JP5996187B2 - エクオールの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、エクオール生産能を有する嫌気性微生物（エクオール生産菌）によるエクオールの製造方法、特に、嫌気性微生物の培地中に多価アルコールを含有させることを特徴とする該製造方法に関する。

大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの分類のひとつであり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。

たとえば大豆内では、イソフラボン類は糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitin）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれのアグリコンであるダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA） 又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている（図１）。

エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献７及び８）。しかしながら、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献９及び１０）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。

これらの課題を克服するために、近年、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１〜４）。しかしながら、どのような発酵条件・発酵方法により、より効果的・実用的にエクオールが製造できるかについては、明らかとなっていなかった。また、いずれも生成したエクオール濃度が低く、大量生産することができなかった。

また、特許文献５には、エクオール産生菌と少なくとも１種のエクオール非産生菌
と、を含む混合微生物を、ダイゼイン類を含む培地中で培養してダイゼイン代謝物を製造する際に、原料であるダイセイン類の可溶化剤として、（１）シクロデキストリン、又は、（２）ポリエチレングルコール鎖を有し、水及びエタノール溶解可能でありＨＬＢ値が１１以上である界面活性剤を、培地中に添加することが記載されている。

更に、特許文献６には、エクオール産生乳酸菌含有組成物に関する発明が記載されており、微生物を利用した発酵において、本発明微生物の良好な生育のための発酵促進物質として、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えることができる旨が記載されている。

その他に、４種類の嫌気性微生物を水素気相下で混合培養し、エクオールの製造を試みた例（非特許文献１１）が存在していたが、混合培養では実用的生産（工業化）には適さないものであった。

特開２００６−２０４２９６号公報 特表２００６−５０４４０９号公報 特開２００８−６１５８４号公報 特開２０１０−１０４２４１号公報 特開２０１０−１８７６４７号公報 特開２００６−２９６４３４号公報

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本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、嫌気性微生物の作用を利用して、より最適な培地条件によりイソフラボン類を発酵させ、従来よりも効果的にエクオールを製造できる方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために、嫌気性微生物の一例として アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に分類される菌を用い、エクオール製造の好適な培地条件の検討を行った。

その結果、エクオール生産菌の培養における培地中に多価アルコールを含有させることによって、エクオールの製造効率が顕著に高まること、及び、培地中に更にシクロデキストリンを共存させることによって、エクオールの製造効率がより一層高まるといった相乗効果が見られることが判明した。
以上の知見に基づき、本発明者らは、エクオール生産菌を用いたエクオール製造におけるより好適な培養条件の確立に成功し、これにより本発明を完成するに至った。

本発明は、より具体的には以下の態様［１］〜［９］を提供するものである。
［態様１］
次の工程を含むエクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法：
（１）イソフラボン類及び多価アルコールを含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
（２）工程（１）で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。
［態様２］
イソフラボンがダイゼインである、態様１記載の方法。
［態様３］
多価アルコールが糖類及び／又は糖アルコール類から選ばれる少なくとも一種である態様１又は２に記載の製造方法。
［態様４］
糖類がグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、デンプン、アミロース、デキストリン、シュクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、セロビオース、メリビオース、パラチノース、イソマルトース、ラクツロース、コージビオース、パラチノース、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、及び、ラフィノースから選ばれる少なくとも一種であり、糖アルコール類がグリセリン、エリスリトール、ソルビトール、イノシトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、及びアラビニトールから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする態様１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
［態様５］
多価アルコールがデキストリンである、態様４記載の製造方法。
［態様６］
培地中に更にシクロデキストリンを含有させる、態様１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
［態様７］
嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツス、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス、スラッキア・イソフラビニコンバーテンスより選ばれる少なくとも一種の菌である、態様１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
［態様８］
水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で嫌気性微生物を培養する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。

本発明によって、嫌気性微生物発酵を利用した、イソフラボン類を原料とするエクオールの効率的な製造方法が実現でき、エクオールの工業的な製造技術が提供された。本発明方法によって、多価アルコールを含有する培地でエクオール生産菌を培養することによって、エクオールの生産量が顕著に増大する、という予想外の効果が得られた。更に、培地中に多価アルコールとシクロデキストリンを共存させることによって、エクオールの製造効率がより一層高まるといった相乗効果が見られることが判明した。

ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオールの構造式及び反応式を示す図である。 本発明における培地中への糖類の添加によるエクオール生産に対する効果を示す図である。

本発明は、
次の工程を含むエクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法に関する。
（１）イソフラボン類及び多価アルコールを含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
（２）工程（１）で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。

本発明方法におけるイソフラボン類は、その原料に特に制限はないが、主に大豆、クズ、レッドクローバー、カンゾウなどマメ科植物から得られ、アグリコン、配糖体及びそのマロニル化及びアセチル化等の任意の誘導体を含む。

アグリコンの例として、ダイゼイン、6-ヒドロキシダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ビオカニンA、フォルモネチン、及びクメストロールなどを挙げることができる。又、配糖体の例として、ゲニスチン、グリシチン、ダイジン、プエラリンなどを挙げることができる。

好適なイソフラボン類としては、ダイゼイン、6-ヒドロキシダイゼイン、及びジヒドロダイゼイン、並びに、それらの配糖体を挙げることができる。

イソフラボン類はそのままか、β−グルコシダーゼ等の酵素あるいは微生物を作用させ、イソフラボンアグリコンに変換して本培養に用いることができる。例えば、イソフラボンアグリコンは大豆胚芽に麹菌を加え発酵させ、得られた発酵大豆胚芽から抽出することにより得られる。

本発明方法において、エクオールの生産原料として培地に含有させるイソフラボン類は、必ずしも精製された純品である必要はない。培地から回収されるエクオールの使用目的・用途などに応じて、イソフラボン類の種類・形態・精製度等を任意に選択することができる。

例えば、化粧品向けのエクオールを製造する場合には、例えば、大豆及び葛等から天然抽出し精製された高純度品であるイソフラボン類（例えば、ダイゼイン）を使用することが好ましい。

一方、食品向けのエクオールを製造する場合には、イソフラボン類として、大豆及び葛等から天然抽出した、粗精製品であって、イソフラボンアグリコン（例えば、ダイゼイン）の高含有品を使用することが好ましい。

更に、飼料向けのエクオールを製造する場合には、安価に製造することが重要であるために、イソフラボン類として、例えば、大豆胚軸等を使用することが好ましい。

市販されているイソフラボン類として、例えば、フジッコ社製フジフラボンP４０、P１０などを用いることができる。更に、イソフラボンアグリコンとして、例えば、「AglyMax−３０」（ニチモウバイオテックス社製）を用いることができる。

本発明方法において、培地に添加する多価アルコールとしては、当業者に公知の任意の一種以上の化合物を使用することが出来る。

多価アルコールの例として、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、及びキシロース等の単糖類；シュクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、セロビオース、メリビオース、パラチノース、イソマルトース、ラクツロース、コージビオース、パラチノース、ソホロース、ゲンチオビオース、及びラミナリビオース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；並びに、デキストリン、デンプン、及びアミロース等の糖類を挙げることができる。

更に、多価アルコールの例として、グリセリン、エリスリトール、ソルビトール、イノシトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、及びアラビニトール
等の糖アルコール類を挙げることができる。

本発明方法における培地中の多価アルコールの含有量は、エクオールの生産量が顕著に増大するように、エクオール生産菌の培養におけるその他の条件等に応じて当業者が適宜決めることができるが、実施の形態における通常の範囲としては、培地（L）中に1g/L〜100g/L、好ましくは、10g/L〜60g/Lである。

本発明方法において、多価アルコール添加との相乗効果によりエクオールの生産量をより一層増大させるために、培地中に更にシクロデキストリンを含有させることが好ましい。シクロデキストリンとしては、当業者公知の任意の物質を使用することができるが、β−シクロデキストリン（シクロヘプタミロード）、β−シクロデキストリン誘導体、またはγ−シクロデキストリンが好ましい。培地中のシクロデキストリン含有量は当業者が適宜決めることができるが、実施の形態における通常の範囲としては、培地（L）中に1g/L〜100g/L、好ましくは、10g/L〜60g/Lである。

なお、上記のβ−シクロデキストリン誘導体としては、例えば、グルコシル−β−シクロデキストリン（６−O−α−D−Glucosyl−β−cyclodextrin）、マルトシル−β−シクロデキストリン（６−O−α−D−Maltosyl−β−cyclodextrin）、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Hydroxypropyl−β−cyclodextrin）、メチル−β-シクロデキストリン（Methyl−β−cyclodextrin）、ポリ−β−シクロデキストリン（Poly−β−cyclodextrin）などを挙げることができる。

本発明方法で培養するエクオールの生産能を有する嫌気性微生物（エクオール生産菌）としては、培地中に含まれるフラボン類を原料として用いる発酵によってエクオールを生産することができる限り、当業者に公知の任意の嫌気性微生物を用いることができる。

かかるエクオール生産菌の例として、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌、ストレプトコッカセアエ（Streptococcaceae）科に分類される菌、又はこれらの類縁菌を例示することができる。

また、以下の群から選択される属に分類される微生物を、エクオール生産能を有するものとして例示することができる。
コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
アシネトバクター（Acinetobacter）属
アトポビウム（Atopobium）属
コリンゼラ（Collinsella）属
クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
エガセラ（Eggerthella）属
エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
ゴードニバクター（Gordonibacter）属
オルセネラ（Olsenella）属
パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
スラッキア（Slackia）属
ラクトコッカス(Lactococcus)属
ユーバクテリウム（Eubacterium）属
シャーペア（Sharpea）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
バクテロイデス（Bacteroides）属

本発明方法で使用するエクオール生産菌としては、上記の中で、特に、アサッカロバクター・セラツス、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス、スラッキア・イソフラビニコンバーテンスが好ましい。
具体的には以下の微生物を利用することができる。
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8（DSM 22006）
Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729
Eggerthella sp. KCCM-10490
Asaccharobacter celatus DSM 18785
Lactococcus garvieae DSM 6783
Sharpea azabuensis DSM 18934
Lactococcus 20-92 FERM BP-10036
Bacteroides E-23-15 FERM BP-6435
Streptococcus E-23-17 FERM BP-6436
Streptococcus A6G225 FERM BP-6437
Eubacterium limosum ATCC 8486
上記の中で、特に、Asaccharobacter celatus DSM 18785、Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 、Slackia isoflavoniconvertens HE8（DSM 22006）が好ましい。

さらに、本発明方法において、エクオール生産菌としては、実施例で使用されているアサッカロバクター・セラツス（Ａｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｌａｔｕｓ）ＤＳＭ １８７８５がより好ましい。

尚、上記嫌気性微生物の多くは市販されており、更に、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
FERM 特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
ATCC American Type Culture Collection
http://www.atcc.org/

本発明方法においては、エクオール生産能を有する嫌気性微生物は、エクオールの生産に適した条件で培地中でフラボン類と接触させられ、培養される。本発明におけるエクオールの生産に適した条件とは、エクオール生成活性を持つ嫌気性微生物の生存と活動が維持されることを言う。より具体的には、嫌気性微生物の生存が可能な気相条件（嫌気性条件）が維持され、当該嫌気性微生物の活性と増殖を支持するための栄養素が与えられることを言う。嫌気性微生物の生存に適した種々の培地組成が公知である。したがって、先に示したエクオール生産能を有する嫌気性微生物について、当業者は、適切な培地組成を選択することができる。たとえば、実施例において用いた日水製薬社製のGAMブイヨン培地や、Difco社製のＢＨＩ培地等を使用することができる。

たとえば、本発明で用いられる培地には、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、ソルボース、フラクトース、グルコース、並びに、吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、及びギ酸など有機酸類等の化合物を挙げることができる。

炭素源としての培地に加える有機物の濃度は、効率的に培地中の嫌気性微生物を発育させるために適宜調節することができる。一般的には、0.1〜10wt/vol%の範囲から添加量を選択することによって、過不足を避けることができる。

上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源が加えられる。本発明において、窒素原としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。より好ましい窒素源はアルギニン、シトルリン、オルニチン、リジン、酵母エキス、ペプトン類である。

更に、炭素源や窒素源に加えて、偏性嫌気性微生物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。例えば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、偏性嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。例えば、無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。

無機化合物として、例えば、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウムが挙げられる。

また、ビタミン類として、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビタミンＢ１２、チオオクト酸、ｐ−アミノ安息香酸が挙げられる。さらに、ポルフィリン化合物であるヘミンを添加するとよい場合がある。

これらの無機化合物やビタミン類、あるいは増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法は公知である。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。本発明のエクオールの製造方法において、好ましい培地の形態は、液体培地である。

本発明方法において、嫌気性微生物は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム (continuous fermentation system)が好適である。

嫌気性微生物の培養においては、連続培養システム内への酸素の混入を防ぐことが必要である。培養器は通常用いられる培養槽がそのまま利用できる。嫌気性微生物の培養にも利用することができる培養タンクは市販されている。培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは水素ガスなどで置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。

たとえば、嫌気培養ジャー(anaerobic jar)を嫌気性微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。さらに、嫌気培養ジャーは、嫌気培養ジャー内部の空間や培養液中に含まれる分子状酸素を除去するための機構を備えることができる。たとえば、嫌気培養ジャー内部を吸引する真空ポンプを接続して吸引し、酸素以外の気体を供給することで、内部を嫌気状態に維持することができる。

本発明においては、培養槽に付加的な機能を与えることができる。たとえば、通常使用される撹はん混合槽のほか、気泡塔型、ドラフトチューブ型の培養槽も利用できる。液体培地に吹き込まれる混合気体によって微生物は遊離分散され、微生物と培地を十分に接触させることができる。また、バイオトリックリングフィルター（biotrickling filter）のように通気性の高いスラグ、その他セラミック系の無機充てん物、あるいはポリプロピレン等の有機合成物質の充てん層に、水分を滴らせながら微生物を生息させ、そこにガスを通気しながら培養することもできる。さらに、使用する微生物は常法によりカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、アクリルアミドゲル、キチン、セルロース、寒天などに固定化して用いることもできる。

本発明方法の工程（１）における培養において、上記の基質ガスからなる気相を構成する気体の組み合わせは特に制限されるものではなく、水素、二酸化炭素、窒素等から選択される１種類以上の気体を構成成分として用いることが可能である。当該気相においては、水素が構成成分として含まれていることが好ましい。

上記の場合、工程（１）の気相において、水素の分圧パーセント濃度が２〜１００％であることが好ましい。たとえば、２％、４％、６％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、１００％、又はこれらから選択される２点の分圧パーセント濃度を下限（「〜以上、又は、〜より高い）及び上限（〜以下、又は、〜より低い）、とする濃度範囲により示される分圧パーセント濃度であることが好ましい。

また、効率よくエクオールを生成させるためには、気相を構成する混合気体の培養槽への通気量は0.01〜2.0 V/V/Mガス量/液量/分であることが好ましい。

本発明でエクオールの製造に用いられる嫌気性微生物は、３７℃付近（30〜42℃）の温度でエクオール生産能を有する嫌気性微生物である。

本発明において、嫌気性微生物を培養する際の加圧条件は、当該微生物が生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、好ましい加圧条件としては、0.02〜0.2MPaの範囲を挙げることができる。

当業者は、生成した嫌気性微生物と培養生成液を分離するために公知の任意の方法を用いることができる。好ましい分離の方法は、ろ過性能、濃縮性能を有するホローファイバー型限外ろ過あるいは精密ろ過膜を利用する方法である。また、微生物と該生成液の分離に十分なろ過速度を得るためには使用する微生物に応じて適当な分画分子量の膜を選択すれば良い。生産されたエクオールは当業者に公知の任意の手段で培地から回収することができる。例えば、培養槽から限外ろ過膜を通して分離された培養液からエクオールを回収することができる。エクオールの精製方法は公知である。たとえば、培養物を遠心分離などで菌体を除き、上清を減圧下に濃縮、乾固後、70%エタノールあるいはメタノールで抽出する。抽出液をさらにシリカゲルクロマトグラフィーや晶析などの操作を行うことで精製できる。また、アンバーライトやセパビーズなどスチレン-ジビニルベンゼンの吸着樹脂も用いることができる。

微生物の十分な生育のため、培養物のpHは、3.0〜8.0が好ましく、4.5〜7.5がより好ましい。また、エクオールの回収量を増加させるため、培養槽の温度は特に制限されるものではないが、37℃を好ましい温度として挙げることができる。

効率よくエクオールを回収するため、培養槽に供給される新鮮な培地の量は、培養槽内の培養物における希釈率が時間当たり0.04〜2/hrが好ましい。より好ましい希釈率は0.08〜1/hrである。

本発明の製造方法により得られたエクオールは、様々な用途、例えば、医薬品又は飲食物として提供することが可能である。

エクオールを医薬品として提供する場合、その製剤化には、一般的に製剤化に用いられる物質（たとえば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等）を用いることができる。医薬品として提供する場合の剤型としては、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等を例示することができる。

エクオールを飲食物として提供する場合、その形態としては、健康食品、清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。

尚、本明細書において引用された全ての先行技術文献の記載内容は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
以下、各実施例においては、以下の方法により、濁度の測定、ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオールの定量を行った。

濁度の測定
培養液を純水で3倍に希釈した液の660 nmの濁度を測定し、3倍して元の培養液の濁度とした。

フラボン類及びエクオールの定量
培養液0.5 mLに対し、酢酸エチル1.5 mLを加えて、激しく攪拌した後、3000 rpmで10秒遠心し、酢酸エチル層をパスツールピペットで可能な限り取り出した。同培養液に同様の操作をあと2回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得た。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、1.0 mLのメタノールに溶解させた。これを0.45 μmのPTFE膜でろ過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。

（高速液体クロマトグラフィー条件）
カラム：J’sphere ODS M-80, 2.0（直径）×250 mm（ワイエムシィ製）
移動相：水/アセトニトリル/酢酸［70：30：0.1, v/v］
流速：0.2 mL/min
カラム温度.：40 ℃
検出：UV280 nm
保持時間：ダイゼイン 14.1分、ジヒドロダイゼイン 15.1分、エクオール 26.3分

〔実施例１〜２、比較例１〜２〕
GAMブイヨン培地（日水製薬製）5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管（三紳工業製）に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus） DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行った。以下に示すようなエクオール生産培地（実験培地）を調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却後、この種培養液0.1 mLを植菌し、気相を水素ガスで無菌的に2分間以上置換した後、37℃、250 spmの条件で振とう培養を行った。24時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量した。
結果を表1に示す。デキストリン単独添加でも無添加に比べ2倍以上にエクオール生産量が増えるが、β-シクロデキストリンとデキストリンを同時に添加することにより、無添加にくらべ約10倍のエクオールが生産され、β-シクロデキストリンとデキストリンを単独で添加した場合と比較して顕著な相乗効果があることが分かった。

［エクオール生産培地A］
1リットル当たりの量
ポリペプトン（日本製薬） 3 g
酵母エキス（極東製薬） 5 g
KH2PO4 2.5 g
L-システイン塩酸塩 0.5 g
L-アルギニン塩酸塩 12.1 g
ヘミン 0.002 g
ダイゼイン（LKT社製）5.5 g
精製水を加え、pHを7.1に調整する。

（実験培地）
比較例１：エクオール生産培地A
比較例２：エクオール生産培地A＋β-シクロデキストリン 24.8 g/L
実施例１：エクオール生産培地A＋デキストリン 40 g/L
実施例２：エクオール生産培地A＋β-シクロデキストリン 24.8 g/L＋デキストリン 40 g/L

〔実施例３〜９、比較例３〕
GAMブイヨン培地（日水製薬製）5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管（三紳工業製）に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus） DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行った。以下に示すようなエクオール生産培地（実験培地）を調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却後、この種培養液0.1 mLを植菌し、気相を水素ガスで無菌的に2分間以上置換した後、37℃、250 spmの条件で振とう培養を行った。24時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量した。結果を図２に示す。デキストリンのみならず、二糖類、糖アルコール類とβ-シクロデキストリンの両者を培地に添加することでもエクオールの生産が顕著に増加（２〜３倍）するという相乗効果があることが明らかになった。

［エクオール生産培地B］
エクオール生産培地Aにβ−シクロデキストリン 24.8 g/Lを加えた培地
（実験培地）
添加物（いずれも40 g/Lの濃度で加えた）
比較例３：無添加
実施例３：セロビオース
実施例４：マルトース
実施例５：トレハロース
実施例６：エリトリトール
実施例７：ソルビトール
実施例８：myo-イノシトール
実施例９：デキストリン

〔実施例１０〜１３、比較例４〕
GAMブイヨン培地（日水製薬製）5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管（三紳工業製）に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus） DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行った。以下に示すようなエクオール生産培地（実験培地）を調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却後、この種培養液0.1 mLを植菌し、気相を水素ガスで無菌的に2分間以上置換した後、37℃、250 spmの条件で振とう培養を行った。24時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量した。結果を表２に示す。実施例３〜９の結果と同様に、アルコール、二糖類でエクオール生産が増加することが明らかになった。デキストリンのみならず、二糖類、糖アルコール類とβ-シクロデキストリンの両者を培地に添加することでもエクオールの生産が顕著に増加（２〜３倍）するという相乗効果があることが明らかになった。

［エクオール生産培地C］
エクオール生産培地Bの内、ダイゼインを3.7 g/L、β-シクロデキストリンを 16.9g/Lに変更した培地
（実験培地）
添加物（いずれも40 g/Lの濃度で加えた）
比較例４： 無添加
実施例１０：グリセリン
実施例１１：シュクロース
実施例１２：ラクトース
実施例１３：デキストリン

本発明の方法により製造されたエクオールを、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防できるものと考えられる。

Claims (5)

1. 次の工程を含むエクオール生産能を有する、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法：
   （１）イソフラボン類に加えて、シクロデキストリン、並びに、デキストリン、セロビオース、マルトース、トレハロース、エリスリトール、ソルビトール、イノシトール、グリセリン、シュクロース、及びラクトースから選ばれる少なくとも一種である多価アルコールの両者を夫々10g/L〜60g/Lの濃度で含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
   （２）工程（１）で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。
2. イソフラボン類がダイゼインである、請求項１記載の製造方法。
3. シクロデキストリンがβ−シクロデキストリンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツスである請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で嫌気性微生物を培養する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。

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