤージし
た。カラムは、メタノール濃度を漸増させるメタ
ノール−水混合物で連続的に展開した（表）。
流速は５ml／分、分画は各7.5mlであつた。 【表】 分画の高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
分析および生物検定に基き、抗菌物質が分画109
−121に溶出し、この分画は表のピーク２（デイ
フイシジン成分）と同じ高速液体クロマトグラフ
イー保持時間を示した。分画109−121を粗デイフ
イシジン成分濃厚区分として併合した。 濃厚区分を8.2mlにまで濃縮し、0.9mlの1Mク
エン酸ナトリウムPH5.4および6.1mlのメタノール
で稀釈した。この溶液を４：６メタノール−
0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.5中イー・メルク・
リクロプレツプ（E.Merck LiChroprep）RP−
18樹脂25−40ミクロンの177mlのカラム上に２
ml／分で吸着させた。カラムを同一流速で30mlの
４：６メタノール−クエン酸緩衝液で洗浄した。
カラムを次に75：25メタノール−クエン酸（分画
１−35）および８：２メタノール−クエン酸（分
画36−70）で展開した。全分画は２mlであつた。
薄クロマトグラフイー（TLC）および紫外線
（UV）分析に基き、分画42−65を併せ、６mlに
濃縮した。得られた白色懸濁液を、５mlの0.1M
燐酸カルシウムPH7.2および不溶物質が再溶解す
るのに充分な量のメタノール（７ml）で稀釈し
た。その溶液を以下の方式で脱塩した。この溶液
を３：７メタノール−0.1M燐酸カリウムPH7.0中
の８mlのリクロプレツプ（LiChroprep）RP−18
樹脂上に吸着させた。この樹脂を24mlの３：７メ
タノール燐酸緩衝液および24mlの３：７メタノー
ル−蒸留水で連続的に洗浄した。デイフイシジン
成分は30mlの９：１メタノール−蒸留水で溶出し
た。溶出液は81：19メタノール−0.1Mクエン酸
ナトリウムPH5.5中室温下デユポン・ゾルバツク
ス（Dupont Zorbax）ODSカラム〔内径4.6mm
（ID）×25cm〕を用いた高速液体クロマトグラフ
イーにより分析した。流速は２ml／分であつた。
溶出液の275nmにおける紫外線吸収の約94％はデ
イフイシジン成分（保持時間379秒）に帰因する
ものであつた。保持時間418秒の不純物は、
275nm吸収の残りの６％に対応した。その不純物
はリクロプレツプRP−18樹脂上で注意深くクロ
マトグラフイーを行なうことにより除去した。次
に上記30mlの溶出液を濃縮してメタノールを除き
1Mクエン酸ナトリウムPH5.4およびメタノールで
８ml、最終溶液組成４：６メタノール−0.1Mク
エン酸ナトリウムにした。この溶液を17mlのリク
ロプレツプRP18樹脂に仕込んだ。カラムを75：
25メタノール−0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.5
（分画１−31、各２ml）、および８：２メタノール
−クエン酸（分画32−72、各２ml）で、２ml／分
で連続的に溶出した。高速液体クロマトグラフイ
ー分析に基き、分画41−54を濃厚区分１として併
合した。濃厚区分のPHを稀水酸化ナトリウムで
1.5単位増大させた。外れの区分55−72は併せて
溶媒組成４：６メタノール−0.1Mクエン酸にま
で濃縮し上述のように17mlのリクロプレツプRP
−18クロマトグラフにかけた。適当な分画を濃厚
区分２として併合した。溶液のPHを1.5単位増大
させた。濃厚区分１および２を併せ濃縮してメタ
ノールを除き、0.1M燐酸カリウムでPH8.0に調整
した。得られた10mlの不透明溶液に、試料を透明
にするのに充分な量のメタノール（7.5ml）を加
えた。この溶液を８mlのリクロプレツプRP−18
樹脂に吸着させることにより脱塩した。樹脂を50
mlの３：７メタノール0.1M燐酸カリウムPH7.0お
よび30mlの３：７メタノール−蒸留水で連続的に
洗浄した。次に、樹脂を30mlの９：１メタノール
−水で溶出した。溶出液は、約21mgの実質上純粋
なデイフイシジンを含んでいた。 Ｄ 抗菌物質デイフイシジンの単離―方法２ 上述Ａ部の水抽出後酢酸エチル溶液2.1リツト
ル中の1.7リツトルを40℃で油状にまで濃縮し、
９：１メタノール−勢で915mlに稀釈した。不溶
物を遠心分離により取り除いた。澄明な遠心分離
液を、９：１メタノール−水で充填したDEAE・
セフアデツクスＡ−25（アセテート・サイクル）
600mlのカラムに20ml／分で吸着させた。この樹
脂を４リツトルの９：１メタノール−水で洗浄し
た。粗デイフイシジン成分を樹脂から９：１メタ
ノール−水中３％塩化アンモニウムで溶出し、そ
の間一連の100ml分画を集めた。450mlの濃厚区
分、分画７−10は高速液体クロマトグラフイー検
定によりデイフイシジン160mgを含んでいた。濃
厚区分を916mlの水で稀釈し、180mlのダイアイオ
ン（Diaion）HP−20樹脂に18ml／分で吸着させ
ることにより脱塩した。樹脂を600mlの水、600ml
の0.1M燐酸カリウムPH7.5および再度600mlの水
で連続的に洗浄した。メタノールによる樹脂の溶
出で１ｇの総固体を含む208mlの抗生物質濃厚区
分を与えた。試料を100mlに濃縮し、233mlの
0.05M燐酸カリウムPH７で稀釈し、190mlのリク
ロプレツプRP−18樹脂、25−40ミクロンのカラ
ム上に仕込んだ。次いで、１：１メタノール−
0.05M燐酸カリウムPH７、10ml／分で（分画１−
40）続いて50％メタノールから90％メタノール緩
衝液の直線勾配により（分画41−280）溶出した。
全分画は各10mlであつた。高速液体クロマトグラ
フイー検定およびビブリオパーコランス
（（Vibrio percolans）に対する生体外（in
vitro）寒天平板拡散検定に基き分画222−237を
まとめた。154mlの濃厚区分は115mlのデイフイシ
ジンを含んでいた。試料を170mlの0.05M燐酸カ
リウムPH７で稀釈し、95mlのフオトマン・パーテ
イシル（Whatman Partisil）M20 10／25ODS
−３カラム（内径2.2cm×25cm）、10ミクロン、上
に吸着させた。カラム10ml／分で65：35メタノー
ル−0.05M燐酸カリウムPH７（分画１−89）、70：
30メタノール−緩衝液（分画90−149）、および
75：25メタノール−緩衝液（分画150−230）で連
続的に溶出した。全分画は各５mlであつた。分画
180−220を併合し、34mlにまで蒸発させた。得ら
れたミルク状の懸濁液が透明になるのに充分な量
のメタノール（11ml）を添加した。その溶液を２
ml／分で18mlのダイアイホンHP−20樹脂上に吸
着させた。樹脂を40mlの33：７メタノール−水で
洗浄した。樹脂をメタノールで溶出し、本質的に
純粋なデイフイシジン・カリウム塩83mgを含む濃
厚区分を得た。水からその抗生物質を凍結乾燥す
ることにより、白色無定形固体を得た。それにつ
いて以下に述べる分析結果が得られた。 デイフイシジンの物理化学的特性 − 水、メタノールおよびエタノールのような低
級アルコールに可溶 − 0.1重量パーセント水溶液のPH6.9 紫外線スペクトル（メタノール中）λmax Ａ１％ １cm 235nm 866 263nm 316 273nm 415 283nm 328 マススペクトルデータ 高分解能質量測により、トリメチルシリル化の
際、試料は分子式C31H45O6P：分子量544（ジ−
TMS誘導体、ｍ／z688.3744）に対応するジ−
TMS誘導体（M+TMS2）としてｍ／z688.3741
の位置に分子イオンを示した。陰イオンFAB
〔Fast Atom Bombardment高速原子衝撃〕分析
の結果はその分子量算定（観察（Ｍ−Ｈ）-、ｍ／
z543）を確証した。1 HNMRスペクトル スペクトルは第１図のように測定された。スペ
クトルは20％CD3OD／CDCl3中22℃（約５mg／
0.35ml）300MHzで記録されており、ケミカルシ
フトは内部標準テトラメチルシランをゼロppmと
した相対値ppmで示されている。13 CNMRケミカルシフト スペクトルは、20％CD3OD／CDCl3中５℃で
記録された。ケミカルシフトは内部標準テトラメ
チルシラン（TMS）のダウンフイールドにppm
で表示されている。HRMSデータと一致して、
31個の炭素原子は以下のケミカルシフトで認めら
れた：16.8、18.7、20.0、23.2、24.9、30.7（2x）、
32.7、35.9、39.0、39.5、41.5、71.7、74.2、11.7、
115.4、120.7、123.6、124.2、125.0、126.1、
127.0、127.2、129.7、133.2、133.7、134.6、
139.1、141.1、146.2、172.7ppm。 実施例 ３ ATCC39374を用いたデイフイシジンおよびオ
キシデイフイシジンの製造 培地の調製 培地Ａは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁す
ることにより調製した。50mlのこの懸濁液を邪魔
板３個つき250mlフラスコおよび500mlを邪魔板３
個つき2000ml容フラススコに分配した。フラスコ
は綿栓し、121℃、約1.26Kg／cm2（18PSI）で30分
間オートクレーブした。 培地Ｂは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁す
ることにより調製した。PHは指示されているよう
に調製し、この培地9.5リツトルを14リツトルの
ニユー・ブランスブイツク・サイエンテイフイツ
ク（New Brunswick Scientific）のミクロフエ
ルム（Microferm）フアーメンター、MF−114
型に仕込んだ。フアーメンターを無撹拌、121℃、
約1.26Kg／cm2（18PSI）で120分間オートクレーブ
した。オートクレーブ後、培地を機械的に撹拌、
通気し、28℃に冷却した。 培地Ｃは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁
し、沸騰するまで加熱し、18×150mm試験管に12
ml分配することにより調製した。試験管を121℃、
約1.26Kg／cm2（18PSI）で20分間オートクレーブ
の後、試験管を傾斜状に置き、培地がスラントに
固化するようにした。 培養液の調製 ATCC39374培養の凍結乾燥試験管を無菌的に
培地Ａの邪魔板３個つき250ml容フラスコに接種
し、220RPM28℃で24時間インキユベートした。
このタネ培養をＣ培地のスラント12本に接種する
のに用いた。一度接種した後、スラントを96時間
28℃でインキユベートし、冷蔵した。上述のよう
に調製したスラントの一部を培地Ａの250mlフラ
スコに接種するのに用いた。フラスコは
220RPM28℃で24時間インキユベートした。この
第１段階タネフラスコの３％を培地Ａの2000mlフ
ラスコの接種に用い、これも又220RPM、28℃で
24時間インキユベートした。この第２段階タネ・
フラスコを直接フアーメンターの接種に、あるい
は第３段階のタネの接種に用いることができる。
第３段階のタネを用いる際は第２段階のタネの３
％を培地Ａのもう一つの2000mlフラスコへの接種
に用いた。第３段階のタネを28℃、220RPMで24
時間インキユベーシヨン後、そのフラスコを用い
て培地Ｂ含有フアーメンターへ接種した。 デイフイシジンおよびオキシデイフイシジンの生
産 上述のように調製し、前述の第２または第３段
階のタネ・フラスコを接種した培地Ｂを含むフア
ーメンターを28℃、300−400RPM、0.3vvm空気
下でインキユベートした。発泡制御の必要がある
ので無菌ポリグリコールＰ−2000を添加した；フ
アーメンター中のポリグリコールＰ−2000の全量
は１％（ｖ／ｖ）を越えなかつた。発酵は88時間
で終了した。フアーメンターから引き出した試料
をメタノール（全培溶液１部にメタノール２部を
加える）で抽出し、産物形成を高速液体クロマト
グラフイーにより検定した。試料の様相、２つの
発酵の平均値を表に示す。収穫したフアーメン
ターは、処理するまで４−10℃に貯蔵した。 培地Ａ： ｇ／ トリプチカ−ゼペプトン 25 スクロース 10 大豆粉 10 可溶性澱粉 10 CaCO3 10 グルコース ５ 牛肉エキス １ 麦芽エキス １ 酵母エキス １ コーンステイープリカー（Corn Steep
Liquor） 0.5 大豆油 0.1 大豆トリプチカーゼ 0.1 PH 6.8（そのまま） 培地Ｂ：ｇ／ デキストリン 40 ソルラツク（Solulac） ７ 酵母エキス ５ CoCl2−6H2O 0.05 ポリグリコールＰ−2000 ５ml／Ｌ 培地Ｃ： ｇ／ 寒 天 20 麦芽エキス 10 デキストロース ４ 酵母エキス ４ PH7.0 【表】 これらの発酵結果は生産されたデイフイシジ
ン：オキシデイフイシジンの比が約３：１である
点で異常と思われる。この比が約１：１に観察さ
れるのがより普通である。 実施例 ４ デイフイシジンの単離 上述の実施例３で記載された発酵分からの約11
リツトルの全培養液（PH6.5）を約88時間目に収
穫した。培養液PHを水酸化ナトリウム水溶液で
7.3に調整した。培養液に4.8リツトル量のイソプ
ロパノールを添加した。完全に撹拌した後、培養
液を遠心分離で清澄にした。14.4リツトルの清澄
培養液試料を100ml／分で１リツトルのドウエク
ス（Dowex）１×２（Cl-）樹脂50−100メツシユ
に吸着させた。樹脂を２リツトルの蒸留水で洗浄
し、100ml／分で９：１メタノール−水中、３％
塩化アンモニウムにより溶出した。溶出物を８本
の500ml分画に集めた。1.5リツトルの濃厚区分
（分画２−４）を３リツトルの水で稀釈し、100
ml／分でダイアイオンHP−20樹脂の１リツトル
カラム上に吸着させた。樹脂を２リツトルの３：
７メタノール−水、1.5リツトルの0.1M燐酸カリ
ウムPH７および２リツトルの水で連続的に洗浄し
た。樹脂をメタノールで溶出し、2.5ｇの29％純
度のデイフイシジンを得た。溶出液を30mlに濃縮
した。濃縮液10ml（250mlデイフイシジン）を
0.05M燐酸カリウムPH7.1で15.4mlに稀釈し、カー
ル・フイツシヤー（Karl Fsher）分析により分
析した試料中の含水量を50％にした。15.4mlの試
料を１：１メタノール−0.05M燐酸カリウムPH
7.1中100mlのセフアデツクスLH−20樹脂でクロ
マトグラフにかけた。流速は2.5ml／分であつた。
デイフイシジンは保持時間1.75カラム体積で溶出
した。200mlの濃厚区分を150mlの水で稀釈し、８
ml／分で、３：７メタノール−水で平衡化した80
mlのダイアイオンHP−20に吸着させた。樹脂を
100mlの３：７メタノール−水で洗浄し、200mlの
メタノールで溶出した。溶出液濃厚区分は80ml
で、256mgの56％純度デイフイシジンを含んでい
た。溶出液40ml量を４mlに濃縮し、0.03M燐酸カ
リウムPH７で8.2mlに稀釈し、65：35メタノール
−０，03M燐酸カリウム緩衝液で平衡化しておい
た95mlのフオトマン・パーテイシルM20 10／
25ODS−３カラム（10ミクロン）上に仕込んだ。
カラムを75：25メタノール−緩衝液で溶出し、溶
出液を一連の10ml分画に集めた。分画31から40を
併合し、30％以下のメタノールを含む溶液にまで
濃縮し、2.5ml／分で25mlのダイアイオンHP−20
樹脂上に吸着させた。樹脂を100mlの３：７メタ
ノール−水で洗浄した。メタノールでの溶出によ
り54mgのほとんど純粋なデイフイシジンを得た。
抗菌物質は分解を最小にするために−80℃でメタ
ノール中に保存した。一部を水から凍結乾燥し、
物理化学的特性測定用の試料とした。1HNMRス
ペクトルおよびマス・スペクトルはこの産物が上
記の実施例２のＤ工程で評価した産物と同一であ
ることを示した。 実施例 ５ オキシデイフイシジンの製造 オキシデイフイシジンの製造に３つの異なる発
酵過程を用いた。 Ａ 培地の調製 以下に述べる培地Ａは、下に挙げた成分を蒸留
水に溶解し、滅菌前に濃塩酸または50％水酸化ナ
トリウムによりPHを7.0と7.2との間に調整するこ
とによつて調製した。この培50mlを邪魔板３個つ
き250ml容振盪フラスコに分配し、500mlの同一培
地を邪魔板３個つき2000ml容振盪フラスコに分配
した。フラスコを綿栓し、オートクレーブ中で
121℃で25分間加熱することにより滅菌し、室温
にまで冷却した。 培地Ａ ％ デキストロース 0.1 可溶性澱粉 1.0 牛肉エキス 0.3 アルダミン（Ardamine）PH 0.5 NZアミンＥ型 0.5 MgSO4・7H2O 0.005 燐酸緩衝液(1) 2.0ml CaCO3 (2) 0.05％ (1) 燐酸緩衝液 ％ KH2PO4 9.1 Na2HPO4 9.5 PH−7.70 (2) PHを適当なレベルに調整した後添加 以下に述べる培地Ｂは、ニユー・ブランスブイ
ツク・サイエンテイフツク（New Brunswick
Scientific）の栄養滅菌器NS−20型中で、以下に
挙げた成分を蒸留水に懸濁、滅菌前に濃塩酸また
は50％水酸化ナトリウムでPHを7.2および7.4の間
に調整し、121℃、約1.26Kg／cm2（１平方インチ
当り18ポンド）で20分の加熱で滅菌することによ
り調製した。14リツトルの電磁的に組合せたニユ
ー・ブランスブイツク・サイエンステイフイツク
のミクロフエルム（Microferm）フアーメンタ
ー、MF−114型をジヤー中100mlの蒸留水と共に
オートクレーブ内で121℃、約1.26Kg／cm2（一平
方インチ当り18ポンド）で90分間加熱することに
より滅菌した。栄養滅菌器からの9.5リツトルの
冷却培地Ｂを滅菌フアーメンター中に無菌的に移
し温度を約28℃に調整した。 培地Ｂ ％ デキストリン 4.0 譲造可溶物 0.7 酵母エキス 0.5 CoCl2・6H2O 0.005 培養の展開 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39320の凍結乾燥体を無菌的に開き、上述
のように250mlの培地Ａを含むフラスコへの接種
に用いた。フラスコは、220rpm回転振盪機上で
28℃24時間インキユベートした。タネは引続き第
１のフラスコから15mlずつを培地Ａを含む2000ml
振盪フラスコ３本に無菌的に移すことにより増殖
させた。その2000ml振盪フラスコを220rpm回転
振盪機上で28℃24時間インキユベートした。タネ
工程における最終PH測定値は、7.20から8.35の範
囲であつた。 製 造 2000mlフラスコ１本を用いて、前述のように調
製した14リツトル容器の各々へ接種した。接種直
後にフアーメンターの条件を28℃（27.9乃至28.3
℃）、300rpmおよびKdwが2.35×10-4gram、
moles O2／ml／hr／atmに相当する２リツト
ル／分通気に設定した。発酵の間に発泡制御のた
めに必要に応じポリグリコールＰ−2000を添加し
たが、0.04％を越すことはなかつた。接種77時間
後に撹拌および通気を、Kdwが1.3×10-4gram、
moles O2／ml／hr／atmに相当する200rpmおよ
び１リツトル／分に減じた。フアーメンターをイ
ンキユベーシヨン89時間後に収穫した。フアーメ
ンター過培養液試料について抗菌およびPH分析
を行なつた。そのデータを以下に示す： 【表】 B. 培地調製および培養の展開は上のＡに述べ
たのと同じである。 生 産 2000mlフラスコ１本を用いて、前述のように調
製した14リツトル容器の各々に接種した。接種直
後にフアーメンターの条件を28℃（28.0乃至28.3
℃）、300rpmおよびKdWが2.35×10-4gram、
molesO2／ml／hr／atmに相当する２リツトル／
分通気に設定した。発酵中に発泡制御のために必
要に応じてポリグリコールＰ−2000を添加した
が、004％を越すことはなかつた。フアーメンタ
ーを接種後41時間に収穫した。フアーメンター
過培養液試料について抗菌およびPH分析を実施し
た。そのデータを以下に示す： 【表】 Ｃ 培地調製は上のＡに述べたのと同じである。 培養の展開 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39320の凍結乾燥菌体を無菌的に開き、上
述のように、250mlの培地Ａを含むフラスコへの
接種に用いた。フラスコは220rpm回転振盪機上
で27℃24時間インキユベートした。タネは引続き
第１のフラスコから２mlずつを培地Ａを含む振盪
フラスコ４本に無菌的に移すことにより増殖させ
た。これら４本のフラスコは220rpm回転振盪機
上で、28℃24時間インキユベートした。24時間
後、４本のフラスコをまとめて15mlずつを培地Ａ
を含む2000ml振盪フラスコ４本に無菌的に移し
た。これら2000mlフラスコを220rpm回転振盪機
上で28℃24時間インキユベートした。タネ工程に
おける最終PH測定値は7.21から8.35の範囲であつ
た。 生 産 2000mlのフラスコ１本を用いて、前述のように
調製した14リツトルフアーメンター容器の各々へ
接種した。接種直後にフアーメンターの条件を28
℃（27.5から28.2℃）400rpmおよびKdwが3.8×
10-gram、moles O2／ml／hr／atmに相当する
３リツトル／分に設定した。発酵中に発泡制御の
ために必要に応じてポリグリコールＰ−2000を添
加したが、0.23％を越えることはなかつた。接種
65時間後に撹拌を200rpmに低下させ、Kdwを
1.75×10-4gram、moles O2／ml／hr／atmに減
少させた。フアーメンターを接種89時間後に収穫
した。４つのバツチを併合し、回分供給式
（batchfed）シヤープレス遠心分離機で
30.000rpmで遠心分離した。上澄をもう２回遠心
分離し、清澄な上澄を得た。フアーメンター過
培養液試料について抗菌およびPH分析を行なつ
た。４本の14リツトル・バツチの平均値のデータ
は以下の通りであつた： 【表】 実施例 ６ オキシデイフイシジンの単離及び精製 Ａ オキシデイフイシジンの予備的精製 上記実施例５に記載した、同一条件で生育させ
た14リツトル発酵４本からの全培養液を併合し、
ターボシヤープレス遠心分離機にかけた。清澄遠
心上澄28.3リツトルを濃塩酸でPH4.8に調整し、
2.1リツトルのローム・アンド・ハース社のアン
バーライトXAD−２樹脂上に吸着させた。次に
樹脂を同じ流速で８リツトルの水により洗浄し
た。抗生物質活性分を樹脂から６リツトルの酢酸
エチルで溶出し、１つの分画に集めた。溶出液は
約0.8リツトルの暗色水性下層を含んでおり、こ
れを取除き廃棄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナ
トリウムで簡単に乾燥し、次に400mlまで濃縮し
た。 粗抗菌成分を、酢酸エチル濃縮物を撹拌しつ
つ、2.5N水酸化ナトリウムで水層のPHを8.5に至
らせつつ150mlの水を用いて水へ逆抽出した。水
性抽出物を除去し、水抽出後の酢酸エチルを再び
PH8.5の100mlの水で抽出した。最終の第３回目の
PH8.5の70mlの水での抽出の後、３つの水性抽出
物を併合し、PH8.5に調整した。最終体積は360ml
試料を−80℃で凍結保存した。 Ｂ ほとんど純粋なオキシデイフイシジンの単離 上記Ａ工程からの併合水性抽出物を融解し、
205mlに濃縮し、15mlの1M燐酸カリウムPH７で緩
衝化した。この溶液215ml量を流速20ml／分で500
mlのダイアイオンHP−20に吸着させた。樹脂を
1.5リツトルの水、1.5リツトルの１：１メタノー
ル−0.1M燐酸カリウムPH７および1.5リツトルの
65：35メタノール−0.1M燐酸カリウムPH７で段
階的に洗浄した。オキシデイフイシジンを９：１
メタノール−水で樹脂から溶出した。溶出物を20
ml分画で集め、高速液体クロマトグラフイーによ
り検定した。分画20から35を併せ、50mlに濃縮
（）した。PH7.5；高速液体クロマトグラフイー
検定によりオキシデイフイシジン430mg。 （）の49ml量（421mgオキシデイフイシジン）
を１：４メタノール−水中リクロプレツプRP−
18樹脂〔イー・メルク（E.Merck）25−40ミクロ
ン〕170mlのカラムに仕込んだ。先ず、カラムを
流速約3.5ml／分で250mlの１：４メタノール−水
により溶出した。溶出物は廃棄した。カラムを次
に同じ流速で１：１メタノール−水により溶出し
た。一連の20ml分画を集めた。紫外線及び高速液
体クロマトグラフイー検定に基き、分画27から38
をほとんど純粋なオキシデイフイシジンとして併
合した。−80℃における保存中の凍結を防ぐため
に、その分画に100mlのメタノールを添加し、メ
タノール濃度を65％にした。最終体積360mlで378
mgのほとんど純粋なオキシデイフイシジンを含
む。 試料は−80℃で保存した（）。 Ｃ オキシデイフイシジンのアルカリ性フオスフ
アターゼによる脱燐酸 薄層クロマトグラフイーシステム：フオトマン
（Whatman）KC18F逆相平板 ９：１メタノール−0.1Mクエン酸ナトリウムPH
6.0 ５mg／mlのオキシデイフイシジン水溶液（上記
Ｂ工程からの試料（）〕100μに10μの
0.25MTRIS塩酸緩衝液および5μの子牛腸粘膜
アルカリ性フオスフアターゼ〔2000単位／ml、ピ
ー・エル・バイオケミカルス社（Ｐ−Ｌ
Biochemicals Inc.）〕を添加した。28℃で60分間
インキユベーシヨンした後に大部分のオキシデイ
フイシジン（Rf0.59）は、燐酸検出用のハーネ
（Hane′s）試薬に陰性の新物質（Rf0.38）に変換
していた。 Ｄ 物理化学的および生物学的特性解析のための
ほとんど純粋なオキシデイフイシジンの単離 上記実施例５に述べたオキシデイフイシジン生
産生物に関する発酵研究の結果から良好な抗生物
質力価を有する３つの培養液が得られた。バツチ 全培養液体積 PH １ 6.7リツトル 6.3 ２ ６リツトル 6.2 ３ 7.3リツトル 6.1 粗オキシデイフイシジンを以下の手法により
各々のバツチよりそれぞれ単離した。全培養液
（６−７リツトル）を濃塩酸でPH4.8に調整した。
後続のXAD−２吸着段階でカラムをつめる可能
性をさけるために培養液を遠心分離にかけ、細胞
体を除くのが有利であることが認められた。しか
し、全培養液から、直接オキシデイフイシジンを
XAD−２樹脂に吸着させることが可能であるこ
とが示された。培養液（清澄化したものまたは全
部）を70ml／分で700mlのローム・アンド・ハー
ス社のAnberite XAD−２樹脂上に吸着させた。
樹脂を2.5リツトルの水で洗浄した。粗オキシデ
イフイシジンを2.5リツトルの酢酸エチルで溶出
した。酢酸エチル溶出液の下部水層を廃棄した；
上層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、約300ml
に濃縮した。酢酸エチル濃縮物はＢ段階で述べた
ようにPH8.5で100ml、50mlおよび30mlの水で連続
的に逆抽出した。併合した水性抽出物をPH6.8に
調整し、−80℃で保存した。 バツチ１、２、および３の水性抽出は、溶け込
んでいる酢酸エチルを除くために各々150−200ml
に濃縮した後、併合した。その溶液を10mlの1M
燐酸カリウムPH７で緩衝化し、流速20ml／分でダ
イアイオンHP−200樹脂上に吸着させた。カラ
ムを1.4リツトルの0.1M燐酸カリウムPH７、1.4リ
ツトルの１：１メタノール−0.1M燐酸カリウム
PH７で連続的に洗浄した。次にカラムを20ml／分
で９：１メタノール−水により溶出した。溶出物
を体積各220ml、100ml、200ml、200mlおよび210
mlの５分画（分画１−５）に集めた。高速液体ク
ロマトグラフイー検定およびビブリオ・パーコラ
ンス（Vibrio percolans）に対する寒天平板拡
散検定に基き、分画３および４をオキシデイフイ
シジン区分（）として併せた；高速液体クロマ
トグラフイー検定により約350mgオキシデイフイ
シジン。 試料（）を45mlに濃縮し、PH7.0に調整した。
濃縮物を水中のリクロプレツプRP−18樹脂（イ
ー・メルク、25−40ミクロン）170mlカラム上に
仕込んだ。カラムを先ず450mlの水で洗浄した。
カラムをさらに600mlの１：１メタノール−水で
次いで1.1リツトルの65：35メタノール−水で溶
出した。溶出液を20ml分画で集めた。紫外線及び
高速液体クロマトグラフイー検定に基き、分画28
−42を併合した。−80℃保存中の凍結を防ぐ目的
で貯めた分画（）に100mlのメタノールを添加
した。体積380ml、試料を凍結乾燥し、238mgのほ
とんど純粋なオキシデイフイシジン（）を得
た。窒素下−80℃で保存した。 Ｅ オキシデイフイシジン（試料）の物理化学
的特性 紫外線スペクトル（0.1M燐酸カリウム中） λMax Ａ１％ １cm 235nm 750 266nm（sh） 304 275nm 376 284nm（sh） 307 （）から（）への凍結乾燥の間に、オキシ
デイフイシジンの10−15％の分解が生じ得る証拠
がある。（）の凍結乾燥重量と（）の紫外線
分析に基いて、Ａ１％ １cm（275nm）−438が算定され
る。 マススペクトルデータ 高分解能質量測定り、電子衝撃マス・スペクト
ル（EI−MS）は、分子式C31H42O3（計算値
462.3134）に対応するM+−H3PO4イオンをｍ／
z462.3095に与えた。高質量領域の他の有意なイ
オンはｍ／z444、381、および349に生じた。トリ
メチルシリル化の際、試料は分子式C31H45O7P
（分子量560）（トリ−TMS誘導体の計算値ｍ／
z776.4089）に対応するトリ−TMS誘導体
（M+・TMS3）としてｍ／z776.4100の位置に分
子イオンを示した。モノ−TMS（mono−TMS）
誘導体としてｍ／z462、381および349に相当する
適切なEI−MSを確証する他の有意なイオンおよ
びその対応する正確な質量値および分子式は以下
のようである： 【表】13 CNMRケミカルシフト スペクトルは、CD3OD／CDCl3（約１：１）
中、０℃（12mg／0.35ml）で記録された。ケミカ
ルシフトは、テトラメチルシラン（TMS）内部
標準のダウンフイールドにppmで与えられてい
る。マス・スペクトル・データと一致して、31個
の炭素原子は以下のケミカルシフトで認められて
いる： 16.3、16.7、18.8、24.1、26.1、31.3（2x）、33.5、
36.2、41.8、46.6、72.5、74.5、75.2、114.1、
115.4、121.3、124.8、125.0（2x）、125.2、126.6、
127.3、129.4、133.9、134.0、137.1、139.0、
141.2、144.6、173.5ppm。 33.5および72.5ppmのピークは、燐酸基の31Pと
のカツプリングによつて二重線として出現してい
る。1 HNMRスペクトル スペクトルは第２図のように測定された。スペ
クトルは、300MHz、CD3OD／CDCl3（約１：１）
中０℃（約４mg／0.35ml）で記録された。ケミカ
ルシフトは内部テトラメチルシランをゼロppmと
した相対値ppmで示されている。 薄層クロマトグラフイーデータ − フオトマンKC18F逆相平板 ９：１メタノール−0.1Mクエン酸ナトリウム、
PH6.0 Rf＝0.59 − 視覚化の方法 １ 短紫外線光下の照明 ２ 燐酸エステルにたいするハーネ（Hane′s）
試薬（モリブデン酸アンモニウム−HClO4）
噴霧 マススペクトルの結果は、抗生物質オキシデイ
フイシジンの分子式をC31H45O7P（分子量560）と
確定した。トリス（トリメチルシリル）−オキシ
デイフイシジンの分子イオンからH3PO4・
2TMSが容易に消失することは燐原子が、燐酸モ
ノエステルとして存在することを示唆する。この
ことは、ハーネ試薬試験（薄層クロマトグラフイ
ー）陽性および上詰Ｃ段階に示したアルカリ性フ
オスフアターゼによりオキシデイフイシジンが容
易に失活することで支持される。NMRデータ
は、オキシデイフイシジンの構造が燐酸に加えて
以下のものを含むことを示唆する。 − ８つのオレフイン結合、その中２つは末端の
メチレン − １つのエステルまたはラクトン機能 − １つの水酸基および − アつの環
（difficidin）と呼ばれる新規抗菌化合物およびそ
の誘導化合物、および該化合物を製造、単離およ
び精製する工程に関するものである。ここで用い
られているように、新造名称である“デイフイシ
ジン”は、下記構造式の化合物を示す（式中、
R1は水素であり、Ra及びRbは下記に列挙した意
味を有し、各種のその塩を与える）。それに対応
して、“オキシデイフイシジン”の名称は、ここ
で用いられるように、R1が水酸基でRaおよびRb
が指示された意味を有する下記構造式の化合物
を意味する。この新規抗菌性化合物は、メリーラ
ンド州、ロツクビルにあるブタペスト条約第２条
（）の国際寄記当局である米国標準菌株保存施
設（American Type Culfure Collection）に寄
託され各々ATCC39374および39320と指定された
バチリス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
MB3575およびMB4488の微生物培養により得ら
れる。 本発明の新規抗菌性化合物デイフイシジンおよ
び誘導体化合物は好気性および嫌気性微生物に対
して抗菌活性を有する。これらは、グラム陽性お
よびグラム陰性細菌感染の治療に、非経口的に用
いることができる。 プロチシン（proticin）は、燐を含む強度に不
飽和な無定形化合物で、広い抗菌スペクトルを有
し、特にグラム陰性感菌性に有効と記載されてい
る既知の抗菌性化合物である。この物質は、バチ
ルス・リケンホルミス（Bacillus
licheniformis）の形として同定された菌株の発
酵により生産されたと言われる。その製造、特
性、および抗菌活性についてのより詳細な記載
は、以下の参考文献中に見出し得る：(1)プレフエ
ピー（Prave，P.）ほかアンチビオツクス誌
（J.Antibiotics）25(1)：第１−３頁、1972年；(2)
フエルテシー エル（Vertesy，L.）、アンチビ
オチツクス誌（J.Antibiot）25(1)：第４−10頁、
1972年；(3)エスマン ジー（Nessmann、G.）ほ
か、ナツールビツセンシヤツト
（Naturwissenschaften）59(2)：第81−82頁、
1972年；(4)ドイツ特許公開公報第2035812号フエ
ルテシー エル（Vertesy，Ｌ）ほか“バチリス
リヘニホルミスからのプロチシンの製造”
“（Proticin from Bacillus lichenirormis）”フ
アルプベルケ ヘキスト社、1970年７月18日；お
よび(5)英国特許第1350271号、バチルス リヘニ
ホルミスの醗酵によるプロチシンの製造
（Proticin Produced by Bacillus
licheniformis fermentation）フアルプベルケ
ヘキスト社（Farbwerke Hoechst A.G.）、
1974年４月18日（ケミカルアブストラクト81：
48531y、p30b、1974年参照）。 しかしながら、特異抗生物質化合物プロチシン
について繰返し参照しても、上述の参考文献では
単一化合物を特徴づけることは出来ず、またそこ
に示されているスペクトル・データは数種の可能
な化合物に矛盾しないものである。上述のフエル
テシーの文献(2)は、二重結合のただ一つにのみ一
つのメチル基が存在することを記載しているのに
対し、本発明の化合物は、そのようなメチル基を
２個有しているので、本発明のR1が水酸基であ
る新規抗菌性化合物（オキシデイフイシジン）は
上記文献中に記載されたいわゆるプロチジンと
は、化学的に異なるものである。他方、R1が水
素である本発明での新規抗菌性化合物（デイフイ
シジン）は、それが異なる分子量を有しているこ
とから、文献中の化合物とは容易に区別される。 デイフイシジンは化学的には、構造式に図示
されるように、不斉中心をC4、C5、C15、およ
びC21に有する22員大環状ポリエンラクトン燐酸
エステルである。 見れば判るように、構造式中には２つの主要
化合物がある。一つの化合物は、R1が水素のも
のであつて、既に指摘したように、以後は“デイ
フイシジン”と記す。もう一方の化合物はR1が
水酸基のものであつて、以後は“オキシデイフイ
シジンと記す。 本発明に従つて、以下の構造式を有する新規抗
菌性化合物デイフイシジンおよびその誘導体が与
えられる： 式中、RaおよびRbは、水素；アルカリ金属お
よびアルカリ土類金属陽イオン；アンモニウム；
および置換アンモニウムからなる群より独立的に
選択された置換基であり、R1は水素または水酸
基である。 アンモニウム陽イオンは、既知の方式によつ
て、好ましくは、例えば低級アルキル基により置
換され得る。 デイフイシジンが製造され、さらにモノおよび
ジ−カリウム塩の平衡を変える燐酸カリウム塩と
して用いられる。この塩の形は、製造が容易であ
ること、および低PH下で存在する酸型（Ra＝Rb
＝Ｈ）が恐らく不安定なことから採用されたもの
である。 デイフイシジンおよびその誘導体は、メリーラ
ンド州、ロツクビルの米国標準菌株保存施設
（American Type Culfure Collection）に寄託
されたバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）MB3575およびMB4488の微生物培養に
より製造することができる。これらはそこから
各々受託番号ATCC39374および39320で無制限に
入手し得る。 該バチルスあるいはその変種および変異株は、
微生物培養ら一般的に用いられる栄養培地あるい
は栄養溶液を用いた寒天スラント試験管またはエ
ルレンマイヤー・フラスコあるいはフアーメンタ
ー中の深部培養条件下において、よく知られた微
生物手法に従つて培養することができる。 本発明においては、デイフイシジンおよびその
誘導体は、微生物、例えばバチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCC39320を好気条件下、
約28℃の温度で培養中に生産される。栄養培地の
組成は、広範囲に変化させることができる。必須
の同化可能な栄養成分は、炭素源、窒素源、燐、
硫黄、マグネシウム、カルシウム、および塩素を
含む無機物源である。培養は中性PH条件好ましく
は、約6.0から7.0の条件が最も生産的である。 典型的な炭素源には、グルコース、デキストリ
ン、澱粉、グリセロールなどを含む。典型的な窒
素源は植物粉（大豆、綿実、トウモロコシなど）
肉粉または動物性ペプトン、醸造可溶物
（distillers solubles）、カザミノ酸、酵母細胞、
種々の加水分解物（カゼイン 酵母、大豆、な
ど）、酵母核酸、およびアミノ酸を含む。 ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネ
シウム、およびカルシウムの塩酸、硝酸、硫酸、
炭酸および燐酸塩の如き無機塩類は必須無機元素
の供給源を提供する。栄養培地は鉄、銅、マンガ
ン、亜鉛、及びコバルトのような種々の微量元素
をも含む。 培養中に過剰な発泡が生じたときは、発酵の前
または途中で、発酵培地中に、植物油、ラード
油、およびポリプロピレングリコールのような消
泡剤を添加することができる。デイフイシジンの
最大収量は、約20ないし120時間以内に到達され、
培養に依存している。発酵の接種ダネは、懸濁
液、スラント、凍結細胞、または凍結乾燥物から
供給され得る。 上述の通常培養法に加えて、メソド インマイ
クロバイオロジー（Methods in Microbiology）
第２巻〔アカデツク出版（Academic Press）ロ
ンドン−ニユーヨーク〕、1970年、第259−328頁
に記載されているような連続法を用いることもで
きる。そのような糸では、菌を長期間自然変異あ
るいは他の崩壊が顕著になることなく定常状態を
保つことができる。 デイフイシジンおよびその誘導体の生産のため
に、本発明がバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）ATCC39374あるいは39320を使用する
ことのみに限定されるのではないことが理解され
るべきである。菌がデイフイシジンおよびその誘
導体を生産している限りは、該微生物から生じた
自然または人工の変異株またはバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilisATCC39374または
29320の他の変種の使用を包含することが特に望
まれ、また意図されている。バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）変異株の人工的な生産
は、Ｘ−線または外線（UV）照射の如き通常の
操作、または、ナイトロジエン・マスタード、ニ
トロソグアニジン、樟脳などのような化学変異剤
の利用、または組換えDNA工学手法などにより
達成することができる。 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39320の形態学的および生理学的特性 ATCC39320の形態学的および生理学的性質は
以下のようである： 形態：グラム陽性、空胞のない栄養桿菌で末端は
円形；平均の大きさ0.9×2.3〜2.6μ；単細
胞体。桿菌は運動性あり。好気条件下で胞
子形成。胞子は0.5×1.0μ（平均の大きさ）、
卵形ないし円筒形、多く中央部に形成、胞
子のうは膨まず。 集落の外観： 平たん、円状で外縁は不規則、表面は滑ら
かでない。集落がなくなるに従つて外縁は
不透明になる。肉汁表面で光沢なく、しわ
のある全面薄膜形成、トリプチカーゼ大豆
寒天上で色素生産なし。28℃、37℃で生
育、60℃で生育せず。 陽性反応： カタラーゼ、フオゲス−プロスカウエル
（Voges−Proskauer）、ゼラチン、硝酸塩
還元。クエン酸の利用、グルコース、アラ
ビノース、マンニトール、キシロース、ソ
ルビトール、およびスクロースからの酸生
成、澱粉加水分解。 陰性反応： ウレアーゼ、インドール、プロピオン酸の
利用。アルギニン・ジヒドロラーゼ、ラム
ノースおよびメリオビースからの酸生成、
嫌気性寒天中（穿刺または嫌気ジヤー中で
の平板培養）で非生育、嫌気条件下肉汁ま
たは硝酸肉汁中で非生育。 ベルゲイ（Bergey）のマニユアル・オブデイ
ターミナテイプ バクテリオロジー（Manual of
Deferminative Bacteriology）、第８版、〔ウイ
リアムス・アンド・ウイルキンス（Williams＆
Wilkins）〕、1974年、およびゴルデン・アール・
イー（Gordon，R.E.）、ハイネム・ダブリユー・
シー（Haynes，W.C.）およびパンク・シー・エ
イチ（Pang，C.H.）（1973年）、ザ・ギナス・バ
チルス（The Genus Bacillus）、アグリカルチ
ヤーモノグラフ（Agriculture Monograph）No.
427、ユー・エス・デパートメント・オブ・アグ
リカルチヤー（U.S.Department of
Agriculture）、〔ワシントン・デイー・シー
（Washington，D.C.）〕中の培養記載との比較の
結果は、MB4488／ATCC34320が既知種バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）の株であ
ることを示す。 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39374の形態学的および生理学的特性 ATCC39374の形態学的および生理学的性質は、
以下に述べる微生物の集落の外観に関する点を除
くと上に示したATCC39320のものと同じであ
る： 集落の外観：24時間で盛り上つた円形、ムコイ
ド。集落が古くなるに従つて外縁が乾燥不透明
および不規則になる。中央ムコイド領域は乾燥
し続け、不透明化およびしわがよる。肉汁表面
上で光沢なく、しわのある全面薄膜形成。トリ
プチカーゼ大豆寒天上で色素生成なし。28℃、
37℃で生育、60℃で非生育。 デイフイシジンおよびその誘導体の生産 Ａ 抗菌性化合物デイフイシジンおよびその誘導
体、またはそれらの塩の一つの、しかしその中
ではオキシデイフイシジンが大きな割合で生産
されるような、製造方法は、デイフイシジンお
よびその誘導体を形成し、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）ATCC39320株に属す
る微生物を炭素源、窒素源、栄養塩、および微
量元素を含む栄養水溶液により、20゜乃至40℃
の範囲の温度で24乃至120時間、栄養溶液が可
成りの量のデイフイシジンおよびその誘導体を
含むようになるまで培養すること、その後、培
養液からデイフイシジンおよびその誘導体を分
離し、必要なら薬学的に許容される塩基を用い
て塩に変換することを含む。 培養中に、栄養培地のPH値は、中性からやや
酸性に変る；一般に緩衝液の添加は不要である
が、予防策として用いることも出来る。望まし
い収量が２〜４日後に得られるので、培養をこ
の期間後に適当に停止する；その時栄養液は多
量のオキシデイフイシジンを含んでいる。
ATCC39320の培養はデイフイシジンに比して
より多くのオキシデイフイシジンを生産する
が、全体の力価は以下に述べるATCC39374培
養より低いことが認められた。 Ｂ 抗菌性化合物デイフイシジンおよびその誘導
体、またはそれらの薬学的に許容される塩基と
の塩の一つ、しかしその中ではデイフイシジン
がより大きな割合で生産されるもう一つの、そ
してより好ましい製造方法は、デイフイシジン
およびその誘導体を形成し、バチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）ATCC39374株に属
する微生物を、炭素源、窒素源、栄養塩および
特にコバルトを含有する微量元素を含む栄養水
溶液により、栄養養液が可成りの量のデイフイ
シジンおよびその誘導体を含むまで20゜乃至40
℃の範囲で24乃至120時間培養し、その後培養
液からデイフイシジンおよびその誘導体を分離
し必要なら薬学上許容される塩基との塩に変換
することを含む。 既に指摘したように、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCC39374株を用いる方
法が同様に好ましい。何故なら、オキシデイフイ
シジンより大きな割合のデイフイシジンを生成
し、上記“Ａ”に述べた方法で用いたバチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）ATCC39320微
生物より高力価を生成することが認められたから
である。 コバルトの添加、例えば0.1ｇ／、は該微生
物によるデイフイシジンの優先的な生産を起こさ
せ、生産されるオキシデイフイシジン量に対し重
量比で３：１の大きさにまでなることが認められ
た。種々の水溶性のコバルト塩を用いることがで
できる。例えば、好んで用いられるのは塩化コバ
ルト６水和物である。 同様に、コバルト存在下で燐酸塩を例えば
100ppm添加すると、オキシデイフイシジンの生
産に比し、バチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）培養によるデイフイシジンの優先的な
生産が起こることが認められた。他方、オキシデ
イフイシジンの優先的な生産はマンガン、例えば
塩化マンガン４水和物を例えば0.025ｇ／添加
することにより行なわれる。しかし、これらの知
見は予備的な性格のものであり、望まれるかも知
れない、デイフイシジンかまたはオキシデイフイ
シジンの生産に影響を及ぼす目的で培地に有利な
操作を加える可能性があることを示すものとして
のみ含まれているものである。 デイフイシジンおよびその誘導体の分離 デイフイシジンおよびその誘導体を分離するた
めに菌の培養液を先ず遠心分離により清澄にす
る。しかし、デイフイシジンおよびその誘導体の
可成りの部分は、細胞部分に残留することにな
る。この粗製品をXAD−２およびHP−20樹脂の
ような有機系ポリマー樹脂およびリクロプレプ
（LiChroprep）RP−18樹脂およびフオトマン
（Whatman）のODS樹脂（共にC18H37残基が化
学的に結合した外層をもつた珪酸である）のよう
な珪酸系ポリマー樹脂のような適当な吸着剤を用
いぞクロマトグラフイーにより精製する。デイフ
イシジンおよびその誘導体は、吸着剤から適当な
極性溶媒またはその混合物により溶出され、次い
で、デイフイシジンおよびその誘導体の水性抽出
が行なわれる。デイフイシジンおよびオキシデイ
フイシジンは次に高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）により相互に、そして、構造的な関連
化合物から分離される。 デイフイシジンおよびその誘導体の有効抗菌量
は、哺乳動物で５mg／Kgから20mg／Kgの程度と考
えられる。デイフイシジンおよびその誘導体は、
グラム陰性およびグラム陽性感染症の治療に有効
であり、静脈内、筋肉内、または皮下に単独ある
いは製剤担体との組み合せで投与し得る。最終的
な投与経路および量は臨床的により決定され、患
者の独自の条件に基くべきである。 デイフイシジンおよびその誘導体と、適当な製
剤担体との組み合わせは、薬剤士の領域でよく知
られている方法によりなされる。例えば、皮下
（S.C.）投与の目的では、デイフイシジンおよび
その誘導体の溶液は一般に例えば無菌水溶液また
はアルコール溶液を用いる。この溶液は、必要な
ら適当に緩衝化されるべきであり、稀釈液は先
ず、食塩またはグルコースで等張にしておくこと
ができる。これらの水溶液およびアルコール溶液
は静脈内（i.v.）注射としても適当である。 以下の例は、バチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）ATCC39320およびATCC39374から
のデイフイシジンおよびオキシデイフイシジンの
製造および単離を説明するものである。 実施例 １ ATCC39320を用いたデイフイシジンおよびオ
キシデイフイシジンの製造 １ “Ａ”工程 ATCC39320（MB4488）培養、凍結乾燥管は培
養の脱脂乳懸濁液0.15mlを含む1.00mlアンプル
中に凍結乾燥した状態で保持されている。 ２ “Ｂ”工程 容器：フラスコ当り50ml培地を含む邪魔板３個
つき250ml容エルレンマイヤーフラスコ、 培地： 重量／体積 デキストロース １ｇ／ 可溶性澱粉 10ｇ／ 牛肉エキス ３ｇ／ アルダミン（Ardamine）PH ５ｇ／ NZ−アミンＥ型 ５ｇ／ MgSO47H2O 0.05ｇ／ 1.34M燐酸緩衝液 0.02％体積／体積 CaCO3（PHを7.0−7.2に調整後） 0.05％ 燐酸緩衝液 KH2PO4 91ｇ／ Na2HPO4 95ｇ／ 接種材料： 凍結乾燥管（Lyo tube）１本の内容物を各
“Ｂ”フラスコ中へ インキユベーシヨン： 220RPMで回転する約５cm（2″）回転盤から
なる回転振盪機上で28℃24時間 無菌性： 平板塗抹およびグラム染色 ３ “Ｃ”工程 容器：500ml培地を含む邪魔板３個つき２リツ
トル容エルレンマイヤーフラスコ、 接地：“Ｂ”工程と同じ 接種材料： “Ｂ”工程からの10ml インキユベーシヨン： “Ｂ”工程と同じ 無菌性： “Ｂ”工程と同じ ４ “Ｅ”工程 容器：750リツトル容ステンレス スチール
フアーメンター 培地： デキストリン 40ｇ／ ソルラツク（Solulac） ７ｇ／ アルダミン（Ardamine）YEP ５ｇ／ 塩化コバルト 50mg／ ポリグリコール2000 １ml／ 前−殺菌 PH 7.3 殺菌：121℃ 20分 接種材料： “Ｃ”工程１リツトル フアーメンター容積A.I.：501リツトル 温度：28℃ 通気：約141リツトル／分（5CFM）（30時間）
次に約170リツトル／分（6CFM） 撹拌：130RPM（12時間）次に110RPM 圧：約0.91Kg／cm2（13PSI） 消泡剤： ポリグリコール2000 循環時間： 92時間 無菌性： 顕微鏡検定および28℃および37℃で平板塗抹 生理： 【表】 実施例 ２ デイフイシジンおよびオキシデイフイシジンの
単離および精製 Ａ 抗菌複合体の予備的単離 実施例１で記載された発酵バツチからの約420
リツトルの全培養液（PH5.9）は、92時間目に収
穫した。培養液をシヤープレス遠心機を用いて清
澄化した。416リツトルの清澄培養液を500mlの
4N塩酸によりPH5.0に合せ、次いで、４リツト
ル／分で38リツトルのロームアンドハース社のア
ンバーライトXAD−２樹脂に吸着させた。樹脂
を４リツトル／分で120リツトルの冷たい蒸留脱
イオン水により洗浄した。抗菌複合体は、160リ
ツトルの酢酸エチル４リツトル／分により樹脂か
ら溶出した。溶出液の下部水層は除去廃棄した。
溶出液を無水硫酸ナトリウム上で30分間撹拌し、
乾燥した。乾燥剤を過により除去し、液を真
空下で2.65リツトルに濃縮した。濃縮液に１リツ
トルの水を加え、緩やかに撹拌しつつ130mlの
2.5N水酸化ナトリウムにより下部水層のPHを8.5
に調整した。混合物を２分間激しく撹拌した。層
を分離させた。下部水性抽出液を別容器に移し、
上部有機層を各回500mlの水と抽出の間PHを8.5に
するのに十分な2.5N水酸化ナトリウムにより２
回抽出した。３つの水性抽出液を併せ、PH6.9に
調整した。抽出液量は2.4リツトルであつた。2.1
リツトルの抽出後酢酸エチル溶液は、94ｇの総固
体を含んでいた。 デイフイシジンおよびオキシデイフイシジン
は、水性抽出物中、および水抽出後酢酸エチル区
分の両方に種々の量で存在した。下記Ｂ工程は、
水抽出後酢酸エチルからのデイフイシジンおよび
オキシデイフイシジンの単離を述べる。下記Ｃ工
程は水性抽出液からのデイフイシジンの単離を述
べる。Ｄ工程は別の単離法および対応する分析評
価を述べる。 Ｂ デイフイシジンおよびオキシデイフイシジン
の単離 上記Ａ工程からの2.1リツトル水抽出後酢酸エ
チル分画の0.4ml試料を油状残渣まで蒸発させ、
0.7mlの７：３メタノール−0.01M燐酸カリウム
PH7.0中に取つた。その溶液0.4mlを同一溶媒中、
28℃でデユポン・ゾルバツクス（Dupont
Zorbax）ODSカラム〔内径4.6mm（ID）×25cm〕、
10ミクロン、上でクロマトグラフにかけた。流速
は１ml／分で、カラム溶出液は、10mm光路長のフ
ローセル（（flow cell）およびハネウエル・エレ
クトリツク（Honeywell Electronik）の195記録
機を備えたラボラトリー・データー・コントロー
ル・スペクトラ・モニター（Laboratory Data
Control Spectra Monitor）紫外線検出機を用
いて275nmでモニターした。溶出液を0.5ml分画
で集め、ビブリオ パーコラスト（Vibrio
percolaus）MB1272に対する寒天平板拡散法で
検定した。表は生物検定の結果を要約したもの
である。 表のデータは、水抽出後酢酸エチル中に２つ
の異なつた抗菌物質の存在を示す。11および12分
画の活性は抗菌性オキシデイフイシジンによるも
のである。61−65分画の活性は抗菌性デイフイシ
ジンによるものである。 【表】 Ｃ 抗菌性デイフイシジンの分離―方法１ 上記Ａ工程からの併合水性混合抽出液2.4リツ
トル（総固体66ｇ）は溶け込んでいる酢酸エチル
の大部分を除くために2.1リツトルに濃縮した。
濃縮物は0.22Lの0.1M燐酸カリウムPH7.0で稀釈
し、50ml／分で１リツトルのミツビシ・ダイアイ
オン（Mitubishi Diaion）HP−20樹脂上に吸着
させた。樹脂を３リツトルの蒸留水、３リツトル
の１：１メタノール−0.1M燐酸カリウムPH7.0、
３リツトルの65：35メタノール−燐酸緩衝液、お
よび３リツトルの９：１メタノール−蒸留水で連
続的に洗浄した。抗菌性複合体は50ml／分で、
3.9リツトルのメタノールで溶出し、1.45リツト
ルの先駆分画と2.45リツトルの濃厚分画として集
めた。先駆部分にはオキシデイフイシジンが豊富
であり、一方濃厚分画にはデイフイシジンが豊富
であつた。濃厚区分（総固体0.55ｇ）は50mlまで
濃縮し、116mlの0.1M燐酸カリウムPH7.0で稀釈
した。溶液は、イー・メルク・リクロプレツプ
（E.Merck LiChroprep）RP−18、25−40ミクロ
ン樹脂の74mlのカラムに５ml／分でチヤージし
た。カラムは、メタノール濃度を漸増させるメタ
ノール−水混合物で連続的に展開した（表）。
流速は５ml／分、分画は各7.5mlであつた。 【表】 分画の高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
分析および生物検定に基き、抗菌物質が分画109
−121に溶出し、この分画は表のピーク２（デイ
フイシジン成分）と同じ高速液体クロマトグラフ
イー保持時間を示した。分画109−121を粗デイフ
イシジン成分濃厚区分として併合した。 濃厚区分を8.2mlにまで濃縮し、0.9mlの1Mク
エン酸ナトリウムPH5.4および6.1mlのメタノール
で稀釈した。この溶液を４：６メタノール−
0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.5中イー・メルク・
リクロプレツプ（E.Merck LiChroprep）RP−
18樹脂25−40ミクロンの177mlのカラム上に２
ml／分で吸着させた。カラムを同一流速で30mlの
４：６メタノール−クエン酸緩衝液で洗浄した。
カラムを次に75：25メタノール−クエン酸（分画
１−35）および８：２メタノール−クエン酸（分
画36−70）で展開した。全分画は２mlであつた。
薄クロマトグラフイー（TLC）および紫外線
（UV）分析に基き、分画42−65を併せ、６mlに
濃縮した。得られた白色懸濁液を、５mlの0.1M
燐酸カルシウムPH7.2および不溶物質が再溶解す
るのに充分な量のメタノール（７ml）で稀釈し
た。その溶液を以下の方式で脱塩した。この溶液
を３：７メタノール−0.1M燐酸カリウムPH7.0中
の８mlのリクロプレツプ（LiChroprep）RP−18
樹脂上に吸着させた。この樹脂を24mlの３：７メ
タノール燐酸緩衝液および24mlの３：７メタノー
ル−蒸留水で連続的に洗浄した。デイフイシジン
成分は30mlの９：１メタノール−蒸留水で溶出し
た。溶出液は81：19メタノール−0.1Mクエン酸
ナトリウムPH5.5中室温下デユポン・ゾルバツク
ス（Dupont Zorbax）ODSカラム〔内径4.6mm
（ID）×25cm〕を用いた高速液体クロマトグラフ
イーにより分析した。流速は２ml／分であつた。
溶出液の275nmにおける紫外線吸収の約94％はデ
イフイシジン成分（保持時間379秒）に帰因する
ものであつた。保持時間418秒の不純物は、
275nm吸収の残りの６％に対応した。その不純物
はリクロプレツプRP−18樹脂上で注意深くクロ
マトグラフイーを行なうことにより除去した。次
に上記30mlの溶出液を濃縮してメタノールを除き
1Mクエン酸ナトリウムPH5.4およびメタノールで
８ml、最終溶液組成４：６メタノール−0.1Mク
エン酸ナトリウムにした。この溶液を17mlのリク
ロプレツプRP18樹脂に仕込んだ。カラムを75：
25メタノール−0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.5
（分画１−31、各２ml）、および８：２メタノール
−クエン酸（分画32−72、各２ml）で、２ml／分
で連続的に溶出した。高速液体クロマトグラフイ
ー分析に基き、分画41−54を濃厚区分１として併
合した。濃厚区分のPHを稀水酸化ナトリウムで
1.5単位増大させた。外れの区分55−72は併せて
溶媒組成４：６メタノール−0.1Mクエン酸にま
で濃縮し上述のように17mlのリクロプレツプRP
−18クロマトグラフにかけた。適当な分画を濃厚
区分２として併合した。溶液のPHを1.5単位増大
させた。濃厚区分１および２を併せ濃縮してメタ
ノールを除き、0.1M燐酸カリウムでPH8.0に調整
した。得られた10mlの不透明溶液に、試料を透明
にするのに充分な量のメタノール（7.5ml）を加
えた。この溶液を８mlのリクロプレツプRP−18
樹脂に吸着させることにより脱塩した。樹脂を50
mlの３：７メタノール0.1M燐酸カリウムPH7.0お
よび30mlの３：７メタノール−蒸留水で連続的に
洗浄した。次に、樹脂を30mlの９：１メタノール
−水で溶出した。溶出液は、約21mgの実質上純粋
なデイフイシジンを含んでいた。 Ｄ 抗菌物質デイフイシジンの単離―方法２ 上述Ａ部の水抽出後酢酸エチル溶液2.1リツト
ル中の1.7リツトルを40℃で油状にまで濃縮し、
９：１メタノール−勢で915mlに稀釈した。不溶
物を遠心分離により取り除いた。澄明な遠心分離
液を、９：１メタノール−水で充填したDEAE・
セフアデツクスＡ−25（アセテート・サイクル）
600mlのカラムに20ml／分で吸着させた。この樹
脂を４リツトルの９：１メタノール−水で洗浄し
た。粗デイフイシジン成分を樹脂から９：１メタ
ノール−水中３％塩化アンモニウムで溶出し、そ
の間一連の100ml分画を集めた。450mlの濃厚区
分、分画７−10は高速液体クロマトグラフイー検
定によりデイフイシジン160mgを含んでいた。濃
厚区分を916mlの水で稀釈し、180mlのダイアイオ
ン（Diaion）HP−20樹脂に18ml／分で吸着させ
ることにより脱塩した。樹脂を600mlの水、600ml
の0.1M燐酸カリウムPH7.5および再度600mlの水
で連続的に洗浄した。メタノールによる樹脂の溶
出で１ｇの総固体を含む208mlの抗生物質濃厚区
分を与えた。試料を100mlに濃縮し、233mlの
0.05M燐酸カリウムPH７で稀釈し、190mlのリク
ロプレツプRP−18樹脂、25−40ミクロンのカラ
ム上に仕込んだ。次いで、１：１メタノール−
0.05M燐酸カリウムPH７、10ml／分で（分画１−
40）続いて50％メタノールから90％メタノール緩
衝液の直線勾配により（分画41−280）溶出した。
全分画は各10mlであつた。高速液体クロマトグラ
フイー検定およびビブリオパーコランス
（（Vibrio percolans）に対する生体外（in
vitro）寒天平板拡散検定に基き分画222−237を
まとめた。154mlの濃厚区分は115mlのデイフイシ
ジンを含んでいた。試料を170mlの0.05M燐酸カ
リウムPH７で稀釈し、95mlのフオトマン・パーテ
イシル（Whatman Partisil）M20 10／25ODS
−３カラム（内径2.2cm×25cm）、10ミクロン、上
に吸着させた。カラム10ml／分で65：35メタノー
ル−0.05M燐酸カリウムPH７（分画１−89）、70：
30メタノール−緩衝液（分画90−149）、および
75：25メタノール−緩衝液（分画150−230）で連
続的に溶出した。全分画は各５mlであつた。分画
180−220を併合し、34mlにまで蒸発させた。得ら
れたミルク状の懸濁液が透明になるのに充分な量
のメタノール（11ml）を添加した。その溶液を２
ml／分で18mlのダイアイホンHP−20樹脂上に吸
着させた。樹脂を40mlの33：７メタノール−水で
洗浄した。樹脂をメタノールで溶出し、本質的に
純粋なデイフイシジン・カリウム塩83mgを含む濃
厚区分を得た。水からその抗生物質を凍結乾燥す
ることにより、白色無定形固体を得た。それにつ
いて以下に述べる分析結果が得られた。 デイフイシジンの物理化学的特性 − 水、メタノールおよびエタノールのような低
級アルコールに可溶 − 0.1重量パーセント水溶液のPH6.9 紫外線スペクトル（メタノール中）λmax Ａ１％ １cm 235nm 866 263nm 316 273nm 415 283nm 328 マススペクトルデータ 高分解能質量測により、トリメチルシリル化の
際、試料は分子式C31H45O6P：分子量544（ジ−
TMS誘導体、ｍ／z688.3744）に対応するジ−
TMS誘導体（M+TMS2）としてｍ／z688.3741
の位置に分子イオンを示した。陰イオンFAB
〔Fast Atom Bombardment高速原子衝撃〕分析
の結果はその分子量算定（観察（Ｍ−Ｈ）-、ｍ／
z543）を確証した。1 HNMRスペクトル スペクトルは第１図のように測定された。スペ
クトルは20％CD3OD／CDCl3中22℃（約５mg／
0.35ml）300MHzで記録されており、ケミカルシ
フトは内部標準テトラメチルシランをゼロppmと
した相対値ppmで示されている。13 CNMRケミカルシフト スペクトルは、20％CD3OD／CDCl3中５℃で
記録された。ケミカルシフトは内部標準テトラメ
チルシラン（TMS）のダウンフイールドにppm
で表示されている。HRMSデータと一致して、
31個の炭素原子は以下のケミカルシフトで認めら
れた：16.8、18.7、20.0、23.2、24.9、30.7（2x）、
32.7、35.9、39.0、39.5、41.5、71.7、74.2、11.7、
115.4、120.7、123.6、124.2、125.0、126.1、
127.0、127.2、129.7、133.2、133.7、134.6、
139.1、141.1、146.2、172.7ppm。 実施例 ３ ATCC39374を用いたデイフイシジンおよびオ
キシデイフイシジンの製造 培地の調製 培地Ａは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁す
ることにより調製した。50mlのこの懸濁液を邪魔
板３個つき250mlフラスコおよび500mlを邪魔板３
個つき2000ml容フラススコに分配した。フラスコ
は綿栓し、121℃、約1.26Kg／cm2（18PSI）で30分
間オートクレーブした。 培地Ｂは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁す
ることにより調製した。PHは指示されているよう
に調製し、この培地9.5リツトルを14リツトルの
ニユー・ブランスブイツク・サイエンテイフイツ
ク（New Brunswick Scientific）のミクロフエ
ルム（Microferm）フアーメンター、MF−114
型に仕込んだ。フアーメンターを無撹拌、121℃、
約1.26Kg／cm2（18PSI）で120分間オートクレーブ
した。オートクレーブ後、培地を機械的に撹拌、
通気し、28℃に冷却した。 培地Ｃは以下に挙げた成分を蒸留水中に懸濁
し、沸騰するまで加熱し、18×150mm試験管に12
ml分配することにより調製した。試験管を121℃、
約1.26Kg／cm2（18PSI）で20分間オートクレーブ
の後、試験管を傾斜状に置き、培地がスラントに
固化するようにした。 培養液の調製 ATCC39374培養の凍結乾燥試験管を無菌的に
培地Ａの邪魔板３個つき250ml容フラスコに接種
し、220RPM28℃で24時間インキユベートした。
このタネ培養をＣ培地のスラント12本に接種する
のに用いた。一度接種した後、スラントを96時間
28℃でインキユベートし、冷蔵した。上述のよう
に調製したスラントの一部を培地Ａの250mlフラ
スコに接種するのに用いた。フラスコは
220RPM28℃で24時間インキユベートした。この
第１段階タネフラスコの３％を培地Ａの2000mlフ
ラスコの接種に用い、これも又220RPM、28℃で
24時間インキユベートした。この第２段階タネ・
フラスコを直接フアーメンターの接種に、あるい
は第３段階のタネの接種に用いることができる。
第３段階のタネを用いる際は第２段階のタネの３
％を培地Ａのもう一つの2000mlフラスコへの接種
に用いた。第３段階のタネを28℃、220RPMで24
時間インキユベーシヨン後、そのフラスコを用い
て培地Ｂ含有フアーメンターへ接種した。 デイフイシジンおよびオキシデイフイシジンの生
産 上述のように調製し、前述の第２または第３段
階のタネ・フラスコを接種した培地Ｂを含むフア
ーメンターを28℃、300−400RPM、0.3vvm空気
下でインキユベートした。発泡制御の必要がある
ので無菌ポリグリコールＰ−2000を添加した；フ
アーメンター中のポリグリコールＰ−2000の全量
は１％（ｖ／ｖ）を越えなかつた。発酵は88時間
で終了した。フアーメンターから引き出した試料
をメタノール（全培溶液１部にメタノール２部を
加える）で抽出し、産物形成を高速液体クロマト
グラフイーにより検定した。試料の様相、２つの
発酵の平均値を表に示す。収穫したフアーメン
ターは、処理するまで４−10℃に貯蔵した。 培地Ａ： ｇ／ トリプチカ−ゼペプトン 25 スクロース 10 大豆粉 10 可溶性澱粉 10 CaCO3 10 グルコース ５ 牛肉エキス １ 麦芽エキス １ 酵母エキス １ コーンステイープリカー（Corn Steep
Liquor） 0.5 大豆油 0.1 大豆トリプチカーゼ 0.1 PH 6.8（そのまま） 培地Ｂ：ｇ／ デキストリン 40 ソルラツク（Solulac） ７ 酵母エキス ５ CoCl2−6H2O 0.05 ポリグリコールＰ−2000 ５ml／Ｌ 培地Ｃ： ｇ／ 寒 天 20 麦芽エキス 10 デキストロース ４ 酵母エキス ４ PH7.0 【表】 これらの発酵結果は生産されたデイフイシジ
ン：オキシデイフイシジンの比が約３：１である
点で異常と思われる。この比が約１：１に観察さ
れるのがより普通である。 実施例 ４ デイフイシジンの単離 上述の実施例３で記載された発酵分からの約11
リツトルの全培養液（PH6.5）を約88時間目に収
穫した。培養液PHを水酸化ナトリウム水溶液で
7.3に調整した。培養液に4.8リツトル量のイソプ
ロパノールを添加した。完全に撹拌した後、培養
液を遠心分離で清澄にした。14.4リツトルの清澄
培養液試料を100ml／分で１リツトルのドウエク
ス（Dowex）１×２（Cl-）樹脂50−100メツシユ
に吸着させた。樹脂を２リツトルの蒸留水で洗浄
し、100ml／分で９：１メタノール−水中、３％
塩化アンモニウムにより溶出した。溶出物を８本
の500ml分画に集めた。1.5リツトルの濃厚区分
（分画２−４）を３リツトルの水で稀釈し、100
ml／分でダイアイオンHP−20樹脂の１リツトル
カラム上に吸着させた。樹脂を２リツトルの３：
７メタノール−水、1.5リツトルの0.1M燐酸カリ
ウムPH７および２リツトルの水で連続的に洗浄し
た。樹脂をメタノールで溶出し、2.5ｇの29％純
度のデイフイシジンを得た。溶出液を30mlに濃縮
した。濃縮液10ml（250mlデイフイシジン）を
0.05M燐酸カリウムPH7.1で15.4mlに稀釈し、カー
ル・フイツシヤー（Karl Fsher）分析により分
析した試料中の含水量を50％にした。15.4mlの試
料を１：１メタノール−0.05M燐酸カリウムPH
7.1中100mlのセフアデツクスLH−20樹脂でクロ
マトグラフにかけた。流速は2.5ml／分であつた。
デイフイシジンは保持時間1.75カラム体積で溶出
した。200mlの濃厚区分を150mlの水で稀釈し、８
ml／分で、３：７メタノール−水で平衡化した80
mlのダイアイオンHP−20に吸着させた。樹脂を
100mlの３：７メタノール−水で洗浄し、200mlの
メタノールで溶出した。溶出液濃厚区分は80ml
で、256mgの56％純度デイフイシジンを含んでい
た。溶出液40ml量を４mlに濃縮し、0.03M燐酸カ
リウムPH７で8.2mlに稀釈し、65：35メタノール
−０，03M燐酸カリウム緩衝液で平衡化しておい
た95mlのフオトマン・パーテイシルM20 10／
25ODS−３カラム（10ミクロン）上に仕込んだ。
カラムを75：25メタノール−緩衝液で溶出し、溶
出液を一連の10ml分画に集めた。分画31から40を
併合し、30％以下のメタノールを含む溶液にまで
濃縮し、2.5ml／分で25mlのダイアイオンHP−20
樹脂上に吸着させた。樹脂を100mlの３：７メタ
ノール−水で洗浄した。メタノールでの溶出によ
り54mgのほとんど純粋なデイフイシジンを得た。
抗菌物質は分解を最小にするために−80℃でメタ
ノール中に保存した。一部を水から凍結乾燥し、
物理化学的特性測定用の試料とした。1HNMRス
ペクトルおよびマス・スペクトルはこの産物が上
記の実施例２のＤ工程で評価した産物と同一であ
ることを示した。 実施例 ５ オキシデイフイシジンの製造 オキシデイフイシジンの製造に３つの異なる発
酵過程を用いた。 Ａ 培地の調製 以下に述べる培地Ａは、下に挙げた成分を蒸留
水に溶解し、滅菌前に濃塩酸または50％水酸化ナ
トリウムによりPHを7.0と7.2との間に調整するこ
とによつて調製した。この培50mlを邪魔板３個つ
き250ml容振盪フラスコに分配し、500mlの同一培
地を邪魔板３個つき2000ml容振盪フラスコに分配
した。フラスコを綿栓し、オートクレーブ中で
121℃で25分間加熱することにより滅菌し、室温
にまで冷却した。 培地Ａ ％ デキストロース 0.1 可溶性澱粉 1.0 牛肉エキス 0.3 アルダミン（Ardamine）PH 0.5 NZアミンＥ型 0.5 MgSO4・7H2O 0.005 燐酸緩衝液(1) 2.0ml CaCO3 (2) 0.05％ (1) 燐酸緩衝液 ％ KH2PO4 9.1 Na2HPO4 9.5 PH−7.70 (2) PHを適当なレベルに調整した後添加 以下に述べる培地Ｂは、ニユー・ブランスブイ
ツク・サイエンテイフツク（New Brunswick
Scientific）の栄養滅菌器NS−20型中で、以下に
挙げた成分を蒸留水に懸濁、滅菌前に濃塩酸また
は50％水酸化ナトリウムでPHを7.2および7.4の間
に調整し、121℃、約1.26Kg／cm2（１平方インチ
当り18ポンド）で20分の加熱で滅菌することによ
り調製した。14リツトルの電磁的に組合せたニユ
ー・ブランスブイツク・サイエンステイフイツク
のミクロフエルム（Microferm）フアーメンタ
ー、MF−114型をジヤー中100mlの蒸留水と共に
オートクレーブ内で121℃、約1.26Kg／cm2（一平
方インチ当り18ポンド）で90分間加熱することに
より滅菌した。栄養滅菌器からの9.5リツトルの
冷却培地Ｂを滅菌フアーメンター中に無菌的に移
し温度を約28℃に調整した。 培地Ｂ ％ デキストリン 4.0 譲造可溶物 0.7 酵母エキス 0.5 CoCl2・6H2O 0.005 培養の展開 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39320の凍結乾燥体を無菌的に開き、上述
のように250mlの培地Ａを含むフラスコへの接種
に用いた。フラスコは、220rpm回転振盪機上で
28℃24時間インキユベートした。タネは引続き第
１のフラスコから15mlずつを培地Ａを含む2000ml
振盪フラスコ３本に無菌的に移すことにより増殖
させた。その2000ml振盪フラスコを220rpm回転
振盪機上で28℃24時間インキユベートした。タネ
工程における最終PH測定値は、7.20から8.35の範
囲であつた。 製 造 2000mlフラスコ１本を用いて、前述のように調
製した14リツトル容器の各々へ接種した。接種直
後にフアーメンターの条件を28℃（27.9乃至28.3
℃）、300rpmおよびKdwが2.35×10-4gram、
moles O2／ml／hr／atmに相当する２リツト
ル／分通気に設定した。発酵の間に発泡制御のた
めに必要に応じポリグリコールＰ−2000を添加し
たが、0.04％を越すことはなかつた。接種77時間
後に撹拌および通気を、Kdwが1.3×10-4gram、
moles O2／ml／hr／atmに相当する200rpmおよ
び１リツトル／分に減じた。フアーメンターをイ
ンキユベーシヨン89時間後に収穫した。フアーメ
ンター過培養液試料について抗菌およびPH分析
を行なつた。そのデータを以下に示す： 【表】 B. 培地調製および培養の展開は上のＡに述べ
たのと同じである。 生 産 2000mlフラスコ１本を用いて、前述のように調
製した14リツトル容器の各々に接種した。接種直
後にフアーメンターの条件を28℃（28.0乃至28.3
℃）、300rpmおよびKdWが2.35×10-4gram、
molesO2／ml／hr／atmに相当する２リツトル／
分通気に設定した。発酵中に発泡制御のために必
要に応じてポリグリコールＰ−2000を添加した
が、004％を越すことはなかつた。フアーメンタ
ーを接種後41時間に収穫した。フアーメンター
過培養液試料について抗菌およびPH分析を実施し
た。そのデータを以下に示す： 【表】 Ｃ 培地調製は上のＡに述べたのと同じである。 培養の展開 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCC39320の凍結乾燥菌体を無菌的に開き、上
述のように、250mlの培地Ａを含むフラスコへの
接種に用いた。フラスコは220rpm回転振盪機上
で27℃24時間インキユベートした。タネは引続き
第１のフラスコから２mlずつを培地Ａを含む振盪
フラスコ４本に無菌的に移すことにより増殖させ
た。これら４本のフラスコは220rpm回転振盪機
上で、28℃24時間インキユベートした。24時間
後、４本のフラスコをまとめて15mlずつを培地Ａ
を含む2000ml振盪フラスコ４本に無菌的に移し
た。これら2000mlフラスコを220rpm回転振盪機
上で28℃24時間インキユベートした。タネ工程に
おける最終PH測定値は7.21から8.35の範囲であつ
た。 生 産 2000mlのフラスコ１本を用いて、前述のように
調製した14リツトルフアーメンター容器の各々へ
接種した。接種直後にフアーメンターの条件を28
℃（27.5から28.2℃）400rpmおよびKdwが3.8×
10-gram、moles O2／ml／hr／atmに相当する
３リツトル／分に設定した。発酵中に発泡制御の
ために必要に応じてポリグリコールＰ−2000を添
加したが、0.23％を越えることはなかつた。接種
65時間後に撹拌を200rpmに低下させ、Kdwを
1.75×10-4gram、moles O2／ml／hr／atmに減
少させた。フアーメンターを接種89時間後に収穫
した。４つのバツチを併合し、回分供給式
（batchfed）シヤープレス遠心分離機で
30.000rpmで遠心分離した。上澄をもう２回遠心
分離し、清澄な上澄を得た。フアーメンター過
培養液試料について抗菌およびPH分析を行なつ
た。４本の14リツトル・バツチの平均値のデータ
は以下の通りであつた： 【表】 実施例 ６ オキシデイフイシジンの単離及び精製 Ａ オキシデイフイシジンの予備的精製 上記実施例５に記載した、同一条件で生育させ
た14リツトル発酵４本からの全培養液を併合し、
ターボシヤープレス遠心分離機にかけた。清澄遠
心上澄28.3リツトルを濃塩酸でPH4.8に調整し、
2.1リツトルのローム・アンド・ハース社のアン
バーライトXAD−２樹脂上に吸着させた。次に
樹脂を同じ流速で８リツトルの水により洗浄し
た。抗生物質活性分を樹脂から６リツトルの酢酸
エチルで溶出し、１つの分画に集めた。溶出液は
約0.8リツトルの暗色水性下層を含んでおり、こ
れを取除き廃棄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナ
トリウムで簡単に乾燥し、次に400mlまで濃縮し
た。 粗抗菌成分を、酢酸エチル濃縮物を撹拌しつ
つ、2.5N水酸化ナトリウムで水層のPHを8.5に至
らせつつ150mlの水を用いて水へ逆抽出した。水
性抽出物を除去し、水抽出後の酢酸エチルを再び
PH8.5の100mlの水で抽出した。最終の第３回目の
PH8.5の70mlの水での抽出の後、３つの水性抽出
物を併合し、PH8.5に調整した。最終体積は360ml
試料を−80℃で凍結保存した。 Ｂ ほとんど純粋なオキシデイフイシジンの単離 上記Ａ工程からの併合水性抽出物を融解し、
205mlに濃縮し、15mlの1M燐酸カリウムPH７で緩
衝化した。この溶液215ml量を流速20ml／分で500
mlのダイアイオンHP−20に吸着させた。樹脂を
1.5リツトルの水、1.5リツトルの１：１メタノー
ル−0.1M燐酸カリウムPH７および1.5リツトルの
65：35メタノール−0.1M燐酸カリウムPH７で段
階的に洗浄した。オキシデイフイシジンを９：１
メタノール−水で樹脂から溶出した。溶出物を20
ml分画で集め、高速液体クロマトグラフイーによ
り検定した。分画20から35を併せ、50mlに濃縮
（）した。PH7.5；高速液体クロマトグラフイー
検定によりオキシデイフイシジン430mg。 （）の49ml量（421mgオキシデイフイシジン）
を１：４メタノール−水中リクロプレツプRP−
18樹脂〔イー・メルク（E.Merck）25−40ミクロ
ン〕170mlのカラムに仕込んだ。先ず、カラムを
流速約3.5ml／分で250mlの１：４メタノール−水
により溶出した。溶出物は廃棄した。カラムを次
に同じ流速で１：１メタノール−水により溶出し
た。一連の20ml分画を集めた。紫外線及び高速液
体クロマトグラフイー検定に基き、分画27から38
をほとんど純粋なオキシデイフイシジンとして併
合した。−80℃における保存中の凍結を防ぐため
に、その分画に100mlのメタノールを添加し、メ
タノール濃度を65％にした。最終体積360mlで378
mgのほとんど純粋なオキシデイフイシジンを含
む。 試料は−80℃で保存した（）。 Ｃ オキシデイフイシジンのアルカリ性フオスフ
アターゼによる脱燐酸 薄層クロマトグラフイーシステム：フオトマン
（Whatman）KC18F逆相平板 ９：１メタノール−0.1Mクエン酸ナトリウムPH
6.0 ５mg／mlのオキシデイフイシジン水溶液（上記
Ｂ工程からの試料（）〕100μに10μの
0.25MTRIS塩酸緩衝液および5μの子牛腸粘膜
アルカリ性フオスフアターゼ〔2000単位／ml、ピ
ー・エル・バイオケミカルス社（Ｐ−Ｌ
Biochemicals Inc.）〕を添加した。28℃で60分間
インキユベーシヨンした後に大部分のオキシデイ
フイシジン（Rf0.59）は、燐酸検出用のハーネ
（Hane′s）試薬に陰性の新物質（Rf0.38）に変換
していた。 Ｄ 物理化学的および生物学的特性解析のための
ほとんど純粋なオキシデイフイシジンの単離 上記実施例５に述べたオキシデイフイシジン生
産生物に関する発酵研究の結果から良好な抗生物
質力価を有する３つの培養液が得られた。バツチ 全培養液体積 PH １ 6.7リツトル 6.3 ２ ６リツトル 6.2 ３ 7.3リツトル 6.1 粗オキシデイフイシジンを以下の手法により
各々のバツチよりそれぞれ単離した。全培養液
（６−７リツトル）を濃塩酸でPH4.8に調整した。
後続のXAD−２吸着段階でカラムをつめる可能
性をさけるために培養液を遠心分離にかけ、細胞
体を除くのが有利であることが認められた。しか
し、全培養液から、直接オキシデイフイシジンを
XAD−２樹脂に吸着させることが可能であるこ
とが示された。培養液（清澄化したものまたは全
部）を70ml／分で700mlのローム・アンド・ハー
ス社のAnberite XAD−２樹脂上に吸着させた。
樹脂を2.5リツトルの水で洗浄した。粗オキシデ
イフイシジンを2.5リツトルの酢酸エチルで溶出
した。酢酸エチル溶出液の下部水層を廃棄した；
上層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、約300ml
に濃縮した。酢酸エチル濃縮物はＢ段階で述べた
ようにPH8.5で100ml、50mlおよび30mlの水で連続
的に逆抽出した。併合した水性抽出物をPH6.8に
調整し、−80℃で保存した。 バツチ１、２、および３の水性抽出は、溶け込
んでいる酢酸エチルを除くために各々150−200ml
に濃縮した後、併合した。その溶液を10mlの1M
燐酸カリウムPH７で緩衝化し、流速20ml／分でダ
イアイオンHP−200樹脂上に吸着させた。カラ
ムを1.4リツトルの0.1M燐酸カリウムPH７、1.4リ
ツトルの１：１メタノール−0.1M燐酸カリウム
PH７で連続的に洗浄した。次にカラムを20ml／分
で９：１メタノール−水により溶出した。溶出物
を体積各220ml、100ml、200ml、200mlおよび210
mlの５分画（分画１−５）に集めた。高速液体ク
ロマトグラフイー検定およびビブリオ・パーコラ
ンス（Vibrio percolans）に対する寒天平板拡
散検定に基き、分画３および４をオキシデイフイ
シジン区分（）として併せた；高速液体クロマ
トグラフイー検定により約350mgオキシデイフイ
シジン。 試料（）を45mlに濃縮し、PH7.0に調整した。
濃縮物を水中のリクロプレツプRP−18樹脂（イ
ー・メルク、25−40ミクロン）170mlカラム上に
仕込んだ。カラムを先ず450mlの水で洗浄した。
カラムをさらに600mlの１：１メタノール−水で
次いで1.1リツトルの65：35メタノール−水で溶
出した。溶出液を20ml分画で集めた。紫外線及び
高速液体クロマトグラフイー検定に基き、分画28
−42を併合した。−80℃保存中の凍結を防ぐ目的
で貯めた分画（）に100mlのメタノールを添加
した。体積380ml、試料を凍結乾燥し、238mgのほ
とんど純粋なオキシデイフイシジン（）を得
た。窒素下−80℃で保存した。 Ｅ オキシデイフイシジン（試料）の物理化学
的特性 紫外線スペクトル（0.1M燐酸カリウム中） λMax Ａ１％ １cm 235nm 750 266nm（sh） 304 275nm 376 284nm（sh） 307 （）から（）への凍結乾燥の間に、オキシ
デイフイシジンの10−15％の分解が生じ得る証拠
がある。（）の凍結乾燥重量と（）の紫外線
分析に基いて、Ａ１％ １cm（275nm）−438が算定され
る。 マススペクトルデータ 高分解能質量測定り、電子衝撃マス・スペクト
ル（EI−MS）は、分子式C31H42O3（計算値
462.3134）に対応するM+−H3PO4イオンをｍ／
z462.3095に与えた。高質量領域の他の有意なイ
オンはｍ／z444、381、および349に生じた。トリ
メチルシリル化の際、試料は分子式C31H45O7P
（分子量560）（トリ−TMS誘導体の計算値ｍ／
z776.4089）に対応するトリ−TMS誘導体
（M+・TMS3）としてｍ／z776.4100の位置に分
子イオンを示した。モノ−TMS（mono−TMS）
誘導体としてｍ／z462、381および349に相当する
適切なEI−MSを確証する他の有意なイオンおよ
びその対応する正確な質量値および分子式は以下
のようである： 【表】13 CNMRケミカルシフト スペクトルは、CD3OD／CDCl3（約１：１）
中、０℃（12mg／0.35ml）で記録された。ケミカ
ルシフトは、テトラメチルシラン（TMS）内部
標準のダウンフイールドにppmで与えられてい
る。マス・スペクトル・データと一致して、31個
の炭素原子は以下のケミカルシフトで認められて
いる： 16.3、16.7、18.8、24.1、26.1、31.3（2x）、33.5、
36.2、41.8、46.6、72.5、74.5、75.2、114.1、
115.4、121.3、124.8、125.0（2x）、125.2、126.6、
127.3、129.4、133.9、134.0、137.1、139.0、
141.2、144.6、173.5ppm。 33.5および72.5ppmのピークは、燐酸基の31Pと
のカツプリングによつて二重線として出現してい
る。1 HNMRスペクトル スペクトルは第２図のように測定された。スペ
クトルは、300MHz、CD3OD／CDCl3（約１：１）
中０℃（約４mg／0.35ml）で記録された。ケミカ
ルシフトは内部テトラメチルシランをゼロppmと
した相対値ppmで示されている。 薄層クロマトグラフイーデータ − フオトマンKC18F逆相平板 ９：１メタノール−0.1Mクエン酸ナトリウム、
PH6.0 Rf＝0.59 − 視覚化の方法 １ 短紫外線光下の照明 ２ 燐酸エステルにたいするハーネ（Hane′s）
試薬（モリブデン酸アンモニウム−HClO4）
噴霧 マススペクトルの結果は、抗生物質オキシデイ
フイシジンの分子式をC31H45O7P（分子量560）と
確定した。トリス（トリメチルシリル）−オキシ
デイフイシジンの分子イオンからH3PO4・
2TMSが容易に消失することは燐原子が、燐酸モ
ノエステルとして存在することを示唆する。この
ことは、ハーネ試薬試験（薄層クロマトグラフイ
ー）陽性および上詰Ｃ段階に示したアルカリ性フ
オスフアターゼによりオキシデイフイシジンが容
易に失活することで支持される。NMRデータ
は、オキシデイフイシジンの構造が燐酸に加えて
以下のものを含むことを示唆する。 − ８つのオレフイン結合、その中２つは末端の
メチレン − １つのエステルまたはラクトン機能 − １つの水酸基および − アつの環
第１図は実施例２において得られたデイフイシ
ジンの1H−NMRスペクトル（20％ CD3OD／
CDCl3中、22℃、300MHz）である。第２図は実
施例６において得られたオキシデイフイシジンの
1H−NMRスペクトル〔CD3OD／CDCl3（約１：
１）中、０℃、300MHz）である。
ジンの1H−NMRスペクトル（20％ CD3OD／
CDCl3中、22℃、300MHz）である。第２図は実
施例６において得られたオキシデイフイシジンの
1H−NMRスペクトル〔CD3OD／CDCl3（約１：
１）中、０℃、300MHz）である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、RaおよびRbが水素；アルカリ金属お
よびアルカリ土類金属陽イオン；アンモニウム；
および置換アンモニウムからなる群より独立して
選択された置換基であり、またR1は水素または
水酸基である）を有する化合物。 ２ R1が水素である特許請求の範囲第１項に記
載の化合物デイフイシジン。 ３ R1が水酸基である特許請求の範囲第１項に
記載の化合物オキシデイフイシジン。 ４ バチルス属に属する、式 （式中、RaおよびRbが水素；アルカリ金属お
よびアルカリ土類金属陽イオン；アンモニウム；
および置換アンモニウムからなる群より独立して
選択された置換基であり、またR1は水素または
水酸基である）の化合物（）生産菌を、水性栄
養培地中、制御された好気性条件下で培養して化
合物（）を回収する化合物（）の製造方法。 ５ 生産菌がバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）ATCC39320である特許請求の範囲第４
項記載の製造方法。 ６ 生産菌がバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）ATCC39374である特許請求の範囲第４
項記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US503951 | 1983-06-13 | ||
| US06/503,951 US4545991A (en) | 1983-06-13 | 1983-06-13 | Difficidin and derivative antibacterials |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6069085A JPS6069085A (ja) | 1985-04-19 |
| JPH0460474B2 true JPH0460474B2 (ja) | 1992-09-28 |
Family
ID=24004207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59120045A Granted JPS6069085A (ja) | 1983-06-13 | 1984-06-13 | デイフイシジンおよび誘導体抗菌物質 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4545991A (ja) |
| EP (1) | EP0128505B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6069085A (ja) |
| DE (1) | DE3483374D1 (ja) |
| ES (1) | ES533101A0 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4609742A (en) * | 1985-02-04 | 1986-09-02 | Merck & Co., Inc. | Difficol, intermediate in antibiotic preparation |
| US4816448A (en) * | 1987-02-05 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Thermal isomer of difficidin and thermal isomer of oxydifficidin antibacterials |
| US5430053A (en) * | 1994-04-19 | 1995-07-04 | Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University | Isolation and structure of dictyostatin 1 |
| WO2002044350A2 (de) | 2000-11-28 | 2002-06-06 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Cyclodextrin-glucanotransferase (cg tase) aus bicillus agaradherens (dsm 9948) sowie wasch- und reinigungsmittel mit dieser neuen cyclodextrin-glucanotransferase |
| US7247299B2 (en) * | 2002-11-27 | 2007-07-24 | Kemin Industries, Inc. | Antimicrobial compounds from Bacillus subtilis for use against animal and human pathogens |
| EP2179652B1 (de) * | 2008-09-10 | 2019-05-08 | ABiTEP GmbH Gesellschaft für AgroBioTechnische Entwicklung und Produktion | Verwendung eines antibakteriellen Mittels zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Kulturpflanzen |
| BE1025305B1 (fr) * | 2017-12-08 | 2019-01-11 | Ets Pollet Sa | Composition détergente |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE351494B (ja) * | 1970-07-13 | 1972-11-27 | Food Control | |
| DE2035812A1 (de) * | 1970-07-18 | 1972-02-03 | Farbwerke Hoechst AG, vorm. Meister Lucius & Brüning, 6000 Frankfurt | Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
-
1983
- 1983-06-13 US US06/503,951 patent/US4545991A/en not_active Expired - Fee Related
-
1984
- 1984-06-04 ES ES533101A patent/ES533101A0/es active Granted
- 1984-06-06 DE DE8484106408T patent/DE3483374D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-06-06 EP EP84106408A patent/EP0128505B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-13 JP JP59120045A patent/JPS6069085A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0128505B1 (en) | 1990-10-10 |
| ES8602942A1 (es) | 1985-12-01 |
| US4545991A (en) | 1985-10-08 |
| EP0128505A2 (en) | 1984-12-19 |
| JPS6069085A (ja) | 1985-04-19 |
| ES533101A0 (es) | 1985-12-01 |
| EP0128505A3 (en) | 1987-06-03 |
| DE3483374D1 (de) | 1990-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1724015A3 (ru) | Способ получени гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С или их солей, штамм актиномицета NocaRDIa оRIеNтаLIS NRRL 18098-продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С, Штамм актиномицета NocaRDIa оRIеNтаLIS NRRL 18099-продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С и штамм актиномицета NocaRDIa оRIеNтоLIS NRRL 18100-продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С. | |
| JP5729919B2 (ja) | チアクマイシン生産 | |
| EP0231111B1 (en) | Glycopeptide antibiotics, their preparation and use and microorganisms for producing them | |
| KR960013432B1 (ko) | 항균제 fr109615 및 이의 제조방법 | |
| JPH0460474B2 (ja) | ||
| US4681846A (en) | Process for the preparation of difficidin and derivative antibacterials | |
| US4341768A (en) | Antibiotic compounds | |
| US4282322A (en) | Process for enzymatic deacylation of antibiotics | |
| EP0253413B1 (en) | New antibiotics called "mureidomycins a, b, c and d" a process for their preparation and their therapeutic use | |
| US4360593A (en) | Process of producing a peptide antibiotic with Bacillus circulans | |
| JPH0430400B2 (ja) | ||
| EP0413967B1 (en) | Novel antibiotic | |
| US4264734A (en) | Process for producing antibiotic desacetyl 890A10 | |
| US4262002A (en) | Discovery of A73A, a new efrotomycin-like antibiotic in fermentation broth | |
| US4950605A (en) | FR-900493 substance, a process for its production and a pharmaceutical composition containing the same | |
| EP0010964A1 (en) | Ravidomycin, process of preparation and pharmaceutical compositions containing same | |
| KR820002138B1 (ko) | A-40104 항생물질의 제조방법 | |
| JP2002226499A (ja) | 抗生物質ｇｅ２３０７７、その医薬上許容される塩および組成物ならびにそれらの用途 | |
| NZ533732A (en) | Antibiotics GE 81112 factors A, B, B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| EP0216636A2 (en) | Process for producing oganomycin E | |
| US4304859A (en) | Process for producing A73A, a new Efrotomycin-like antibiotic in fermentation broth | |
| KR100349771B1 (ko) | 항생물질스탈로바신 | |
| EP0424051A1 (en) | Glycopeptide antibiotics | |
| GB2093017A (en) | Polyene antibiotics | |
| JPS60192593A (ja) | Ｆｒ−９００４６２物質 |