JP2001352975A - 納豆菌由来の生理活性物質 - Google Patents
納豆菌由来の生理活性物質Info
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Abstract
いて、納豆菌由来の生理活性物質であるナットウキナー
ゼとメナキノン−７を安価に大量生産する、あるいはそ
れを利用することを目的としたものである。 【解決手段】 焼酎製造時などに生じる蒸留粕にグリセ
リンを添加するなどした培地に納豆菌を接種してなる発
酵物、及びその発酵物から水、有機溶媒などの抽出液で
ナットウキナーゼとメナキノン−７を抽出することを特
徴とする。
Description
生じる蒸留粕にグリセリンを添加するなどした培地で納
豆菌を培養することにより、生理活性物質であるナット
ウキナーゼとメナキノン−７の両方を同時に安価に大量
生産する、あるいはさらに水抽出、有機溶媒処理などを
組み合わせた方法で精製するこれらの生理活性物質とそ
の利用に関する。
７年に納豆中に発見した納豆菌由来の血栓溶解酵素であ
るが（Ｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ，４３，１１１０−１１１１，１９８７）、その後の
研究で血栓（フィブリン）のみならず、プロ−ウロキナ
ーゼの活性化（須見ら、日食科工、４３、１１２４−１
１２７、１９９６）、あるいはエラスチン分解に働く
（須見ら、農化、７３、１１８７−１１９０、１９９
９）こと、またその血中血栓溶解（線溶）活性の亢進は
経口投与でも起こることなどから（Ｓｕｍｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ，６２，５４
９，１９８９；Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，８４，
１３９−１４３，１９９０；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓ．，６９，１２６７，１９９３）、狭心症や脳
梗塞などの血栓症だけでなく、広く老人性痴呆症などの
血栓性疾患の予防剤としても注目されている。また一
方、ビタミンＫ、中でも納豆菌由来のメナキノン−７は
近年、骨でのカルシウム結合性タンパク（オステオカル
シン）の合成に必須のビタミンとして注目されている
（折茂、医事新報、３７６７、１９９６；Ｓｕｍｉ ｅ
ｔ ａｌ．，ＸＶｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇ．ｏｎ Ｆｉ
ｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ＆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，
Ｈａｍａｍａｔｓｕ，２０００；ＩＩＩｒｄ Ｉｎｔ．
Ｓｏｃ．ＳｏｙｂｅａｎＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｕ
ｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｆ．，Ｔｓｕｋｕｂａ，
２０００；須見ら、日本家政学会第５２回大会要旨集、
ｐ．６４、２０００）。
の研究が知られている。例えば、ナットウキナーゼは直
接納豆から分離する方法（冨家ら、特開昭６１−１６２
１８４；中西ら、特開平３−１６８０８２）、大豆ペプ
トンなどの発酵物、特に液体培養を行いその発酵液から
分離する方法（藤田ら、特開平８−５３３６４）、ある
いは大豆粕であるオカラの固体培養を行い分離する方法
（竹中、特開平１０−２６５３９６）などである。一
方、メナキノン−７については、やはり納豆中に多いこ
とから納豆あるいは大豆成分を主原料とする納豆菌培養
液の油成分画から得る方法（磯部ら、特開平８−７３３
９６）、大豆タンパクあるいは豆腐カス（オカラ）発酵
で得る方法（荒木ら、特開平８−９９１６）、そして大
豆煮汁の発酵で得る方法（荒木ら、特開平８−１９３７
８；特開平１０−２９５３９３）があった。他の穀類利
用としては出願者の行った麦類の発酵物から得るという
方法（須見、特願２０００−４６５９５）があるに過ぎ
ない。これまで産業廃棄物であり現在大量が海洋投棄さ
れている焼酎などの蒸留粕から納豆菌による発酵で極め
て効率良く作り出せるということは全く知られていなか
った。また、いずれのナットウキナーゼとメナキノン−
７の製造も各々の生理活性物質を別々に得るというもの
であって、両方を同時に大量生産できる方法ではなかっ
た。
ナーゼあるいはメナキノン−７は、かなり高価な大豆成
分を原料とする、製造過程で生じる大量の粘質物をアル
コールなどを用いて取り除く操作が加わる、あるいは何
よりもその収率が悪いなどの理由でかなりコストが高く
なる欠点があった。本発明は、ナットウキナーゼとメナ
キノン−７をこれまで知られていなかった酒類の蒸留粕
の発酵によって作り出すことができ、また同時に極めて
安価に大量生産が可能である。もともと食品であるもの
を原料とするため安全性にも優れ、乾燥するなどしてそ
のまま多くの健康食品、加工食品、動物用飼料として応
用でき、またそれから精製したナットウキナーゼ及びメ
ナキノン−７は医薬、化粧品製剤としても有望である。
菌による各種発酵法を検討してきたが（須見洋行、デイ
リーフード、２１０、３２−３７、１９９７；Ｆｏｏｄ
Ｓｔｙｌｅ ２１，３（８），３７−４０，１９９
９；日本家政誌、５０、３０９、１９９９；日本農化
誌、７３、５９９、１９９９；日本農化誌、７３、１１
８７、１９９９；日本家政学会第５２回大会要旨集、
ｐ．６４、１９９９）、今回最も安価な一種の産業廃棄
物といえるものから極めて効率良くナットウキナーゼと
メナキノン−７を同時に得ることに成功した。即ち、本
発明は焼酎製造時などに生じる蒸留粕という、２００１
年から海洋投棄が禁止されその消却には１トン当たり
５，０００円もかかるとされ社会問題にもなっている、
正にただよりも安価な原料を納豆菌の培養基質とするも
のであり、それにグリセリンを添加するなどした後に、
納豆菌を接種して常法により培養することにより、前記
従来の問題点を解決した。焼酎などの製造時に生じる蒸
留粕は納豆菌の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩な
どをバランス良く含んでおり、ナットウキナーゼとメナ
キノン−７の両方が一度の発酵で同時に大量生産でき
る。特に、イモ焼酎の蒸留粕は両生理活性物質の生産に
最適であることが分かった。
る。なお、本発明は当該実施例によって何ら限定される
ものではない。
バ（雲海酒造、宮崎）、ムギ（宇都酒造、熊本）を原料
とした各種焼酎の製造時に生じたスラリー状の蒸留粕に
各々１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨ７．０に調整した
後、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理した後に、
１００×１４５ｃｍのステンレス製トレイの中に厚さ約
２．５ｃｍになるように拡げ、このものに納豆菌（成瀬
醗酵化学研究所、東京）を滅菌水に懸濁したものを１０
７個／ｍｌになるように添加攪拌した後７日間、３７℃
で静置培養した。得られた培養物を凍結乾燥した後、各
々に含まれるナットウキナーゼ活性をフィブリン平板法
（Ｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，
４３，１１１０−１１１１，１９８７）で、またメナキ
ノン−７濃度を我々が既に確立しているＨＰＬＣ法（須
見、日本家政誌、５０、３０９、１９９９）で測定し
た。いずれの蒸留粕を発酵させたものにも強いナットウ
キナーゼ活性（臨床用のウロキナーゼを基準にして２０
万ＩＵ以上／１００ｇ）とメナキノン−７（５．３ｍｇ
以上／１００ｇ）の両方が含まれることが分かったが、
特にイモ焼酎製造で生じる蒸留粕を原料に用いた発酵物
は図１及び図２にその分析例を示すように極めて高含量
で、各々１００ｇ当たり８５万ＩＵ及び１９．２ｍｇで
あった。これらの測定値はこれまでの同条件下で測定し
た市販納豆、あるいは大豆やオカラ発酵物の分析値（須
見ら、日本家政誌、５０、３０９、１９９９；日本農化
誌、７３、５９９、１９９９；日本農化誌、７３、１１
８７、１９９９；日本家政学会第５２回大会要旨集、
ｐ．６４、１９９９）に比較してもはるかに強いもので
あった。
に攪拌しながら２８％アンモニア水の添加を行いｐＨ
７．０に調整した後、さらに蒸留水で１．５倍に希釈し
グリセリンを１〜１２％（重量％）加え、その各混液
０．７Ｌを２Ｌのジャーファーメンター内で温度４０
℃、通気０．５Ｌ／分、攪拌速度５００ｒｐｍで４日間
培養を行った。得られた培養物はいずれも強いナットウ
キナーゼ活性と高メナキノン−７濃度を示したが、特に
グリセリン５％添加の場合が最も優れ、ナットウキナー
ゼ活性は実施例１と同じ方法で８３０ＩＵ／ｍｌ、また
メナキノン−７のほとんどが水溶性タイプでその濃度は
ＨＰＬＣ法（須見、日本農化誌、７３、５９９、１９９
９）で３４μｇ／ｍｌであった。なお、グリセリンの添
加量は２％未満では効果が少なく、１０％を超えても収
量増加は認められなかった。
場、山梨）とイモ焼酎の蒸留粕（薩摩酒造、鹿児島）を
等量混ぜたものを実施例２と同様に醗酵させたもの（ナ
ットウキナーゼ７８万ＩＵ／１００ｇ乾燥品、メナキノ
ン−７１３．８ｍｇ／１００ｇ乾燥品）１ｋｇにジエチ
ルエーテル１０Ｌを加えて振盪後、静置して分離したジ
エチルエーテル層（上層）を分取した。上層の溶媒を２
ｋＰａ、６０℃で留去し、１１５ｇの残渣を得た。この
残渣を５ｈＰａ、１８０℃、０．０８ｇ水蒸気／時間で
６０分間脱臭を行って、黄色、無味、無臭、油状の脂質
１．４ｇを得た。この脂質分画のナットウキナーゼは失
活していたが、メナキノン−７は約１０％量含まれてお
り、ＴＬＣで観察したところトリグリセライド、ステロ
ールおよびその誘導体、リン脂質、炭化水素類が認めら
れた。
して２倍容量の３％グリセリンを混ぜ合わせ、それを１
ＮのＮａＯＨでｐＨ７．８に調整した後、１２１℃、３
０分間オートクレーブ処理したものに、市販納豆（タカ
ノフーズ、茨城）より分離した納豆菌を植え、３７℃、
１００ｒｐｍで４日間振盪培養した。本培養物を３，０
００ｒｐｍ、１０分間遠心分離したところ、上清中には
３０．７ｍｇ／Ｌのメナキノン−７が含まれていた。そ
こで、この上清のｐＨ（ｐＨ７．３）を酢酸を用いてｐ
Ｈを２．０〜３．５に調整し、４℃で２４時間放置した
後、４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し得られた白
色沈殿物中のメナキノン−７を分析したところ、上清の
８５％以上がこの分画に回収されていることが分かっ
た。なお、ナットウキナーゼの方はもとの上清中にはフ
ィブリン平板法で強い活性が確認されたがこの酸処理物
ではほとんどが失なわれていた。
の湿重量５００ｇに対して５％量のグリセリン、及び２
８％アンモニア水を加えてｐＨ７．３に調整した後、オ
ートクレーブ処理して滅菌したものをホーローびきのト
レイ（２９×３４ｃｍ）中に拡げ、クリーンベンチ内で
１×１０１０個／ｇの目黒菌（目黒研究所、大阪）を
０．１ｇ添加して攪拌した後、アルミホイルで蓋をして
４０℃で４日間発酵させた。５０℃で減圧乾燥後、ブレ
ンダーで粉末化したものに大豆発酵物（一般の納豆）の
ような臭いはなく、香ばしい香りで、そのメナキノン−
７の含量は実施例１と同様のＨＰＬＣ法で乾燥粉末１０
０ｇ当たり４２ｍｇの高含量であった。一方、この処理
条件下でもナットウキナーゼ活性は残っておりフィブリ
ン平板法で乾燥粉末１００ｇ当たり１２８万ＩＵを示し
た。この乾燥粉末を小麦（強力粉＋中力粉１：１）に対
して５％量加え、２％量の生イースト、３％量の砂糖、
その他バター、食塩を少量加えて発酵させた後、１８０
℃で焙焼してできたビタミン高含量パンは大変美味であ
った。なお、焼くことで含まれるナットウキナーゼは失
活したが、メナキノン−７含量が低下することはなかっ
た。
高濃度のメナキノン−７を含む乾燥粉末（メナキノン−
７として２０ｍｇ）を大豆油に溶かし、それを混合添加
した。乾燥粉末の未添加のものとの摂取効果の比較を行
った。実験は５羽の鶏に水とこの餌を毎日自由に摂取さ
せ、２０日目に産んだ各卵の卵黄中に含まれるビタミン
Ｋ（メナキノン−７）量の分析を実施例１と同様の方法
で行った。その結果、平均値は未添加群の卵黄１００ｇ
当たりの値が０μｇであったのに対して、添加群では１
０８μｇと著しく高まっていることから、本物質がビタ
ミンＫ飼料として有効であることが分かった。
キナーゼ、メナキノン−７が提供できる。
ン）溶解の写真である。発酵物を１０倍量の生理的食塩
水で抽出したものを一枚のフィブリン平板上に各々３０
μＬ、３ヶ所にのせた。
パターン。ＨＰＬＣでＲｔ約１７分目のピークがメナキ
ノン−７である。なお、未発酵物ではこのピークは全く
みられない。
Claims (5)
- 【請求項１】 焼酎製造時などに生じる蒸留粕に必要な
添加物を加え、ｐＨ調整した後、納豆菌を接種してな
る、生理活性物質としてナットウキナーゼとメナキノン
−７の両方を含む発酵物。 - 【請求項２】 グリセリンの添加量を２〜１０％（重
量）とすることを特徴とした請求項１の発酵物。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の発酵物から水抽
出、あるいは適当な極性有機溶媒処理、限外濾過処理、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過などの操作を一種以上組み合わせて精製す
るナットウキナーゼ及びメナキノン−７。 - 【請求項４】 請求項１または２記載の発酵物、または
請求項３記載の方法で得られた生理活性物質と他の原料
を用いた食品。 - 【請求項５】 請求項１または２記載の発酵物、または
請求項３記載の方法で得られた生理活性物質と他の原料
を用いた動物飼料。
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