JP6005453B2 - オルニチンとエクオールを含む組成物 - Google Patents
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Description
オルニチン及びエクオールを含む組成物は、エクオールの持つ種々の予防効果をさらに活性化することが期待できる。またオルニチン及びエクオールを含む組成物は、上述のオルニチン、エクオールの両方の生理作用を有することが期待される。
オルニチン及びエクオールを含む組成物については、これらを含む大豆胚軸発酵物に関する報告がある(特許文献1)。しかし特許文献1で報告された発酵物では、それぞれの濃度が低いという課題があった。
〔1〕以下の工程を含む、L‐オルニチン及びエクオールの製造方法;
(1)イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
(2)工程(1)において得られるL‐オルニチン及びエクオールを回収する工程。
〔2〕嫌気性微生物の培養を、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で発酵させることを特徴とする、〔1〕に記載の方法。
〔3〕デキストリンが、βシクロデキストリン、βシクロデキストリン誘導体及びγシクロデキストリンからなる群より選択される、〔1〕又は〔2〕に記載の方法。
〔4〕嫌気性微生物がコーリオバクテリウム(Coriobacterium)属、アドレクラウチア(Adlercreutzia)属、アサッカロバクター(Asaccharobacter)属、アトポビウム(Atopobium)属、コリンゼラ(Collinsella)属、クリプトバクテリウム(Cryptobacterium)属、デニトロバクテリウム(Denitrobacterium)属、エガセラ(Eggerthella)属、エンテロハブダス(Enterorhabdus)属、ゴードニバクター(Gordonibacter)属、オルセネラ(Olsenella)属、パラエゲセエラ(Paraeggerthella)属、スラッキア(Slackia)属、又はラクトコッカス(Lactococcus)属のいずれかに分類される菌である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)、あるいはアドレクロウチア・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)である、〔4〕に記載の方法。
〔6〕嫌気性微生物がアドレクロウチア・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株である、〔5〕に記載の方法。
〔7〕〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法によって得られるL‐オルニチン及びエクオールのいずれか一方又は両方。
〔8〕〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法によって得られるL‐オルニチン及びエクオールを含む組成物。
〔9〕エクオールを1〜50重量%含む、〔8〕に記載の組成物。
〔10〕L‐オルニチンを2〜50重量%含む、〔8〕又は〔9〕に記載の組成物。
〔11〕乾燥処理された、〔8〕〜〔10〕のいずれかに記載の組成物。
また本発明の方法では、従来技術よりも高濃度にオルニチンとエクオールを製造することができる。例えばWO2007/066655では、粉末状大豆胚軸発酵物100gあたり632.0mgのエクオール、1.06gのオルニチンが生成されたことが報告されている。つまりWO2007/066655では、粉末状大豆胚軸発酵物中のエクオール及びオルニチンの割合はそれぞれ、0.632重量%、1.06重量%に過ぎない。これに対し本発明の方法によると、乾燥粉末試料中にエクオール及びオルニチンをそれぞれ5.0重量%、11.8重量%含有する。すなわち本発明の方法によると、従来技術よりも約10倍量のエクオール及びオルニチンを製造することができる。
(1)イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
(2)工程(1)において得られるオルニチン及びエクオールを回収する工程
本発明において好ましいオルニチンはL‐オルニチンである。
アグリコンの例として、ダイゼイン、6-ヒドロキシダイゼイン、ジヒドロキシダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ビオカニンA、フォルモネチン、及びクメストロールなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
また配糖体の例として、ゲニスチン、グリシチン、ダイジン、プエラリンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明において好適なイソフラボン類としては、ダイゼイン、6-ヒドロキシダイゼイン及びジヒドロキシダイゼイン、並びにこれらの配糖体を挙げることができる。
・グルコシル−β−シクロデキストリン(6−O−α−D−Glucosy−β−cyclodextrin)
・マルトシル−β−シクロデキストリン(6−O−α−D−Maltosy−β−cyclodextrin)
・ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(Hydroxypropy−β−cyclodextrin)
・メチル−β−シクロデキストリン(Methyl−β−cyclodextrin)
・ポリ−β−シクロデキストリン(Poly−β−cyclodextrin)
培地中へのデキストリンの添加量は、例えば培地中のイソフラボン類の0.5モル〜5モル倍、好ましくは1.0モル〜3モル倍とすることができるがこれらに限定されない。
・コーリオバクテリウム(Coriobacterium)属
・アドレクラウチア(Adlercreutzia)属
・アサッカロバクター(Asaccharobacter)属
・アトポビウム(Atopobium)属
・コリンゼラ(Collinsella)属
・クリプトバクテリウム(Cryptobacterium)属
・デニトロバクテリウム(Denitrobacterium)属
・エガセラ(Eggerthella)属
・エンテロハブダス(Enterorhabdus)属
・ゴードニバクター(Gordonibacter)属
・オルセネラ(Olsenella)属
・パラエゲセエラ(Paraeggerthella)属
・スラッキア(Slackia)属
・ラクトコッカス(Lactococcus)属
例えば、培養液に酢酸エチルを加えて、激しく攪拌した後遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同培養液に同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得ることができる。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとすることができる。高速液体クロマトグラフィーの条件は例えば以下のものを例示することができるがこれに限定されない。
[高速液体クロマトグラフィー条件]
カラム:Phenomenox Luna 5uC18、2.0mm×150mm(島津ジーエルシー)
移動相:水/メタノール[55:45,v/v]
流速:0.2mL/min
カラム温度:40℃
検出:UV280nm
保持時間:ジヒドロダイゼインが13.8分、ダイゼインが19.6分、グリシテインが22.5分、エクオールが25.6分、ゲニステインが35.0分。
オルニチンは一般的なのHPLCによるアミノ酸分析法で定量することもできる。例えば、新生化学実験講座I,p.p.30〜40(日本生化学学会編, 東京化同人,1990)に示されている。
・Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
・Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
・Slackia isoflavoniconvertens HE8(DSM 22006)
・Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729号
・Eggerthella sp. KCCM-10490
・Asaccharobacter celatus DSM 18785
・Lactococcus garvieae DSM 6783
・アサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus)DSM 18785株
・アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株
・スラッキア・イソフラボニコンバーテンス(Slackia isoflavoniconvertens)DSM 22006株
FERM 特許生物寄託センター;International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
ソルボース
フラクトース
グルコース
メタノール
吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸など有機酸類
一方、好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類(例えばポリペプトンNなど)、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい有機窒素源はアルギニン、システイン、シトルリン、リジン、酵母エキス、ペプトン類(例えばポリペプトンNなど)である。
無機化合物 ビタミン類
リン酸二水素カリウム ビオチン
硫酸マグネシウム 葉酸
硫酸マンガン ピリドキシン
塩化ナトリウム チアミン
塩化コバルト リボフラビン
塩化カルシウム ニコチン酸
硫酸亜鉛 パントテン酸
硫酸銅 ビタミンB12
明ばん チオオクト酸
モリブデン酸ソーダ p-アミノ安息香酸
塩化カリウム
ホウ酸等
塩化ニッケル
タングステン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウム
硫酸第一鉄アンモニウム
発酵時間は、オルニチン及びエクオールの生成量、イソフラボン類の残存量等に応じて適宜設定できる。例えば8〜120時間、好ましくは12〜72時間、特に好ましくは16〜60時間を例示することができるがこれらに限定されない。
(1)イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
(2)工程(1)において得られる培養生成液から菌体を除去し、オルニチン及びエクオールを含む発酵組成物を取得する工程
このようにして得られる組成物には、オルニチン及びエクオールの他に、原料であるイソフラボン類に由来する物質など培養に使用した様々な物質が含まれる。
また本発明においては、培養生成液から純度の高いオルニチンやエクオールを取得することもできる。従って本発明は、本発明の方法によって製造されるオルニチンを提供する。また本発明は、本発明の方法によって製造されるエクオールを提供する。さらに本発明は、本発明の方法によって製造されるオルニチン及びエクオールを提供する。また本発明は、本発明の方法によって製造されるオルニチン及びエクオールを含む組成物を提供する。
また本発明の組成物は、乾燥粉末中、オルニチンを2〜50重量%含むことができる。例えば、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、30%、40%、50%から選択される2点の質量パーセント濃度を下限(「〜以上、又は、〜より高い)及び上限(〜以下、又は、〜より低い)とする濃度範囲により示される質量パーセント濃度であることが好ましい。
なお本発明の方法によって得られる組成物には、エクオールやオルニチンの他に、シトルリンが含まれていてもよい。シトルリンは、本発明の方法によって得られる組成物の乾燥粉末中、例えば、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%から選択される2点の質量パーセント濃度を下限(「〜以上、又は、〜より高い)及び上限(〜以下、又は、〜より低い)とする濃度範囲により示される質量パーセント濃度であることが好ましい。
ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン、ダイゼイン、ジハイドロダイゼ、イン等のダイゼイン類、
ゲニスチン、マロニルゲニスチン、アセチルゲニスチン、ゲニステイン、ジハイドロゲニステイン等のゲニステイン類、
グリシチン、マロニルグリシチン、アセチルグリシチン、グリシティン、ジハイドログリシティン等のグリシティン類
などが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物を医薬品として提供する場合、その剤型は、予防または治療しようとする疾患や医薬品の使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、心疾患、更年期障害の予防や治療のために使用することができる。
本発明の組成物等は、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕
GAMブイヨン培地(日水製薬製)5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管(三紳工業製)に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアドレクロウチア・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後(水素の分圧パーセント濃度 100%)、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行い、種培養液を調製した。
オートマチックシステムリサーチ社製2L容ミニジャーに表1に示すようなエクオール生産培地1.0Lを調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した。これに上記種培養液20 mLを植菌し、水素/N2〔2:98〕ガスを0.1 L/minで通気しながら37℃、500 rpm、0.05 MPaで培養を行った。48時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量したところ、2.95 g/Lのエクオールが生成していた。
培養終了後、105℃、1分加熱殺菌し、冷却後、遠心分離にて菌体および不溶物を除去した。この上清をさらにスペクトラム社製MFろ過膜(0.2 μm、ポリエーテルサルホン、MiniKrosサンプルモジュール)によりろ過を行い、清澄なろ液約900 mLを得た。これをスプレードライ装置にて乾燥し、粉末47 gを得た(熱風温度165℃、排風温度95〜100℃、アトマイザー回転数26000 rpm)。分析の結果、この粉末中にはエクオール5.0重量%、オルニチン11.8重量%、シトルリン 1.69重量%が含まれていた。
Claims (7)
- 以下の工程を含む、L‐オルニチン及びエクオールの製造方法;
(1)L−アルギニン塩酸塩、イソフラボン類及びデキストリンを含む培地でアドレクロウチア・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株を培養する工程、及び
(2)工程(1)において得られるL‐オルニチン及びエクオールを回収する工程。 - アドレクロウチア・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株の培養を、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で発酵させることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- デキストリンが、βシクロデキストリン、βシクロデキストリン誘導体及びγシクロデキストリンからなる群より選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 以下の工程を含む、L‐オルニチン及びエクオールを含む組成物の製造方法;
(1)L−アルギニン塩酸塩、イソフラボン類及びデキストリンを含む培地でアドレクロウチア・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens)DSM 19450株を培養する工程、及び
(2)工程(1)において得られる培養液から菌体を除去し、L‐オルニチン及びエクオールを含む発酵組成物を取得する工程。 - 組成物がエクオールを1〜50重量%含む、請求項4に記載の方法。
- 組成物がL‐オルニチンを2〜50重量%含む、請求項4又は5に記載の方法。
- 組成物が乾燥処理されたものである、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
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