JP6968575B2 - 微生物を用いた5‐ヒドロキシエクオールの製造方法 - Google Patents
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これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素(β‐グルコシダーゼ等)の働きにより、それぞれダイゼイン(daidzein)、グリシテイン(glycitein)、ゲニステイン(genistein)となる。
これらのうちダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン(dihydrodaidzein)を経てエクオール(equol)へと酵素的に変換されることが知られている。同様に、ゲニステインも一部の腸内細菌の働きによりジヒドロゲニステイン(dihydrogenistein)、5‐ヒドロキシエクオール(5-hydroxyequol)へと変換されることが知られている(非特許文献7)。
を産生できることが明らかとなっている(非特許文献7、13〜14)。しかしながら、たとえば、エクオール産生菌であるエガセラ(Eggerthella)属によるゲニステインの代謝および5‐ヒドロキシエクオール産生は報告されておらず(非特許文献12)、5‐ヒドロキシエクオールの産生においては、産生菌選択の幅が非常に狭い状態であった。
下記工程(a)を含む5‐ヒドロキシエクオールの製造方法。
工程(a):ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属する微生物及び/又はアドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物に、ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程。
〔2〕
前記アサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)に属する微生物である、〔1〕に記載の製造方法。
〔3〕
前記アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)DSM 18785である、〔2〕に記載の製造方法。
〔4〕
前記アドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)に属する微生物である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の製造方法。
〔5〕
前記アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450である、〔4〕に記載の製造方法。
〔6〕
水素を含む1種類以上の気体を含む気相下で前記工程(a)が行われる、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の製造方法。
〔7〕
前記気相における前記水素の割合が0.1%以上100%以下である、〔6〕に記載の製造方法。
本発明により得られる5‐ヒドロキシエクオールを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品(サプリメントを含む。)等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、5‐ヒドロキシエクオールによる公知の効果を簡便に得ることができる。
工程(a)は、ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属
する微生物及び/又はアドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物に、ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程である。
本発明におけるアサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属する微生物は、ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する。中でも、その能力が高いことから、アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)に属する微生物が好ましく、中でも、DSM 18785株がより好ましい。当該微生物は、1種でも2種以上を用いてもよい。
本発明におけるアドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物は、ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する。中でも、その能力が高いことから、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)に属する微生物が好ましく、中でも、DSM 19450株が好ましい。当該微生物は、1種でも2種以上を用いてもよい。
本発明におけるゲニステインを含有する溶液とは、該溶液において、ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属する微生物及び/又はアドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物に、該ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは後述する「培地、及び培養による5‐ヒドロキシエクオールの産生」欄に記載した培地である。
溶液中のゲニステインの含有量は、通常0.01g/L以上、好ましくは0.1g/L以上、より好ましくは1g/L以上である。一方、通常100g/L以下、好ましくは20g/L以下、より好ましくは10g/L以下である。
工程(a)では、前記溶液が培地であることが好ましい。該培地は特に限定されないが、たとえば、Thermo scientific社製 Anaerobe Basal Broth (ABB)培地、日水製薬社製のGAM培地、変法GAM培地などを使用することができる。
ソルボース
フラクトース
メタノール
吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸など有機酸類
無機化合物 ビタミン類
リン酸二水素カリウム ビオチン
硫酸マグネシウム 葉酸
硫酸マンガン ピリドキシン
塩化ナトリウム チアミン
塩化コバルト リボフラビン
塩化カルシウム ニコチン酸
硫酸亜鉛 パントテン酸
硫酸銅 ビタミンB12
明ばん チオオクト酸
モリブデン酸ソーダ p‐アミノ安息香酸
塩化カリウム
ホウ酸等
塩化ニッケル
タングステン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウム
硫酸第一鉄アンモニウム
培養中の気相や水相をこのような環境にする方法は特に制限されないが、例えば、培養前に上記ガスで気相を置換する、培養中も培養器の底部から供給する、培養器の気相部に供給する、培養前に上記ガスで水相をバブリングするなどの方法をとることが出来る。前記水素は、水素ガスをそのまま用いてもよいが、培地にギ酸など水素の前駆体を添加し、微生物の作用により培養中に水素を生成してもよい。
培養温度は、20℃〜45℃、より好ましくは25℃〜40℃、さらに好ましくは30℃〜37℃が好ましい。
培養器の加圧条件は、生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、0.001〜1MPaの範囲、好ましくは0.01〜0.5MPaを挙げることができる。
培養時間としては、通常8〜340時間、好ましくは12〜170時間、より好ましくは16〜120時間を挙げることが出来る。
たとえば、嫌気培養ジャー(anaerobic jar)を、上記微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。
本発明は、以下の工程を含んでもよい。
本発明は、例えば、得られた5‐ヒドロキシエクオールを定量する工程を含んでもよい。定量方法は常法に従うことができる。例えば、培養液の一部を採取して適宜希釈し、よく撹拌した後、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー定量することなどが挙げられる。
さらに、5‐ヒドロキシエクオールを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
ヒドロキシエクオールの定量を行った。
培養液20μLを50倍希釈し、よく攪拌した後、孔径0.45 μmの精密濾過膜(ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜)でろ過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。
カラム:Synergi 4μm polar-RP (Phenomenex、φ4.6×150 mm)
移動相:水/メタノール[55:45, v/v]
流速:1.0 mL/min
カラム温度:40 ℃
検出:UV280 nm
保持時間:ゲニステイン: 17.2分、ジヒドロゲニステイン: 13.0分、5‐ヒドロキシエクオール: 7.2分
前培養培地としてABB培地を使用した。また、ABB培地に6.0 g/Lとなるようにイソフラボンアグリコン(ダイゼインおよびゲニステインの混合物)を添加した本培養培地を調製した。18 mm試験管に前培養培地を10 mL、本培養培地を5 mL分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして窒素ガスでガス置換した後に、121 ℃、15分間滅菌した。
前培養培地にアサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を置換した後、37℃、200 spmで24時間振とう培養を行った。
アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株を用いたこと以外は実施例1と同様にした。その結果、表1に示される通り、最大0.13 g/Lの5‐ヒドロキシエクオール(5HEQ)が産生されることを確認した。また、原料であるゲニステイン(GEN)が0.62 g/L残存し、ジヒドロゲニステイン(DHG)が1.93 g/L蓄積していた。
本発明により得られる5‐ヒドロキシエクオールを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品(サプリメントを含む。)等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、5‐ヒドロキシエクオールによる公知の効果を簡便に得ることができる。
Claims (7)
- 下記工程(a)を含む5‐ヒドロキシエクオールの製造方法。
工程(a):ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属する微生物及び/又はアドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物に、ゲニステインから5‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程。 - 前記アサッカロバクター(Asaccharobacter)属に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)に属する微生物である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)DSM 18785である、請求項2に記載の製造方法。
- 前記アドレクラウチア(Adlercreutzia)属に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)に属する微生物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450である、請求項4に記載の製造方法。
- 水素を含む1種類以上の気体を含む気相下で前記工程(a)が行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記気相における前記水素の割合が0.1%以上100%以下である、請求項6に記載の製造方法。
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