SU1724015A3 - Способ получени гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С или их солей, штамм актиномицета NocaRDIa оRIеNтаLIS NRRL 18098-продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С, Штамм актиномицета NocaRDIa оRIеNтаLIS NRRL 18099-продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С и штамм актиномицета NocaRDIa оRIеNтоLIS NRRL 18100-продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С. - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к способам получени  новых гликопептидных антибиотиков группы ванкомицина, в частности антибиотика А82846 и его компонентов А82846А, А82846В и А82846С культивированием новых штаммов микроорганизмов, Штамм Nocardia orientalis NRRL 18098 или NRRL 18099, или NRRL 18100 культивируют в глубинных услови х при аэрации и перемешивании в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли. Антибиотический комплекс выдел ют из культуральной жидкости, очищают и хроматографически раздел ют на составл ющие компоненты, обладающие антибиотической активностью. Компоненты могут быть преобразованы в соль, дл  чего очищенный раствор комплекса подкисл ют до рН на уровне 3. На основе компонентов или их солей могут быть приготовлены различные лекарственные формы. 4 с.п,ф-лы, 2 з.п.ф-лы, 3 ил., 3 табл. 18100 в питательной среде, содержащей усво емые источники углерода, азота и неорганические соли. Гликопептидные антибиотики произвольно названы как А82846 и его компоненты . По своему строению антибиотик А82846 аналогичен ванкомицину, но обладает большей in vlrto и in vivo активностью по отношению к грамположительным бактери м, а также лучшей фармокинетикой, что про вл етс  в гораздо большем периоде полураспада , чем у ванкомицина. VI ю 4 О сл 00

Description

фо-, сорбинова , пикринова , бензойна , корична  и т.п. кислоты.

Фармацевтически приемлемые соли с кислотами образуют особенно предпочтительную группу солей по изобретению.

Антибиотик А82846 может быть получек культивированием в услови х аэробного глубинного брожени  в соответствующей культурной среде штамма Nocardia orientalis, продуцирующего А82846, до мо- мента достижени  достаточной антибиотической активности. Антибиотик может быть выделен различными хорошо известными способами выделени  и очистки.

Изобретение также относитс  к биоло- гически чистым культурам микроорганизмов: Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 18100.

Штамм NRRL 18098 обозначен как куль- тура А82846, штамм NRRL 18099 - как культура А82846.1 и штамм NRRL 18100 - как культура А82846.2. Культура А82846 выделена из образца почвы с острова Гаити. Культура А82846.1 получена путем химического мутагенеза культуры А82846, а культура А82846.2 представл ет собой природный вариант, выделенный из культуры А82846.

Культуры А82846, А82846.1 и А82846.2 депонированы в коллекции культур штам- мов Регионального исследовательского центра Нофтери Мивест Эриа сельскохоз йственной исследовательной службы, Министерства сельского хоз йства США. При депозитировании культуры получили регистрационные номера NRRL 18098 (А82846, основной штамм), NRRL 18099 (А82846.1 мутантный штамм), и NRRL 18100 (А82846.2, вариантный штамм);

Морфологи  изучена с использованием оптического микроскопа. Дл  изучени  орнаментации поверхности пор использован электронный сканирующий микроскоп (Э СМ).

Дл  присваивани  наименований цвета использованы Центроидные цветовые таблицы ISCC-NBS, стандартный образец № 106 (Национальное бюро стандартов (NBS), 1958, Торгова  Палата США, а также ежегодник гармонии цвета.

Характеристика культур. Культуры А82846 и А82846.2 хорошо растут на всех использованных сложных средах. Культуры на большинстве сред образуют воздушный мицелий. Окраска массы воздушных спор бела  или сера  в зависимости от характера среды. На большинстве сред происходит образование четко определ емого растворимого пигмента, окраска обратной стороны от коричневой до желтовато-белой.

Культура А82846.1 также растет на всех использованных средах, однако рост этой культуры не такой изобильный, как у основной культуры. Культура А82846.1 образует воздушный белый мицелий только в редких случа х. На нескольких средах происходит образование случайного плохо различимого светло-коричневого растворимого пигмента; обратна  сторона имеет окраску от коричневой до желтоватой.

Характеристика культур А82846, А82846.1 и А82846.2 суммирована в табл.1.

Культуры А82846 и А82846.1 очень похожи , отличаютс  лишь немногими свойствами . Вследствие их схожести и поскольку А82846.2  вл етс  природным вариантом А82846 дальнейшее сравнение не проводилось .

Морфологические признаки. Культуры А82846, А82846.1 и А82846.2 образуют пространный субстрат мицели . Воздушные гифы образуют длинные цепи конидий, похожих на паутину.

Дл  всех культур орнаментаци  поверхности спор гладка , форма спор цилиндрическа . Размер спор в интервале 1,2-1,3 х 0,4 - 0,5 мкм дл  А82846 и 1,4-2,2 х 0,3 - 0,4 мкм-дл  А82846.1.

При выращивании в услови х глубинного встр хивани  культура А82846 про вл ет минимальную фрагментацию, фрагментаци  А82846.1 интенсивна , а культура А82846.2 про вл ет умеренную фрагментацию .

Биохимические свойства. Обе культуры А82846 и А82846.1 образуют кислоты из ара- бизоны, целлобиозы, декстрана, фруктозы, галактозы, мальтозы, маннита, маннозы, мелибиозы, рамнозы, глюкозы, а-метил-D- глюкозида, глицерина, инозита, рибозы, сахарозы, трегалозы и ксилозы, но не образуют кислоты из адонита, целлюлозы, дуль- цита, эритрита, инулина,сорбита и ксилита. А82846 также образует кислоту из этанола, гликогена, мелезитозы, раффинозы и салицина , в то врем  как А82846.1 из этих соединений кислоты не образует. Обе культуры усваивают ацетат, цитрат, лактат, малат, ок- салат, пропионат, пуриват, сукцинат, но не усваивают бензоат, мукат и тартрат. Культура А82846.1 усваивает бутират, а культура А82846 бутират. не усваивает.

Культуры А82846 и А82846.1 разлагают казеин, гипоксантин, тирозин, мочевину и ДНК, но не разлагают аденин, малат кальци  или ксантин. Обе культуры гидролизуют крахмал, не гидролизуютэскулин или гиппу- рат, восстанавливают нитрат, ожижают желатин , выживают при 50°С в течение 8 ч и образуют каталазу, HaS и фосфатазу.

Культуры А82846 и А82846.1 про вл ют одинаковую устойчивость к антибиотикам. Так они устойчивы к бацитрацину (10 ед.), цефалотину (30 мкг), кентамицину (10 мкг), линкомицину (2 мкг), олеандомицину (15 мкг), пенициллину G (10 ед.), стрептомицину (10 мкг), ванкомицину (30 мкг), тобрамицину (10 мкг), эритромицину (15 мкг), налидикси- новой кислоте (30 мкг), полимиксину (300 ед.), триметоприну (5 мкг), сульфадиазину (30 мкг), но чувствительны к неомицину (30 мкг), ри- фамицину (5 мкг), тетрациклину (30 мкг), хло- рамфениколу (30 мкг), новобиоцину (30 мкг) и мандель мину (3 мкг).

Обе культуры А82846 и А82846.1 окра- шивают грамположительные бактерии, но не окрашивают кислотоупорные бактерии. Культура А82846 образует меланоидные пигменты, в то врем  как А82846.1 таких пигментов не образует.

Анализ клеточной стенки. Полностью гидролизованные клетки А82846 содержат мезоизомер диаминопимелиновой кислоты, а также сахар арабизону и галактозу. Культуры имеют клеточные стенки, относ щиес  к типу IV согласно Бекеру и др. Характер образовани  Сахаров относитс  к типу А. Культуры не образуют миколевых кислот (LCN-A).

Культура А82846.1 получена под деист- вием химических агентов,  вл етс  мутантом культуры А82846. Признаки, по которым А82846.1 отличаетс  от А82846, приведены в табл. 2.

Культура А82846.1 отличаетс  от А82846 и по антибиотической активности.

Культура А82846.2 представл ет собой природный вариант культуры А82846. Вследствие этого характерные признаки А82846.2 фактически те же, что и у А82846. Основное различие между А82846 и А82846.2 заключаетс  в том, что культура А82846.2 образует в гораздо большем количестве антибиотик А82846 при выращивании во встр хиваемых сосудах по сравнению с культурой А82846.

Питательной средой, используемой дл  выращивани  культур Nocardla orientalis может быть люба  из существующих сред. С целью экономии получени  оптимизаци  выхода и облегчени  выделени  продукта, предпочтительным определенные среды. Так, например, предпочтительным источником углеродов при широкомасштабном бро- жении  вл етс  глюкоза и картофельный декстрин, хот  могут быть использованы также рибоза, ксилоза, фруктоза, галактоза, манноза, маннит, растворимый крахмал и т.п.

Рекомендуемыми источниками азота  вл ютс  ферментативно гидролизованный казеин и пептоны м са, хот  также могут быть использованы дрожжевой экстракт, подвергнутый кислотному гидролизу казеин , гов жий экстракт, рыбна  мука, печеночна  мука и т.п.

Питательные неорганические соли, которые могут быть введены в культурную среду , включают обычные растворимые соли, способные образовывать ионы цинка, натри , магни , кальци , аммони , хлорид-, карбонат-, сульфат, нитрат- и тому подобные ионы.

Важные следовые элементы, необходимые дл  роста и развити  микроорганизма, также должны быть введены в питательную среду. Такие следовые элементы обычно присутствуют в виде примесей к другим компонентам среды в количестве, достаточном дл  удовлетворени  потребностей растущего микроорганизма. В случае возникновени  проблемы пенообразовани  к ферментационной среде в небольших количествах (например, 0,2 мл/л) может быть добавлено противопенное средство, такое как полипропиленгликоль,

Дл  получени  значительных количеств антибиотиков А82846 рекомендуетс  проведение аэробного глубинного брожени  в танках. Небольшие количества антибиотика можно получить встр хиванием культуры в сосуде. Вследствие задержки so времени при производстве антибиотика, обычно св занной с заражением больших танков споровой формой организма, рекомендуют использовать вегетативный посевной материал . Вегетативный повесной материал готов т путем высева в небольшой объем посевной среды споровой формы мицели- альных фрагментов с получением свежей, активно растущей культуры организма. Вегетативный посевной материал затем перенос т в танк большего размера. Среда дл  приготовлени  вегетативного посевного материала может быть той же, что и используема  дл  ферментации, однако могут быть использованы и другие среды.

Антибиотики А82846 получают из продуцирующих А82846 организмов путем их выращивани  при 23-37°С. Оптимальна  температура образовани  А82846 30-31 °С.

Как обычно в процессах аэробного глубинного брожени  в нижнюю часть сосуда вдувают стерильный воздух с одновременным перемешиванием среды с помощью обычной турбинной мешалки. Максимальное поглощение кислорода при брожении в использованных услови х не превышает примерно 0,2 мм/л/мин. Как правило скорость аэрации и скорость перемешивани  должны быть достаточными дл  установлени  уровн  растворенного кислорода в 50% от насыщени  или выше.

Образование антибиотиков А82846 контролируетс  в ходе брожени  испытанием образцов бульона на антибиотическую активность против микроорганизмов, обладающих заранее известной чувствительностью к антибиотику. Одним из таких пригодных дл  проведени  испытаний микроорганизмов  вл етс  Bacillus subtills АТСС 6638. Биоиспытание обычно провод т использованием пластин дл  испытаний с агаром.

После накоплени  в услови х аэробного глубинного брожени  антибиотики А82846 могут быть затем выделены из среды брожени  известными способами,

Антибиотическа  активность обнаруживаетс  как в мицелии, так и в бульоне. Максимальный выход А82846 достигаетс  в результате первоначальным доведением значени  рН до 10,5 с целью выделени  А82846 из мицели  и фильтровани  среды с удалением бульона из массы мицели .

Из отфильтрованного бульона А82846 может быть извлечен самыми разнообразными способами. Рекомендуема  методика включает доведение рН в отфильтрованном бульоне до 7 и абсорбцию его катио- нообменной смолой, например, Дауэкс XF5-43278. Дауэкс-50 или Амберлитов IR-120. Активный материал вымывают из смолы с помощью соответствующего растворител , например, разбавленным раствором МЩОН. Активные фракции затем концентрируют в вакууме, адсорбируют на макропористой смоле, например Диаионе НР-20 и Амберлите XAD-4, и вымывают соответствующим растворителем, таким как смесь воды с изопропанолом (95:5), содержащей 1% уксусной кислоты, с получением А82846. Активный материал может быть также вымыт смесью воды с ацетонитрилом или смесью воды с метанолом с небольшим количеством кислоты.

А82846 может быть разделен на отдель- ные компоненты А82846А, А82846В и А82846С аналогичными методами. Рекомендуема  методика разделени  включает хроматографию с обращением фаз (Cie или Сз) на силикагеле.

В качестве источника А82846 могут быть использованы также твердые вещества культуры, в том числе компоненты среды и мицели  без их экстракции или отделени , но предпочтительно после удалени  воды .Например, после образовани  А82846 весь ферментационный бульон может быть

высушен лиофилизацией, сушкой в барабане или азеотропной перегонкой и высушиванием . Высушенный бульон затем подмешивают непосредственно в пищевую

добавку.

Антибиотики А82846 про вл ют прекрасную in vlfro и In vivo активность против грамположительных патогенных бактерий. Особенно неожиданной особенностью этих

антибиотиков  вл етс  их длительный период полураспада в сыворотке. Например, при внутривенном введении крысам ванкоми- цин показывает период полураспада в сыворотке в 45 мин, в то врем  как А82846А и

А82846В имеют период прлураспада в 2,2 ч. Один из важных аспектов антимикробной активности соединений А82846 заключаетс  в их активности против анаэробных бактерий.

Антибиотики А82846 также обладают антимикробной активностью in vivo против экспериментально вызванных инфекций у лабораторных животных. При введении двух доз испытуемого соединени  мыши,

искусственно зараженной испытуемым микроорганизмом , наблюдаемую при этом активность измер ют в виде значений ЭДзо (эффективна  доза в мг/кг, необходима  дл  защиты 50% испытуемых животных). Значени  ЭДво дл  испытуемых соединений приведены в табл. 3.

Одним из важных аспектов антибактериальной активности антибиотиков А82846 заключаетс  в их применимости дл  лечени  пиелонефритов. Например, А82846А и А82846В более эффективны по сравнению с ванкомицином при создании защиты в экспериментальной ликвидации инфекции пиелонефрита у крыс.

Антибиотики А82846 также применимы дл  лечени  эндокардита. Например, А82846А и А82846В также эффективны, как иванкомицин при лечении искусственно вызванной с помощью катетера инфекционного эндокардита у крыс. В этом испытании крысам ввод т пластиковый катетер в правую сонную артерию, затем продвигают в правый желудочек сердца, где надежно закрепл ют . Зверьков оставл ют в покое на

два дн , после чего внутривенно ввод т испытуемый микроорганизм (Streptococcus faccalis X-66). Титр микроорганизма примерно 5 х 108/мл, введено 0,5 мл.

Соединение ввод т подкожно за 15 мин до заражени  и затем с интервалом в 12 ч в течение 14 дн, всего провод т 28 инъекций. После лечени  зверьков выдерживают 2 дн , затем извлекают сердце, размельчают и нанос т на триптиказовый соевый агар.

Пластинки с агаром инкубируют перед подсчетом в течение 48 ч.

Фармацевтические составы, содержащие антибиотики А82846, предпочтительно в виде фармацевтически приемлемой соли готов т дл  перорального или парентерального введени  с целью лечени  или профилактики бактериальных инфекций. Например, соединение может быть смешано с обычными фармацевтическими носите- л ми и наполнител ми и использовано в виде таблеток, капсул, элексиров, суспензий , сиропов, вафель и т.п.

Содержание антибиотика А82846 в композиции: 0,1-90 мас.% активного сое- динени , но, как правило, 10-30 мас.%. Композиции могут включать обычные носители и наполнители, такие как кукурузный крахмал или желатин, лактоза, сахароза, микрокристаллическа  целлюлоза, каолин, маннит, дикальций фосфат, хлористый натрий и альгинова  кислота. Размельчители, обычно используемые в составах предлагаемого изобретени , включают кромкармел- лозу натри , микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, натрийгли- кол т крахмала и алыиновую кислоту.

Св зывающие вещества дл  получени  таблеток включают аравийскую камедь, ме- тилцеллюлозу, карбоксиметйлцеллюлозу натри , поливинилпирролидон (Новидон), гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу, крахмал и этил целлюлозу.

Смазки, которые можно использовать, включают стеарэт магни  или стеараты дру- гих металлов, стеариновую кислоту, тальк, воски, масла и коллоидную окись кремни .

Могут быть также использованы отдушки , такие как перечна  м та, винтер- греновое масло, вишнева  эссенци  и т.п. Желательно добавление красител  дл  придани  дозировочной форме более эстетического вида или дл  облегчени  идентификации продукта.

Дл  внутривенных инъекций водораство- рима  форма антибиотика может быть растворена в одной уз обычно используемых дл  внутривенных инъекций жидкостей и введена в виде вливани . Например, могут быть использованы такие жидкости как: фи- зиологический раствор, раствор Ринджера или 5%-ный раствор декстрозы.

Дл  внутримышечных препаратов стерильный состав соответствующей растворимой соли соединени , например, хлоргидрат может быть растворен и введен в фармацевтический растворитель, такой как вода дл  инъекций, физиологический раствор или 5% раствор глюкозы. Соответствующа  нерастворима  форма соединени  может быть приготовлена и введена в виде суспензии в водную основу или фармацевтически приемлемую масл ную основу, например эфир длинноцепочечной жирной кислоты,такой как этилолеат.

Дл  перорального введени  особенно приемлемым  вл етс  стерильный состав соответствующей соли антибиотика, например хлоргидрата в смеси в разбавителем, таким как дистиллированна  или деионизи- рованна  вода.

Единична  дозировка антибиотика может также представл ть собой раствор антибиотика , предпочтительно в виде соли в соответствующем разбавителе, заключенный в стерильную герметично запа нную ампулу. Концентраци  антибиотика в единичной дозировке может мен тьс , например от 1 до 50% в зависимости от конкретной формы антибиотика и его растворимости , а также от назначаемой врачом дозы.

Способ иллюстрируетс  следующими примерами.

П ри ме р 1. ВЭЖХ дл  А82846.

Нижеследующа  аналитическа  система ВЭЖХ применима дл  компонентов А82846:

1.Колонка с катионообменной смолой Носитель - Зорбакс SCX (колонка 4,6 х

150мм).

Система- градиент вымывани  А; 8 (4:1) к А:В (1:9) в 5 мин, удерживание 16 мин.

А-МеОН:0,1 М №Н2РСм(1:9)

В-МеОН:0,9 М NaHaPC (1:9)

Скорость потока - 1 мл/мин.

Детектирование - УФ при 225 нм.

Времена удерживани  - завис т от концентрации , но примерные значени  дл : А82846С - 6,6 мин, А82846В - 8,9 мин, А82846А 9,5 мин.

2.Колонка с обращенными фазами. Носитель - Зорбакс ODS (колонка 4,6 х

150мм).

Система - градиент вымывани  1% (NH4) H2P04:CH3CN (95:5) до (1:1) в 20 мин.

Скорость потока - 1 мл/мин.

Детектирование - УФ при 25 нм.

Времена удерживани : А82846А - 7,3 мин, А82846С - 7,6 мин, А82846В - 8,0 мин.

Пример 2. Получение антибиотика А82846, использование культуры А82846,

А. Брожение культуры А82846 до встр хиваемое™ сосуда. Культуру Nocardia orientalis NRRL 18098 либо в виде лиофили- зованных таблеток, либо в виде суспензии, выдерживаемой в жидком азоте, используют дл  заражени  посевной среды следующего состава:

Посевна  среда, (%): Глюкоза1,0

Растворимый крахмал2,0

Дрожжевой экстракт0,5

Ферментивный гидроли- зат казеина0,5

СаСОз0,1

Деионизированна 

вода.Разбавление до 1 л

Перед стерилизацией добавлением NaOH довод т рН среды примерно до 7,5.

Добавлением к посевной среде 2,5% агара готов т скошенный агар или пластины . Зараженный скошенный агар инкубируют при 30°С от 10 до 14 дней. Вызревшую культуру на скошенном агаре соскребают стерильным инструментом с целью разрыхлени  спор, удалени  и отделени  мицели- альной пленки. Примерно четвертую часть полученных разрыхленных спор и культуры используют дл  заражени  50 мл посевной среды первой стадии.

Зараженную среду первой стадии инкубируют в колбе Эрленмейера на 250 мл в течение 24-48 ч при 30°С на качалке, вращающейс  со скоростью 250 об/мин по кругу в два дюйма (5,08 см).

Полученную в результате инкубировани  среду первой стадии (0,5 мл) используют дл  заражени  50 мл продуцирующей среды следующего состава, %:

Глюкоза2,5

Соева  мука1,5

Картофельный декстрин3,0

СаСОз0,25

Конечна  меласса0,3

Подвергнутый кислот- - ному гидролизу казеин0,5

Деионизированна 

водаРазбавление до 1 л

Перед стерилизацией добавлением NaOH устанавливают рН 7,5.

Зараженную продуцирующую среду инкубируют в широкогорлой колбе Эрлемей- ера на 250 мл при 30°С от 4 до 5 дней на качалке, вращающейс  со скоростью 250 об/мин по кругу в 5,08 см.

Б. Брожение культуру А82846 в чане. Дл  приготовлени  в большом объеме посевного материала 10 мл инкубированной среды первой стадии, приготовленной согласно разделу А, используют дл  заражени  400 мл питательной среды второй стадии, имеющей состав, аналогичный составу среды .первой стадии. Такую вегетативную среду второй стадии инкубируют при 30°С в течение примерно 48 ч в широкогорлой колбе Эрленмейера на 1 л

на качалке, вращающейс  со скоростью в 250 об/мин по кругу в 5,08 см.

Полученную в результате инкубированную вегетативную среду второй стадии (1000 мл) используют дл  заражени  100 л стерильной продуцирующей среды, приготовленной согласно разделу А за тем исключением , что добавл ют противопенную присадку Р-2000 (0,3 г/л). Зараженную про- 0 дуцирующую среду оставл ют бродить в перемешиваемом чане дл  брожени  на 165 л при 30°С в течение от 90 до 100 ч. Воздушный поток в перемешиваемом сосуде (80 об/мин) устанавливают так, чтобы 5 уровень растворенного кислорода составл л примерно 50% от насыщени .

В. Другой вариант брожени  культуры А82846 в чане. Осуществл ют способ раздела Б за исключением того, что соответству- 0 ющим количеством вегетативной среды заражают примерно 3402 л продуцирующей среды, помещенной в чан брожени  на 4536 л.

Пример 3. Получение антибиоти- 5 ка А82846 с использованием культуры А82846.1.

Культуру Nocardia orlentalis NRRL18099 либо в виде лиофилизованных таблеток, либо в виде суспензии, выдерживаемой в 0 жидком азоте, культивируют согласно методике примера 2, за исключением того, что продуцирующа  среда имеет следующий состав , %:

Глюкоза1,0

5 Картофельный декстрин2,0

Пептон1,0

СаСОз0,2

Конечна  меласса2,0

Деионизированна 

0водаРазбавление до 1 л рН не устанавливают,

Пример 4. Получение антибиотика А82846 с использованием культуры 5 А82846.2.

Культуру Nocardia orientals NRRL 18100 в виде лиофилизованных таблеток, либо в виде суспензии, выдерживаемой в жидком азоте, культивируют согласно методике 0 примера 2 за исключением того, что в качестве источника азота используют Амиказ.

Пример 5. Получение сырого А82846.

Ферментационный бульон (4200 л) из бродильного чана на 4536 л, приготовлен- 5 ный по методике примера 2 раздел В, добавлением 5 N NaOH подщелачивают до рН 10,5, после чего добавл ют 3% Целита 545 (фильтрующа  добавка). Смесь фильтруют через пресс-фильтр и промывают водой. Объединенные фильтрат и промывочные воды (4200 л) довод т до рН 7 добавлением 5 и HCI (или H2S04) и перенос т на колонку, заполненную смолой Дауэкс-XFS -3278 (МЩ4) (200 л фильтрата/10 смолы). Колонку вымывают при скорости потока 750 мл/мин. Фракции провер ют либо в бшиспытании с использованием Bacillus subtilis, либо с помощью ВЭЖХ.

Колонку промывают 5 колоночными объемами воды, собира  аликвоты до 100 л.

Активный материал вымывают со смолы 5 колоночными объемами 0,05 N NH40H с отбором фракций по 25 л. Содержание А82846 фракции объедин ют и концентрируют в вакууме примерно до 30 л. Получен- ный раствор нанос т на колонку объемом 10 л, заполненную смолой Диаион НР-20 в воде. Колонку промывают 3 колоночными объемами воды при скорости потока 300 мл/мин. Промывные воды отбрасыва- ют. Активный материал вымывают с колонки раствором Н20:изо-РгОН (95:5), содержащим 1%-уксусной кислоты, при скорости потока 100 мл/мин с отбором фракций по 4 л, которые провер ют в биоиспытании или с помощью ВЭЖХ. Содержание А82846 фракции (#6-14)объедин ют, концентрируют в вакууме и сушат вымораживанием с получением 356 г сырого А82846.

Пример 6. Выделение А82846А и А82846В.

А. Разделение обогащенных А82846А и А82846В. В 500 мл воды раствор ют 30 г В82846, приготовленного по методике примера 5 и перенос т в наход щуюс  под дав- лением колонку из нержавеющей стали на 30 л, заполненную силикагелем LP-1/Cis в равновесии с 1 % NH4H2P04. Колонку про вл ют использованием градиента 1% МН4Н2РСм(60л) к смеси вода-ацетонитрил (88:12), содержащей 1% ЫН4Н2Р04(60л)при скорости потока 250-300 мл/мин (макс, давление 42,2 кг/см2) с отбором фракций по 4 л и их проверкой с помощью УФ-детектора при 254 нм. Отдельные фракции провер ют с помощью аналитической ВЭЖХ. Фракции, обогащенные А82846А (#6-9), и фракции, обогащенные А82846В (# 10-17), объедин ют и концентрируют в вакууме.

Б. Очистка А82846А. Концентраты, обогащенные А82846, из двух загрузок по 30 г, проведенных согласно описанию раздела А, обессоливают на колонке (1750 мл) Диаион НР-20 SS промыванием водой, вымыванием смесью Н20:изо-РгОН (95:5), содержащей 0,5% уксусной кислоты, и контролем с помощью аналитической ВЭЖХ. Содержащие А82846 фракции объедин ют, концентрируют и сушат вымораживанием с получением 7,4 г препарата, обогащенного А82846.

Обогащенный А82846 препарат (8,2 г) раствор ют в воде и перенос т на препаративную ВЭЖХ колонку, заполненную силикагелем LP-1/Cie в 1% МЬЦН2Р04. Колонку про вл ют градиентом 1% МЩН2Р04 к смеси 1% МН4Й2Р04 - ацетонитрил (9:1) с контролем вымывани  с помощью анатили- ческой ВЭЖХ и скорости вымывани  48 мл/мин. После вымывани  первых 10 л собирают фракции по 500 мл.

Фракции, содержащие А82846А (# 4-10), и фракции, содержащие А82846В (# 12-20), объедин ют и концентрируют в вакууме. Концентраты А82846А из трех загрузок объедин ют и дл  обессоливани  нанос т на колонку(1750 мл)Диаиона HP-20SS. Колонку промывают водой и А82846А вымывают смесью hteO - изо-РЮН (95:5), содержащей 0,5 % уксусной кислоты. Вымывание контролируют с помощью ВЭЖХ. Содержащие А82846В фракции объедин ют, концентрируют и сушат вымораживанием с получением 7,9 г очищенного А82846А.

В, Очистка А82846В. Обогащенные А82846В фракции из 3 загрузок разделени  А82846А и А82846В на препаративных ВЭЖХ колонках, приготовленных согласно методике раздела Б, объедин ют и обессоливают на колонке (1750 мл) Диаион НР-20 SS промыванием водой и вымыванием смесью Н20-изо-РгОН (95:5), содержащей 0,5% уксусной кислоты. Вымывание контролируют с помощью ВЭЖХ, фракции А82846В объедин ют, концентрируют в вакууме и после высушивани  вымораживанием получают 8,8 г очищенного А82846В.

Г. Обессоливание. Обессоливание может быть также осуществлено использованием смолы Диаион НР-20 SS и смеси МеОН:Н20 (4:1), содержащей 0,1 уксусной кислоты, дл  вымывани .

Пример. Выделение А82846С.

А. Отделение А82846.

Бульон брожени  (461 л), полученный из четырех загрузок по 165 л проведенных согласно разделу Б примера 2, подщелачивают 5 н. NaOH до рН 10,5 и фильтруют после добавлени  3% Хайфло Супецел  (фильтрующа  добавка). Фильтрат (30 л) подкисл ют добавлением 5 N HCI до рН 7 и перенос т на колонку, заполненную 10 л смолы Дау- 3KC-XFS-3273 (NH44). Колонку промывают 50 л воды, активный материал вымывают 0,05 H.NH40H (50 л) с отбором фракций по 4 л. Вымывание контролируют с помощью биоиспытани . Активные фракции (# 1-7) объедин ют, концентрируют в вакууме до

объема примерно 1700 мл и после высушивани  получают 283,9 г сырого А82846.

Б. Разделение А82846А, В и С. Сырой А82846 (2 г), приготовленный по методике раздела А, раствор ют в воде и перенос т на колонку (5,08 х 115 см) из нержавеющей стали, заполненную 2110 мл силикагел  LP-1/C18 в 1% NH4H2P04. Колонку про вл ют использованием градиента от 1% NH4H2P04 до 1 % NH4H2P04 - ацетонитрил (92:8) при скорости потока 70 мл/мин с отбором фракций по 400 мл и контролем с помощью УФ при 254 нм.

Фракции, содержащие А82846А (# 11-1), объедин ют как продукт 1; фракции, содержащие А82846С (# 16-20) объедин ют как продукт 2; фракции, содержащие А82846В (# 21-25), объедин ют как продукт 3.

В. Очистка А82846С. Продукт 2 концентрируют до объема примерно в 200 мл и с целью обессоливани  перенос т на стекл нную колонку (7 х 45 см), заполненную 1800 мл смолы Диаион HP 20. Активный материал вымывают смесью MeOHiHaO (4:1), содержащей 0,1% уксусной кислоты и при скорости потока 25 мл/мин отбирают фракции по 1 л. Содержание С фракции (# 9-12)объедин ют, концентрируют в вакууме и после сушки вымораживанием получают 662,2 мг полуочищенного А82846С.

Полуочищенный А82846С (500 мг) подвергают дальнейшей очистке повторением операций ВЭЖХ с обращением фаз использованием колонки (2,5 х 122 см) из нержавеющей стали, заполненной 50 мл силикагел  LP-1/Cis, и градиента от 1% NH4H2PCM до 1 % NH4H2P04 - ацетонитрил (92:8) при скорости потока 11 мл/мин, отбором фракций по 25 мл и контроле при 254 нм. Содержащие А82846С фракции (# 169-210) собирают и обессоливают на стекл нной колонке (5 х 45 см), заполненной смолой НР-20. Колонку вымывают смесью МеОН - НаО, содержащей 0,1 % уксусной кислоты с отбором фракций по 100 мл и контроле вымывани  с помощью аналитической ВЭЖХ в сочетании с УФ при 254 нм. Содержание А82846С фракции (# ) объедин ют, концентрируют в вакууме и после сушки вымораживанием получают 127,3 мг А82846С.

Продукт 1, содержащий А82846А, и продукт 3, содержащий А82846В, подвергают аналогичной очистке с получением дополнительных количеств очищенных А82846А и А82846В.

Г. Дальнейша  очистка А82846С. А82846С (70 мл) подвергают дальнейшей очистке использованием следующей методики препаративной хроматографии:

Колонка - Зорбакс SCX (9,2 х 250 мм) катионообменна  смола.

Подвижна  фаза - Линейный градиент от 0,15 М NaHaPCM буфера, содержащего

10% МеОН, до 0,9 М NaH2P04 буфера, содержащего 10% МеОН, в течение 6 мин и удерживанием в течение 5 мин (без регулировки буфера).

Скорость потока - 6,0 мл/мин.

Детектирование - УФ при 280 нм

Загрузка - Инъекцией по 6,0 кг в НаО. А82846С собирают применением автоматического отборника фракций, снабженного механизмом детектировани , пиков.

Подвижную фазу подают .с помощью системы градиента ВЭЖХ М600, раствор образца впрыскивают с помощью автоматического прибора дл  ввода проб.

Содержащие А82846С фракции объедин ют , концентрируют до объема в 30 мл и перенос т на колонку, заполненную НР-20 (50 мл). Колонку промывают водой и вымывают смесью Н20 - изопропанол (95:5), содержащей 0,5% АсОН, с отбором фракций

по25 мл. Содержащие А82846С фракции (# 9-14) объедин ют, концентрируют и лио- филизуют с получением 37 мг очищенного А82846С.

Пример 8. Получение солей А82846.

В каждом случае компонент А82846 (100 мг) раствор ют в деионизированной воде (10 мл). В полученном растворе устанавливают рН 3 добавлением 0,5 кислоты (HCI, H2S04 и Н3Р04). Раствор лиофилизуют с

получением соответствующей соли. При понижении рН ниже 3 (например, до рН 2), происходит разрушение компонента. В результате получают соли со следующими выходами , мг:

СольА82846АА82846В

HCI93,8мг88,1

H2S04 92,5 мг75,4

НзР04 110,8мг105,7

Claims (6)

1. Способ получени  гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С или их солей, заключающийс  в том, что штамм Nocardia orientalis NRRL 18098, или штамм Nocardia orientalis NRRL 18099, или

штамм Nocardia orientalis NRRL 18100 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в аэробных глубинных услови х выдел ют антибиотической комплекс из культуральной жидкости с последующей очисткой и хроматографическим разделением раствора комплекса на компоненты А82846А, А82846В и А82846С, при этом дл  получени  компонентов комплекса в виде солей очищенный раствор комплекса подкисл ют до рН на уровне 3,0.

2.Способ поп.1,отличающийс-  тем, что получают А82846А или его фармацевтически приемлемые соли.

3.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что получают А82846В или его фармацевтически приемлемые соли.

4.Штамм актиномицета Nocardia orientalis NRRL18098- продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С.

5.Штамм актиномицета Nocardia orientalis NRRL 18099 - продуцент гликопеп- тидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С.

6.Штамм актиномицета Nocardia orientalis NRRL 18100- продуцентгликопеп- тидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С.

(мечание.

Р --РОст; 0 - обратна  сторона; Вч - воздушный мицелий; а РП растворимьй пигмент. Инкубации в течение 21 дн  при 30 С.

Свойство

Фрагментаци 

Размер колонии

Поверхность колонии

Воздушные гифы

Цвет обратной стороны

Растворимый пигмент

Образование кислоты из этанола гликогена мелезитозы раффинозы салицина

Усвоение

а-Мегликози

гликогена

мелезитозы

сорбозы

бутирата

Меланоидные пигменты

мг/кг х 2, дозы введены мышам подкожно, спуст  1 и 4 ч после заражени .

JLOJljAJlAj

987654321

PPM

Фиг. /

Та бл и ц а 2

А 82846

А 82846.1

Минимальна 

7 мм

Тверда 

Изобильные

емно-коричневый

+

+ + + + +

+ + +

+

Изобильна 

5 мм

М гка 

Следы

Светло-коричневый

Таблица 3

Л/Ал

98765432 PPM

Фаг 2

9876543 PPM

Физ.З

1 О

2 1 0