JP2001136959A - 枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物、これに由来する水溶性ビタミンｋ誘導体、これらを含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法 - Google Patents
枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物、これに由来する水溶性ビタミンｋ誘導体、これらを含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法Info
- Publication number
- JP2001136959A JP2001136959A JP32746099A JP32746099A JP2001136959A JP 2001136959 A JP2001136959 A JP 2001136959A JP 32746099 A JP32746099 A JP 32746099A JP 32746099 A JP32746099 A JP 32746099A JP 2001136959 A JP2001136959 A JP 2001136959A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- bacillus subtilis
- vitamin
- culture
- derivative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Confectionery (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ビタミンＫ誘導体を最も多量に菌体内に貯蔵
した枯草菌（Bacillus subtilis）菌体および／または
菌体外に放出したこのような産生物を含む培養物を提供
する。 【解決手段】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、およびそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体、そ
れらを含む医薬、食品および飼料、ならびにそれらの製
造方法である。
した枯草菌（Bacillus subtilis）菌体および／または
菌体外に放出したこのような産生物を含む培養物を提供
する。 【解決手段】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、およびそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体、そ
れらを含む医薬、食品および飼料、ならびにそれらの製
造方法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、枯草菌（Bacillus
subtilis）の菌体および／またはその産生物を含む培
養物、これに由来する水溶性ビタミンＫ誘導体、これら
を含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法
に関するものである。より詳しくは、本発明は、ビタミ
ンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導
体を最も多量に菌体内に貯蔵した枯草菌菌体および／ま
たは菌体外に放出したこのような産生物を含む培養物、
該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノ
ン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体、該培養物または該水溶
性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ
2 ）誘導体を含む医薬、食品および飼料ならびに該培養
物および該水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−
７（ビタミンＫ2 ）誘導体の製造方法に関するものであ
る。
subtilis）の菌体および／またはその産生物を含む培
養物、これに由来する水溶性ビタミンＫ誘導体、これら
を含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法
に関するものである。より詳しくは、本発明は、ビタミ
ンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導
体を最も多量に菌体内に貯蔵した枯草菌菌体および／ま
たは菌体外に放出したこのような産生物を含む培養物、
該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノ
ン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体、該培養物または該水溶
性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ
2 ）誘導体を含む医薬、食品および飼料ならびに該培養
物および該水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−
７（ビタミンＫ2 ）誘導体の製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ビタミンＫは、従来、血液が凝固する際
に必要な因子として知られており、このビタミンの欠乏
は血液凝固能の低下をもたらすので抗出血性ビタミンと
も呼ばれる脂溶性ビタミンの一種である。このビタミン
Ｋの欠乏が血液凝固能の低下をもたらす原因としては、
近年、プロトロンビンを含む数種の血液凝固因子の生合
成にビタミンＫが不可欠であることが示唆された。しか
しながら、血液凝固能の低下を防止するために必要とさ
れるビタミンＫの量はμｇオーダーと極めて微量であ
り、一般的には、成人では腸内細菌から供給されるの
で、ビタミンＫ欠乏症になることはまれであり、また、
ビタミンＫ欠乏性出血症の治療には合成ビタミンＫ1 や
Ｋ2 が医薬品として用いられ、これまではこの予防を目
的として天然ビタミンＫ1濃縮物が食品として利用され
ているため、ビタミンＫはこれまであまり注目されるこ
とはなかった。
に必要な因子として知られており、このビタミンの欠乏
は血液凝固能の低下をもたらすので抗出血性ビタミンと
も呼ばれる脂溶性ビタミンの一種である。このビタミン
Ｋの欠乏が血液凝固能の低下をもたらす原因としては、
近年、プロトロンビンを含む数種の血液凝固因子の生合
成にビタミンＫが不可欠であることが示唆された。しか
しながら、血液凝固能の低下を防止するために必要とさ
れるビタミンＫの量はμｇオーダーと極めて微量であ
り、一般的には、成人では腸内細菌から供給されるの
で、ビタミンＫ欠乏症になることはまれであり、また、
ビタミンＫ欠乏性出血症の治療には合成ビタミンＫ1 や
Ｋ2 が医薬品として用いられ、これまではこの予防を目
的として天然ビタミンＫ1濃縮物が食品として利用され
ているため、ビタミンＫはこれまであまり注目されるこ
とはなかった。
【０００３】しかしながら、近年、ビタミンＫには骨形
成促進作用及び骨吸収抑制作用があり、ビタミンＫの投
与で骨密度が増加することが明らかにされた。一方、骨
粗鬆症は、老化や疾病などの原因によって起こる、骨が
もろくなる病態で、骨折したり、激しい痛みなどを伴
い、老人医療の面から大きな社会問題となりつつある病
気であり、骨粗鬆症患者におけるビタミンＫの血中濃度
を調べてみると健常人に比べて約１／２と少ないことが
報告された。このため、合成ビタミンＫが骨粗鬆症用治
療薬として臨床試験が行われているが、出血症の治療・
予防の場合と異なり、骨粗鬆症の治療・予防では、一日
に４５ｍｇ以上という多量のビタミンＫの投与で骨量を
増す改善効果があることが臨床試験により証明されてい
る。また、骨粗鬆症は発病してからの治療より予防が重
要であり、このためには食品から日常的にビタミンＫを
摂取することが望まれるが、健常者の場合、一日にどの
くらいのビタミンＫを摂取すれば骨量が増し、骨粗鬆症
の予防に役立つかは明らかではない上、既存の食品で上
記したような量を摂取することは難しいと思われる。
成促進作用及び骨吸収抑制作用があり、ビタミンＫの投
与で骨密度が増加することが明らかにされた。一方、骨
粗鬆症は、老化や疾病などの原因によって起こる、骨が
もろくなる病態で、骨折したり、激しい痛みなどを伴
い、老人医療の面から大きな社会問題となりつつある病
気であり、骨粗鬆症患者におけるビタミンＫの血中濃度
を調べてみると健常人に比べて約１／２と少ないことが
報告された。このため、合成ビタミンＫが骨粗鬆症用治
療薬として臨床試験が行われているが、出血症の治療・
予防の場合と異なり、骨粗鬆症の治療・予防では、一日
に４５ｍｇ以上という多量のビタミンＫの投与で骨量を
増す改善効果があることが臨床試験により証明されてい
る。また、骨粗鬆症は発病してからの治療より予防が重
要であり、このためには食品から日常的にビタミンＫを
摂取することが望まれるが、健常者の場合、一日にどの
くらいのビタミンＫを摂取すれば骨量が増し、骨粗鬆症
の予防に役立つかは明らかではない上、既存の食品で上
記したような量を摂取することは難しいと思われる。
【０００４】上述したように、ビタミンＫの摂取は日常
の食品を通じて行われるのが望ましく、実際、ビタミン
Ｋ1 は緑黄色野菜や海草類などから、ビタミンＫ2 は納
豆などの発酵食品から摂取することができる。しかしな
がら、市販の食品から骨粗鬆症の改善に有効な量である
との報告のある４５ｍｇのビタミンＫを摂取しようとす
る場合、例えば、ビタミンＫを１ｐｐｍ含有する食品で
は、一日に４５ｋｇという多量の食品を食する必要があ
るが、このようなことは実際には非常に困難である。ま
た、食品のうちでビタミンＫの含量が十数ｐｐｍと最も
多いのは納豆であるが、たとえ、このような納豆を食し
ても一日に数百ｇから数ｋｇの量を食さなくてはなら
ず、嗜好上、これだけの量を毎日食することは困難であ
る上、摂取されたビタミンＫの半減期は短く、単発で経
口摂取したのでは効果が不十分であったり、また逆に一
時に大量摂取すると副作用の問題も残されていた。この
ため、ビタミンＫが濃縮されたものを摂取することが望
ましいが、出血症予防のために調製粉乳に添加している
市販の天然ビタミンＫ濃縮物は高価であり、医薬品の合
成ビタミンＫは食品に使用できないという問題があっ
た。
の食品を通じて行われるのが望ましく、実際、ビタミン
Ｋ1 は緑黄色野菜や海草類などから、ビタミンＫ2 は納
豆などの発酵食品から摂取することができる。しかしな
がら、市販の食品から骨粗鬆症の改善に有効な量である
との報告のある４５ｍｇのビタミンＫを摂取しようとす
る場合、例えば、ビタミンＫを１ｐｐｍ含有する食品で
は、一日に４５ｋｇという多量の食品を食する必要があ
るが、このようなことは実際には非常に困難である。ま
た、食品のうちでビタミンＫの含量が十数ｐｐｍと最も
多いのは納豆であるが、たとえ、このような納豆を食し
ても一日に数百ｇから数ｋｇの量を食さなくてはなら
ず、嗜好上、これだけの量を毎日食することは困難であ
る上、摂取されたビタミンＫの半減期は短く、単発で経
口摂取したのでは効果が不十分であったり、また逆に一
時に大量摂取すると副作用の問題も残されていた。この
ため、ビタミンＫが濃縮されたものを摂取することが望
ましいが、出血症予防のために調製粉乳に添加している
市販の天然ビタミンＫ濃縮物は高価であり、医薬品の合
成ビタミンＫは食品に使用できないという問題があっ
た。
【０００５】ところで、ビタミンＫ類の中で、自然界に
存在するのはビタミンＫ1およびビタミンＫ2 群のみで
ある。ビタミンＫ1 は、食品中では、特に緑色野菜、植
物油、海藻等に多く含まれており、例えば、海藻・海苔
・茶葉などに数十ｐｐｍ、大豆油、ほうれん草やブロッ
コリーなどに数ｐｐｍ含まれており、また２−メチル−
１，４−ナフトキノンとフィチルアセテートを縮合する
ことよって合成される。また、ビタミンＫ2 群は、側鎖
長の違いによりメナキノン−１〜１４（ＭＫ−１〜１
４）の同族体が知られている。これらのうち、特にメナ
キノン−７（本明細書では、単に「ＭＫ−７」ともい
う）は、ビタミンＫ2 の代表的な物質であり、主に納豆
菌によって合成されるが、自然界では納豆でも数〜十数
ｐｐｍと比較的微量にしか存在しない上半減期が短いた
め、単離が非常に困難であり、これまで、ＭＫ−７高含
量の脂質を調製した例は、特開平８−７３３９６号公報
一例くらいしか知られていない。
存在するのはビタミンＫ1およびビタミンＫ2 群のみで
ある。ビタミンＫ1 は、食品中では、特に緑色野菜、植
物油、海藻等に多く含まれており、例えば、海藻・海苔
・茶葉などに数十ｐｐｍ、大豆油、ほうれん草やブロッ
コリーなどに数ｐｐｍ含まれており、また２−メチル−
１，４−ナフトキノンとフィチルアセテートを縮合する
ことよって合成される。また、ビタミンＫ2 群は、側鎖
長の違いによりメナキノン−１〜１４（ＭＫ−１〜１
４）の同族体が知られている。これらのうち、特にメナ
キノン−７（本明細書では、単に「ＭＫ−７」ともい
う）は、ビタミンＫ2 の代表的な物質であり、主に納豆
菌によって合成されるが、自然界では納豆でも数〜十数
ｐｐｍと比較的微量にしか存在しない上半減期が短いた
め、単離が非常に困難であり、これまで、ＭＫ−７高含
量の脂質を調製した例は、特開平８−７３３９６号公報
一例くらいしか知られていない。
【０００６】このため、ビタミンＫ2 を納豆菌等の微生
物を用いて大量に生産することが試みられ、天然ビタミ
ンＫ2 を得る方法としては多くの研究が知られており、
例えば、フラボバクテリウム属に属する微生物の培養液
からビタミンＫ2 を採取する方法（特公平７−２８７４
８号及び特公平７−５１０７０号公報）、大豆煮汁や豆
腐粕等に納豆菌を接種して発酵させることによりビタミ
ンＫを生産する方法（特開平１０−２９５３９３号、特
開平８−１９３７８号、特開平８−９９１６号及び特開
平８−１７３０７８号公報）が挙げられる。これらの方
法に加えて、納豆菌の発酵物をアルコール、エーテル、
エステルやケトン等の有機溶媒による溶媒抽出などを行
うことによって天然ビタミンＫ2 、特に天然ＭＫ−７を
多量に含む濃縮脂質を得る方法（特開平８−７３３９６
号公報）が提案されている。しかしながら、フラボバク
テリウムなどのビタミンＫ生産菌を使用する方法は、フ
ラボバクテリウムが食品としての安全性が証明されてい
ないので、直ちに食品に供することはできないという問
題がある。また、納豆菌を用いてビタミンＫを調製する
方法では、確かに最大約４０ｍｇ／リットル培養液とい
う比較的ビタミンＫ含有量の高い培養物が得られたもの
の、ここで産生するのは水溶性ではなく脂溶性のビタミ
ンＫであるため、その使用できる用途は非常に限定され
たものとなる。さらに、納豆菌の発酵物を有機溶媒で抽
出することによって調製される天然メナキノン−７高含
量脂質は、大豆等の食用に供することができるものを原
料として調製されてはいるものの、有機溶媒を使用する
ため食品に使用する際にはこの有機溶媒を完全に除去し
なければならずこのための設備や時間がさらに必要とな
る上、上記と同様、得られるＭＫ−７高含量脂質はその
名称からも明らかなように脂溶性であるためその使用で
きる用途が限定される。
物を用いて大量に生産することが試みられ、天然ビタミ
ンＫ2 を得る方法としては多くの研究が知られており、
例えば、フラボバクテリウム属に属する微生物の培養液
からビタミンＫ2 を採取する方法（特公平７−２８７４
８号及び特公平７−５１０７０号公報）、大豆煮汁や豆
腐粕等に納豆菌を接種して発酵させることによりビタミ
ンＫを生産する方法（特開平１０−２９５３９３号、特
開平８−１９３７８号、特開平８−９９１６号及び特開
平８−１７３０７８号公報）が挙げられる。これらの方
法に加えて、納豆菌の発酵物をアルコール、エーテル、
エステルやケトン等の有機溶媒による溶媒抽出などを行
うことによって天然ビタミンＫ2 、特に天然ＭＫ−７を
多量に含む濃縮脂質を得る方法（特開平８−７３３９６
号公報）が提案されている。しかしながら、フラボバク
テリウムなどのビタミンＫ生産菌を使用する方法は、フ
ラボバクテリウムが食品としての安全性が証明されてい
ないので、直ちに食品に供することはできないという問
題がある。また、納豆菌を用いてビタミンＫを調製する
方法では、確かに最大約４０ｍｇ／リットル培養液とい
う比較的ビタミンＫ含有量の高い培養物が得られたもの
の、ここで産生するのは水溶性ではなく脂溶性のビタミ
ンＫであるため、その使用できる用途は非常に限定され
たものとなる。さらに、納豆菌の発酵物を有機溶媒で抽
出することによって調製される天然メナキノン−７高含
量脂質は、大豆等の食用に供することができるものを原
料として調製されてはいるものの、有機溶媒を使用する
ため食品に使用する際にはこの有機溶媒を完全に除去し
なければならずこのための設備や時間がさらに必要とな
る上、上記と同様、得られるＭＫ−７高含量脂質はその
名称からも明らかなように脂溶性であるためその使用で
きる用途が限定される。
【０００７】上述したように、納豆、納豆の製造過程で
発生する粕、煮汁等の副産物の発酵物から納豆菌等の微
生物を用いてビタミンＫやＭＫ−７を生産する（即ち、
菌体外からビタミンＫやＭＫ−７を取り出す）方法は多
数報告されてきたが、納豆菌をはじめとする枯草菌の菌
体内に貯蔵されたビタミンＫやＭＫ−７に関する報告は
従来ほとんどなかった。
発生する粕、煮汁等の副産物の発酵物から納豆菌等の微
生物を用いてビタミンＫやＭＫ−７を生産する（即ち、
菌体外からビタミンＫやＭＫ−７を取り出す）方法は多
数報告されてきたが、納豆菌をはじめとする枯草菌の菌
体内に貯蔵されたビタミンＫやＭＫ−７に関する報告は
従来ほとんどなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、通常の食品からは充分な量の摂取ができないま
たは摂取困難な天然ビタミンＫ、特に天然ＭＫ−７を簡
単に日常的に摂取することを可能ならしめるべく、ビタ
ミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ 2 ）誘
導体を最も多量に菌体内に貯蔵した枯草菌菌体および／
または菌体外に放出したこのような産生物を含む培養
物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナ
キノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体、該培養物または該
水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミ
ンＫ2 ）誘導体を含む医薬、食品および飼料ならびに該
培養物および該水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノ
ン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体の製造方法を提供するも
のである。
目的は、通常の食品からは充分な量の摂取ができないま
たは摂取困難な天然ビタミンＫ、特に天然ＭＫ−７を簡
単に日常的に摂取することを可能ならしめるべく、ビタ
ミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ 2 ）誘
導体を最も多量に菌体内に貯蔵した枯草菌菌体および／
または菌体外に放出したこのような産生物を含む培養
物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナ
キノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体、該培養物または該
水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミ
ンＫ2 ）誘導体を含む医薬、食品および飼料ならびに該
培養物および該水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノ
ン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体の製造方法を提供するも
のである。
【０００９】本発明の他の目的は、長時間血中濃度を必
要な濃度に高めたままそれを維持する効果を有しかつ安
全性にも優れたビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７
（ビタミンＫ2 ）誘導体を最も多量に菌体内に貯蔵した
枯草菌菌体および／または菌体外に放出したこのような
産生物を含む培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ
誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体、
該培養物または該水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキ
ノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体を含む医薬、食品およ
び飼料ならびに該培養物および該水溶性ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体の製造
方法を提供するものである。
要な濃度に高めたままそれを維持する効果を有しかつ安
全性にも優れたビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７
（ビタミンＫ2 ）誘導体を最も多量に菌体内に貯蔵した
枯草菌菌体および／または菌体外に放出したこのような
産生物を含む培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ
誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体、
該培養物または該水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキ
ノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体を含む医薬、食品およ
び飼料ならびに該培養物および該水溶性ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体の製造
方法を提供するものである。
【００１０】本発明のさらなる他の目的は、保存安定性
に優れ、取り扱いの容易なビタミンＫ誘導体、特にメナ
キノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体を最も多量に菌体内
に貯蔵した枯草菌菌体および／または菌体外に放出した
このような産生物を含む培養物、該培養物由来の水溶性
ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミン
Ｋ 2 ）誘導体、該培養物または該水溶性ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体を含む
医薬、食品および飼料ならびに該培養物および該水溶性
ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミン
Ｋ2 ）誘導体の製造方法を提供するものである。
に優れ、取り扱いの容易なビタミンＫ誘導体、特にメナ
キノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体を最も多量に菌体内
に貯蔵した枯草菌菌体および／または菌体外に放出した
このような産生物を含む培養物、該培養物由来の水溶性
ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミン
Ｋ 2 ）誘導体、該培養物または該水溶性ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2 ）誘導体を含む
医薬、食品および飼料ならびに該培養物および該水溶性
ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミン
Ｋ2 ）誘導体の製造方法を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記事情に
鑑みて、納豆の成分（Experientia, 43:1110, 1987；Ac
ta Haematol., 84: 139, 1990；Fibrinolysis, 6: 86,
1992；日本薬剤師会誌、30: 73, 1994；バイオインダス
トリー、14: 47, 1996）、ならびに納豆菌中及び血中ビ
タミンＫの分析（日本血栓止血誌、8: 287, 1997；Fibr
inolysis & Proteolysis, Vol.12, Supplement 1, 205,
p.75, 1998）について鋭意研究を行ってきた結果、
（１）納豆等の納豆菌の発酵物やそれに含まれるビタミ
ンＫの摂取ではなく、生きた枯草菌そのものの摂取によ
って高い血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度の亢進
効果が認められること、及び特に納豆菌の場合は他に比
べて極めて高い血漿中濃度の持続効果を発揮すること、
（２）特定の成長段階まで培養した納豆菌は菌体内に多
量のＭＫ−７を蓄積しており、この段階で回収された納
豆菌またはその培養物そのものを摂取することによって
高い血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度が認めら
れ、かつこのようにして摂取された際の血漿中のビタミ
ンＫ濃度は長持間持続すること （３）上記段階で回収された納豆菌の菌体内に蓄積され
たビタミンＫ、特にＭＫ−７は水溶性であること、等を
見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至
った。
鑑みて、納豆の成分（Experientia, 43:1110, 1987；Ac
ta Haematol., 84: 139, 1990；Fibrinolysis, 6: 86,
1992；日本薬剤師会誌、30: 73, 1994；バイオインダス
トリー、14: 47, 1996）、ならびに納豆菌中及び血中ビ
タミンＫの分析（日本血栓止血誌、8: 287, 1997；Fibr
inolysis & Proteolysis, Vol.12, Supplement 1, 205,
p.75, 1998）について鋭意研究を行ってきた結果、
（１）納豆等の納豆菌の発酵物やそれに含まれるビタミ
ンＫの摂取ではなく、生きた枯草菌そのものの摂取によ
って高い血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度の亢進
効果が認められること、及び特に納豆菌の場合は他に比
べて極めて高い血漿中濃度の持続効果を発揮すること、
（２）特定の成長段階まで培養した納豆菌は菌体内に多
量のＭＫ−７を蓄積しており、この段階で回収された納
豆菌またはその培養物そのものを摂取することによって
高い血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度が認めら
れ、かつこのようにして摂取された際の血漿中のビタミ
ンＫ濃度は長持間持続すること （３）上記段階で回収された納豆菌の菌体内に蓄積され
たビタミンＫ、特にＭＫ−７は水溶性であること、等を
見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至
った。
【００１２】すなわち、本発明は、枯草菌（Bacillus s
ubtilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビ
タミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出さ
れる前に該菌体および／またはその産生物を回収するこ
とにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産生
物を含む培養物である。
ubtilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビ
タミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出さ
れる前に該菌体および／またはその産生物を回収するこ
とにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産生
物を含む培養物である。
【００１３】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物である。
【００１４】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記培養物である。
llus subtilis natto）である前記培養物である。
【００１５】本発明はまた、該菌体数が対数期から定常
期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前に
回収することにより得られる前記培養物である。
期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前に
回収することにより得られる前記培養物である。
【００１６】また、本発明は、前記培養物に由来する水
溶性ビタミンＫ誘導体である。
溶性ビタミンＫ誘導体である。
【００１７】本発明はまた、ビタミンＫ2 誘導体である
前記ビタミンＫ誘導体である。
前記ビタミンＫ誘導体である。
【００１８】本発明はさらに、メナキノン−７誘導体で
ある前記ビタミンＫ誘導体である。
ある前記ビタミンＫ誘導体である。
【００１９】さらに、本発明は、枯草菌（Bacillus sub
tilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタ
ミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出され
る前に該菌体および／またはその産生物を回収すること
により得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物
を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK
誘導体を含む医薬である。
tilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタ
ミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出され
る前に該菌体および／またはその産生物を回収すること
により得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物
を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK
誘導体を含む医薬である。
【００２０】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体を含む医薬である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体を含む医薬である。
【００２１】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記医薬である。
llus subtilis natto）である前記医薬である。
【００２２】本発明はまた、該培養物は、該菌体数が対
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記医薬である。
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記医薬である。
【００２３】本発明はさらに、骨粗鬆症予防および治療
剤である前記医薬である。
剤である前記医薬である。
【００２４】また、本発明は、枯草菌（Bacillus subti
lis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミ
ンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出される
前に該菌体および／またはその産生物を回収することに
より得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を
含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘
導体の医薬としての使用である。
lis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミ
ンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出される
前に該菌体および／またはその産生物を回収することに
より得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を
含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘
導体の医薬としての使用である。
【００２５】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体の医薬としての使用である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体の医薬としての使用である。
【００２６】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記使用である。
llus subtilis natto）である前記使用である。
【００２７】本発明はまた、該培養物は、該菌体数が対
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記使用である。
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記使用である。
【００２８】本発明はさらに、該医薬は骨粗鬆症予防お
よび治療剤である前記使用である。
よび治療剤である前記使用である。
【００２９】さらに、本発明は、枯草菌（Bacillus sub
tilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタ
ミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出され
る前に該菌体および／またはその産生物を回収すること
により得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物
を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK
誘導体の有効量を患者に投与することからなるヒトの疾
病の予防および／または治療方法である。
tilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタ
ミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出され
る前に該菌体および／またはその産生物を回収すること
により得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物
を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK
誘導体の有効量を患者に投与することからなるヒトの疾
病の予防および／または治療方法である。
【００３０】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体の有効量を患者に投与することからなるヒト
の病気の予防および／または治療方法である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体の有効量を患者に投与することからなるヒト
の病気の予防および／または治療方法である。
【００３１】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記方法である。
llus subtilis natto）である前記方法である。
【００３２】本発明はまた、該培養物は、該菌体数が対
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記方法である。
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記方法である。
【００３３】本発明はさらに、該疾病は骨粗鬆症である
前記方法である。
前記方法である。
【００３４】また、本発明は、枯草菌（Bacillus subti
lis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミ
ンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出される
前に該菌体および／またはその産生物を回収することに
より得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を
含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘
導体を含む食品である。
lis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミ
ンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出される
前に該菌体および／またはその産生物を回収することに
より得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を
含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘
導体を含む食品である。
【００３５】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体を含む食品である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体を含む食品である。
【００３６】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記食品である。
llus subtilis natto）である前記食品である。
【００３７】本発明はまた、該培養物は、該菌体数が対
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記食品である。
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記食品である。
【００３８】さらに、本発明は、枯草菌（Bacillus sub
tilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタ
ミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出され
る前に該菌体および／またはその産生物を回収すること
により得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物
を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK
誘導体を含む飼料である。
tilis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタ
ミンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出され
る前に該菌体および／またはその産生物を回収すること
により得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物
を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK
誘導体を含む飼料である。
【００３９】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体を含む飼料である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことにより得られる、枯草菌菌体および／またはその産
生物を含む培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミ
ンK誘導体を含む飼料である。
【００４０】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記飼料である。
llus subtilis natto）である前記飼料である。
【００４１】本発明はまた、該培養物は、該菌体数が対
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記飼料である。
数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産
生される前に回収することにより得られるものである前
記飼料である。
【００４２】また、本発明は、枯草菌（Bacillus subti
lis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミ
ンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出される
前に該菌体および／またはその産生物を回収することを
特徴とする、枯草菌菌体および／またはその産生物を含
む培養物の製造方法である。
lis）を培養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミ
ンＫおよび／またはその誘導体が該菌体外に放出される
前に該菌体および／またはその産生物を回収することを
特徴とする、枯草菌菌体および／またはその産生物を含
む培養物の製造方法である。
【００４３】本発明はまた、枯草菌（Bacillus subtili
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことを特徴とする、枯草菌菌体および／またはその産生
物を含む培養物の製造方法である。
s）を培養し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に
入る時期に該菌体および／またはその産生物を回収する
ことを特徴とする、枯草菌菌体および／またはその産生
物を含む培養物の製造方法である。
【００４４】本発明はさらに、該枯草菌は納豆菌（Baci
llus subtilis natto）である前記製造方法である。
llus subtilis natto）である前記製造方法である。
【００４５】本発明はまた、該菌体数が対数期から定常
期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前に
回収することを特徴とする前記製造方法である。
期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前に
回収することを特徴とする前記製造方法である。
【００４６】さらに、本発明は、枯草菌（Bacillus sub
tilis）を培養して得られた枯草菌菌体および／または
その産生物を含む培養液を酸性化し、沈殿物を得ること
からなる水溶性ビタミンＫ誘導体の分取方法である。
tilis）を培養して得られた枯草菌菌体および／または
その産生物を含む培養液を酸性化し、沈殿物を得ること
からなる水溶性ビタミンＫ誘導体の分取方法である。
【００４７】また、本発明は、枯草菌（Bacillus subti
lis）を培養して得られた枯草菌菌体および／またはそ
の産生物を含む培養物をソックスレー抽出することを特
徴とするビタミンＫの抽出方法である。
lis）を培養して得られた枯草菌菌体および／またはそ
の産生物を含む培養物をソックスレー抽出することを特
徴とするビタミンＫの抽出方法である。
【００４８】
【発明の実施の形態】本発明を以下に詳細に説明する。
【００４９】本発明の第一の概念によると、枯草菌を培
養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび
／またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体
および／またはその産生物を回収することを特徴とす
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物
の製造方法が提供される。
養し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび
／またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体
および／またはその産生物を回収することを特徴とす
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物
の製造方法が提供される。
【００５０】本発明に使用される枯草菌（Bacillus sub
tilis）は、枯草菌に属しかつビタミンＫを産生するも
のであれば特に制限されず、公知の枯草菌が使用でき
る。特に、安全性及びビタミンＫの産生量などを考慮す
ると、納豆菌（Bacillus subtilis natto）が本発明に
おいて好ましく使用される。本発明において特に好まし
く使用される納豆菌としては、特に制限されず、高橋菌
（高橋祐蔵研究所製、山形）、成瀬菌（株式会社成瀬醗
酵化学研究所製、東京）、宮城野菌（有限会社宮城野納
豆製造所製、仙台）、朝日菌（株式会社朝日工業製、東
京）、日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都）、目黒
菌（株式会社目黒研究所製、大阪）等の市販の納豆菌；
及び雲南SL-001菌が挙げられる。なお、雲南SL-001菌
は、平成１１年５月７日付で通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７
１３号で国際寄託された。
tilis）は、枯草菌に属しかつビタミンＫを産生するも
のであれば特に制限されず、公知の枯草菌が使用でき
る。特に、安全性及びビタミンＫの産生量などを考慮す
ると、納豆菌（Bacillus subtilis natto）が本発明に
おいて好ましく使用される。本発明において特に好まし
く使用される納豆菌としては、特に制限されず、高橋菌
（高橋祐蔵研究所製、山形）、成瀬菌（株式会社成瀬醗
酵化学研究所製、東京）、宮城野菌（有限会社宮城野納
豆製造所製、仙台）、朝日菌（株式会社朝日工業製、東
京）、日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都）、目黒
菌（株式会社目黒研究所製、大阪）等の市販の納豆菌；
及び雲南SL-001菌が挙げられる。なお、雲南SL-001菌
は、平成１１年５月７日付で通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７
１３号で国際寄託された。
【００５１】本発明において、枯草菌を菌体内で産生さ
れたビタミンＫが菌体外に放出される前に培養を終了し
て回収することを必須とし、枯草菌の培養（例えば、培
地や培養条件）などについては、枯草菌を一般的に培養
するのと同様の培地及び培養条件が使用できる。これに
より、ビタミンＫは、菌体外にはほとんど放出されずに
微生物菌体中に選択的にかつ多量に蓄積されるため、こ
のような特定の状態の菌体を回収するという簡単な操作
によって、ビタミンＫを多量に含む菌体が得られ、この
ようにして回収された菌体は、特に納豆菌など安全性が
確認されている菌である場合には、菌体からビタミンＫ
を抽出するという操作を介さずとも、そのまま菌体を食
するあるいはこのような菌体の培養物を一般的な食品に
含ませることも可能である。
れたビタミンＫが菌体外に放出される前に培養を終了し
て回収することを必須とし、枯草菌の培養（例えば、培
地や培養条件）などについては、枯草菌を一般的に培養
するのと同様の培地及び培養条件が使用できる。これに
より、ビタミンＫは、菌体外にはほとんど放出されずに
微生物菌体中に選択的にかつ多量に蓄積されるため、こ
のような特定の状態の菌体を回収するという簡単な操作
によって、ビタミンＫを多量に含む菌体が得られ、この
ようにして回収された菌体は、特に納豆菌など安全性が
確認されている菌である場合には、菌体からビタミンＫ
を抽出するという操作を介さずとも、そのまま菌体を食
するあるいはこのような菌体の培養物を一般的な食品に
含ませることも可能である。
【００５２】本発明において、枯草菌菌体の回収時期
は、上述したように、菌体内で産生されたビタミンＫが
菌体外に放出される前でなければならないが、好ましく
は前記微生物の菌体数が対数期から定常期に入る時期で
ある。また、特に枯草菌が納豆菌である際には、対数期
から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生さ
れる前に菌体を回収することが好ましい。より具体的に
は、培養時間は培養温度及びｐＨや菌体の初期濃度等の
培養条件および培養方法によって異なるものの、例え
ば、５００ｍｌ容量の三角フラスコを用いて３００ｍｌ
の培養液（組成：１．５％ポリペプトン−Ｓ、１％グル
コース、０．１％酵母エキス、ｐＨ７．２）中に雲南SL
-001株を、５×１０6個／ｍｌの初期濃度で接種して３
７℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）を行った場合、０．５
〜４日間、好ましくは６６０ｎｍでの吸光度で最大値を
示した直後（１〜２日間）である。
は、上述したように、菌体内で産生されたビタミンＫが
菌体外に放出される前でなければならないが、好ましく
は前記微生物の菌体数が対数期から定常期に入る時期で
ある。また、特に枯草菌が納豆菌である際には、対数期
から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生さ
れる前に菌体を回収することが好ましい。より具体的に
は、培養時間は培養温度及びｐＨや菌体の初期濃度等の
培養条件および培養方法によって異なるものの、例え
ば、５００ｍｌ容量の三角フラスコを用いて３００ｍｌ
の培養液（組成：１．５％ポリペプトン−Ｓ、１％グル
コース、０．１％酵母エキス、ｐＨ７．２）中に雲南SL
-001株を、５×１０6個／ｍｌの初期濃度で接種して３
７℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）を行った場合、０．５
〜４日間、好ましくは６６０ｎｍでの吸光度で最大値を
示した直後（１〜２日間）である。
【００５３】本発明において、枯草菌の培養では、枯草
菌を一般的に培養するのと同様の培地及び培養条件が使
用され、例えば、本発明による培養に使用される培地
は、当業者には公知の成分からなる培地が使用でき特に
制限されず、各種培養成分を適宜混合することにより調
製してもあるいは市販の培地をそのまま使用してもある
いは市販の培地に上記公知の成分を補助成分として添加
した培地を使用してもよい。この際、培地は、固体また
は液体培地のいずれを使用してもよく使用目的によって
適宜選択され、また、使用する微生物が資化しうる炭素
源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有す
る培地であれば、合成培地または天然培地のいずれであ
ってもよい。
菌を一般的に培養するのと同様の培地及び培養条件が使
用され、例えば、本発明による培養に使用される培地
は、当業者には公知の成分からなる培地が使用でき特に
制限されず、各種培養成分を適宜混合することにより調
製してもあるいは市販の培地をそのまま使用してもある
いは市販の培地に上記公知の成分を補助成分として添加
した培地を使用してもよい。この際、培地は、固体また
は液体培地のいずれを使用してもよく使用目的によって
適宜選択され、また、使用する微生物が資化しうる炭素
源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有す
る培地であれば、合成培地または天然培地のいずれであ
ってもよい。
【００５４】本発明による枯草菌の培養において使用で
きる炭素源は、使用する種によって異なり、使用する菌
株が良好に生育し、ビタミンＫを効率よく産生できるも
のであれば特に制限されない。具体的には、デンプンま
たはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、
デンプン誘導体、物理処理デンプン、α−デンプン、可
溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオ
リゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシ
デンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキスト
リン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース
等の炭水化物が挙げられる。これらの炭素源のうち、ビ
タミンＫの産生の観点から、グルコース及びデンプンが
好ましく使用される。これらの炭素源は、単独あるいは
２種以上の混合物の形態で使用できる。
きる炭素源は、使用する種によって異なり、使用する菌
株が良好に生育し、ビタミンＫを効率よく産生できるも
のであれば特に制限されない。具体的には、デンプンま
たはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、
デンプン誘導体、物理処理デンプン、α−デンプン、可
溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオ
リゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシ
デンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキスト
リン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース
等の炭水化物が挙げられる。これらの炭素源のうち、ビ
タミンＫの産生の観点から、グルコース及びデンプンが
好ましく使用される。これらの炭素源は、単独あるいは
２種以上の混合物の形態で使用できる。
【００５５】本発明による枯草菌の培養において使用で
きる窒素源もまた、使用する種によって異なり、使用す
る菌株が良好に生育し、ビタミンＫを効率よく産生でき
るものであれば特に制限されない。具体的には、肉エキ
ス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン
（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大
豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイ
ン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコーンスティープリ
カー等の有機窒素化合物、およびアンモニア、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムなど
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素
等の無機窒素化合物等が挙げられる。これらの窒素源の
うち、ビタミンＫの産生の観点から、大豆由来のポリペ
プトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）及び大豆粉末が好
ましく使用される。これらの窒素源も、単独あるいは２
種以上の混合物の形態で使用できる。
きる窒素源もまた、使用する種によって異なり、使用す
る菌株が良好に生育し、ビタミンＫを効率よく産生でき
るものであれば特に制限されない。具体的には、肉エキ
ス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン
（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大
豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイ
ン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコーンスティープリ
カー等の有機窒素化合物、およびアンモニア、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムなど
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素
等の無機窒素化合物等が挙げられる。これらの窒素源の
うち、ビタミンＫの産生の観点から、大豆由来のポリペ
プトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）及び大豆粉末が好
ましく使用される。これらの窒素源も、単独あるいは２
種以上の混合物の形態で使用できる。
【００５６】本発明による培養に使用できる無機塩もま
た、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に
生育し、ビタミンＫを良好に産生できうるものであれば
特に制限されないが、具体的には、マグネシウム、マン
ガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び
亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から
選ばれた１種または２種以上を使用することができる。
た、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に
生育し、ビタミンＫを良好に産生できうるものであれば
特に制限されないが、具体的には、マグネシウム、マン
ガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び
亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から
選ばれた１種または２種以上を使用することができる。
【００５７】また、本発明による培養に市販の培地を使
用する場合の市販の培地としては、例えば、栄養ブイヨ
ン（nutrient broth）（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式
会社または日本製薬株式会社製）、ポリペプトン−Ｓ
（和光純薬製）などが挙げられる。
用する場合の市販の培地としては、例えば、栄養ブイヨ
ン（nutrient broth）（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式
会社または日本製薬株式会社製）、ポリペプトン−Ｓ
（和光純薬製）などが挙げられる。
【００５８】または、本発明において、枯草菌の培養に
使用する培地として、オカラ、大豆、味噌や納豆製造時
に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆
腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕、味噌
製造時の副産物である大豆の種皮など、納豆菌によって
発酵できる材料を使用してもよい。この際、必要であれ
ば、この材料に上記したような炭素源、窒素源及び無機
塩を適宜添加してもよい。
使用する培地として、オカラ、大豆、味噌や納豆製造時
に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆
腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕、味噌
製造時の副産物である大豆の種皮など、納豆菌によって
発酵できる材料を使用してもよい。この際、必要であれ
ば、この材料に上記したような炭素源、窒素源及び無機
塩を適宜添加してもよい。
【００５９】本発明において、枯草菌の培養は、従来公
知の方法と同様にして行われ、その際の培養条件は、使
用する菌株、培地の組成及び培養法によって適宜選択さ
れ、使用する菌株が増殖しビタミンＫを効率よく産生で
きる条件であれば特に制限されない。培養温度は、通
常、２０〜４５℃、好ましくは３７〜４２℃であり、ま
た、培養に適当な培地のｐＨは、通常、６．０〜９．
５、好ましくは７．０〜８．５である。
知の方法と同様にして行われ、その際の培養条件は、使
用する菌株、培地の組成及び培養法によって適宜選択さ
れ、使用する菌株が増殖しビタミンＫを効率よく産生で
きる条件であれば特に制限されない。培養温度は、通
常、２０〜４５℃、好ましくは３７〜４２℃であり、ま
た、培養に適当な培地のｐＨは、通常、６．０〜９．
５、好ましくは７．０〜８．５である。
【００６０】本発明の第二の概念によると、上記方法に
よって培養された枯草菌の菌体および／またはその産生
物を含む培養物が提供される。
よって培養された枯草菌の菌体および／またはその産生
物を含む培養物が提供される。
【００６１】本発明において、「枯草菌の培養物」とい
うことばは、上記方法によって培養された枯草菌菌体お
よび枯草菌菌体外に産生された産物の双方を含む。後者
の場合では、雲南SL-001菌が、より高い菌体外での収率
を示すため、好ましい。
うことばは、上記方法によって培養された枯草菌菌体お
よび枯草菌菌体外に産生された産物の双方を含む。後者
の場合では、雲南SL-001菌が、より高い菌体外での収率
を示すため、好ましい。
【００６２】また、本発明の第三の概念によると、本発
明の第二の概念の培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体
が提供される。
明の第二の概念の培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体
が提供される。
【００６３】上述したように、本発明の方法によって培
養された枯草菌の培養物は、多量のビタミンＫ、特にビ
タミンＫ2 、さらに特にメナキノン−７（ＭＫ−７）を
その菌体内に蓄積している。具体的には、本発明の方法
によって培養された枯草菌の培養物中に蓄積されるビタ
ミンＫ、ビタミンＫ2 およびＭＫ−７の量は、使用する
菌体や培地の種類や培養条件などによって変化するが、
それぞれ、通常、１０〜２００ｍｇ／１００ｇ真空熱乾
燥菌体である。より具体的には、目黒菌を３％大豆ペプ
トン培地中で３７℃で２日間振盪培養（１００ｒｐｍ）
した場合、菌体中のＭＫ−７量は最大約７０ｍｇ／１０
０ｇ乾燥菌体であり、これは科学技術庁の食品分析表に
よる納豆における量（８７０μｇ／１００ｇ）の約８０
倍量に相当する。なお、本明細書において、菌体内に蓄
積されるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量は、
下記実施例の項で記載される方法によって測定された値
である。
養された枯草菌の培養物は、多量のビタミンＫ、特にビ
タミンＫ2 、さらに特にメナキノン−７（ＭＫ−７）を
その菌体内に蓄積している。具体的には、本発明の方法
によって培養された枯草菌の培養物中に蓄積されるビタ
ミンＫ、ビタミンＫ2 およびＭＫ−７の量は、使用する
菌体や培地の種類や培養条件などによって変化するが、
それぞれ、通常、１０〜２００ｍｇ／１００ｇ真空熱乾
燥菌体である。より具体的には、目黒菌を３％大豆ペプ
トン培地中で３７℃で２日間振盪培養（１００ｒｐｍ）
した場合、菌体中のＭＫ−７量は最大約７０ｍｇ／１０
０ｇ乾燥菌体であり、これは科学技術庁の食品分析表に
よる納豆における量（８７０μｇ／１００ｇ）の約８０
倍量に相当する。なお、本明細書において、菌体内に蓄
積されるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量は、
下記実施例の項で記載される方法によって測定された値
である。
【００６４】本発明の方法によって培養された枯草菌の
培養物を濾過や遠心分離等の既知の方法により集菌した
後、これを凍結乾燥、風乾、真空熱乾燥等の公知の方法
により乾燥し、この乾燥菌体を水に溶解したところ、ビ
タミンＫが水に溶け出してくる。即ち、この菌体中には
多量のビタミンＫ（特にＭＫ−７）が含まれる点を合わ
せて考慮すると、菌体内に蓄積されたビタミンＫ（特に
ＭＫ−７）は菌体内では何らかの変化を受けて水溶性と
なっていると考えられ、このような水溶性が付与された
形態のビタミンＫ、ビタミンＫ2 及びメナキノン−７
（ＭＫ−７）を、本願明細書において、それぞれ、「水
溶性ビタミンＫ誘導体」（または、単に「ビタミンＫ誘
導体」と称する）、「水溶性ビタミンＫ2 誘導体」（ま
たは、単に「ビタミンＫ2 誘導体」と称する）及び「水
溶性メナキノン−７誘導体（水溶性ＭＫ−７誘導体）」
と称する。この際、水溶性メナキノン−７誘導体は、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される際に約
１０万の分子量の単一のバンドを示す点、ゲル瀘過で測
定される際には１０万以上の分子量を示す点、およびメ
ナキノン−７の分子量が約６４９である点を考慮するこ
とにより、ＭＫ−７に何らかの物質（例えば、糖タンパ
ク質）が結合して安定化されて水に可溶性のビタミンＫ
誘導体（ビタミンＫ2 誘導体及びメナキノン−７誘導体
を含む；以下、省略）が菌体内で形成されるのではない
かと推定される。しかしながら、上記仮説によって本発
明の概念が限定されるものではないことはいうまでもな
い。
培養物を濾過や遠心分離等の既知の方法により集菌した
後、これを凍結乾燥、風乾、真空熱乾燥等の公知の方法
により乾燥し、この乾燥菌体を水に溶解したところ、ビ
タミンＫが水に溶け出してくる。即ち、この菌体中には
多量のビタミンＫ（特にＭＫ−７）が含まれる点を合わ
せて考慮すると、菌体内に蓄積されたビタミンＫ（特に
ＭＫ−７）は菌体内では何らかの変化を受けて水溶性と
なっていると考えられ、このような水溶性が付与された
形態のビタミンＫ、ビタミンＫ2 及びメナキノン−７
（ＭＫ−７）を、本願明細書において、それぞれ、「水
溶性ビタミンＫ誘導体」（または、単に「ビタミンＫ誘
導体」と称する）、「水溶性ビタミンＫ2 誘導体」（ま
たは、単に「ビタミンＫ2 誘導体」と称する）及び「水
溶性メナキノン−７誘導体（水溶性ＭＫ−７誘導体）」
と称する。この際、水溶性メナキノン−７誘導体は、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される際に約
１０万の分子量の単一のバンドを示す点、ゲル瀘過で測
定される際には１０万以上の分子量を示す点、およびメ
ナキノン−７の分子量が約６４９である点を考慮するこ
とにより、ＭＫ−７に何らかの物質（例えば、糖タンパ
ク質）が結合して安定化されて水に可溶性のビタミンＫ
誘導体（ビタミンＫ2 誘導体及びメナキノン−７誘導体
を含む；以下、省略）が菌体内で形成されるのではない
かと推定される。しかしながら、上記仮説によって本発
明の概念が限定されるものではないことはいうまでもな
い。
【００６５】本発明において、水に対するビタミンＫ誘
導体、ビタミンＫ2 誘導体及びメナキノン−７誘導体の
溶解度は、使用する菌体や培地の種類、培養条件及び培
養物の処理（抽出）方法などによって変化する。例え
ば、ビタミンＫ誘導体の溶解度は、培養菌体の水抽出操
作による場合、約１０５μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）
であり、液体培養上清の場合、約３００μｇ／１００ｍ
ｌ水（２０℃）であり、さらに、納豆の水抽出操作によ
る場合、約１，５００μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）で
ある。
導体、ビタミンＫ2 誘導体及びメナキノン−７誘導体の
溶解度は、使用する菌体や培地の種類、培養条件及び培
養物の処理（抽出）方法などによって変化する。例え
ば、ビタミンＫ誘導体の溶解度は、培養菌体の水抽出操
作による場合、約１０５μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）
であり、液体培養上清の場合、約３００μｇ／１００ｍ
ｌ水（２０℃）であり、さらに、納豆の水抽出操作によ
る場合、約１，５００μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）で
ある。
【００６６】本発明の第四の概念によると、上記第二の
概念による培養物または上記第三の概念による水溶性ビ
タミンＫ誘導体を含む医薬、該培養物または水溶性ビタ
ミンＫ誘導体の医薬としての使用、および該培養物また
は水溶性ビタミンＫ誘導体の有効量を患者に投与するこ
とからなるヒトの疾病の予防および／または治療方法が
提供される。
概念による培養物または上記第三の概念による水溶性ビ
タミンＫ誘導体を含む医薬、該培養物または水溶性ビタ
ミンＫ誘導体の医薬としての使用、および該培養物また
は水溶性ビタミンＫ誘導体の有効量を患者に投与するこ
とからなるヒトの疾病の予防および／または治療方法が
提供される。
【００６７】本発明の薬剤は、特に骨粗鬆症予防および
治療剤として利用した場合、極めて有効である。
治療剤として利用した場合、極めて有効である。
【００６８】本発明の薬剤は、前記培養物または水溶性
ビタミンＫ誘導体を単体で、または錠剤、丸剤、散剤、
粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプ
セル剤等として患者に経口投与できる。また、注射剤と
して静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、脊
髄腔内等に投与できる。さらに、座薬として直腸内に投
与しても良いし、ペレットによる埋め込みも可能であ
る。点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、吸入剤等として直接患部
およびその周辺部位に局所的に投与することもできる
し、軟膏、クリーム、粉状もしくは液状塗布剤、貼付剤
等の外用剤として経皮的に投与しても良い。上述したう
ち、好ましい製剤形態や投与形態等は、患者の年齢、性
別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適
宜選択される。本剤を骨粗鬆症予防および治療剤として
投与する場合、経口的にまたは注射剤として非経口的に
投与するのが好ましい。
ビタミンＫ誘導体を単体で、または錠剤、丸剤、散剤、
粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプ
セル剤等として患者に経口投与できる。また、注射剤と
して静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、脊
髄腔内等に投与できる。さらに、座薬として直腸内に投
与しても良いし、ペレットによる埋め込みも可能であ
る。点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、吸入剤等として直接患部
およびその周辺部位に局所的に投与することもできる
し、軟膏、クリーム、粉状もしくは液状塗布剤、貼付剤
等の外用剤として経皮的に投与しても良い。上述したう
ち、好ましい製剤形態や投与形態等は、患者の年齢、性
別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適
宜選択される。本剤を骨粗鬆症予防および治療剤として
投与する場合、経口的にまたは注射剤として非経口的に
投与するのが好ましい。
【００６９】本剤を錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤等
の固形製剤とする場合には、前記培養物または水溶性ビ
タミンＫ誘導体を、常法に従って適当な添加剤、例え
ば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプ
ン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形
剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラ
チン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメ
チルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルー
ロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギ
ン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カ
ルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸
ナトリウム等の充填剤または希釈剤等と適宜混合して製
造することができる。錠剤等は、必要に応じて適当な被
覆用基剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フイル
ムコーティング等を施しても良い。
の固形製剤とする場合には、前記培養物または水溶性ビ
タミンＫ誘導体を、常法に従って適当な添加剤、例え
ば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプ
ン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形
剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラ
チン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメ
チルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルー
ロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギ
ン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カ
ルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸
ナトリウム等の充填剤または希釈剤等と適宜混合して製
造することができる。錠剤等は、必要に応じて適当な被
覆用基剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フイル
ムコーティング等を施しても良い。
【００７０】本剤を注射剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、
噴霧剤、ローション剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳
剤等の液状製剤とする場合には、前記培養物または水溶
性ビタミンＫ誘導体を、精製水、リン酸緩衝液等の適当
な緩衝液、生理的食塩水、リンゲル溶液、ロック溶液等
の生理的塩類溶液、カカオバター、ゴマ油、オリーブ油
等の植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸、エタ
ノール等の有機溶媒等に溶解して、必要に応じてコレス
テロール等の乳化剤、アラビアゴム等の懸濁剤、分散助
剤、浸潤剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系、ポリ
エチレングリコール系等の界面活性剤、リン酸ナトリウ
ム等の溶解補助剤、糖、糖アルコール、アルブミン等の
安定化剤、パラベン等の保存剤、塩化ナトリウム、ブド
ウ糖、グリセリン等の等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸
着防止剤、保湿剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料、フレ
ーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、滅菌さ
れた水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマ
ルジョン等として調整できる。この際、注射剤は、生理
学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨを有する
ことが好ましい。
噴霧剤、ローション剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳
剤等の液状製剤とする場合には、前記培養物または水溶
性ビタミンＫ誘導体を、精製水、リン酸緩衝液等の適当
な緩衝液、生理的食塩水、リンゲル溶液、ロック溶液等
の生理的塩類溶液、カカオバター、ゴマ油、オリーブ油
等の植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸、エタ
ノール等の有機溶媒等に溶解して、必要に応じてコレス
テロール等の乳化剤、アラビアゴム等の懸濁剤、分散助
剤、浸潤剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系、ポリ
エチレングリコール系等の界面活性剤、リン酸ナトリウ
ム等の溶解補助剤、糖、糖アルコール、アルブミン等の
安定化剤、パラベン等の保存剤、塩化ナトリウム、ブド
ウ糖、グリセリン等の等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸
着防止剤、保湿剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料、フレ
ーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、滅菌さ
れた水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマ
ルジョン等として調整できる。この際、注射剤は、生理
学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨを有する
ことが好ましい。
【００７１】本剤を、ローション剤、クリーム剤、軟膏
等の半固形製剤とするには、前記培養物または水溶性ビ
タミンＫ誘導体を脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、
パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコ
ール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、縣
濁化剤等と適宜混和することにより製造することができ
る。
等の半固形製剤とするには、前記培養物または水溶性ビ
タミンＫ誘導体を脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、
パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコ
ール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、縣
濁化剤等と適宜混和することにより製造することができ
る。
【００７２】本発明の薬剤に含まれる前記培養物または
水溶性ビタミンＫ誘導体の含有量は、投与形態、重篤度
や目的とする投与量などによって様々であるが、本剤を
骨粗鬆症予防および治療剤として投与する場合、一般的
には、製剤の全重量に対して０．０１〜５０重量％、好
ましくは０．０２〜１０重量％である。
水溶性ビタミンＫ誘導体の含有量は、投与形態、重篤度
や目的とする投与量などによって様々であるが、本剤を
骨粗鬆症予防および治療剤として投与する場合、一般的
には、製剤の全重量に対して０．０１〜５０重量％、好
ましくは０．０２〜１０重量％である。
【００７３】また、本発明の薬剤の投与量は、対象疾
患、対象部位、患者の年齢、体重及び症状、目的とする
投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって
異なり、正確な量は医師により決定されるものである
が、本剤を骨粗鬆症予防および治療剤として投与する場
合、通常、本剤が経口投与される場合には、前記培養物
または水溶性ビタミンＫ誘導体の投与量換算で、成人に
対し１日当り１〜５０ｍｇを１回または数回に分けて投
与する。また、本剤を静脈内投与する場合には、前記培
養物または水溶性ビタミンＫ誘導体の投与量換算で、成
人に対し１日当り０．０１〜１０ｍｇを１回または数回
に分けて投与する。
患、対象部位、患者の年齢、体重及び症状、目的とする
投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって
異なり、正確な量は医師により決定されるものである
が、本剤を骨粗鬆症予防および治療剤として投与する場
合、通常、本剤が経口投与される場合には、前記培養物
または水溶性ビタミンＫ誘導体の投与量換算で、成人に
対し１日当り１〜５０ｍｇを１回または数回に分けて投
与する。また、本剤を静脈内投与する場合には、前記培
養物または水溶性ビタミンＫ誘導体の投与量換算で、成
人に対し１日当り０．０１〜１０ｍｇを１回または数回
に分けて投与する。
【００７４】本発明の第五の概念によると、上記第二の
概念による培養物および／または上記第三の概念による
水溶性ビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料が
提供される。
概念による培養物および／または上記第三の概念による
水溶性ビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料が
提供される。
【００７５】本発明に係る食品、飲料または飼料は、特
に納豆菌などの安全性が確認されている菌を使用する場
合には、上記第二の概念による培養物および／または上
記第三の概念による水溶性ビタミンＫ誘導体のみから構
成されてもよい。
に納豆菌などの安全性が確認されている菌を使用する場
合には、上記第二の概念による培養物および／または上
記第三の概念による水溶性ビタミンＫ誘導体のみから構
成されてもよい。
【００７６】あるいは、本発明に係る食品、飲料または
飼料は、上記第二の概念による培養物および／または上
記第三の概念による水溶性ビタミンＫ誘導体を通常食す
ることのできる食品、飲料または飼料に含ませたもので
あってもよい。この際、通常食することのできる食品、
飲料または飼料としては、例えば、オカラ、オカラ納
豆、納豆、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮
汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料
とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物で
ある大豆の種皮、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、かま
ぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、なると、つみれ
等の水産練り製品、でんぶ等の魚介類加工品、ソーセー
ジ、フランクフルト、レバーペースト等の食肉加工品、
豆腐、焼き豆腐、生揚げ、油揚げ、がんもどき、おか
ら、凍り豆腐、湯葉等の豆製品、ピューレ等の野菜加工
品、マッシュポテト、くず、はるさめ、こんにゃく、し
らたき等の芋加工品、もち、白玉、白飯、麩、ビーフ
ン、マカロニ、スパゲッティ、そうめん、そば、うど
ん、中華めん、即席麺、食パン、乾パン、アンパン等の
穀物の加工品、冷凍食品、栄養補助食品、ジャム等の甘
味類、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング
等の油脂類、あめ、らくがん、せんべい、あられ、カス
テラ、ようかん、もなか、まんじゅう、大福もち、だん
ご、ういろう、チョコレート、ビスケット、クッキー、
ドーナツ、ケーキ、パイ、アイスクリーム、プリン、バ
バロア、ガム等の菓子類、豆腐、ゼリー、コンニャク、
寒天またはトコロテン等のゲル状食品、コンブ、ワカ
メ、ノリ、テングサ等の海草類など、すべての食品；各
種果汁ジュース（オレンジ、パイナップル、リンゴ、ブ
ドウ、メロン及びイチゴジュース等を含む）、各種炭酸
飲料、お茶（煎茶、ウーロン茶等を含む）、飲むヨーグ
ルト、牛乳、豆乳、調製乳、ミネラルウォーター、清涼
飲料、コーヒー、紅茶、ココアなど、すべての飲料；な
らびにブタ、ウシ、ウマ、ヒツジやヤギ等の家畜、イ
ヌ、ネコ、ウサギやハムスター等のペット、家禽及び魚
など、通常、飼育される動物用のエサ（飼料）が挙げら
れる。
飼料は、上記第二の概念による培養物および／または上
記第三の概念による水溶性ビタミンＫ誘導体を通常食す
ることのできる食品、飲料または飼料に含ませたもので
あってもよい。この際、通常食することのできる食品、
飲料または飼料としては、例えば、オカラ、オカラ納
豆、納豆、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮
汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料
とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物で
ある大豆の種皮、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、かま
ぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、なると、つみれ
等の水産練り製品、でんぶ等の魚介類加工品、ソーセー
ジ、フランクフルト、レバーペースト等の食肉加工品、
豆腐、焼き豆腐、生揚げ、油揚げ、がんもどき、おか
ら、凍り豆腐、湯葉等の豆製品、ピューレ等の野菜加工
品、マッシュポテト、くず、はるさめ、こんにゃく、し
らたき等の芋加工品、もち、白玉、白飯、麩、ビーフ
ン、マカロニ、スパゲッティ、そうめん、そば、うど
ん、中華めん、即席麺、食パン、乾パン、アンパン等の
穀物の加工品、冷凍食品、栄養補助食品、ジャム等の甘
味類、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング
等の油脂類、あめ、らくがん、せんべい、あられ、カス
テラ、ようかん、もなか、まんじゅう、大福もち、だん
ご、ういろう、チョコレート、ビスケット、クッキー、
ドーナツ、ケーキ、パイ、アイスクリーム、プリン、バ
バロア、ガム等の菓子類、豆腐、ゼリー、コンニャク、
寒天またはトコロテン等のゲル状食品、コンブ、ワカ
メ、ノリ、テングサ等の海草類など、すべての食品；各
種果汁ジュース（オレンジ、パイナップル、リンゴ、ブ
ドウ、メロン及びイチゴジュース等を含む）、各種炭酸
飲料、お茶（煎茶、ウーロン茶等を含む）、飲むヨーグ
ルト、牛乳、豆乳、調製乳、ミネラルウォーター、清涼
飲料、コーヒー、紅茶、ココアなど、すべての飲料；な
らびにブタ、ウシ、ウマ、ヒツジやヤギ等の家畜、イ
ヌ、ネコ、ウサギやハムスター等のペット、家禽及び魚
など、通常、飼育される動物用のエサ（飼料）が挙げら
れる。
【００７７】また、本発明において、食品、飲料または
飼料が本発明による培養物を含む場合の食品における培
養物の添加量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件
さらには水溶性ビタミンＫ誘導体の含量などによって変
化するが、食品では、通常、０．００１〜２０重量％の
菌体乾燥物、好ましくは０．１〜５重量％の菌体乾燥物
を含む量であり、飲料では、通常、０．０００１〜５
（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物、好ましくは０．０１〜５
（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物を含む量であり、さらに、飼
料では、通常、０．０００１〜５重量％の菌体乾燥物、
好ましくは０．００１〜１重量％の菌体乾燥物を含む量
である。また、食品、飲料または飼料が本発明による水
溶性ビタミンＫ誘導体を含む場合の食品における水溶性
ビタミンＫ誘導体の量は、上記と同様使用する菌体や培
地の種類や培養条件などによって変化するが、食品で
は、通常、０．００００１〜１０重量％の水溶性ビタミ
ンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．１重量％の
水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、飲料では、通
常、０．００００１〜０．１（ｗ／ｖ）％の水溶性ビタ
ミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ
／ｖ）％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、さ
らに、飼料では、通常、０．００００１〜１０重量％の
水溶性ビタミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜１
重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量である。
飼料が本発明による培養物を含む場合の食品における培
養物の添加量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件
さらには水溶性ビタミンＫ誘導体の含量などによって変
化するが、食品では、通常、０．００１〜２０重量％の
菌体乾燥物、好ましくは０．１〜５重量％の菌体乾燥物
を含む量であり、飲料では、通常、０．０００１〜５
（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物、好ましくは０．０１〜５
（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物を含む量であり、さらに、飼
料では、通常、０．０００１〜５重量％の菌体乾燥物、
好ましくは０．００１〜１重量％の菌体乾燥物を含む量
である。また、食品、飲料または飼料が本発明による水
溶性ビタミンＫ誘導体を含む場合の食品における水溶性
ビタミンＫ誘導体の量は、上記と同様使用する菌体や培
地の種類や培養条件などによって変化するが、食品で
は、通常、０．００００１〜１０重量％の水溶性ビタミ
ンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．１重量％の
水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、飲料では、通
常、０．００００１〜０．１（ｗ／ｖ）％の水溶性ビタ
ミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ
／ｖ）％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、さ
らに、飼料では、通常、０．００００１〜１０重量％の
水溶性ビタミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜１
重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量である。
【００７８】したがって、本発明の水溶性ビタミンＫ
（特にＭＫ−７）誘導体を多量に含む菌体培養物および
／またはこのような培養物由来の水溶性ビタミンＫ（特
にＭＫ−７）誘導体を含む食品を摂取することにより、
従来に比べてビタミンＫ、特にＭＫ−７を無理なく（不
快感を過度に伴うことなく）、効率よくかつ一回に多量
に摂取することができ、また、特に納豆菌の場合には、
安全性も確保でき好ましい。
（特にＭＫ−７）誘導体を多量に含む菌体培養物および
／またはこのような培養物由来の水溶性ビタミンＫ（特
にＭＫ−７）誘導体を含む食品を摂取することにより、
従来に比べてビタミンＫ、特にＭＫ−７を無理なく（不
快感を過度に伴うことなく）、効率よくかつ一回に多量
に摂取することができ、また、特に納豆菌の場合には、
安全性も確保でき好ましい。
【００７９】本発明の第六の概念によると、枯草菌の培
養菌体をソックスレー抽出することからなるビタミンＫ
の抽出方法が提供される。
養菌体をソックスレー抽出することからなるビタミンＫ
の抽出方法が提供される。
【００８０】上記概念の一実施態様を以下に記載する。
まず、培養された微生物菌体をソックスレー抽出器を用
いてヘキサン、ジエチルエーテル、アセトン、エタノー
ル及びイソプロパノール等の有機溶媒で使用する有機溶
媒の沸点でソックスレー抽出し、脂溶性画分を得る。次
に、この画分をヘキサン、ジエチルエーテル、アセト
ン、エタノール及びイソプロパノール等の有機溶媒で３
０〜１００℃で０．１〜２０時間、抽出する。得られた
抽出物を上記と同様の有機溶媒で所定の総容量にまで希
釈する。希釈された抽出物の一部を水及びイソプロパノ
ールと混和し、さらにタッチミキサーを使用するなどに
より上記と同様の有機溶媒とさらに混和する。得られた
液体混合物を遠心し、上清を乾固した後、残渣をエタノ
ールに溶解することにより、ビタミンＫ2 （ＭＫ−７、
ＭＫ−４）及びビタミンＫ1 等のより純度の高い脂溶性
のビタミンＫが調製される。
まず、培養された微生物菌体をソックスレー抽出器を用
いてヘキサン、ジエチルエーテル、アセトン、エタノー
ル及びイソプロパノール等の有機溶媒で使用する有機溶
媒の沸点でソックスレー抽出し、脂溶性画分を得る。次
に、この画分をヘキサン、ジエチルエーテル、アセト
ン、エタノール及びイソプロパノール等の有機溶媒で３
０〜１００℃で０．１〜２０時間、抽出する。得られた
抽出物を上記と同様の有機溶媒で所定の総容量にまで希
釈する。希釈された抽出物の一部を水及びイソプロパノ
ールと混和し、さらにタッチミキサーを使用するなどに
より上記と同様の有機溶媒とさらに混和する。得られた
液体混合物を遠心し、上清を乾固した後、残渣をエタノ
ールに溶解することにより、ビタミンＫ2 （ＭＫ−７、
ＭＫ−４）及びビタミンＫ1 等のより純度の高い脂溶性
のビタミンＫが調製される。
【００８１】上記方法によって、脂溶性のビタミンＫが
公知の方法に比してより効率的に抽出され、これにより
ビタミンＫ2 （ＭＫ−７、ＭＫ−４）及びビタミンＫ1
等の脂溶性のビタミンＫがより高い収率で培養菌体から
回収できる。
公知の方法に比してより効率的に抽出され、これにより
ビタミンＫ2 （ＭＫ−７、ＭＫ−４）及びビタミンＫ1
等の脂溶性のビタミンＫがより高い収率で培養菌体から
回収できる。
【００８２】本発明の第七の概念によると、枯草菌の培
養液を酸性化し、沈殿物を得ることからなる水溶性ビタ
ミンＫ誘導体の分取方法が提供される。
養液を酸性化し、沈殿物を得ることからなる水溶性ビタ
ミンＫ誘導体の分取方法が提供される。
【００８３】上記概念の一実施態様を以下に記載する。
枯草菌を公知の方法または上記方法によって培養し、培
養液を得る。次に、この培養液のｐＨを下げる、好まし
くはｐＨを１〜３に調整することによって沈殿物が得ら
れ、この沈殿物には菌体内に蓄積された及び菌体外に放
出された水溶性ビタミンＫ誘導体が含まれる。したがっ
て、この沈殿物を遠心分離などによって分離することに
よって、水溶性ビタミンＫ誘導体が分取できる。
枯草菌を公知の方法または上記方法によって培養し、培
養液を得る。次に、この培養液のｐＨを下げる、好まし
くはｐＨを１〜３に調整することによって沈殿物が得ら
れ、この沈殿物には菌体内に蓄積された及び菌体外に放
出された水溶性ビタミンＫ誘導体が含まれる。したがっ
て、この沈殿物を遠心分離などによって分離することに
よって、水溶性ビタミンＫ誘導体が分取できる。
【００８４】または、枯草菌を公知の方法または上記方
法によって培養し、得られた培養液を遠心分離などによ
って、菌体を除去した培養上清を得る。次に、この培養
上清のｐＨを下げる、好ましくはｐＨを１〜３に調整す
ることによって沈殿物が得られ、この沈殿物には菌体外
に放出された水溶性ビタミンＫ誘導体が含まれる。した
がって、この沈殿物を遠心分離などによって分離するこ
とによって、水溶性ビタミンＫ誘導体が分取できる。
法によって培養し、得られた培養液を遠心分離などによ
って、菌体を除去した培養上清を得る。次に、この培養
上清のｐＨを下げる、好ましくはｐＨを１〜３に調整す
ることによって沈殿物が得られ、この沈殿物には菌体外
に放出された水溶性ビタミンＫ誘導体が含まれる。した
がって、この沈殿物を遠心分離などによって分離するこ
とによって、水溶性ビタミンＫ誘導体が分取できる。
【００８５】
【実施例】以下、実施例を参照しながら、本発明をより
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【００８６】なお、下記実施例において、ＭＫ−７、Ｍ
Ｋ−４及びビタミンＫ1の量は、以下の方法に従って測
定した。
Ｋ−４及びビタミンＫ1の量は、以下の方法に従って測
定した。
【００８７】各種ビタミンＫ量の測定方法 まず、脂溶性のＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の
場合の菌体試料の調製方法を以下に説明する：培養され
た微生物菌体１ｇ（乾燥重量）を試料として、ソックス
レー抽出器（SIBATA SPC 34, WATER BATH SIBATA WB-6
C, 濾紙：ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶性画分を抽出
する。これを１００ｍｌヘキサンで８０℃で６時間抽出
した後、全液量をヘキサンにより１００ｍｌに調節す
る。この抽出物１００μｌを１．０ｍｌの蒸留水及び
１．５ｍｌのイソプロパノールと混和し、さらに４．９
ｍｌのヘキサンをタッチミキサーで約１０秒間混和す
る。この混合液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０
分、２０℃）する。得られた上清部分（有機層：水層＝
５．８：１．７）４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・
乾固した後、これを１００μｌのエタノールに溶解す
る。このようにして、菌体内に蓄積された脂溶性のＭＫ
−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量を測定するための
ＨＰＬＣ試料（以下、「ソックスレー−ＨＰＬＣ試料」
と称する）が調製される。なお、このソックスレー−Ｈ
ＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによってＭＫ−７量を
測定する方法を「ソックスレー−ＨＰＬＣ法」と称す
る。
場合の菌体試料の調製方法を以下に説明する：培養され
た微生物菌体１ｇ（乾燥重量）を試料として、ソックス
レー抽出器（SIBATA SPC 34, WATER BATH SIBATA WB-6
C, 濾紙：ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶性画分を抽出
する。これを１００ｍｌヘキサンで８０℃で６時間抽出
した後、全液量をヘキサンにより１００ｍｌに調節す
る。この抽出物１００μｌを１．０ｍｌの蒸留水及び
１．５ｍｌのイソプロパノールと混和し、さらに４．９
ｍｌのヘキサンをタッチミキサーで約１０秒間混和す
る。この混合液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０
分、２０℃）する。得られた上清部分（有機層：水層＝
５．８：１．７）４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・
乾固した後、これを１００μｌのエタノールに溶解す
る。このようにして、菌体内に蓄積された脂溶性のＭＫ
−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量を測定するための
ＨＰＬＣ試料（以下、「ソックスレー−ＨＰＬＣ試料」
と称する）が調製される。なお、このソックスレー−Ｈ
ＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによってＭＫ−７量を
測定する方法を「ソックスレー−ＨＰＬＣ法」と称す
る。
【００８８】次に、水溶性ビタミンＫ誘導体（ＭＫ−７
を含む）の場合の試料の調製方法を以下に説明する：培
養物をスパーテルでよく練った後に得られた５ｇ量に対
して、蒸留水４５ｍｌを加える。この混合液を、２０℃
で、３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、得られ
た上清０．５ｍｌを抽出試料とする。この抽出試料に、
蒸留水０．５ｍｌ、イソプロパノール１．５ｍｌを混和
し、さらにヘキサン５．０ｍｌを加え撹拌した後、２０
℃で３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。得ら
れた上清４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・乾固し、
１００μｌのエタノールで溶解する。このようにして、
水溶性ＭＫ−７誘導体の量を測定するためのＨＰＬＣ試
料（以下、「ＨＰＬＣ試料」と称する）が調製される。
なお、このＨＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによって
ＭＫ−７量を測定する方法を「ＨＰＬＣ法」と称する。
を含む）の場合の試料の調製方法を以下に説明する：培
養物をスパーテルでよく練った後に得られた５ｇ量に対
して、蒸留水４５ｍｌを加える。この混合液を、２０℃
で、３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、得られ
た上清０．５ｍｌを抽出試料とする。この抽出試料に、
蒸留水０．５ｍｌ、イソプロパノール１．５ｍｌを混和
し、さらにヘキサン５．０ｍｌを加え撹拌した後、２０
℃で３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。得ら
れた上清４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・乾固し、
１００μｌのエタノールで溶解する。このようにして、
水溶性ＭＫ−７誘導体の量を測定するためのＨＰＬＣ試
料（以下、「ＨＰＬＣ試料」と称する）が調製される。
なお、このＨＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによって
ＭＫ−７量を測定する方法を「ＨＰＬＣ法」と称する。
【００８９】また、培養液中のＭＫ−７、ＭＫ−４及び
ビタミンＫ1の量を測定するためのＨＰＬＣ試料として
は、培養液がそのまま使用される。
ビタミンＫ1の量を測定するためのＨＰＬＣ試料として
は、培養液がそのまま使用される。
【００９０】さらに、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）によるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1量
の測定は、ビタミンＫが白金−アルミナ触媒でハイドロ
キノン体に還元され、蛍光物質になることを利用するも
のである。具体的には、以下の条件で測定する。
ＰＬＣ）によるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1量
の測定は、ビタミンＫが白金−アルミナ触媒でハイドロ
キノン体に還元され、蛍光物質になることを利用するも
のである。具体的には、以下の条件で測定する。
【００９１】 装置 ポンプ ：ＰＵ−９８０（日本分光製） インジェクタ ：７１２５（日本分光製） カラムオーブン：ＣＯ−９６５（日本分光製） 検出器 ：蛍光検出器 ８２１−ＦＰ（日本分光製） データ処理装置：Ｃ−Ｒ５Ａ（島津製作所製） 条件 カラム ：ＯＤＳ−ＩＩカラム（４．６×２５０ｍｍ） （島津製作所製） 還元カラム ：白金−アルミナ触媒カラム（和光純薬製、一級白金 −アルミナ、Ｐｔ＝５％を約０．２ｇ充填する； ４．０φ×１０ｍｍ） 移動相 ：９７％エタノール（流速；０．７ｍｌ／分） 分離・還元温度：４０℃ 測定波長 ：励起 ３２０ｎｍ 蛍光 ４３０ｎｍ 注入量 ：１０μｌ このような測定方法によって、ＭＫ−７、メナキノン−
４及びビタミンＫ1について検量線を作成したところ、
ＭＫ−７の量は、０．０５〜５０ｎｇの範囲で式［−
０．８９６６１＋１．６９９３×１０-6×（ビタミンＫ
に相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によっ
て、ならびにメナキノン−４及びビタミンＫ1の量は、
０．０１〜１０ｎｇの範囲で、それぞれ、式［−０．５
８６５７＋４．８０３０×１０-9×（ビタミンＫに相当
するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］及び式［−
０．４４３８１＋４．０６２６×１０-7×（ビタミンＫ
に相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によっ
て、測定が可能であった。
４及びビタミンＫ1について検量線を作成したところ、
ＭＫ−７の量は、０．０５〜５０ｎｇの範囲で式［−
０．８９６６１＋１．６９９３×１０-6×（ビタミンＫ
に相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によっ
て、ならびにメナキノン−４及びビタミンＫ1の量は、
０．０１〜１０ｎｇの範囲で、それぞれ、式［−０．５
８６５７＋４．８０３０×１０-9×（ビタミンＫに相当
するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］及び式［−
０．４４３８１＋４．０６２６×１０-7×（ビタミンＫ
に相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によっ
て、測定が可能であった。
【００９２】また、検量線を作成する際のＭＫ−７の標
準品は、以下によって調製した。すなわち、６００ｇの
納豆に、７５％イソプロパノール１リットル及びｎ−ヘ
キサン１リットルを加え、１時間、ゆっくりと撹拌、静
置した。分離した２層のうち上層を取り、無水硫酸ナト
リウムで乾燥、蒸発乾固することにより、抽出物約２０
ｇを得た。これを１０ｍｌのｎ−ヘキサンと混合し、４
００ｍｌのクロマトグラフィー用シリカゲルに通して吸
着させ、２リットルのｎ−ヘキサン／トルエン（１：
１）で溶出・分画した。ＭＫ−７を含む画分を減圧下で
蒸発乾固し、得られたシリカゲル濃縮物を５ｍｌのｎ−
ヘキサンで溶解し、上記と同様にして、再度シリカゲル
カラムで分画し、減圧下で蒸発乾固して約３５０ｍｇを
得た。このうち５０ｍｇを少量のアセトンに溶解し、ア
セトニトリル／メタノール（１：１）で充填した６０ｍ
ｌのクロマトグラフィー用ＯＤＳ−シリカゲルに通液
し、アセトニトリル／メタノール（１：１）で展開し
た。溶出液をＨＰＬＣでモニタリングしながら、ＭＫ−
７と考えられる物質が単独で溶出している画分を分取
し、減圧乾固した。得られた物質について、赤外吸収ス
ペクトラム及びマススペクトラムを得て、ＭＫ−７であ
ることを確認した。なお、この物質の純度を検定したと
ころ、９９．８％であった。また、フィロキノン（ビタ
ミンＫ1）及びメナキノン−４（ＭＫ−４）の標準品と
しては、それぞれ、シグマ社（Sigma）製の特級品を用
いた。測定は、３回抽出して分析した平均値により求め
た。
準品は、以下によって調製した。すなわち、６００ｇの
納豆に、７５％イソプロパノール１リットル及びｎ−ヘ
キサン１リットルを加え、１時間、ゆっくりと撹拌、静
置した。分離した２層のうち上層を取り、無水硫酸ナト
リウムで乾燥、蒸発乾固することにより、抽出物約２０
ｇを得た。これを１０ｍｌのｎ−ヘキサンと混合し、４
００ｍｌのクロマトグラフィー用シリカゲルに通して吸
着させ、２リットルのｎ−ヘキサン／トルエン（１：
１）で溶出・分画した。ＭＫ−７を含む画分を減圧下で
蒸発乾固し、得られたシリカゲル濃縮物を５ｍｌのｎ−
ヘキサンで溶解し、上記と同様にして、再度シリカゲル
カラムで分画し、減圧下で蒸発乾固して約３５０ｍｇを
得た。このうち５０ｍｇを少量のアセトンに溶解し、ア
セトニトリル／メタノール（１：１）で充填した６０ｍ
ｌのクロマトグラフィー用ＯＤＳ−シリカゲルに通液
し、アセトニトリル／メタノール（１：１）で展開し
た。溶出液をＨＰＬＣでモニタリングしながら、ＭＫ−
７と考えられる物質が単独で溶出している画分を分取
し、減圧乾固した。得られた物質について、赤外吸収ス
ペクトラム及びマススペクトラムを得て、ＭＫ−７であ
ることを確認した。なお、この物質の純度を検定したと
ころ、９９．８％であった。また、フィロキノン（ビタ
ミンＫ1）及びメナキノン−４（ＭＫ−４）の標準品と
しては、それぞれ、シグマ社（Sigma）製の特級品を用
いた。測定は、３回抽出して分析した平均値により求め
た。
【００９３】［実施例１］５００ｍｌ容の三角コルベン
内に入れた乾燥ブイヨン（日水製薬株式会社製）を３％
の濃度で０．３％の麦芽汁に溶かしたもの２００ｍｌを
計１０本（総量：２リットル）を１３０℃で約３０分間
加圧釜で蒸煮（オートクレーブ滅菌）した。冷却後、こ
の培養液に、約５×１０8個の宮城野菌（有限会社宮城
野納豆製造所、仙台）を加え、４０℃で３６時間、振盪
培養（１００ｒｐｍ）した後、集菌、洗浄し、それにほ
ぼ等量のコーンスターチを混ぜて４℃で３日間かけて風
乾した。この乾燥物は、生きた納豆菌（胞子及び栄養細
胞）を大量に含むものであり、これについてメナキノン
−７（ＭＫ−７）蓄積量をＨＰＬＣ法で測定したとこ
ろ、乾燥菌体１ｇ当たり約３１．７μｇであった。
内に入れた乾燥ブイヨン（日水製薬株式会社製）を３％
の濃度で０．３％の麦芽汁に溶かしたもの２００ｍｌを
計１０本（総量：２リットル）を１３０℃で約３０分間
加圧釜で蒸煮（オートクレーブ滅菌）した。冷却後、こ
の培養液に、約５×１０8個の宮城野菌（有限会社宮城
野納豆製造所、仙台）を加え、４０℃で３６時間、振盪
培養（１００ｒｐｍ）した後、集菌、洗浄し、それにほ
ぼ等量のコーンスターチを混ぜて４℃で３日間かけて風
乾した。この乾燥物は、生きた納豆菌（胞子及び栄養細
胞）を大量に含むものであり、これについてメナキノン
−７（ＭＫ−７）蓄積量をＨＰＬＣ法で測定したとこ
ろ、乾燥菌体１ｇ当たり約３１．７μｇであった。
【００９４】次に、この乾燥菌体を５人の健常成人に１
ｇずつ毎朝１０時に経口摂取させ、摂取させてから所定
の時間経過後に健常成人から採血し、血漿中のＭＫ−７
濃度を測定した。血漿中のＭＫ−７濃度の経時変化を調
べた結果を図１に示す。図１に示されるように、明らか
な血漿中濃度の亢進が認められ、かつこの亢進は２４時
間以上持続して起こること（ｐ＜０．０５）が分かっ
た。
ｇずつ毎朝１０時に経口摂取させ、摂取させてから所定
の時間経過後に健常成人から採血し、血漿中のＭＫ−７
濃度を測定した。血漿中のＭＫ−７濃度の経時変化を調
べた結果を図１に示す。図１に示されるように、明らか
な血漿中濃度の亢進が認められ、かつこの亢進は２４時
間以上持続して起こること（ｐ＜０．０５）が分かっ
た。
【００９５】［実施例２］２％ソイペプトン−Ｓを培地
として日東菌（株式会社日東薬品工業、京都）を接種
し、４０℃、２日間培養して得られた菌体の凍結乾燥物
１ｇ（１．８×１０ 10個の生細胞を含む）を５人の健常
成人に毎朝１０時に経口摂取させた後、経時的に採血し
た。採血された血液から血漿を採り、この血漿中のＭＫ
−７濃度を、実施例１と同様にして測定した。結果を表
１及び図２に示す。なお、本実施例で使用した納豆菌の
ＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法で測定したところ、約５１．
０μｇ／ｇ乾燥菌体であった。
として日東菌（株式会社日東薬品工業、京都）を接種
し、４０℃、２日間培養して得られた菌体の凍結乾燥物
１ｇ（１．８×１０ 10個の生細胞を含む）を５人の健常
成人に毎朝１０時に経口摂取させた後、経時的に採血し
た。採血された血液から血漿を採り、この血漿中のＭＫ
−７濃度を、実施例１と同様にして測定した。結果を表
１及び図２に示す。なお、本実施例で使用した納豆菌の
ＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法で測定したところ、約５１．
０μｇ／ｇ乾燥菌体であった。
【００９６】また、対照実験として、上記納豆菌と同量
の純化したＭＫ−７を同様にして５人の健常成人に経口
摂取させ、血漿中のＭＫ−７濃度を測定した結果を下記
表１に示す。
の純化したＭＫ−７を同様にして５人の健常成人に経口
摂取させ、血漿中のＭＫ−７濃度を測定した結果を下記
表１に示す。
【００９７】
【表１】
【００９８】表１及び図２に示されるように、いずれの
群においても摂取してから４時間目をピークに有意な血
中ＭＫ−７濃度の亢進が確認され（ｐ＜０．００５）、
また納豆菌摂取群の血中濃度亢進効果の方がはるかに長
期間持続し、特に３２時間以降の効果は純化したＭＫ−
７摂取群に比べて有意な差（ｐ＜０．００５）のあるこ
とが分かった。
群においても摂取してから４時間目をピークに有意な血
中ＭＫ−７濃度の亢進が確認され（ｐ＜０．００５）、
また納豆菌摂取群の血中濃度亢進効果の方がはるかに長
期間持続し、特に３２時間以降の効果は純化したＭＫ−
７摂取群に比べて有意な差（ｐ＜０．００５）のあるこ
とが分かった。
【００９９】なお、この摂取量ではどの群もトロンボエ
ラストグラフィー、活性部分トロンボプラスチン時間、
あるいは血漿プロトロンビン、プロテインＣ含量などで
調べた血液凝固−線溶系の活性に有意な変化は認められ
なかった。なお、血液のトロンボエラストグラフィー
（ＴＥＧ）パターンは、Hellige社、また、プロトロン
ビン時間（ＰＴ）及び活性化トロンボプラスチン時間
（ＡＰＴＴ）はErma社のClot Digitim TE20装置を用い
て常法通りに行った。
ラストグラフィー、活性部分トロンボプラスチン時間、
あるいは血漿プロトロンビン、プロテインＣ含量などで
調べた血液凝固−線溶系の活性に有意な変化は認められ
なかった。なお、血液のトロンボエラストグラフィー
（ＴＥＧ）パターンは、Hellige社、また、プロトロン
ビン時間（ＰＴ）及び活性化トロンボプラスチン時間
（ＡＰＴＴ）はErma社のClot Digitim TE20装置を用い
て常法通りに行った。
【０１００】［実施例３］下記６種の納豆菌を、それぞ
れ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で３００ｍｌの３％
栄養ブイヨン（nutrient broth）（乾燥ブイヨン）（日
本製薬株式会社製）培地中で３０℃で振盪培養（１００
ｒｐｍ）した。この際の菌の成長を６６０ｎｍでの吸光
度として測定し、また、培養液中及び菌体内のＭＫ−７
量を経時的に測定した。
れ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で３００ｍｌの３％
栄養ブイヨン（nutrient broth）（乾燥ブイヨン）（日
本製薬株式会社製）培地中で３０℃で振盪培養（１００
ｒｐｍ）した。この際の菌の成長を６６０ｎｍでの吸光
度として測定し、また、培養液中及び菌体内のＭＫ−７
量を経時的に測定した。
【０１０１】培養時間に対する、各種納豆菌の成長、培
養液中のＭＫ−７量（μｇ／ｍｌ）および各種納豆菌の
菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量（μｇ／ｇ）を、それぞ
れ、図３、図４及び図５に示す。
養液中のＭＫ−７量（μｇ／ｍｌ）および各種納豆菌の
菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量（μｇ／ｇ）を、それぞ
れ、図３、図４及び図５に示す。
【０１０２】使用した納豆菌 雲南SL-001菌（または、「雲南菌」とも称する） 宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台） 目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪） 日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都） 高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形） 成瀬菌（株式会社成瀬醗酵化学研究所製、東京） 以下、上記納豆菌は菌名のみを記載する。
【０１０３】図３から示されるように、菌の成長は、す
べての納豆菌で類似の挙動を示し、６６０ｎｍでの平均
吸光度（ｎ＝６）として表すと、０．５日目で０．５８
３、１日目で１．０１１、２日目で０．９４８、３日目
で０．８５４、５日目で０．５９２、および７日目で
０．５５２であり、これから菌の成長は培養開始後１〜
２日で定常状態となることが分かった。また、培養液中
に放出されるＭＫ−７量は、図４から示されるように、
やはりすべての納豆菌で類似の挙動を示し、６種の納豆
菌による平均値換算で、０．５日目で０．５６３μｇ／
ｍｌ、１日目で１．５９２μｇ／ｍｌ、３日目で３．８
６７μｇ／ｍｌ、５日目で４．３１７μｇ／ｍｌ、７日
目で４．７８４μｇ／ｍｌであり、これから、培地中に
放出されるＭＫ−７量は、菌の成長が定常状態になる１
〜２日目よりもむしろそれ以降に急激に増加し、特に４
日目以降に多量のＭＫ−７が培地中に放出された。この
結果に比例するように、菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量に
換算した場合のＭＫ−７量（やはりすべての納豆菌で類
似の挙動を示した）は、図５から示されるように、２日
目で最大（平均で約３００μｇ／ｇ乾燥菌）となり、培
地中に多量の放出し始める４日目以降ではむしろ減って
いくことが分かった。
べての納豆菌で類似の挙動を示し、６６０ｎｍでの平均
吸光度（ｎ＝６）として表すと、０．５日目で０．５８
３、１日目で１．０１１、２日目で０．９４８、３日目
で０．８５４、５日目で０．５９２、および７日目で
０．５５２であり、これから菌の成長は培養開始後１〜
２日で定常状態となることが分かった。また、培養液中
に放出されるＭＫ−７量は、図４から示されるように、
やはりすべての納豆菌で類似の挙動を示し、６種の納豆
菌による平均値換算で、０．５日目で０．５６３μｇ／
ｍｌ、１日目で１．５９２μｇ／ｍｌ、３日目で３．８
６７μｇ／ｍｌ、５日目で４．３１７μｇ／ｍｌ、７日
目で４．７８４μｇ／ｍｌであり、これから、培地中に
放出されるＭＫ−７量は、菌の成長が定常状態になる１
〜２日目よりもむしろそれ以降に急激に増加し、特に４
日目以降に多量のＭＫ−７が培地中に放出された。この
結果に比例するように、菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量に
換算した場合のＭＫ−７量（やはりすべての納豆菌で類
似の挙動を示した）は、図５から示されるように、２日
目で最大（平均で約３００μｇ／ｇ乾燥菌）となり、培
地中に多量の放出し始める４日目以降ではむしろ減って
いくことが分かった。
【０１０４】［実施例４］オカラ（旭松食品株式会社、
飯田市）を−２５℃で凍結保存し、必要時に解凍して使
用した。解凍したオカラを、１２０℃で３０分間、オー
トクレーブで滅菌した後、約１２０ｍｌ容のポリスチレ
ンペーパー（ＰＳＰ）容器に入れ、これを納豆菌の培地
とした。
飯田市）を−２５℃で凍結保存し、必要時に解凍して使
用した。解凍したオカラを、１２０℃で３０分間、オー
トクレーブで滅菌した後、約１２０ｍｌ容のポリスチレ
ンペーパー（ＰＳＰ）容器に入れ、これを納豆菌の培地
とした。
【０１０５】別途、市販の納豆に使用されている４種の
納豆菌株（高橋菌、成瀬菌、宮城野菌及び朝日菌）、薬
剤として使用されている２種の納豆菌株（日東菌及び目
黒菌）、ならびに中国雲南の納豆から分離された納豆菌
株（雲南菌 SL-001）の合計７種の納豆菌を、それぞ
れ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で１５０ｍｌの３％
栄養ブイヨン（nutrient broth）（乾燥ブイヨン）（日
水製薬株式会社製）培地中で３７℃で３日間、振盪培養
（１００ｒｐｍ）することによって、上記７種の納豆菌
の前培養液を調製した。
納豆菌株（高橋菌、成瀬菌、宮城野菌及び朝日菌）、薬
剤として使用されている２種の納豆菌株（日東菌及び目
黒菌）、ならびに中国雲南の納豆から分離された納豆菌
株（雲南菌 SL-001）の合計７種の納豆菌を、それぞ
れ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で１５０ｍｌの３％
栄養ブイヨン（nutrient broth）（乾燥ブイヨン）（日
水製薬株式会社製）培地中で３７℃で３日間、振盪培養
（１００ｒｐｍ）することによって、上記７種の納豆菌
の前培養液を調製した。
【０１０６】上記で調製されたオカラ（湿重量５０ｇ）
に、これら計７種の納豆菌の前培養液（生菌数：２×１
０8個／ｍｌ）０．５ｍｌを、それぞれ、添加し、３７
℃で８日間、静置して発酵し続けた。
に、これら計７種の納豆菌の前培養液（生菌数：２×１
０8個／ｍｌ）０．５ｍｌを、それぞれ、添加し、３７
℃で８日間、静置して発酵し続けた。
【０１０７】発酵し始めてから所定の日数（１、２、
４、６、８日目）経過後、納豆菌を水中に懸濁し、これ
を金属製の茶漉しで濾過した後、遠心分離（３，０００
ｒｐｍ×１０分）することによって、各菌体の培養物を
調製し、これをＭＫ−７測定用のソックスレー−ＨＰＬ
Ｃ試料とした。このようにして調製されたソックスレー
−ＨＰＬＣ試料について、ＭＫ−７量及び線溶（血栓溶
解）活性を測定し、その結果を図６に示す。
４、６、８日目）経過後、納豆菌を水中に懸濁し、これ
を金属製の茶漉しで濾過した後、遠心分離（３，０００
ｒｐｍ×１０分）することによって、各菌体の培養物を
調製し、これをＭＫ−７測定用のソックスレー−ＨＰＬ
Ｃ試料とした。このようにして調製されたソックスレー
−ＨＰＬＣ試料について、ＭＫ−７量及び線溶（血栓溶
解）活性を測定し、その結果を図６に示す。
【０１０８】図６から明らかなように、菌体数１０10個
当たりの菌体内のＭＫ−７濃度は１〜２日目で高く、そ
れ以降は減少し、これに比例するようにＭＫ−７が培地
中に放出され、培地中に放出されるＭＫ−７の量は、発
酵後２日をピークとするナットウキナーゼ（ＮＫ）によ
る血栓溶解活性が高まる時点（標準フィブリン平板法で
も、合成基質分解法でも発酵開始後２日以内に最高値に
達する）より遅れた４日目をピークとすることが分かっ
た。
当たりの菌体内のＭＫ−７濃度は１〜２日目で高く、そ
れ以降は減少し、これに比例するようにＭＫ−７が培地
中に放出され、培地中に放出されるＭＫ−７の量は、発
酵後２日をピークとするナットウキナーゼ（ＮＫ）によ
る血栓溶解活性が高まる時点（標準フィブリン平板法で
も、合成基質分解法でも発酵開始後２日以内に最高値に
達する）より遅れた４日目をピークとすることが分かっ
た。
【０１０９】また、いずれの納豆菌についても、オカラ
湿重量１ｇ当たり１．９μｇ以上という高いＭＫ−７生
産性（水に溶け出した量が、平均で、雲南菌 ３６．６
μｇ／ｇオカラ湿重量；宮城野菌 １．９μｇ／ｇオカ
ラ湿重量；成瀬菌 １４．２μｇ／ｇオカラ湿重量；高
橋菌 ６．８μｇ／ｇオカラ湿重量；朝日菌 １１．９
μｇ／ｇオカラ湿重量；目黒菌 １．９μｇ／ｇオカラ
湿重量；および日東菌５．２μｇ／ｇオカラ湿重量）が
確認された。特に、雲南菌（SL-001）は、３６．６μｇ
／ｇオカラ湿重量という高いＭＫ−７生産量を示し、こ
の値は、計算上、他の納豆菌の生産量に比べて２〜２０
倍という高い値であり、また、従来報告（山口迪夫監
修、日本食品成分表、医歯薬出版、東京、１９９７年、
pp.52-53；坂野俊行ら、ビタミン、６２、393-398（198
8）；H. Ikeda and Y. Doi, Eur.J. Biochem., 192, 21
9-223 （1990）；および池田ひろ、家政誌、４３、643-
648（1992））されている納豆の分析値（６．２〜８．
７μｇ／ｇオカラ湿重量）の４倍以上という高いもので
あった。
湿重量１ｇ当たり１．９μｇ以上という高いＭＫ−７生
産性（水に溶け出した量が、平均で、雲南菌 ３６．６
μｇ／ｇオカラ湿重量；宮城野菌 １．９μｇ／ｇオカ
ラ湿重量；成瀬菌 １４．２μｇ／ｇオカラ湿重量；高
橋菌 ６．８μｇ／ｇオカラ湿重量；朝日菌 １１．９
μｇ／ｇオカラ湿重量；目黒菌 １．９μｇ／ｇオカラ
湿重量；および日東菌５．２μｇ／ｇオカラ湿重量）が
確認された。特に、雲南菌（SL-001）は、３６．６μｇ
／ｇオカラ湿重量という高いＭＫ−７生産量を示し、こ
の値は、計算上、他の納豆菌の生産量に比べて２〜２０
倍という高い値であり、また、従来報告（山口迪夫監
修、日本食品成分表、医歯薬出版、東京、１９９７年、
pp.52-53；坂野俊行ら、ビタミン、６２、393-398（198
8）；H. Ikeda and Y. Doi, Eur.J. Biochem., 192, 21
9-223 （1990）；および池田ひろ、家政誌、４３、643-
648（1992））されている納豆の分析値（６．２〜８．
７μｇ／ｇオカラ湿重量）の４倍以上という高いもので
あった。
【０１１０】［実施例５］日東菌を、５００ｍｌ三角フ
ラスコ内で０．５、２及び３％ポリペプトンＳ（和光純
薬製）を含む液体培地３００ｍｌ中に生菌数が２×１０
6個／ｍｌとなるように添加し、これを３７℃で２日
間、振盪培養（１００ｒｐｍ）した。この培養液を遠心
分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）し、上清と菌体に分
けた。菌体はさらに水洗し、凍結乾燥した。
ラスコ内で０．５、２及び３％ポリペプトンＳ（和光純
薬製）を含む液体培地３００ｍｌ中に生菌数が２×１０
6個／ｍｌとなるように添加し、これを３７℃で２日
間、振盪培養（１００ｒｐｍ）した。この培養液を遠心
分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）し、上清と菌体に分
けた。菌体はさらに水洗し、凍結乾燥した。
【０１１１】このように調製された培養上清中のＭＫ−
７量をＨＰＬＣ法を用いて測定し、および菌体内のＭＫ
−７量をソックスレー−ＨＰＬＣ法を用いて測定し、そ
の結果を下記表２に示す。なお、ポリペプトンＳ濃度が
０．５及び３％での菌体の収率は、培地６００ｍｌ（２
本分）当たり、それぞれ、０．２４ｇ（乾燥菌体重量）
及び１．１８ｇ（乾燥菌体重量）であった。
７量をＨＰＬＣ法を用いて測定し、および菌体内のＭＫ
−７量をソックスレー−ＨＰＬＣ法を用いて測定し、そ
の結果を下記表２に示す。なお、ポリペプトンＳ濃度が
０．５及び３％での菌体の収率は、培地６００ｍｌ（２
本分）当たり、それぞれ、０．２４ｇ（乾燥菌体重量）
及び１．１８ｇ（乾燥菌体重量）であった。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】［実施例６］目黒菌を４１℃で２日間、振
盪培養し、この培養液を遠心分離し、上清と菌体に分け
た。
盪培養し、この培養液を遠心分離し、上清と菌体に分け
た。
【０１１４】つぎに、このように調製された菌体１．０
１１ｇ（乾燥重量）（菌数：５×１０11個）を試料とし
て、ソックスレー抽出器（SIBATA SPC 34, WATER BATH
SIBATA WB-6C, 濾紙：ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶
性画分を６時間抽出した。これを１００ｍｌヘキサンで
８０℃で６時間抽出した後、全液量をヘキサンにより１
００ｍｌに調節する。この抽出物１００μｌを１．０ｍ
ｌの蒸留水及び１．５ｍｌのイソプロパノールと混和
し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサーで約
１０秒間混和する。この混合液を遠心分離（３，０００
ｒｐｍ×１０分、２０℃）する。得られた上清（有機
層：水層＝５．８：１．７）１４ｍｌを乾固した後、こ
れを１００μｌのエタノールに溶解する。このようにし
て得られたサンプルについて、ＭＫ−７量をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法を用いて測定したところ、６７２．６μ
ｇ／ｇ乾燥菌体であった。
１１ｇ（乾燥重量）（菌数：５×１０11個）を試料とし
て、ソックスレー抽出器（SIBATA SPC 34, WATER BATH
SIBATA WB-6C, 濾紙：ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶
性画分を６時間抽出した。これを１００ｍｌヘキサンで
８０℃で６時間抽出した後、全液量をヘキサンにより１
００ｍｌに調節する。この抽出物１００μｌを１．０ｍ
ｌの蒸留水及び１．５ｍｌのイソプロパノールと混和
し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサーで約
１０秒間混和する。この混合液を遠心分離（３，０００
ｒｐｍ×１０分、２０℃）する。得られた上清（有機
層：水層＝５．８：１．７）１４ｍｌを乾固した後、こ
れを１００μｌのエタノールに溶解する。このようにし
て得られたサンプルについて、ＭＫ−７量をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法を用いて測定したところ、６７２．６μ
ｇ／ｇ乾燥菌体であった。
【０１１５】［実施例７］目黒菌を、３７℃で、菌体内
に最大量のビタミンＫ誘導体を蓄積する２日間、培養し
た。このようにして得られた培養物を蒸留水で洗浄した
後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物１ｇ（５×１０11細
胞／ｇ乾燥重量）を腸溶カプセルに充填したものを５人
の健常成人（Ａ〜Ｅ）に摂取させた。なお、この凍結乾
燥物中のＭＫ−７含量をソックスレー−ＨＰＬＣ法によ
って測定したところ、凍結乾燥物１ｇ当たり、７０８．
０μｇのＭＫ−７が含まれていた。所定期間経過後、健
常成人から採血し、血漿中のＭＫ−７濃度を、実施例１
と同様にして測定した。結果を表３に示す。
に最大量のビタミンＫ誘導体を蓄積する２日間、培養し
た。このようにして得られた培養物を蒸留水で洗浄した
後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物１ｇ（５×１０11細
胞／ｇ乾燥重量）を腸溶カプセルに充填したものを５人
の健常成人（Ａ〜Ｅ）に摂取させた。なお、この凍結乾
燥物中のＭＫ−７含量をソックスレー−ＨＰＬＣ法によ
って測定したところ、凍結乾燥物１ｇ当たり、７０８．
０μｇのＭＫ−７が含まれていた。所定期間経過後、健
常成人から採血し、血漿中のＭＫ−７濃度を、実施例１
と同様にして測定した。結果を表３に示す。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】表３の結果から、本願発明の菌体培養物を
投与することによって、有意な血漿中のＭＫ−７濃度の
亢進が認められ、かつこの亢進効果は極めて長期間にわ
たり、摂取後少なくとも１週間は血漿中のＭＫ−７濃度
を正常血中濃度範囲（０．８８±０．１９ｎｇ／ｍｌ）
の約２倍に持続できることが分かった。
投与することによって、有意な血漿中のＭＫ−７濃度の
亢進が認められ、かつこの亢進効果は極めて長期間にわ
たり、摂取後少なくとも１週間は血漿中のＭＫ−７濃度
を正常血中濃度範囲（０．８８±０．１９ｎｇ／ｍｌ）
の約２倍に持続できることが分かった。
【０１１８】［実施例８］実施例６と同様にして調製さ
れた目黒菌由来の水溶性ＭＫ−７誘導体を乾燥し、白色
粉末状の水溶性ＭＫ−７誘導体乾燥物を調製した。この
水溶性ＭＫ−７誘導体乾燥物に室温で蛍光灯を５時間照
射した。この際、ＭＫ−７量を実施例６と同様にして経
時的に測定し、この結果を図７（白抜きの丸）に示し
た。図７に示されるように、ＭＫ−７量は、蛍光灯を照
射してもほとんど変化しなかったことから、本発明によ
り得られた水溶性ＭＫ−７誘導体は光に対して非常に高
い安定性を有することが分かる。
れた目黒菌由来の水溶性ＭＫ−７誘導体を乾燥し、白色
粉末状の水溶性ＭＫ−７誘導体乾燥物を調製した。この
水溶性ＭＫ−７誘導体乾燥物に室温で蛍光灯を５時間照
射した。この際、ＭＫ−７量を実施例６と同様にして経
時的に測定し、この結果を図７（白抜きの丸）に示し
た。図７に示されるように、ＭＫ−７量は、蛍光灯を照
射してもほとんど変化しなかったことから、本発明によ
り得られた水溶性ＭＫ−７誘導体は光に対して非常に高
い安定性を有することが分かる。
【０１１９】また、このようにして調製された水溶性Ｍ
Ｋ−７誘導体乾燥物を、同条件で蛍光灯照射下で１週間
保存した後、同様にして、ＭＫ−７量を測定したが、ほ
とんど変化が認められなかった。
Ｋ−７誘導体乾燥物を、同条件で蛍光灯照射下で１週間
保存した後、同様にして、ＭＫ−７量を測定したが、ほ
とんど変化が認められなかった。
【０１２０】［比較例１］菌体を実施例６と同様にして
調製した。この菌体２ｇを乳鉢にとり、海砂３、水３ｍ
ｌを乳鉢に加えた。次に、この乳鉢に、アセトンで磨砕
抽出（２０ｍｌ×４）し、ガラスフィルターで吸引濾過
した。濾液全量を分液ロートに移し、ジエチルエーテル
１００ｍｌ及び水５０ｍｌを添加して抽出して、エーテ
ル層を分離した。水層にさらにジエチルエーテル１００
ｍｌを添加して、エーテル層を分離した。これらのエー
テル層を合わせて、溶媒を留去し、さらにこれをシリカ
ゲルクロマトグラフィー（ヘキサン１０ｍｌ、シリカゲ
ル５ｇ）にかけて、ヘキサン／ジエチルエーテル（８５
／１５（ｖ／ｖ））３０ｍｌで溶出した。さらに、溶出
液から溶媒を留去した後、２−プロパノールに溶解し、
脂溶性ＭＫ−７を調製した。
調製した。この菌体２ｇを乳鉢にとり、海砂３、水３ｍ
ｌを乳鉢に加えた。次に、この乳鉢に、アセトンで磨砕
抽出（２０ｍｌ×４）し、ガラスフィルターで吸引濾過
した。濾液全量を分液ロートに移し、ジエチルエーテル
１００ｍｌ及び水５０ｍｌを添加して抽出して、エーテ
ル層を分離した。水層にさらにジエチルエーテル１００
ｍｌを添加して、エーテル層を分離した。これらのエー
テル層を合わせて、溶媒を留去し、さらにこれをシリカ
ゲルクロマトグラフィー（ヘキサン１０ｍｌ、シリカゲ
ル５ｇ）にかけて、ヘキサン／ジエチルエーテル（８５
／１５（ｖ／ｖ））３０ｍｌで溶出した。さらに、溶出
液から溶媒を留去した後、２−プロパノールに溶解し、
脂溶性ＭＫ−７を調製した。
【０１２１】このようにして調製された脂溶性ＭＫ−７
を乾燥し、脂溶性ＭＫ−７乾燥物を調製した。この脂溶
性ＭＫ−７乾燥物に室温で蛍光灯を５時間照射した後、
実施例６と同様にしてＭＫ−７量を測定し、その結果を
図７（黒塗りの四角）に示した。図７から明らかなよう
に、ＭＫ−７量は、蛍光灯を約３時間照射すると、測定
不可能になることから、このようにして調製された脂溶
性ＭＫ−７は光に対して非常に不安定であることが示さ
れる。
を乾燥し、脂溶性ＭＫ−７乾燥物を調製した。この脂溶
性ＭＫ−７乾燥物に室温で蛍光灯を５時間照射した後、
実施例６と同様にしてＭＫ−７量を測定し、その結果を
図７（黒塗りの四角）に示した。図７から明らかなよう
に、ＭＫ−７量は、蛍光灯を約３時間照射すると、測定
不可能になることから、このようにして調製された脂溶
性ＭＫ−７は光に対して非常に不安定であることが示さ
れる。
【０１２２】［実施例９］日東菌を振盪培養し、この培
養液を遠心分離して、上清と菌体に分けた。このように
して調製された微生物菌体の培養物のＭＫ−７の量をソ
ックスレー−ＨＰＬＣ法によって測定したところ、ＭＫ
−７量換算で、５６４．０μｇ／ｇ乾燥菌体であった。
養液を遠心分離して、上清と菌体に分けた。このように
して調製された微生物菌体の培養物のＭＫ−７の量をソ
ックスレー−ＨＰＬＣ法によって測定したところ、ＭＫ
−７量換算で、５６４．０μｇ／ｇ乾燥菌体であった。
【０１２３】この菌体０．１ｇに蒸留水５ｍｌを加え、
超音波処理を行った。次に、処理液を遠心分離し、この
上清について水溶性ＭＫ−７誘導体量をＨＰＬＣ法によ
って測定したところ、５２．６μｇ／ｇ乾燥菌体であっ
た。
超音波処理を行った。次に、処理液を遠心分離し、この
上清について水溶性ＭＫ−７誘導体量をＨＰＬＣ法によ
って測定したところ、５２．６μｇ／ｇ乾燥菌体であっ
た。
【０１２４】次に、水溶性ＭＫ−７誘導体を水に溶かし
た溶液について、Sephadex G50カラム（予め、０．１５
Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ
７．５で平衡化したもの：２．５×５０ｃｍ）によるゲ
ル濾過を行い、各フラクションについてＭＫ−７含量を
ＨＰＬＣ法によって測定した。この結果を図８に示す。
図８から示されるように、ＭＫ−７を多く含む部分（フ
ラクション番号１７〜２５）は、アミノ酸部分（フラク
ション番号４６〜４９）よりかなり高分子量域に溶出さ
れることが分かる。
た溶液について、Sephadex G50カラム（予め、０．１５
Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ
７．５で平衡化したもの：２．５×５０ｃｍ）によるゲ
ル濾過を行い、各フラクションについてＭＫ−７含量を
ＨＰＬＣ法によって測定した。この結果を図８に示す。
図８から示されるように、ＭＫ−７を多く含む部分（フ
ラクション番号１７〜２５）は、アミノ酸部分（フラク
ション番号４６〜４９）よりかなり高分子量域に溶出さ
れることが分かる。
【０１２５】［実施例１０］オカラは、旭松食品株式会
社（飯田市）より提供されたものを、−２５℃で凍結保
存し、必要時に解凍して使用した。
社（飯田市）より提供されたものを、−２５℃で凍結保
存し、必要時に解凍して使用した。
【０１２６】別途、中国雲南の納豆から分離した納豆菌
株（雲南菌 SL-001）を、５００ｍｌ容の三角フラスコ
内で１５０ｍｌの３％栄養ブイヨン（nutrient broth）
（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で３７
℃で３日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）することによっ
て、納豆菌の前培養液を調製した。
株（雲南菌 SL-001）を、５００ｍｌ容の三角フラスコ
内で１５０ｍｌの３％栄養ブイヨン（nutrient broth）
（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で３７
℃で３日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）することによっ
て、納豆菌の前培養液を調製した。
【０１２７】解凍したオカラ１ｋｇ（湿重量）を、１２
０℃で３０分間、オートクレーブで滅菌した後、約１２
０ｍｌ容量のポリスチレンペーパー（ＰＳＰ）容器に入
れた。この容器に、上記で調製された納豆菌の前培養液
を添加し、３７℃で４日間、発酵させた。このようにし
て発酵させたオカラ納豆１ｋｇ（湿重量）に対して、５
リットルの水を加え、室温で１時間撹拌し、遠心分離
（３，０００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた上清に
対して、６２０ｇのイオン交換樹脂（DEAE-Sepharose C
L-613）を加え、撹拌した後、室温で３０分間、静置し
た。次に、これをガラスカラム（７．５ｃｍφ×１００
ｃｍ）に充填し、蒸留水及び０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜０．８Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でグ
ラジエント溶出した。各画分について、ＨＰＬＣによっ
てビタミンＫ量を測定し、ビタミンＫを含む画分をメン
ブランフィルター（Millipore製、分子量１０，００
０）で濃縮し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥し、薄黄
色粉末として水溶性ビタミンＫ誘導体を得た。
０℃で３０分間、オートクレーブで滅菌した後、約１２
０ｍｌ容量のポリスチレンペーパー（ＰＳＰ）容器に入
れた。この容器に、上記で調製された納豆菌の前培養液
を添加し、３７℃で４日間、発酵させた。このようにし
て発酵させたオカラ納豆１ｋｇ（湿重量）に対して、５
リットルの水を加え、室温で１時間撹拌し、遠心分離
（３，０００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた上清に
対して、６２０ｇのイオン交換樹脂（DEAE-Sepharose C
L-613）を加え、撹拌した後、室温で３０分間、静置し
た。次に、これをガラスカラム（７．５ｃｍφ×１００
ｃｍ）に充填し、蒸留水及び０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜０．８Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でグ
ラジエント溶出した。各画分について、ＨＰＬＣによっ
てビタミンＫ量を測定し、ビタミンＫを含む画分をメン
ブランフィルター（Millipore製、分子量１０，００
０）で濃縮し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥し、薄黄
色粉末として水溶性ビタミンＫ誘導体を得た。
【０１２８】このようにして得られた水溶性ビタミンＫ
誘導体及び上記と同じオカラをイソプロパノールで抽出
したものを、ＨＰＬＣによって分析し、その結果を図９
に示す。なお、図９において、ＭＫ−４、ビタミンＫ1
及びＭＫ−７の保持時間は、それぞれ、約８．２分、約
１１．３分及び約１７．５分であり、矢印はＭＫ−７の
保持時間を示す。図９から、オカラのイソプロパノール
抽出物の６０％以上が水溶性分画に抽出され、また、ビ
タミンＫとしては、ビタミンＫ1、ＭＫ−４の量は少な
く、常に９５％以上がＭＫ−７で占められることが分か
った。
誘導体及び上記と同じオカラをイソプロパノールで抽出
したものを、ＨＰＬＣによって分析し、その結果を図９
に示す。なお、図９において、ＭＫ−４、ビタミンＫ1
及びＭＫ−７の保持時間は、それぞれ、約８．２分、約
１１．３分及び約１７．５分であり、矢印はＭＫ−７の
保持時間を示す。図９から、オカラのイソプロパノール
抽出物の６０％以上が水溶性分画に抽出され、また、ビ
タミンＫとしては、ビタミンＫ1、ＭＫ−４の量は少な
く、常に９５％以上がＭＫ−７で占められることが分か
った。
【０１２９】また、この水溶性ビタミンＫ誘導体につい
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
析を行ったところ、分子量約１０万の位置に幅広いなが
ら単一のバンドを示した。この結果から、水溶性ビタミ
ンＫ誘導体は他の糖タンパク質と分子量約１０万の複合
体を形成しているのではないかと考察される。また、こ
の際の納豆１ｋｇからの水溶性ビタミンＫ誘導体の収率
は、３回の操作による平均で、約５．３ｇ（８３０μｇ
水溶性ＭＫ−７誘導体／ｇを含む）であった。
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
析を行ったところ、分子量約１０万の位置に幅広いなが
ら単一のバンドを示した。この結果から、水溶性ビタミ
ンＫ誘導体は他の糖タンパク質と分子量約１０万の複合
体を形成しているのではないかと考察される。また、こ
の際の納豆１ｋｇからの水溶性ビタミンＫ誘導体の収率
は、３回の操作による平均で、約５．３ｇ（８３０μｇ
水溶性ＭＫ−７誘導体／ｇを含む）であった。
【０１３０】［実施例１１］５００ｍｌ容の三角フラス
コ５本に、それぞれ、３００ｍｌの３％乾燥ブイヨン
（日水製薬株式会社製）培地を入れ、１２０℃で１５分
間オートクレーブ滅菌した。これらの培地に、雲南SL-0
01菌を一白金耳ずつ接種し、３７℃で振盪培養（１００
ｒｐｍ）した。４日後、培養液を合わせたものを遠心分
離（５，０００ｒｐｍ×１０分）し、得られた上清を４
００ｍｌずつ３つに分けて、各上清のｐＨを希塩酸で
１．０２、２．０７及び３．０１に調節した。室温で３
時間放置した後、上清を遠心分離（５，０００ｒｐｍ×
１０分、１０℃）し、白色の沈殿を分離した。この白色
沈殿物を少量の蒸留水に溶かして、重炭酸アンモニウム
粉末でｐＨを７．０に調節した後、凍結乾燥した。この
結果、凍結乾燥物の重量は、１．０２、２．０７及び
３．０１のｐＨの場合、それぞれ、０．５２ｇ、０．２
８ｇ及び０．３１ｇであった。次に、この凍結乾燥物に
ついて、ＭＫ−７含量（μｇ／ｇ乾燥物）をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法で調べたところ、１．０２、２．０７及
び３．０１のｐＨの場合、それぞれ、２，８００μｇ／
ｇ乾燥物、２，２００μｇ／ｇ乾燥物及び２，０００μ
ｇ／ｇ乾燥物であった。さらに、各凍結乾燥物１５ｍｇ
を蒸留水５ｍｌに添加した溶液を遠心分離（１０，００
０ｒｐｍ×１０分）した。得られた上清（水溶性分画）
について、同様にしてＭＫ−７含量を調べたところ、
１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、それぞ
れ、１，５００μｇ／ｇ乾燥物、１，８００μｇ／ｇ乾
燥物及び１，８００μｇ／ｇ乾燥物であったから、各水
溶性分画の可溶化率は、約５４％、約８２％及び約９０
％であることことが分かった。
コ５本に、それぞれ、３００ｍｌの３％乾燥ブイヨン
（日水製薬株式会社製）培地を入れ、１２０℃で１５分
間オートクレーブ滅菌した。これらの培地に、雲南SL-0
01菌を一白金耳ずつ接種し、３７℃で振盪培養（１００
ｒｐｍ）した。４日後、培養液を合わせたものを遠心分
離（５，０００ｒｐｍ×１０分）し、得られた上清を４
００ｍｌずつ３つに分けて、各上清のｐＨを希塩酸で
１．０２、２．０７及び３．０１に調節した。室温で３
時間放置した後、上清を遠心分離（５，０００ｒｐｍ×
１０分、１０℃）し、白色の沈殿を分離した。この白色
沈殿物を少量の蒸留水に溶かして、重炭酸アンモニウム
粉末でｐＨを７．０に調節した後、凍結乾燥した。この
結果、凍結乾燥物の重量は、１．０２、２．０７及び
３．０１のｐＨの場合、それぞれ、０．５２ｇ、０．２
８ｇ及び０．３１ｇであった。次に、この凍結乾燥物に
ついて、ＭＫ−７含量（μｇ／ｇ乾燥物）をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法で調べたところ、１．０２、２．０７及
び３．０１のｐＨの場合、それぞれ、２，８００μｇ／
ｇ乾燥物、２，２００μｇ／ｇ乾燥物及び２，０００μ
ｇ／ｇ乾燥物であった。さらに、各凍結乾燥物１５ｍｇ
を蒸留水５ｍｌに添加した溶液を遠心分離（１０，００
０ｒｐｍ×１０分）した。得られた上清（水溶性分画）
について、同様にしてＭＫ−７含量を調べたところ、
１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、それぞ
れ、１，５００μｇ／ｇ乾燥物、１，８００μｇ／ｇ乾
燥物及び１，８００μｇ／ｇ乾燥物であったから、各水
溶性分画の可溶化率は、約５４％、約８２％及び約９０
％であることことが分かった。
【０１３１】［実施例１２］大豆を水道水に一晩浸漬し
たもの３．９ｋｇを１０５℃で３０分間オートクレーブ
滅菌した後、１ｍ四方のステンレス製トレイ２枚に広げ
た。これに、普通寒天培地のスラントに培養された枯草
菌（Bacillus subtilis Warburgt）（東京大学応用微生
物研究所、ＩＡＭ１２１１８株）１０白金耳を１００ｍ
ｌの滅菌水に添加したものを接種し、ウレタン製の蓋を
した後、３７℃で４日間静置培養した。４日後の発酵大
豆の全重量（２枚分）は約４．５ｋｇであった。次に、
発酵大豆に１０リットルの蒸留水を加え、よく撹拌した
後、ガーゼ付金網（メッシュ１００ｍｍ）で濾過した。
得られた上清中の水溶性ＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法で測
定したところ、総量（即ち、４．５ｋｇ発酵大豆当た
り）２９．８ｍｇが回収できた。
たもの３．９ｋｇを１０５℃で３０分間オートクレーブ
滅菌した後、１ｍ四方のステンレス製トレイ２枚に広げ
た。これに、普通寒天培地のスラントに培養された枯草
菌（Bacillus subtilis Warburgt）（東京大学応用微生
物研究所、ＩＡＭ１２１１８株）１０白金耳を１００ｍ
ｌの滅菌水に添加したものを接種し、ウレタン製の蓋を
した後、３７℃で４日間静置培養した。４日後の発酵大
豆の全重量（２枚分）は約４．５ｋｇであった。次に、
発酵大豆に１０リットルの蒸留水を加え、よく撹拌した
後、ガーゼ付金網（メッシュ１００ｍｍ）で濾過した。
得られた上清中の水溶性ＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法で測
定したところ、総量（即ち、４．５ｋｇ発酵大豆当た
り）２９．８ｍｇが回収できた。
【０１３２】［実施例１３］５００ｍｌ三角フラスコに
２％ポリペプトン−Ｓ（和光純薬製）３００ｍｌを入
れ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。これ
に、枯草菌（Bacillussubtilis Warburgt）（東京大学
応用微生物研究所、ＩＡＭ１２１１８株）１白金耳接種
し、３７℃で４日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）した。
この培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１０分）
し、上清と菌体に分けた。菌体はさらに水洗して、凍結
乾燥した。
２％ポリペプトン−Ｓ（和光純薬製）３００ｍｌを入
れ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。これ
に、枯草菌（Bacillussubtilis Warburgt）（東京大学
応用微生物研究所、ＩＡＭ１２１１８株）１白金耳接種
し、３７℃で４日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）した。
この培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１０分）
し、上清と菌体に分けた。菌体はさらに水洗して、凍結
乾燥した。
【０１３３】上清について、ＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法
で測定したところ、１４０μｇ／１００ｍｌ上清であっ
た。また、菌体についても、ＭＫ−７含量をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法で測定したところ、２２ｍｇ／１００ｇ
凍結乾燥菌体であった。
で測定したところ、１４０μｇ／１００ｍｌ上清であっ
た。また、菌体についても、ＭＫ−７含量をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法で測定したところ、２２ｍｇ／１００ｇ
凍結乾燥菌体であった。
【０１３４】［実施例１４］朝食のみ絶食させた健常成
人（２１〜６３歳、男性）５人に、実施例９で調製され
た１０００μｇの水溶性ＭＫ−７誘導体を含む水溶性ビ
タミンＫ誘導体を、午前１０時に経口摂取させた後、経
時的に採血し、水溶性ＭＫ−７誘導体の血中濃度を測定
した。なお、比較対照として、１０００μｇの精製ＭＫ
−７を経口摂取させて同様の実験を行った。また、本実
施例に参加した健常成人には、既往症及び血液検査によ
る異常は認められなかった。
人（２１〜６３歳、男性）５人に、実施例９で調製され
た１０００μｇの水溶性ＭＫ−７誘導体を含む水溶性ビ
タミンＫ誘導体を、午前１０時に経口摂取させた後、経
時的に採血し、水溶性ＭＫ−７誘導体の血中濃度を測定
した。なお、比較対照として、１０００μｇの精製ＭＫ
−７を経口摂取させて同様の実験を行った。また、本実
施例に参加した健常成人には、既往症及び血液検査によ
る異常は認められなかった。
【０１３５】この結果、血漿中の主要なビタミンＫはＭ
Ｋ−７であり、水溶性ＭＫ−７誘導体投与後の血漿中の
ＭＫ−７濃度は、投与前が１．３±０．８ｎｇ／ｍｌ
（血漿）であったのに対して、投与後４時間目にはその
約４０倍の４９．９±２９．１ｎｇ／ｍｌ（血漿）（ｐ
＜０．０５）にまで増加し、さらにその亢進効果は等量
の純ＭＫ−７を経口投与した場合に比べて、はるかに長
持間（２４時間目において、純ＭＫ−７群では３．２±
２．３ｎｇ／ｍｌであるのに対して、水溶性ＭＫ−７誘
導体群では２１．０±１２．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０
５）持続することが分かった。
Ｋ−７であり、水溶性ＭＫ−７誘導体投与後の血漿中の
ＭＫ−７濃度は、投与前が１．３±０．８ｎｇ／ｍｌ
（血漿）であったのに対して、投与後４時間目にはその
約４０倍の４９．９±２９．１ｎｇ／ｍｌ（血漿）（ｐ
＜０．０５）にまで増加し、さらにその亢進効果は等量
の純ＭＫ−７を経口投与した場合に比べて、はるかに長
持間（２４時間目において、純ＭＫ−７群では３．２±
２．３ｎｇ／ｍｌであるのに対して、水溶性ＭＫ−７誘
導体群では２１．０±１２．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０
５）持続することが分かった。
【０１３６】［実施例１５］鍋の中に、牛乳４００ｇ、
砂糖８０ｇ及びコーンスターチ８ｇを入れて、撹拌・混
合しながら加熱した。この混合液を沸騰直前で火を弱め
て冷却した後、これに実施例３と同様にして培養された
宮城野菌の培養物を凍結乾燥した物（７３０μｇ ビタ
ミンＫ／ｇ乾燥菌体）１０ｇを加え、さらに約２分間よ
く撹拌した。これとは別にボールに卵黄４０ｇをとっ
て、泡立てた。この泡立てた卵黄に、上記の撹拌混合物
全部を徐々に添加し、混合した。次に、これを水冷した
後、冷蔵庫で１０℃以下まで冷却した。最後に、この冷
却した混合物に、さらに泡立てた生クリーム１５０ｇ及
びバニラエッセンス５ｇを加えて、アイスクリームフリ
ーザーに入れて冷やして固めることによって、ビタミン
Ｋ入りアイスクリームを製造した。
砂糖８０ｇ及びコーンスターチ８ｇを入れて、撹拌・混
合しながら加熱した。この混合液を沸騰直前で火を弱め
て冷却した後、これに実施例３と同様にして培養された
宮城野菌の培養物を凍結乾燥した物（７３０μｇ ビタ
ミンＫ／ｇ乾燥菌体）１０ｇを加え、さらに約２分間よ
く撹拌した。これとは別にボールに卵黄４０ｇをとっ
て、泡立てた。この泡立てた卵黄に、上記の撹拌混合物
全部を徐々に添加し、混合した。次に、これを水冷した
後、冷蔵庫で１０℃以下まで冷却した。最後に、この冷
却した混合物に、さらに泡立てた生クリーム１５０ｇ及
びバニラエッセンス５ｇを加えて、アイスクリームフリ
ーザーに入れて冷やして固めることによって、ビタミン
Ｋ入りアイスクリームを製造した。
【０１３７】［実施例１６］日東菌を、２リットルのジ
ャーファーメンター中で、培養液（グルコース１０ｇ、
ポリペプトン５ｇ及び酵母エキス５ｇを水で１リットル
に溶かしたもの）０．８リットル中に接種し、４０℃
で、通気拡散培養（５００ｒｐｍの撹拌速度；０．５リ
ットル／分の通気量）により、１．５日間発酵した。
ャーファーメンター中で、培養液（グルコース１０ｇ、
ポリペプトン５ｇ及び酵母エキス５ｇを水で１リットル
に溶かしたもの）０．８リットル中に接種し、４０℃
で、通気拡散培養（５００ｒｐｍの撹拌速度；０．５リ
ットル／分の通気量）により、１．５日間発酵した。
【０１３８】このようにして得られた日東菌の培養物の
ＭＫ−７量を従来の方法（坂野ら、ビタミン、６２：３
９３〜３９８、１９８８年）に準じて抽出・測定した。
簡潔にいうと、上記で得られた日東菌の培養物を凍結乾
燥し、その凍結乾燥粉末０．１ｇにイソプロパノール１
０ｍｌを加え、タッチミキサーで撹拌抽出した後、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）した。上清１００μ
ｌを１．０ｍｌの水及び１．５ｍｌのイソプロパノール
と混和し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサ
ーで約１０秒間混和した。この混合液を遠心分離（３，
０００ｒｐｍ×１０分、２０℃）した。得られた上清部
分（有機層：水層＝５．８：１．７）４．０ｍｌをエバ
ポレーターで濃縮・乾固した後、これを１００μｌのエ
タノールに溶解した。このようにして、調製された試料
について、上記各種ビタミンＫ量の測定方法の項に記載
されたＨＰＬＣ条件と同様の条件を用いて、培養物のＭ
Ｋ−７量を測定したことろ、１５．１μｇ／ｇであっ
た。また、上記操作において、イソプロパノールの代わ
りにクロロホルム／メタノール（１：１）混合液及びエ
ーテルを用いて、上記操作を繰り返したところ、ＭＫ−
７量は、それぞれ、１５．０μｇ／ｇ及び１３．６μｇ
／ｇであり、イソプロパノールを用いた場合とほぼ同等
のＭＫ−７量を示した。
ＭＫ−７量を従来の方法（坂野ら、ビタミン、６２：３
９３〜３９８、１９８８年）に準じて抽出・測定した。
簡潔にいうと、上記で得られた日東菌の培養物を凍結乾
燥し、その凍結乾燥粉末０．１ｇにイソプロパノール１
０ｍｌを加え、タッチミキサーで撹拌抽出した後、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）した。上清１００μ
ｌを１．０ｍｌの水及び１．５ｍｌのイソプロパノール
と混和し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサ
ーで約１０秒間混和した。この混合液を遠心分離（３，
０００ｒｐｍ×１０分、２０℃）した。得られた上清部
分（有機層：水層＝５．８：１．７）４．０ｍｌをエバ
ポレーターで濃縮・乾固した後、これを１００μｌのエ
タノールに溶解した。このようにして、調製された試料
について、上記各種ビタミンＫ量の測定方法の項に記載
されたＨＰＬＣ条件と同様の条件を用いて、培養物のＭ
Ｋ−７量を測定したことろ、１５．１μｇ／ｇであっ
た。また、上記操作において、イソプロパノールの代わ
りにクロロホルム／メタノール（１：１）混合液及びエ
ーテルを用いて、上記操作を繰り返したところ、ＭＫ−
７量は、それぞれ、１５．０μｇ／ｇ及び１３．６μｇ
／ｇであり、イソプロパノールを用いた場合とほぼ同等
のＭＫ−７量を示した。
【０１３９】これに対して、上記と同様にして得られた
日東菌の培養物について、ＭＫ−７量をソックスレー−
ＨＰＬＣ法で測定した結果、日東菌の培養物のＭＫ−７
量は、５６４．０μｇ／ｇであった。
日東菌の培養物について、ＭＫ−７量をソックスレー−
ＨＰＬＣ法で測定した結果、日東菌の培養物のＭＫ−７
量は、５６４．０μｇ／ｇであった。
【０１４０】これらの結果から、従来の方法では、納豆
菌を効率よく抽出することが困難であり、培養物のＭＫ
−７量が良好に測定できなかったのに対して、本願発明
で使用されるソックスレー−ＨＰＬＣ法は、従来の方法
に比べて、ＭＫ−７の抽出効率が向上し、培養物のＭＫ
−７量をより良好に測定することができることが示され
た。
菌を効率よく抽出することが困難であり、培養物のＭＫ
−７量が良好に測定できなかったのに対して、本願発明
で使用されるソックスレー−ＨＰＬＣ法は、従来の方法
に比べて、ＭＫ−７の抽出効率が向上し、培養物のＭＫ
−７量をより良好に測定することができることが示され
た。
【０１４１】［実施例１７］水溶性ＭＫ−７誘導体の骨
粗鬆症に対する薬理効果について、卵巣摘出ラットによ
る骨粗鬆症モデルを用いて評価した。
粗鬆症に対する薬理効果について、卵巣摘出ラットによ
る骨粗鬆症モデルを用いて評価した。
【０１４２】実験方法 ラット（５週齢、雌性）は１ゲージ４匹の群飼いとし、
飼育室は１２時間明暗循環、温度２３±２℃、湿度５５
±１０％で維持した。半数のラットにエーテル麻酔下で
卵巣摘出手術を行い、あとの半数は偽手術を行った。エ
サは手術２４時間後から与えた。
飼育室は１２時間明暗循環、温度２３±２℃、湿度５５
±１０％で維持した。半数のラットにエーテル麻酔下で
卵巣摘出手術を行い、あとの半数は偽手術を行った。エ
サは手術２４時間後から与えた。
【０１４３】ペントバルビタール麻酔下に腹部大動脈か
らヘパリン採血を行い、大腿骨（右大腿骨を使用）を摘
出した。血液は、４℃、３，０００ｐｒｍで１０分間遠
心分離して、血漿を分離し、カルシウムをＯＣＰＣ法
（カルシウムＣ−ｔｅｓｔＷＡＫＯ、和光純薬）で測定
した。大腿骨は、筋肉および結合組織を取り除き、エタ
ノールとアセトンで各３回洗浄後、１１０℃、１６時間
乾燥させ、乾燥骨重量を測定した。体積は、アルキメデ
スの原理、即ち、水を入れたビーカーの中に骨をつぶ
し、その時増加した水の重量を体積として測定した。乾
燥骨重量を体積で割った値を骨密度とした。骨カルシウ
ム含量は赤外吸収（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：９−１４，１９８
９）で測定し、骨乾燥重量当たりのｍｇ数で表示した。
らヘパリン採血を行い、大腿骨（右大腿骨を使用）を摘
出した。血液は、４℃、３，０００ｐｒｍで１０分間遠
心分離して、血漿を分離し、カルシウムをＯＣＰＣ法
（カルシウムＣ−ｔｅｓｔＷＡＫＯ、和光純薬）で測定
した。大腿骨は、筋肉および結合組織を取り除き、エタ
ノールとアセトンで各３回洗浄後、１１０℃、１６時間
乾燥させ、乾燥骨重量を測定した。体積は、アルキメデ
スの原理、即ち、水を入れたビーカーの中に骨をつぶ
し、その時増加した水の重量を体積として測定した。乾
燥骨重量を体積で割った値を骨密度とした。骨カルシウ
ム含量は赤外吸収（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：９−１４，１９８
９）で測定し、骨乾燥重量当たりのｍｇ数で表示した。
【０１４４】水溶性ＭＫ−７誘導体の調製 須見洋行，日本農化誌，７３：５９９−６０４，１９９
９に記載の方法に準じて、オカラに雲南菌（ＳＬ−００
１）を接種し、３７℃、２日間発酵させた（蒸煮物１ｇ
当たりに約１，０００個の胞子を使用）。このオカラ納
豆１ｋｇ（湿重量）に対して５ｌの水を加え、室温で１
時間攪拌し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）
して得られた上清に６３０ｇのイオン交換樹脂（ＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６１３）を加え攪拌、室
温３０分間静置した後、これをガラスカラム（７．５ｃ
ｍφ×１００ｃｍ）に充填、蒸留水および０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０．１〜０．８Ｍ
ＮａＣｌを含む同緩衝液でグラジェント溶出した。ＨＰ
ＬＣで確認されるビタミンＫ画分をメンブランフィルタ
ー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、分子量１万）で濃縮、蒸留水
で透析した後、凍結乾燥し、水溶性ＭＫ−７誘導体を約
５．８ｇ（ＭＫ−７として８３２μｇ／ｇを含む）得
た。
９に記載の方法に準じて、オカラに雲南菌（ＳＬ−００
１）を接種し、３７℃、２日間発酵させた（蒸煮物１ｇ
当たりに約１，０００個の胞子を使用）。このオカラ納
豆１ｋｇ（湿重量）に対して５ｌの水を加え、室温で１
時間攪拌し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）
して得られた上清に６３０ｇのイオン交換樹脂（ＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６１３）を加え攪拌、室
温３０分間静置した後、これをガラスカラム（７．５ｃ
ｍφ×１００ｃｍ）に充填、蒸留水および０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０．１〜０．８Ｍ
ＮａＣｌを含む同緩衝液でグラジェント溶出した。ＨＰ
ＬＣで確認されるビタミンＫ画分をメンブランフィルタ
ー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、分子量１万）で濃縮、蒸留水
で透析した後、凍結乾燥し、水溶性ＭＫ−７誘導体を約
５．８ｇ（ＭＫ−７として８３２μｇ／ｇを含む）得
た。
【０１４５】ＭＫ−７の調製 須見洋行，日本家政誌，５０：３０９−３１２，１９９
９に記載の方法で、市販納豆（株式会社タカノフーズ、
茨城）よりＭＫ−７を分離、精製した。即ち、納豆６０
０ｇに対して７５％イソプロピルアルコール１ｌ及びｎ
−ヘキサン１ｌを加え１時間ゆっくりと攪拌、静置後２
層に分離した上層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥、
蒸発乾固して抽出物約２０ｇを得た。これを１０ｍｌの
ｎ−ヘキサン＋トルエン（１＋１）で溶出、分画した。
ＭＫ−７を含む分画を減圧下で蒸発乾固し得られたシリ
カゲル濃縮物を５ｍｌのｎ−ヘキサンで溶解し、上記と
同様に再度シリカゲルカラムで分画し、減圧下で蒸発乾
固して約３５０ｍｇを得た。このうち５０ｍｇを少量の
アセトンに溶解し、アセトニトリル＋メタノール（１＋
１）で充填した６０ｍｌのクロマト用ＯＤＳ−シリカゲ
ルに通夜、アセトニトリル＋メタノール（１＋１）で展
開した。溶出液をＨＰＬＣでモニタリングしながら、Ｍ
Ｋ−７と考えられる物質が単独で溶出している画分を分
取、減圧乾固した。得られた物質について赤外線吸収ス
ペクトラムおよびマススペクトラムを得てＭＫ−７であ
ることを確認した。藤井らの方法（ビタミン，６２：５
０５−５１３，１９８８）で調べた本物質の純度は９
９．８％であった。
９に記載の方法で、市販納豆（株式会社タカノフーズ、
茨城）よりＭＫ−７を分離、精製した。即ち、納豆６０
０ｇに対して７５％イソプロピルアルコール１ｌ及びｎ
−ヘキサン１ｌを加え１時間ゆっくりと攪拌、静置後２
層に分離した上層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥、
蒸発乾固して抽出物約２０ｇを得た。これを１０ｍｌの
ｎ−ヘキサン＋トルエン（１＋１）で溶出、分画した。
ＭＫ−７を含む分画を減圧下で蒸発乾固し得られたシリ
カゲル濃縮物を５ｍｌのｎ−ヘキサンで溶解し、上記と
同様に再度シリカゲルカラムで分画し、減圧下で蒸発乾
固して約３５０ｍｇを得た。このうち５０ｍｇを少量の
アセトンに溶解し、アセトニトリル＋メタノール（１＋
１）で充填した６０ｍｌのクロマト用ＯＤＳ−シリカゲ
ルに通夜、アセトニトリル＋メタノール（１＋１）で展
開した。溶出液をＨＰＬＣでモニタリングしながら、Ｍ
Ｋ−７と考えられる物質が単独で溶出している画分を分
取、減圧乾固した。得られた物質について赤外線吸収ス
ペクトラムおよびマススペクトラムを得てＭＫ−７であ
ることを確認した。藤井らの方法（ビタミン，６２：５
０５−５１３，１９８８）で調べた本物質の純度は９
９．８％であった。
【０１４６】試験１ 「カルシウム欠乏食」（カルシウム１．０％、リン１．
０％）を基本食として、卵巣摘出ラットに毎日まず０．
１ｇの水溶性ＭＫ−７誘導体（ヒトに換算して１日約２
０ｍｇＭＫ−７に相当）を添加したものを摂取させた
後、水および基本食を自由摂取させて、水溶性ＭＫ−７
誘導体投与群とした。他の卵巣摘出ラットおよび偽手術
ラットには、全て水および基本食を自由摂取させて、そ
れぞれ対照群および正常群とした。
０％）を基本食として、卵巣摘出ラットに毎日まず０．
１ｇの水溶性ＭＫ−７誘導体（ヒトに換算して１日約２
０ｍｇＭＫ−７に相当）を添加したものを摂取させた
後、水および基本食を自由摂取させて、水溶性ＭＫ−７
誘導体投与群とした。他の卵巣摘出ラットおよび偽手術
ラットには、全て水および基本食を自由摂取させて、そ
れぞれ対照群および正常群とした。
【０１４７】３５日後の骨カルシウムおよび骨重量の測
定結果を表４に示す。正常群に比べて対照群（骨粗鬆症
モデル）の骨カルシウムおよび骨重量はいずれも減少す
ること、そしてそれらのいずれも水溶性ＭＫ−７誘導体
投与群で有意に回復していることが確認された（ｐ<
０．０１）。
定結果を表４に示す。正常群に比べて対照群（骨粗鬆症
モデル）の骨カルシウムおよび骨重量はいずれも減少す
ること、そしてそれらのいずれも水溶性ＭＫ−７誘導体
投与群で有意に回復していることが確認された（ｐ<
０．０１）。
【０１４８】
【表４】
【０１４９】試験２ 「カルシウム欠乏食」（カルシウム０．０１％、リン
０．３％）を基本食として、卵巣摘出ラットに４日に１
度の割合で、一匹当たり８３μｇのＭＫ−７または０．
１ｇの水溶性ＭＫ−７誘導体（ＭＫ−７として８３μ
ｇ）を添加したものを摂取させた後、水および基本食を
自由摂取させて、それぞれＭＫ−７投与群および水溶性
ＭＫ−７誘導体投与群とした。他の卵巣摘出ラットおよ
び偽手術ラットには、全て水および基本食を自由摂取さ
せて、それぞれ対照群および正常群とした。
０．３％）を基本食として、卵巣摘出ラットに４日に１
度の割合で、一匹当たり８３μｇのＭＫ−７または０．
１ｇの水溶性ＭＫ−７誘導体（ＭＫ−７として８３μ
ｇ）を添加したものを摂取させた後、水および基本食を
自由摂取させて、それぞれＭＫ−７投与群および水溶性
ＭＫ−７誘導体投与群とした。他の卵巣摘出ラットおよ
び偽手術ラットには、全て水および基本食を自由摂取さ
せて、それぞれ対照群および正常群とした。
【０１５０】２４日後の骨重量および骨密度の測定結果
を表５に示す。骨重量および骨密度は、正常群と比較し
て対照群ではいずれも減少したが、水溶性ＭＫ−７誘導
体投与群では有意に高まり、経口投与で骨形成に効果の
あることが示された。なお、ＭＫ−７投与群ではこのよ
うな強い効果は見られなかった（ｐ>０．３）。また、
体重および血漿カルシウム濃度においても、各群間で有
意差は見られなかった（ｐ>０．３）。
を表５に示す。骨重量および骨密度は、正常群と比較し
て対照群ではいずれも減少したが、水溶性ＭＫ−７誘導
体投与群では有意に高まり、経口投与で骨形成に効果の
あることが示された。なお、ＭＫ−７投与群ではこのよ
うな強い効果は見られなかった（ｐ>０．３）。また、
体重および血漿カルシウム濃度においても、各群間で有
意差は見られなかった（ｐ>０．３）。
【０１５１】
【表５】
【０１５２】
【発明の効果】上述したように、本発明の枯草菌の培養
方法は、枯草菌を培養し、該微生物の菌体内で産生され
たビタミンＫが菌体外に放出される前に該微生物菌体を
回収することからなることを特徴とするものである。し
たがって、本発明の方法により、枯草菌をビタミンＫ誘
導体、特にメナキノン−７誘導体を最も多量に菌体内に
貯蔵した状態で回収できる。このため、従来に比べてよ
り多量の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７
誘導体が培養物から回収できる。さらに、特に納豆菌を
使用した場合には、その安全性は確保されているため、
上記方法によって培養された培養物またはこのような培
養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む医薬、食品ま
たは飼料は、従来に比べて多量の水溶性ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７誘導体を含みかつ高い安全性を
有するため、このような医薬、食品または飼料を食する
ことによって、ビタミンＫを効率的にかつ簡単に日常的
に摂取することができ、これにより骨粗鬆症の改善がよ
り一層期待できる。
方法は、枯草菌を培養し、該微生物の菌体内で産生され
たビタミンＫが菌体外に放出される前に該微生物菌体を
回収することからなることを特徴とするものである。し
たがって、本発明の方法により、枯草菌をビタミンＫ誘
導体、特にメナキノン−７誘導体を最も多量に菌体内に
貯蔵した状態で回収できる。このため、従来に比べてよ
り多量の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７
誘導体が培養物から回収できる。さらに、特に納豆菌を
使用した場合には、その安全性は確保されているため、
上記方法によって培養された培養物またはこのような培
養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む医薬、食品ま
たは飼料は、従来に比べて多量の水溶性ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７誘導体を含みかつ高い安全性を
有するため、このような医薬、食品または飼料を食する
ことによって、ビタミンＫを効率的にかつ簡単に日常的
に摂取することができ、これにより骨粗鬆症の改善がよ
り一層期待できる。
【０１５３】また、本発明の培養方法によって培養され
る培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体は、従来脂溶性
であったビタミンＫを水溶性にその性質を変えることが
可能であるという画期的な発明を包含するものである。
さらに、本発明による水溶性ビタミンＫ誘導体は優れた
光安定性を有するので、長期に亘って貯蔵が可能である
と共に、遮光等の特別の保存条件を要せず取扱いにも優
れるものである。この発明により、従来に比べてビタミ
ンＫの用途がかなり拡大できることはいうまでもなく、
ゆえに本発明は産業上の観点から非常に高い価値を有す
ることが期待できる。
る培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体は、従来脂溶性
であったビタミンＫを水溶性にその性質を変えることが
可能であるという画期的な発明を包含するものである。
さらに、本発明による水溶性ビタミンＫ誘導体は優れた
光安定性を有するので、長期に亘って貯蔵が可能である
と共に、遮光等の特別の保存条件を要せず取扱いにも優
れるものである。この発明により、従来に比べてビタミ
ンＫの用途がかなり拡大できることはいうまでもなく、
ゆえに本発明は産業上の観点から非常に高い価値を有す
ることが期待できる。
【０１５４】さらに、本発明による培養物または水溶性
ビタミンＫ誘導体を含む医薬を患者に投与し、または食
品として摂取することにより、効率よく血中ビタミンＫ
濃度を高めることができ、また、従来の薬品や食品で摂
取されるビタミンＫそのものに比べて血中濃度の高まり
をはるかに長持間持続できることから、骨粗鬆症予防の
より高い効果も期待できる。
ビタミンＫ誘導体を含む医薬を患者に投与し、または食
品として摂取することにより、効率よく血中ビタミンＫ
濃度を高めることができ、また、従来の薬品や食品で摂
取されるビタミンＫそのものに比べて血中濃度の高まり
をはるかに長持間持続できることから、骨粗鬆症予防の
より高い効果も期待できる。
【図１】 実施例１における調製された納豆菌乾燥物１
ｇを各々５人の健常成人に経口摂取させた時の、経時的
な血漿中のビタミンＫ（メナキノン−７）濃度の変化を
示すグラフである。
ｇを各々５人の健常成人に経口摂取させた時の、経時的
な血漿中のビタミンＫ（メナキノン−７）濃度の変化を
示すグラフである。
【図２】 実施例２における納豆菌乾燥物１．８×１０
10細胞を各々５人の健常成人に経口摂取させた時の、経
時的な血漿中のビタミンＫ（メナキノン−７）濃度の変
化を示すグラフである。
10細胞を各々５人の健常成人に経口摂取させた時の、経
時的な血漿中のビタミンＫ（メナキノン−７）濃度の変
化を示すグラフである。
【図３】 実施例３における培養時間に対する各種納豆
菌の成長を示すグラフである。
菌の成長を示すグラフである。
【図４】 実施例３における培養時間に対する各種納豆
菌の培養液中のＭＫ−７量を示すグラフである。
菌の培養液中のＭＫ−７量を示すグラフである。
【図５】 実施例３における培養時間に対する各種納豆
菌の菌体内に蓄積されたＭＫ−７量を示すグラフであ
る。
菌の菌体内に蓄積されたＭＫ−７量を示すグラフであ
る。
【図６】 実施例４における菌体内に蓄積されるＭＫ−
７量、線溶活性及び菌体外に放出されたＭＫ−７量を示
すグラフである。
７量、線溶活性及び菌体外に放出されたＭＫ−７量を示
すグラフである。
【図７】 実施例７及び比較例１において、蛍光灯によ
る照射時間に対するＭＫ−７量を示すグラフである。
る照射時間に対するＭＫ−７量を示すグラフである。
【図８】 実施例１０において、ゲル濾過を行った際の
パターンおよび各フラクションにおけるＭＫ−７量を示
すグラフである。
パターンおよび各フラクションにおけるＭＫ−７量を示
すグラフである。
【図９】 実施例９において、水溶性ビタミンＫ誘導体
及びオカラのイソプロパノール抽出物のＨＰＬＣ分析結
果示すグラフである。
及びオカラのイソプロパノール抽出物のＨＰＬＣ分析結
果示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 1/302 Ａ２３Ｌ 1/302 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｋ 31/122 Ａ６１Ｋ 31/122 ４Ｃ２０６ 35/74 35/74 Ａ Ｇ Ａ６１Ｐ 3/02 １０９ Ａ６１Ｐ 3/02 １０９ 19/10 19/10 Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｚ //(Ｃ１２Ｐ 7/66 (Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｆターム(参考） 2B150 AA01 AA02 AA03 AA05 AA06 AA08 AA10 AA20 AB10 AC02 AC03 AC04 DD12 DD26 DE16 4B014 GB18 GK12 GL03 4B018 LB01 MD23 MD88 ME04 ME05 MF01 MF06 MF13 4B064 AD94 BA07 CA02 CC01 CC15 CE08 DA01 DA10 DA11 4B065 AA19X BB27 BC50 BD11 BD16 CA08 CA41 CA43 CA44 4C087 AA01 AA02 AA04 BC65 CA09 CA10 NA03 NA14 ZA97 ZC29 4C206 AA01 AA02 AA03 AA04 CB24 CB25 ZA97 ZC29
Claims (36)
- 【請求項１】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物。 - 【請求項２】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することにより
得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む
培養物。 - 【請求項３】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtilis
natto）である請求項１または２に記載の培養物。 - 【請求項４】 該菌体数が対数期から定常期に入る時期
でかつナットウキナーゼが産生される前に回収すること
により得られる請求項３に記載の培養物。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一つに記載の培
養物に由来する水溶性ビタミンＫ誘導体。 - 【請求項６】 ビタミンＫ2 誘導体である請求項５に記
載のビタミンＫ誘導体。 - 【請求項７】 メナキノン−７誘導体である請求項６に
記載のビタミンＫ誘導体。 - 【請求項８】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体を含
む医薬。 - 【請求項９】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することにより
得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む
培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体
を含む医薬。 - 【請求項１０】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtili
s natto）である請求項８または９に記載の医薬。 - 【請求項１１】 該培養物は、該菌体数が対数期から定
常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前
に回収することにより得られるものである請求項１０に
記載の医薬。 - 【請求項１２】 骨粗鬆症予防および治療剤である請求
項８〜１１のいずれか一つに記載の医薬。 - 【請求項１３】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体の医
薬としての使用。 - 【請求項１４】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することにより
得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む
培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体
の医薬としての使用。 - 【請求項１５】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtili
s natto）である請求項１３または１４に記載の使用。 - 【請求項１６】 該培養物は、該菌体数が対数期から定
常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前
に回収することにより得られるものである請求項１５に
記載の使用。 - 【請求項１７】 該医薬は骨粗鬆症予防および治療剤で
ある請求項１３〜１６のいずれか一つに記載の使用。 - 【請求項１８】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体の有
効量を患者に投与することからなるヒトの疾病の予防お
よび／または治療方法。 - 【請求項１９】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することにより
得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む
培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体
の有効量を患者に投与することからなるヒトの病気の予
防および／または治療方法。 - 【請求項２０】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtili
s natto）である請求項１８または１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 該培養物は、該菌体数が対数期から定
常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前
に回収することにより得られるものである請求項２０に
記載の方法。 - 【請求項２２】 該疾病は骨粗鬆症である請求項１８〜
２１のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項２３】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体を含
む食品。 - 【請求項２４】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することにより
得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む
培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体
を含む食品。 - 【請求項２５】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtili
s natto）である請求項２３または２４に記載の食品。 - 【請求項２６】 該培養物は、該菌体数が対数期から定
常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前
に回収することにより得られるものである請求項２５に
記載の食品。 - 【請求項２７】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することにより得られ
る、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養
物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体を含
む飼料。 - 【請求項２８】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することにより
得られる、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む
培養物、またはそれに由来する水溶性ビタミンK誘導体
を含む飼料。 - 【請求項２９】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtili
s natto）である請求項２７または２８に記載の飼料。 - 【請求項３０】 該培養物は、該菌体数が対数期から定
常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前
に回収することにより得られるものである請求項２９に
記載の飼料。 - 【請求項３１】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体内で産生されたビタミンＫおよび／
またはその誘導体が該菌体外に放出される前に該菌体お
よび／またはその産生物を回収することを特徴とする、
枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物の製
造方法。 - 【請求項３２】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
し、該枯草菌の菌体数が対数期から定常期に入る時期に
該菌体および／またはその産生物を回収することを特徴
とする、枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培
養物の製造方法。 - 【請求項３３】 該枯草菌は納豆菌（Bacillus subtili
s natto）である請求項３１または３２に記載の製造方
法。 - 【請求項３４】 該菌体数が対数期から定常期に入る時
期でかつナットウキナーゼが産生される前に回収するこ
とを特徴とする請求項３３に記載の製造方法。 - 【請求項３５】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
して得られた枯草菌菌体および／またはその産生物を含
む培養液を酸性化し、沈殿物を得ることからなる水溶性
ビタミンＫ誘導体の分取方法。 - 【請求項３６】 枯草菌（Bacillus subtilis）を培養
して得られた枯草菌菌体および／またはその産生物を含
む培養物をソックスレー抽出することを特徴とするビタ
ミンＫの抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32746099A JP2001136959A (ja) | 1999-11-17 | 1999-11-17 | 枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物、これに由来する水溶性ビタミンｋ誘導体、これらを含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32746099A JP2001136959A (ja) | 1999-11-17 | 1999-11-17 | 枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物、これに由来する水溶性ビタミンｋ誘導体、これらを含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001136959A true JP2001136959A (ja) | 2001-05-22 |
Family
ID=18199421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32746099A Pending JP2001136959A (ja) | 1999-11-17 | 1999-11-17 | 枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物、これに由来する水溶性ビタミンｋ誘導体、これらを含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001136959A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007148494A1 (ja) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | J-Oil Mills, Inc. | テストステロン増加剤 |
| WO2008126367A1 (ja) | 2007-04-05 | 2008-10-23 | J-Oil Mills, Inc. | 精神安定剤および機能性食品 |
| WO2010034999A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Kappa Bioscience As | Crystalline menoquinone-7 (vitamin k2) |
| WO2010139690A1 (en) * | 2009-06-03 | 2010-12-09 | Chr. Hansen A/S | Bacteria thya(-) mutants with increased vitamin k |
| US8114642B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-02-14 | Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. | Method for producing vitamin K2 from culture of Bacillus natto |
| CN102488071A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-06-13 | 河北联合大学 | 纳豆激酶冰激凌及其制作方法 |
| WO2014017145A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 株式会社Ｊ－オイルミルズ | 組成物 |
| JP2020080856A (ja) * | 2018-11-14 | 2020-06-04 | 池田食研株式会社 | 老化抑制剤 |
| CN112175856A (zh) * | 2019-07-05 | 2021-01-05 | 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 | 用于枯草芽孢杆菌发酵的固体培养基以及枯草芽孢杆菌固体菌剂及其制备方法和应用 |
| JPWO2020090045A1 (ja) * | 2018-10-31 | 2021-10-14 | 株式会社村田製作所 | 抗グラム陰性菌化合物 |
-
1999
- 1999-11-17 JP JP32746099A patent/JP2001136959A/ja active Pending
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8114642B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-02-14 | Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. | Method for producing vitamin K2 from culture of Bacillus natto |
| US8603552B2 (en) | 2004-12-28 | 2013-12-10 | Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. | Method for producing foods from culture of Bacillus natto |
| WO2007148494A1 (ja) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | J-Oil Mills, Inc. | テストステロン増加剤 |
| WO2008126367A1 (ja) | 2007-04-05 | 2008-10-23 | J-Oil Mills, Inc. | 精神安定剤および機能性食品 |
| WO2010034999A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Kappa Bioscience As | Crystalline menoquinone-7 (vitamin k2) |
| US8871195B2 (en) | 2009-06-03 | 2014-10-28 | Chr. Hansen A/S | Bacteria thyA(−) mutants with increased vitamin K |
| WO2010139690A1 (en) * | 2009-06-03 | 2010-12-09 | Chr. Hansen A/S | Bacteria thya(-) mutants with increased vitamin k |
| JP2012528826A (ja) * | 2009-06-03 | 2012-11-15 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | ビタミンＫ強化ｔｈｙＡ（−）突然変異細菌 |
| CN102488071A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-06-13 | 河北联合大学 | 纳豆激酶冰激凌及其制作方法 |
| WO2014017145A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 株式会社Ｊ－オイルミルズ | 組成物 |
| US9486398B2 (en) | 2012-07-24 | 2016-11-08 | J-Oil Mills, Inc. | Composition |
| US10039704B2 (en) | 2012-07-24 | 2018-08-07 | J-Oil Mills, Inc. | Composition |
| JPWO2020090045A1 (ja) * | 2018-10-31 | 2021-10-14 | 株式会社村田製作所 | 抗グラム陰性菌化合物 |
| JP2020080856A (ja) * | 2018-11-14 | 2020-06-04 | 池田食研株式会社 | 老化抑制剤 |
| JP7376023B2 (ja) | 2018-11-14 | 2023-11-08 | 池田食研株式会社 | 老化抑制剤 |
| CN112175856A (zh) * | 2019-07-05 | 2021-01-05 | 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 | 用于枯草芽孢杆菌发酵的固体培养基以及枯草芽孢杆菌固体菌剂及其制备方法和应用 |
| CN112175856B (zh) * | 2019-07-05 | 2022-10-21 | 中粮生物科技股份有限公司 | 用于枯草芽孢杆菌发酵的固体培养基以及枯草芽孢杆菌固体菌剂及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2474237B1 (en) | Equol-containing fermentation product of soybean embryonic axis, and method for production thereof | |
| KR101054631B1 (ko) | 에쿠올 생산 유산균 함유 조성물 | |
| JP6684966B2 (ja) | 新規なラクトバチルス・サケイ及びそれを含む組成物 | |
| JP2006320257A (ja) | 海藻発酵エキス、その製造方法およびその用途 | |
| JP5282932B2 (ja) | ポリフェノール抽出物の製造方法、骨粗鬆症予防剤、糖質消化酵素阻害剤、これらを用いた機能性組成物、およびこの機能性組成物を含む、食品組成物、特定保健用食品組成物、医薬部外品組成物、医薬組成物 | |
| US6677143B2 (en) | Method for culturing Bacillus subtilis natto to produce water-soluble vitamin K and food product, beverage, or feed containing the cultured microorganism or the vitamin K derivative | |
| JP2001136959A (ja) | 枯草菌菌体および／またはその産生物を含む培養物、これに由来する水溶性ビタミンｋ誘導体、これらを含む医薬、食品および飼料ならびにこれらの製造方法 | |
| JP6005453B2 (ja) | オルニチンとエクオールを含む組成物 | |
| JP2009155293A (ja) | 発酵甘草抽出物及びその製造方法、並びに、発酵甘草抽出物を含有する皮膚外用剤及び美容用飲食品 | |
| JP4809785B2 (ja) | 醤油に含まれる高分子物質の用途 | |
| JP2024010170A (ja) | エクオール含有組成物の製造方法 | |
| JP2001000175A (ja) | 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養方法、該方法によって培養される微生物の培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体ならびに該微生物の培養物またはビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料 | |
| JP4068103B2 (ja) | 雲南ｓｌ−００１菌の培養によるビタミンｋの生産方法 | |
| JP2006199641A (ja) | 鉄吸着性高分子物質及び鉄含有高分子物質ならびにこれらの製造方法 | |
| JP4011938B2 (ja) | 脂質代謝改善剤及びそれを含有する食品 | |
| JPH067115A (ja) | 免疫増強用飲食品添加剤および飲食品の免疫増強効果付与方法 | |
| JP2001120222A (ja) | 過酸化脂質抑制用組成物およびその製造法 | |
| JP2006335709A (ja) | 組織因子阻害組成物、及びそれを含有する飲食品、飼料、医薬部外品、医薬品 | |
| JP2005237300A (ja) | 食品素材及びその製造方法 | |
| GB2233666A (en) | Microbacterium 851R, and a process for producing 851 nutrient solution | |
| JP2005179315A (ja) | 免疫強化剤及びその製造方法 | |
| JPH08196268A (ja) | 乳酸菌増殖促進物質 | |
| JP2005089385A (ja) | リポキシゲナーゼ阻害剤 | |
| JP2007112750A (ja) | 一酸化窒素産生抑制剤 | |
| JP2001352975A (ja) | 納豆菌由来の生理活性物質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050105 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050302 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050328 |