KR100349771B1

KR100349771B1 - 항생물질스탈로바신

Info

Publication number: KR100349771B1
Application number: KR1019960704799A
Authority: KR
Inventors: 시게오 야기; 분지 가게야마; 요시미 가와무라; 고이치 마쓰모토; 도시유키 가미가우치; 시게루 마쓰타니; 스스무 가마타
Original assignee: 시오노기세이야쿠가부시키가이샤
Priority date: 1994-03-01
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 2002-12-11
Also published as: DE69527777D1; DE69527777T2; ATE222262T1; CN1065538C; CA2183951A1; JPH07242686A; JP3568978B2; CN1142230A; WO1995023812A1; EP0748335A1; KR970701205A; MX9603613A; EP0748335B1; ES2181768T3; TW318853B

Abstract

본 발명은 표 1에 나타낸 바와 같은 물리-화학적 특성을 갖는 신규한 항생물질 스탈로백신(stalobacin) H 및 I를 제공하는 것이고, 이것은 그램 양성균에 대해 현저한 효과를 나타내는 우수한 항생물질이다.

Description

항생물질 스탈로바신

특정 항생물질의 항균활성은 치료되는 세균의 성질에 따라 변화하고, 저항성 균주의 출현으로 인하여 항생물질의 효과가 자주 감소한다. 최근, 다중 내약물성 세균의 출현이 큰 문제가 되고 있다. 따라서, 신규하고 효과적인 항생물질을 개발하는 것이 효과적인 치료를 수행하는데 바람직하다. 이밖에도, 포도상구균, 용혈성 연쇄구균등과 같은 그램 양성균(Gram positive bacteria)은 항생물질에 내성이고, 이들 그램 양성균에 큰 효능을 갖는 신규한 항생물질의 개발이 계속 필요하다.

본 발명은 신규한 항생물질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항생물질을 생성하는 미생물인 슈도모나스(Pseudomonas)종 PBJ-5360-STR-1-21에 의해 생성된 항생물질 스탈로바신(stalobacin) H 및 I, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1은 스탈로바신 H의 IR 스펙트럼을 도시한 그래프이다.

도 2는 스탈로바신 I의 IR 스펙트럼을 도시한 그래프이다.

도 3은 스탈로바신 H의 NMR 스펙트럼을 도시한 그래프이다.

도 4는 스탈로바신 I의 NMR 스펙트럼을 도시한 그래프이다.

[실시예]

본 발명은 하기에 예시한 실시예 및 실험으로 더 상세하게 설명될 것이다.

[실시예 1]

(a) 발효단계:

2L용량의 삼각 플라스크에 1.0% 글루코즈, 0.5% 효모 추출물[디프코(Difco)] 및 수도물로 이루어지는 800ml의 배지(2N-NaOH로 pH 7로 조정됨)에 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21(2ml 바이알에서 -80℃로 유지됨)의 종자 균주를 접종시키고, 상기 생성 혼합물을 180rpm에서 70mm의 진탕폭으로 28℃에서 22시간동안 진탕배양하였다. 상기 배양물(800ml)을 30L의 자아 발효기(jar fermenter)중의 1.0% 글루코즈, 0.4% 효모 추출물(디프코), 1.0% 맥아 추출물(디프코), 0.1% 폴리펩톤[니폰 세이야쿠(Nippon Seiyaku)] 및 수도물을 함유하는 20L의 배지(2N-NaOH로 pH 7로 조정점)에 접종하였고, 생성 혼합물을 200rpm에서 0.35kg/cm²G의 내압하에서 14L/min으로 통기시키면서 28℃에서 21시간동안 교반하며 배양하였다.

그런 다음, 8L의 이 배양물을 250L 탱크중의 2.0% 가용성 전분, 2.0% 분말상 효모, 1.5% β-사이클로덱스트린, 0.5% 올리브유, 0.3% 염화마그네슘 · 6H₂O, 0.1% 이수소인산칼륨, 0.0008% 소포제 아데카놀(ADECANOL)[아사히 덴카 고교(Asahi Denka Kogyo)] LG109 및 수도물을 함유하는 125L의 배지(2N-NaOH로 pH 7로 조정됨)에 접종하였고, 생성 혼합물을 0.35kg/cm²G의 내압하에서 65L/min으로 통기시키면서 350rpm에서 28℃에서 72시간동안 교반하며 배양하였다.

(b) 분리단계:

선행단계에서 얻은 138L의 배양물을 1.4L의 클로로포름에 가하여 살균하였다. 그런 다음, 15L의 앰버라이트(Amberlite) XAD-7[오가노(Organo)]을 가하였고 생성 혼합물을 3시간동안 교반 혼합하여 수지상에 활성물질을 배치(batch)흡착하였다. 상기 수지를 #140 메쉬 스테인레스 강 체를 사용하여 회수하였다. 상기 수지를 물로 세척하고, 유리칼럼(내경: 20cm)에 넣고 40L의 물, 40L의 30% 메탄올 및 20mM 인산 염 완충액(pH 7.5)중의 50% 메탄올 15L로 세척하였고, 상기 활성물질을 20mM 인산 염 완충액(pH 7.5)중의 60% 메탄올 40L로 용출시켰다.

에스. 아우레우스(S. aureus) JC-1에 항균활성을 나타내는 분획(20L)을 수집하고, 진공하에 3L로 농축하였다. 상기 농축물을 3L의 에틸 아세테이트로 세척하여 친유성 물질을 제거하였다. 수성층에 함유된 에틸 아세테이트를 진공하에 증발시켰다. 상기 활성물질을 1L 칼럼(내경 6.5cm)중에 앰버라이트 XAD-7(오가노)상에 흡착시키고, 수지를 2L의 물로 세척하였다. 2L의 30% 수성 MeOH 및 3L의 50% 수성 MeOH를 사용하여 용출을 수행하였다. 용출된 분획을 HPLC 분석하였고, 스탈로바신을 함유하는 분획들을 수집하고, 2N-HCL로 pH 7.0으로 조정하고, 진공중에서 농축하고 동결건조하여 3890mg의 분말을 얻었다.

(c) 정제단계:

제 1 정제단계:

선행단계에서 얻은 1820mg의 조분말을 60ml의 20mM 인산염 완충액(pH 7.5)내에 용해시켰다. 상기 용액을 YMC ODS 칼럼[S-15/30μ, 5.0 × 50cm, 용출액: 아세토니트릴/20mM 인산염 완충액(pH 7.5). 50mM 황산나트륨= 40/60, 유속: 50ml/min, UV 감지; 210nm]을 사용하며 제조용 고속 액체 크로마토그래피를 수행하여 스탈로바신 H 및 I를 주요성분으로 함유하는 분획(2.4L)을 얻었다. 상기 분획중의 아세토니트릴을 증류하고 잔사를 Diaion HP-20[미쓰비시 가세이 코포레이션(Mitsubishi Kasei Corporation)]의 칼럼을 통과시켰다. 상기 수지를 물로 세척하였고, 흡착된 성분을 60% 수성 아세톤으로 용출시켰다. 용출물중의 아세톤을 진공하에 증류하고 잔사를 동결건조하여 126mg의 분말을 얻었다.

제 2 정제단계:

상기 단계에서 얻은 분말을 하기의 조건하에서 제조용 고속 액체 크로마토그래피를 수행하여 정제하고 스탈로바신 H 및 I를 얻었다.

상기 분말(126mg)을 7ml의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)중에 용해시켰다. 한절차 당 15mg의 시료를 Asahipak ODP-90 칼럼(내경 21.5mm x 300mm, 용출액: 20mM AcOH 아세토니트릴 용액/ 20mM AcOH 수용액 = 40/60, 유속: 8ml/min, UV 감지: 22nm)내에 적재하고, 144ml 내지 184ml의 분획으로부터 스탈로바신 H를 수집하고 216ml 내지 288ml의 분획으로부터 스탈로바신 I를 수집하였다. 이 분획화를 반복하고, 수집된 분획들을 수성 1N-NaOH로 pH 7.0으로 중화시켰다. 아세토니트릴을 진공중에서 증류하고 5% NaCl 농도를 얻도록 NaCl을 잔여물에 가하였다. 생성된 혼합물을 1N NaOH로 pH 7.5로 조정하고 5% NaCl 수용액으로 평형화된 MCI GEL CHP20P 칼럼(75 내지 150μ, 미쓰비시 가세이)을 통과시켰다. 칼럼을 물로 세척하고 70% 수성 MeOH로 용출시켰다. 용출물중의 MeOH를 진공중에서 증류하고 잔사를 동결건조하여 12mg의 순수한 스탈로바신 H 및 38mg의 순수한 스탈로바신 I를 얻었다.

실시예 1에서 얻어진 스탈로바신 H 및 I의 물리-화학적 특성을 표 2에 나타낸다. 스탈로바신 H 및 I의 IR 스펙트럼을 도 1 및 도 2에 각각 도시하고, 스탈로바신 H 및 I의 NMR 스펙트럼을 도 3 및 도 4에 각각 도시하였다.

실험 1

시험관내 및 생체내에서의 항균활성

1) 시험관내에서의 항균활성:

실시예 1에서 얻은 항생물질 스탈로바신 H 및 I의 시험관내에서의 항균활성을 한천 희석법으로 시험하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

2) 생체내에서의 항균활성:

스탈로바신 I의 생체내에서의 항균활성을 시험하였다. 마우스에게 전염성 세균을 복막내 투여하였다. 주입한지 한시간 후에, 시험 화합물을 피하 투여하였다. 투여 후 7일째에 생존율을 기준으로하여 ED₅₀값을 계산하였다. 한천 희석법에 따라 MIC를 측정하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

전신성 감염된 마우스에서의 스탈로바신 I의 보호효과:

실험 2

PBJ-5360 및 PBJ-5360-STR-1-21의 세균학적 특성:

상기한 PBJ-5360 균주의 돌이변이체로서 본 발명의 PBJ-5360-STR-1-21을 얻었다. 일본 교토에서 수집한 토양으로부터 PBJ-5360을 단리시켰다. 본 발명의 PBJ-5360-STR-1-21의 다양한 세균학적 특성을 하기에 나타낸다. 배양은 주로 28℃에서 실행하였다.

A. 형태학:

이것은 그램 음성 간균이다. 이것의 크기는 0.3 내지 0.5(㎛) x 0.8 내지 1.3(㎛)이다. 이것은 하나이상의 극성 편모로 격렬하게 움직인다.

B. 배양물의 특성

1) 고기 추출물 배지중의 배양:

세균이 성장하는 것이 거의 관찰되지 않았다. 회색 반투명 침전물이 시험관의 기부에서 매우 경미하게 형성되었다.

2) 고기 추출물 한천 천자배양:

자상선을 따라 실 형태 또는 작은 유두 형태로 성장하는 것을 관측하였다. 기체 발생 또는 안료의 생성이 관측되지 않았다. 붉은색을 띤 얇은 세균성 플라그가 표면에 나타났지만, 이 세균성 플라그는 시간이 경과함에 따라 반투명이 되고 연노랑색을 나타내며 몇몇 장소에서 사마귀형 돌기가 관측되었다. 이것은 호기성균이다.

3) 고기 추출물 한천 사면배양:

세균의 성장은 그렇게 빠르지 않았고 2일후에 28℃에서 시작하였다(나안으로 관찰함). 세균은 실 형태로 성장하였고, 이것의 세균성 플라그는 반투명하고 노란빛을 나타내었고, 반점의 외형을 갖고 평평하게 팽윤하였다. 그의 둘레는 결함이 없는 둘레였다. 이어서, 세균성 플라그는 광택이 있는 실 형태 또는 사마귀 형태로바람직하게 성장하였다. 따라서, 습윤성의 반투명하고 경미하게 붉은색을 띤 갈색 세균성 플라그를 얻었다. 둘레는 파형 또는 장파형이었다. 임의의 기체 또는 안료의 생성이 관찰되지 않았다.

4) 고기 추출물 젤라틴 천자배양:

배양을 실온(22 내지 25℃)에서 실행하였다. 젤라틴이 약간 액화되었다.

5) 고기 추출물 한천 평면 배지상의 배양:

세균의 성장은 그렇게 빠르지 않았다. 콜로니는 2일후에 28℃에서 볼 수 있게 되었다. 상기 콜로니는 초기에는 작고, 반점이고, 반투명이고, 갈색이며, 결함이 없는 둘레를 가졌다. 콜로니는 그의 팽화를 관찰하기에는 너무 작았다. 이어서, 콜로니는 반점 또는 원형으로 성장하였고, 결함없는 둘레를 가지며, 팽화는 평평하거나 볼록한 원형이었다. 콜로니는 반투명하고 광택있는 갈색이었다. 기체 또는 가용성 안료가 생성되지 않았다.

6) 리트머스유(litmus milk) 배양물중의 특성:

산이 형성되지 않고, 펩톤화가 일어났지만 14일후에 반응이 시작되었다. 따라서, 상기 반응은 다소 느렸다. 기체가 방출되지 않았다.

C. 생리학적 및 생화학적 특성

1) 카탈라아제(catalase) 시험: 양성

2) 산화효소 시험: 양성

3) OF-시험: 음성(알칼리성을 나타냄)

4) 용혈성 시험: 양성(약함)

5) 5℃에서 생존성 시험: 음성

6) H₂S의 생성: 음성

7) 질산염 감소: 양성

8) 탈질소화 시험: 음성(질소기체가 방출되지 않지만 NO₂-가 감소하는 것으로 보임)

9) 시트르산 이용성: 음성[크리스텐센(Christensen) 배지 및 시몬스(Simons) 배지]

10) NAC 한천 배지상의 성장: 음성(생존 불능)

11) 인돌의 생성: 음성

12) 포게스-프로스카워(Voges-Proskauer) 반응(포게스-프로스카워 시험): 음성

13) 메틸 레드(Methyl Red) 시험: 음성

14) 아르기닌 디하이드롤라제 시험: 약한 양성

15) 리신 데카복실라제 시험: 양성

16) 오르니틴 데카복실라제 시험: 양성

17) 에스쿨린 가수분해: 음성

18) 디엔아제(DNase) 시험: 음성

19) 전분 가수분해: 음성

20) ONPG 시험(37℃에서 배양됨): 음성

21) 아실아미다제 시험: 양성

22) 포스파타제 시험: 양성

23) 키틴 가수분해: 음성

24) 수크로즈로부터 레반의 생성: 양성

25) 당으로부터 산 및 기체의 생성: 글루코즈, 프룩토즈, 갈락토즈, 만노즈, 크실로즈, 아라비노즈, 말토즈, 락토즈, 람노즈, 수크로즈, 셀로비오즈, 트레할로즈 및 만니톨 등의 13개의 당으로부터는 산 또는 기체가 생성되지 않음

26) 세포내에 폴리-β-하이드록시부티레이트의 축적: 음성

27) 탄소 공급원의 이용: 미네랄을 함유하는 배지상에서 글루코즈 및 칼슘 2-케토글루코네이트가 세포형성을 위한 유일한 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다.

이 경우에, 성장을 위한 특정 비타민이 필요없는 것으로 보인다. 반면에, D-(+)-트레할로즈, DL-아르기닌, 게라니올, β-알라닌, L-발린 및 이노시톨은 이용되지 않았다.

28) G+C 몰%(HPLC 방법): 60.4%(A+T 몰% = 39.6%)

상기 시험결과에서, PBJ-5360-STR-1-21은 호기성 그램 양성균이고, 하나이상의 극성 편모를 사용하여 액체 배지중에서 활발히 움직인다. 이것은 카탈라아제에 대해 양성이고 산화 효소를 함유한다. 이것은 OF-시험(알칼리성으로 나타남)에 대해 음성이었다. 이들을 관찰할 때, 본 세균들은 슈도모나다세(Pseudomonadaceae)과 중의 슈도모나스속에 속하는 것이 명확하다.

본 발명자들이 상기 성질을 세포중에 폴리-β-하이드록시부티레이트(PHB)를축적할 수 없는 세균 복합체(이 복합체는 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol, 1(1984) on Genus Pseudomonas]에 기술되어 있다)의 성질과 비교했을 때, 본 발명자들은 상술한 특성에 일치하거나 유사한 특성을 갖는 어떠한 세균도 발견하지 못하였다. 이 세균은 아르기닌을 가수분해시키고 리신 및 오르니틴을 탈카복시화 시키므로 슈도모나스의 매우 비정상적인 균주로 보인다. 60.4%의 G+C 몰% 값은 상기 균주가 슈도모나스중에서 낮은 G+C 값을 갖는 그룹에 속한다는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 언급한 다양한 특성면에서, 본 발명의 세균은 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21로 확인되었다. 이들 특성은 모체 균주 PBJ-5360의 특성과 일치하였다.

본 발명은 상술한 슈도모너스종 PBJ-5360-STR-1-21에 의해 생성된 항생물질 스탈로바신 H 및 I로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 항생물질 스탈로바신을 제공한다. 이들 항생물질은 상기 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21에 의해 생성된 펩티드 항생물질이다. 스탈로바신 H 및 I(이후로는 가끔 단지 "스탈로바신"이라 칭함)는 상기 슈도모나스의 배양에 의해 매우 연관된 유사체의 혼합물 형태로 얻어진다. 그들의 항균작용은 공지된 항생물질보다 더 강력하다. 스탈로바신 H 및 I는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 물리-화학적 특성을 갖는다.

[표 1]

상기 특성을 특징으로 하는 본 발명의 항생물질 스탈로바신은 특히 그램 양성균에 강력한 효과를 나타내는 시험관내 및 생체내에서 우수한 항균활성을 갖는 것으로 밝혀지고 있다.

따라서, 본 발명의 항생물질 스탈로바신은 우수한 활성을 나타내고, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 특히 그램 양성균에 대하여 더 높은 활성을 갖는다.

300mg/kg 및 500mg/kg의 항생물질 스탈로바신을 마우스에게 정맥내 투여하는 급성 독성시험으로는 사망하지 않는다는 것을 관찰하였다.

본 발명의 항생물질 스탈로바신 H 및 I는 슈도모나스종 PBJ-5360(BIKOKEN 기탁 번호 제 10578 호, FERM BP-4342)로부터 유도된 균주인 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21을 배양하여 생성되고, 이것은 통상적인 방법으로, 동화작용가능한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기염을 함유하는 액체 배지내에서 호기성으로 스탈로바신의 혼합물을 생성한다. 이 세균은 하기에 기술된 실험 2의 방법에 따라 배양하고 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1(1984)]에 기술된 것을 참고로하여 그것의 형태, 배양 특성, 생리학적 및 생화학적 특성을 포괄적으로 시험하므로써 상기 언급한 균주임이 확인되었다. 이 균주는 자발적 또는 인위적인 돌연변이를 겪을 수도 있고, 균주가 본 발명의 스탈로바신을 생성하는 능력을 유지하는 한 이러한 돌연변이체는 본 발명의 범위내에 포함되어야 한다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 명백하다. 따라서, 본 발명은 또한 신규한 항생물질 스탈로바신 H 또는 I를 생성하는 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21 및 상기 항생물질 스탈로바신을 생성하는 능력을 갖는 그의 돌연변이체를 제공한다. 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21은 1994년 2월 16일자로 일본 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1-1-3소재의 네쇼날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼 테크놀러지(Institute of Bioscience and Human Technology)에 기탁번호 제 FERM P-14149호로 기탁되었고, 상기 기탁물은 1994년 4월 28일자로 부다페스트 조약의 국제 기탁 기관에 기탁번호 제 FERM BP-4661 호로 양도되었다.

또한, 본 발명은 이러한 균주를 배양하여 항생물질 스탈로바신 H 및 I를 생성하는 방법을 제공한다.

항생물질의 생성을 위해 통상적인 배양에 사용되는 배지의 일반적인 조성 및 일반적인 조건을 사용할 수 있다. 원칙적으로, 배지는 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염등을 포함한다. 필요한 경우에, 비타민, 전구체등을 첨가할 수 있다. 탄소 공급원의 실례는 글루코즈, 전분, 덱스트린, 글리세린, 당밀, 유기산등이고, 이들 탄소 공급원은 단독으로 또는 이들의 혼합물로 사용될 수도 있다. 질소 공급원의 실례는 대두 분말, 옥수수 침지액, 고기 추출물, 효모 추출물, 면실 분말, 펩톤, 밀 배(胚), 황산암모늄, 질산암모늄등이고, 이들 질소 공급원은 단독으로 또는 이들의 혼합물로 사용될 수도 있다. 무기염의 실례는 탄산칼슘, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산구리, 염화망간, 황산아연, 염화코발트, 다양한 인산염등이다. 이들 무기염은 필요한 경우에 배지에 가해질 수도 있다. 충분한 양의 항생물질 스탈로바신 H 및 I는 본 발명의 슈도모나스종 PBJ-5360-STR-1-21을 적절한 매개체로 20 내지 35℃, 바람직하게는 25 내지 29℃에서 약 1 내지 7일동안 배양하여 생성된다. 필요한 경우에, 통상적인 방법으로 배양물로부터 상기 생성물을 분리하고정제한다. 이러한 모든 방법들은 당해분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다.

본 발명의 항생물질 스탈로바신은 생체내 및 시험관내에서 현저한 항균활성을 나타내기 때문에, 다양한 감염의 치료, 특히 다중 내약물성 그램 양성균에 의해 야기된 감염의 치료에 유용한 것으로 생각된다.

Claims

하기에 나타낸 바와 같은 물리-화학적 특성을 갖는 스탈로바신(stalobacin) H 및 스탈로바신 I로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 항생물질 스탈로바신:
제 1 항에 기술한 바와 같은 항생물질 스탈로바신을 생성하는슈도모나스종(Pseudomonas)종 PBJ-5360-STR-1-21.
슈도모나스속에 속하고 제 1 항에 기술한 바와 같은 항생물질 스탈로바신을 생성하는 미생물을 배양하고, 배양물로부터 항생물질 스탈로바신을 분리 및 회수하는 것을 포함하는, 제 1 항에 정의된 항생물질 스탈로바신의 제조 방법.