JP3431573B2 - メナキノン−７の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，大麦を使用する蒸
留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離して得
られる液体分を主たる構成成分とする培地を使用して、
Bacillussubtilisに属するメナキノン−7生産菌を培養
することにより、メナキノン−７を高収率で製造する方
法に関する。特に本発明は、大麦を使用する焼酎製造に
おいて副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して得られ
る液体分を主たる構成成分とする培地を使用して、Baci
llus subtilisに属するメナキノン−7生産菌を培養する
ことにより、メナキノン−７を高収率で製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＫは血液の正常な凝固能を維持
するのに不可欠な栄養素である。一般にビタミンＫと称
されるものには、合成されたものを含めてビタミンＫ1
〜ビタミンＫ7までが知られている。これらのうち、ビ
タミンK1（フィロキノン）及びビタミンK2（メナキノ
ン）は天然に存在するものである。ビタミンK1は主に植
物の葉緑体で合成されることから、緑黄色野菜に多く、
他に植物油、豆類、海藻類及び魚介類に比較的多く含ま
れている。一方、ビタミンＫ2は一般細菌や腸内細菌が
生産するもので、納豆等の発酵食品、あおのり、鶏卵、
肉類及び乳製品に比較的多く含まれる。ビタミンＫ2は
その側鎖構造の違いによってメナキノン−1〜メナキノ
ン−14に類別される。これらのうち特に納豆に多く含ま
れるビタミンK2は、主としてメナキノン−７（以下、
“MK−7"と略称する）から成るものであり、当該MK−7
は納豆菌によって生産されることが知られている。MK−
7は血液凝固能の維持に関わるだけでなく、骨芽細胞に
よる骨形成を促進すると同時にカルシウムの骨からの溶
出を抑制し、骨のカルシウム量の減少を抑制する作用を
有することが知られている。こうしたことからMK−7は
骨粗鬆症の治療薬として既に利用されており、その需要
は益々高まっている。

【０００３】ところで、MK−7の工業的製造について
は、以下に述べるように、（１）大豆煮汁または豆腐粕
等の大豆由来の材料を培地として使用するか、或いは
（２）大豆煮汁または醤油火入れオリ等の大豆由来の材
料に特定の物質を混合して培地として使用し、納豆菌を
培養することによりMK−7を製造する方法が提案されて
いる。

【０００４】前記（１）の方法については、特開平8-19
378号公報、特開平8−73396号公報方法、及び特開平11
−196820号公報に記載されている。即ち、特開平8-1937
8号公報には、納豆製造時に副生する大豆煮汁をpH7に調
整して滅菌し、これに納豆菌を接種し、培養温度48℃、
攪拌数120rpmで4日間振とう培養することによりMK−7を
製造する方法が記載されている。また当該公報には、豆
腐製造時に副生された豆腐粕を滅菌し、これに納豆菌を
接種し、培養温度48℃で、5日間静置培養することによ
りMK−7を製造する方法が記載されている。特開平8−73
396号公報には、納豆製造時に副生する大豆煮汁に納豆
菌を接種し培養することによりMK−7を製造する方法が
記載されている。特開平11−196820号公報には、豆腐の
製造過程で発生した豆腐粕（オカラ）を滅菌し、これに
納豆菌Bacillussp TT-52を接種し、ステンレス製金網上
に厚さ約1cmの層として載置し、37℃で48時間発酵さ
せ、その後25℃で17時間発酵させて培養することにより
MK−7を製造する方法が記載されている。

【０００５】前記（２）の方法については、特開平10-2
95393号公報 及び特開平11−32787号公報に記載されている。即ち、
特開平10-295393号公報には、ブリックス濃度を5〜10%
に調整した大豆煮汁に3〜10重量%のグリセロールを添加
して滅菌し、これに納豆菌を接種し、培養温度40℃、通
気量0.5L/min、攪拌速度500rpmで4日間培養することに
よりMK−7を製造する方法が記載されている。特開平11
−32787号公報には、醤油火入れオリ7%(W/V)、グルコー
ス5%(W/V)、K₂HPO₄ 0.25%(W/V)、MgSO₄・7H₂O 0.05%(W
/V)、NaCl 2%(W/V)からなる組成の培地をpH8.0に調整し
て滅菌し、これにBacillussubtilisに属するMK-7生産菌
を接種して、ジャーファーメンターにて、培養温度40
℃、攪拌数400rpm、通気量1vvmの条件で、培養液のpH値
を2ＮのNaOHで7.0に保ちながら、48時間培養することに
よりMK−7を製造する方法が記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
た従来のMK−7の製造方法は、いずれの場合において
も、得られる培養液中のMK−7濃度が十分に高いとは言
えない。即ち、通常の市販納豆に含まれるMK−7含量は
約10〜20ppmである。これに対して、上述した公報に記
載の方法では、いずれの場合においても、得られる培養
物中のMK−7含量は、当該市販納豆中のMK−7含量と大差
ないものである。即ち、特開平8−73396号公報に記載の
方法では、培養生産物中のMK−7濃度は17.2mg/kgであ
り、特開平11−32787号公報に記載の方法では、培養生
産物中のMK−7濃度は29.8mg/kgである。また、特開平10
−295393号公報に記載の方法では、培養生産物中のMK−
7濃度は40.6mg/Lであり、特開平11−196820号公報に記
載の方法では、培養生産物中のMK−7濃度は、豆腐粕
（オカラ）発酵物1g当たり29636ng（即ち、29.6mg/kg）
である。特開平8-19378号公報に記載には、培養生産物
中のMK−7の濃度は11.7mg/100ml（即ち117mg/L）である
旨記載されているが、この値は途方もなく高い濃度であ
り、当該公報に記載された内容の方法で達成できるもの
とは到底考えられない。因みに、本発明者らが当該公報
に記載の方法に従って、後述する比較例３に記載の追試
を行った結果、得られた培養液中のMK-7濃度は10.3mg/L
であった。このことから、当該公報に記載の方法ではそ
こに記載のMK-7濃度117mg/Lを達成できないことが判明
した。従って、これらの従来のMK−7の製造方法は、い
ずれの場合においても得られる培養液中のMK−7濃度が
低く、工業的製造方法として十分なものとは言えない。

【０００７】更に、上述した特開平11−32787号公報に
記載のMK−7の製造方法においては、醤油中に溶存する
タンパク質を主たる構成成分とする醤油火入れオリに、
グルコース、K₂HPO₄、MgSO₄・7H2O、及びNaCl を栄養成
分として添加した培地を必要とする。また、上述した特
開平10-295393号公報に記載のMK−7の製造方法において
は、ブリックス濃度を5〜10%に調整した大豆煮汁に1重
量%以上のグリセロールを添加した培地を必要とする。
このように大豆由来の材料に特定の化学物質を加えて使
用することは、製品の製造コストを引き上げてしまう。
従って、これらのMK−7の製造方法は、上述したように
培養液中のMK−7濃度が低い上に、経済的な面でも問題
がある。こうしたことから、容易に入手することができ
て、比較的安価な単一の材料のみを培地に使用し、他に
栄養成分を添加することなくして、MK−7の高収率での
生産を可能にするMK−7の製造方法の早期提供が切望さ
れている。本発明は，上述した課題に鑑みて、本発明者
らが鋭意研究の結果完成に至ったものである。本発明の
主たる目的は，従来のMK−7の製造方法における上述の
問題点を解決し上述の要望を叶える、MK−7を効率的且
つ高収率で得る製造方法を提供することにある。本発明
の他の目的は、大麦を使用する蒸留酒の製造において副
生する蒸留残液を固液分離して得られる液体分を主たる
構成成分とする培地のみを用い、他の栄養成分の使用を
一切必要としない簡便なMK−7の効率的な製造方法を提
供することにある。本発明の方法により製造されるMK−
7含有物質は、MK−7濃度の十分高いものであり、そのま
ま食品として或いはビタミン剤として使用することがで
きる。本発明の方法により製造される該MK−7含有物質
は、公知の精製方法により精製して、高純度のMK−7含
有物質とすることができる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、多くの場
合、廃棄に付される大麦焼酎蒸留残液の使用が、従来の
MK−7の製造方法における上述した問題点の解決を図れ
るのではないかとの推測に立って、実験を介して鋭意研
究を行った。即ち、本発明者らは、大麦を使用する焼酎
製造において副生する焼酎蒸留残液を固液分離して、ア
ミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを
含有する液体分を得、該液体分のみを培地に用いて、Ba
cillus subtilisに属するMK−7生産菌である納豆菌の培
養を行った。その結果、前記液体分に、他の栄養成分を
何ら添加することなくして、従来から納豆菌の培養の際
に一般的に用いられてきた大豆煮汁、グリセロールを添
加した大豆煮汁、豆腐粕、蒸煮大豆、或いは醤油火入れ
オリを添加した合成培地などを培地に用いた場合と比較
して、増殖菌体の量が著しく増加するだけでなく、培養
液中において納豆菌が生産するMK−7の濃度も飛躍的に
高まることが判明した。

【０００９】そこで、本発明者らは、大麦焼酎と同様に
原料に大麦を用いるウイスキーの製造において副生する
ウイスキー蒸留残液から得た培地においても同様の効果
が得られるのではないかと考えて次の実験を行った。即
ち、大麦を使用するウイスキーの製造において副生する
ウイスキー蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体
分に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得、該
調製液を滅菌処理することにより得られた培地を用い
て、Bacillus subtilisに属するMK−7生産菌である納豆
菌の培養を行った。その結果、前記液体分に、他の栄養
成分を何ら添加することなくして、従来から納豆菌の培
養の際に一般的に用いられてきた大豆煮汁、グリセロー
ルを添加した大豆煮汁、豆腐粕、蒸煮大豆、或いは醤油
火入れオリを添加した合成培地などを培地に用いた場合
と比較して、増殖菌体の量が著しく増加するだけでな
く、培養液中において納豆菌が生産するMK−7の濃度も
飛躍的に高まることが判明した。

【００１０】以上の結果から，大麦を使用する蒸留酒の
製造において副生する蒸留残液を固液分離して、アミノ
酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有
する液体分を得、該液体分に含まれる酸を実質的に中和
処理して調製液を得、該調製液を培地に用いて、Bacill
us subtilisに属するMK−7生産菌を培養して培養液を得
ることにより、該培養液中のMK−7濃度が極めて高いMK
−7含有物が得られ，上記本発明の目的が達成できるこ
とが判明した。

【００１１】本発明は、上述の判明した事実に基づいて
完成に至ったものである。以下に、本発明の好ましい態
様について述べるが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。本発明のMK−7の製造方法は、大麦を使用す
る蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離し
て、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロ
ールを含有する液体分を得る第1の工程、該液体分に含
まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得る第2の工
程、該調製液を培地に用いてBacillus subtilisに属す
るMK−7生産菌を培養する第3の工程からなるものであ
る。以下に、本発明のMK−7の製造方法を実施する際に
原料として用いる蒸留残液、及び各工程について詳述す
る。

【００１２】本発明において言う蒸留残液は、（イ）大
麦又は精白大麦を原料として大麦麹、及び蒸麦を製造
し、得られた大麦麹、及び蒸麦中に含まれるでんぷんを
麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、さらに酵母に
よるアルコール発酵を行い熟成もろみを得、得られた熟
成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用い
て蒸留する際に蒸留残さとして副生するもの、及び
（ロ）大麦を原料として麦芽を製造し、得られた麦芽中
に含まれるでんぷんを麦芽、及び／又は酵素剤を使用し
て糖化し、さらに酵母によるアルコール発酵を行い熟成
もろみを得、得られた熟成もろみをポットスチルまたは
パテントスチル等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留
残さとして副生するものを意味する。このような蒸留残
液としては、代表的には例えば大麦焼酎あるいはウイス
キーの製造における蒸留残液が挙げられる。ウイスキー
の製造における蒸留残液の場合は、大麦麦芽だけを原料
とするモルトウイスキーは勿論のこと、未発芽穀類を主
原料とするグレインウイスキーにおいても一部に大麦麦
芽を使用する場合に副生するウイスキー蒸留残液も本発
明において言う蒸留残液に包含される。また焼酎の製造
における蒸留残液の場合は、米焼酎、甘藷焼酎、そば焼
酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の
一部として大麦を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液
も本発明において言う蒸留残液に包含される。

【００１３】このように本発明のMK−7の製造方法にお
いて使用する、蒸留残液から得られる培地は、大麦、大
麦麹、麦芽及び酵母に由来する成分を含有するものであ
る。即ち、本発明において使用する蒸留残液から得られ
る培地は、従来のMK−7の製造に用いられる、大豆煮
汁、蒸煮大豆、豆腐粕、及び醤油火入れオリなどの大豆
に由来する材料の液体培地または固体培地とは全く異な
るものである。この点具体的には、表1に示すように、
本発明において用いる大麦を使用する焼酎製造で副生す
る大麦焼酎蒸留残液は、粗タンパク質(食品のタンパク
質量を測定する場合、窒素含量を測定し、その値に窒素
−タンパク質換算計数を乗じて算出した量のこと)が 約
4%であり、主なアミノ酸として、プロリン、ロイシン、
アルギニン、アラニン、及びグルタミン酸を含有する。
且つ、該大麦焼酎蒸留残液は、焼酎製造における発酵過
程において生産されるグリセロール、クエン酸、酢酸、
及び乳酸、あるいは大麦に由来するポリフェノールなど
の納豆菌の培養に好ましい栄養成分を含有する。よって
本発明のMK−7の製造方法において使用する培地は、従
来のMK−7製造方法において使用する培地から客観的に
区別される明らかに別異のものである。

【００１４】ところで、上述の特開平10-295393号公報
に記載のMK−7の製造方法においては、ブリックス濃度
を5〜10%に調整した大豆煮汁に1重量%以上のグリセロー
ルを添加した培地を用いることにより、培養液中のビタ
ミンＫ（MK−7）含量が高まる旨記載されている。一
方、表1から明らかなように、本発明において用いる大
麦を使用する焼酎製造で副生する大麦焼酎蒸留残液は、
それ自体既に1.3%のグリセロールを含有する。従来のMK
−7の製造方法における培地に使用する上述した大豆由
来の材料は、こうした化合物は含有しておらず、当該化
合物は該大豆由来の材料に別途添加されるものである。
よって、本発明においては、MK−7の培地中での生産量
を高めるについて、従来技術におけるようにグリセロー
ルを添加する必要は全くない。即ち、本発明においては
グリセロールを別途添加することなくして、MK−7の生
産量の向上が達成される。

【００１５】本発明において、蒸留酒の製造における蒸
留工程で得られた蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、
ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する
液体分を得る第1の工程は、蒸留残液から原料大麦、麹
あるいは麦芽由来の水不溶性の発酵渣を除去し、液体分
を得ることを目的として行うものである。この第1の工
程における当該固液分離は、スクリュープレス方式やロ
ーラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ
過圧搾式の固液分離機を用いて行うことが出来る。第1
の工程で得られた前記液体分に含まれる酸を実質的に中
和処理して調製液を得る第2の工程においては、適当な
中和剤を用いて中和処理することができ、こうした中和
剤としては，水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を使
用することができる。

【００１６】第2の工程で得られる前記調製液を培地に
用いてBacillus subtilisに属するMK−7生産菌を培養す
る第３の工程においては、該MK−7生産菌としては、Bac
illussubtilisに属するMK−7生産能を有する菌株であれ
ばいずれの菌株であっても用いることができる。特に好
ましくは、Bacillus subtilisに属する代表的なMK−7生
産菌である納豆菌を用いることができる。該納豆菌の具
体例としては、市販納豆菌である成瀬菌、宮城野菌、及
び高橋菌等を挙げることができる。これらの他に、MK−
7生産能の高い納豆菌菌株を用いることもできる。前記
培地を用いた該納豆菌の培養は、公知の液体培養法によ
り行うことができるが、好ましくは、ジャーファーメン
ターなどを用いた通気攪拌培養により、培養温度40℃〜
50℃の温度範囲で行うことが望ましい。この際、培養中
の培養液のpH値は水酸化ナトリウム等を用いて7.0程度
に保持するのが好ましい。

【００１７】本発明においては、前記第３の工程におい
て得られる納豆菌の培養液、即ちMK−7を含有する培養
液は、そのままMK−7含有製品として成立できるもので
ある。しかしながら、該培養液からMK−7のみを分離精
製する必要がある場合には、該MK−7を含有する培養液
からMK−7を抽出することができる。その場合のMK−7を
抽出する方法としては、例えば特開平8-73396号公報に
記載されている、アルコールやエーテルなどの有機溶媒
を用いる溶媒抽出法、活性炭を用いた吸着分別法、分子
蒸留や水蒸気蒸留等の高真空蒸留を用いる蒸留法、合成
吸着剤などを用いたクロマトグラフィー法等を用いるこ
とができる。この他、特開平11-32787号公報に記載され
ている、限外濾過膜や逆浸透膜を用いた分離濃縮法、及
び乾燥操作により脱水する方法を用いることができる。
この場合、有機溶媒の不存在下で脱水処理することによ
り、光に対する安定性の優れたMK−7含有物を得ること
ができる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが，本発明はこれらの実施例によって何ら限定され
るものではない。

【００１９】

【実施例1】1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製 大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロ
リットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュー
プレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリッ
トルの液体分を得，該液体分に水酸化ナトリウムを加え
てそのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液
を得た。得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の
培地を得た。 2．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た溶液に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 3．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た培地1Lと上
記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、
攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を
行った。これにより、MK−7を含有する納豆菌培養液を
得た。なお、培養により生産するMK-7（ビタミンK）は
光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメ
ンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行っ
た。

【００２０】

【比較例1】本比較例においては、実施例1において使用
する大麦焼酎蒸留残液から得た液体分に代えて、納豆製
造時に副生する大豆煮汁廃液を使用する以外は、実施例
1と同様にしてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。 １．大豆煮汁廃液からの培地の調製 納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に水酸化ナトリウ
ムを加えてそのpH値を7.0に調整して調整液を得、得ら
れた調整液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。 ２．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た溶液に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 ３．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと前
記２で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vv
m、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培
養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液
を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により
分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの
周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２１】

【比較例2】本比較例においては、上述した従来のMK-7
製造方法の中で、大豆煮汁廃液にグリセロールを添加す
ることにより、得られた培養液中のMK−7濃度を高める
ことができる旨記載されている特開平10-295393号公報
に記載の方法に従って、納豆菌培養液を得た。即ち、実
施例1において使用する大麦焼酎蒸留残液から得られる
液体分に代えて大豆煮汁廃液にグリセロールを添加した
ものを使用する以外は、実施例1と同様にしてMK−7を含
有する納豆菌培養液を得た。 １．大豆煮汁廃液からの培地の調製 ブリックス濃度を10%に調整した大豆煮汁廃液に５重量
％のグリセロールを添加し、得られた液体に水酸化ナト
リウムを添加してそのpH値を7.0に調整して調整液を得
た。得られた調整液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地
を得た。 ２．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 ３．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと前
記２で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vv
m、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培
養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液
を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により
分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの
周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２２】

【実施例2】上述した従来のMK-7製造方法の中で、最も
高いMK-7濃度を達成できる旨述べている特開平8-19378
号公報に記載の方法に従って、納豆菌培養液を得た。但
し、本実施例においては当該公報に記載の納豆製造時に
副生された大豆煮汁廃液の代わりに、本発明において使
用する大麦焼酎蒸留残液から得られた培地を用いた。即
ち、大麦焼酎製造における蒸留工程で得られた焼酎蒸留
残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製の
スクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.
8キロリットルの液体分を得、該液体分に水酸化ナトリ
ウムを添加してそのpH値を7.0に調整して約0.9キロリッ
トルの調整液を得た。該調整液100mlを500ml容の三角フ
ラスコに導入した後、綿栓をし、オートクレーブにて12
1℃×20minで蒸気加圧滅菌を行い、培地を得た。該培地
にO.D.660nmが10.0の納豆菌胞子を無菌的に10μl接種
し、48℃において120rpmで4日間振盪培養を行なうこと
によりMK−７を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培
養により生産されるMK−7は光により分解する恐れがあ
るため、前記三角フラスコの周囲を予めアルミホイルで
覆って培養を行った。

【００２３】

【比較例３】本比較例では、特開平8-19378号公報に記
載の方法に従って納豆菌培養液を得た。即ち、納豆製造
時に副生された大豆煮汁廃液に水酸化ナトリウムを添加
してそのpH値を7に調整して調整液を得た。該調整液を5
00ml容の三角フラスコに100ml導入した後、綿栓をし、
オートクレーブにて121℃×20minで蒸気加圧滅菌を行
い、培地を得た。該培地にO.D.660nmが10.0の納豆菌胞
子を無菌的に10μl接種し、48℃において120rpmで4日間
振盪培養を行うことによりMK−7を含有する納豆菌培養
液を得た。なお、培養により得られるMK−7は光により
分解する恐れがあるため、前記三角フラスコの周囲を予
めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２４】

【MK-7の定量】実施例1、実施例2、比較例1、比較例2、
及び比較例３で得られたそれぞれの納豆菌培養液中のMK
−7濃度を以下の方法により定量した。即ち、実施例1、
実施例2、比較例1、比較例2、及び比較例３で得られた
それぞれの納豆菌培養液について、その1.5mlに、1.5ml
のイソプロピルアルコールと5mlのヘキサンを添加し、
振とう後、1710g×10minの条件で遠心分離を行い、有機
層と水層を得、該有機層4mlを回収し、該有機層4ml中に
含まれるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除い
た後、残った黄褐色の油を97%エタノール500μlに溶解
し、以下に示す条件の高速液体クロマトグラフィーを用
いてMK−7濃度を定量した。即ち、カラムにInertsil OD
S 4.6×250mm（GLサイエンス社製）、ポストカラムに白
金-アルミナ触媒（ビーズ）カラム4.6×50mm（白金-ア
ルミナビーズは和光純薬工業株式会社製）を用い、97%
エタノールを溶離液として、流速0.7ml/min、カラム温
度40℃、サンプル注入量10μlとし、蛍光検出器（励起3
20nm、蛍光430nm）を用いて分析を行った。なお、MK−7
の検量線作成のために、100ppmのMK-7標準試料を用い
た。得られた結果を表2乃至表4に示す。

【００２５】

【評価1】前記実施例1、比較例1及び比較例2で得られた
培養液中のMK−7の定量結果を表2に示す。表2に示した
結果から明らかなように、実施例1で得られた培養液中
のMK−7濃度が83.1mg/lであったのに対して、比較例1で
得られた培養液中のMK−7濃度は12.2mg/l、比較例2で得
られた培養液中のMK−7濃度は33.8mg/l、であった。即
ち、実施例1で得られた培養液中のMK−7濃度は、比較例
1で得られた培養液中のMK-7濃度の約6.8倍に達し、比較
例2で得られた培養液中のMK−7濃度の約2.5倍に達する
ことが判明した。即ち、大麦焼酎製造における蒸留工程
で得られた焼酎蒸留残液から得られた培地を用いた場合
には、納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液から得られ
た培地を用いた場合に比べて、得られる培養液中のMK−
7濃度は顕著に高まることが判明した。

【００２６】

【評価2】前記実施例2及び比較例３で得られた培養液中
のMK-7の定量結果を表3に示す。表3に示した結果から明
らかなように、実施例2の大麦焼酎製造における蒸留工
程で副生する大麦焼酎蒸留残液から得られた培地を用い
ることにより得られた培養液中のMK−7濃度が22.3mg/l
であったのに対して、比較例３の特開平8-19378号公報
に記載の方法により得られた培養液中のMK−7濃度は10.
3mg/lであった。即ち、特開平8-19378号公報に記載の方
法によれば、培養生産物中のMK−7の濃度は11.7mg/100m
l（すなわち117mg/L）である旨記載されているが、この
値は途方もなく高い濃度であり、当該公報に記載の方法
により達成することは全く不可能であることが判った。
また、大麦焼酎製造における蒸留工程で得られた焼酎蒸
留残液から得られた培地を用いた場合には、納豆製造時
に副生された大豆煮汁廃液から得られた培地を用いた場
合に比べて、得られる培養液中のMK−7濃度は、顕著に
高まることが判明した。

【００２７】

【実施例3】本実施例においては、実施例１において使
用する大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸
留残液の液体分に代えて、モルトウイスキー製造におけ
る蒸留工程で得られたウイスキー蒸留残液を固液分離し
て得られる液体分を使用する以外は、実施例１と同様に
してMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。 1．ウイスキー蒸留残液からの培地の調製 モルトウイスキー製造における蒸留工程で得られたウイ
スキー蒸留残液を固液分離して液体分を得，該液体分に
水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整する
ことにより調整液を得、得られた調整液を滅菌処理して
納豆菌培養用の培地を得た。 2．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た溶液に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 3．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た培地1Lと上
記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、
攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を
行った。これにより、MK−7を含有する納豆菌培養液を
得た。なお、培養により生産するMK−7は光により分解
する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲
を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２８】

【比較例４】本比較例においては、実施例４において使
用するモルトウイスキー製造における蒸留工程で得られ
たウイスキー蒸留残液を固液分離して得られる液体分に
代えて、大豆煮汁廃液を使用する以外は、実施例3と同
様にしてMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。 1．大豆煮汁廃液からの培地の調製 納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に水酸化ナトリウ
ムを添加してそのpH値を7.0に調整し、得られた調整液
を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。 2．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た溶液に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 3．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと上
記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、
攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を
行った。これにより、MK−7を含有する納豆菌培養液を
得た。なお、培養により生産するMK−7は光により分解
する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲
を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２９】

【評価3】実施例3及び比較例４で得られたそれぞれの培
養液について、上述したMK−7の定量法によりMK−7濃度
の測定を行った。その結果、実施例3で得られた培養液
のMK−7濃度は、比較例4で得られた培養液中MK-7濃度よ
りも顕著に高いことが判った。即ち、ウイスキー製造の
蒸留工程で副生するウイスキー蒸留残液から得られた培
地を用いた場合には、納豆製造時に副生された大豆煮汁
廃液から得られた培地を用いた場合に比べて、得られる
培養液中のMK−7濃度が顕著に高まることが判明した。

【００３０】以上の結果から、本発明の大麦を使用する
蒸留酒の製造において副生する蒸留残液から得られた培
地を用いることを特徴とするMK−7含有物質の製造方法
によれば、従来のMK−7製造方法に比べてMK−7濃度が飛
躍的に高いMK−7高含有物が得られることが判明した。

【００３１】

【実施例4】実施例1及び実施例2で得られたそれぞれの
納豆菌培養液からMK-7を含有する油状物質を抽出した。
即ち、実施例1及び実施例2で得られたそれぞれの納豆菌
培養液に、該納豆菌培養液と同量のイソプロピルアルコ
ールを導入し、次に該納豆菌培養液の３倍量のヘキサン
を導入し、振とう後、1710g×10minの条件で遠心分離を
行い、有機層と水層を得、該有機層を回収後、該有機層
に含まれるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除
くことにより、アンモニアを全く含まない黄褐色の油状
物質を得た。

【００３２】

【比較例5】比較例1、比較例2及び比較例3で得られたそ
れぞれの納豆菌培養液からMK-7を含有する油状物質を抽
出した。即ち、比較例1、比較例2 及び比較例3で得られ
たそれぞれの納豆菌培養液に、該納豆菌培養液と同量の
イソプロピルアルコールを導入し、次に該納豆菌培養液
の３倍量のヘキサンを導入し、振とう後、1710g×10min
の条件で遠心分離を行い、有機層と水層を得、該有機層
を回収後、該有機層に含まれるヘキサンをエバポレータ
ーを用いて完全に除くことにより、アンモニアを全く含
まない黄褐色の油状物質を得た。

【００３３】

【評価4】前記実施例4及び前記比較例5で得た、実施例
1、実施例2、比較例1、比較例2及び比較例3 の夫々にお
いて得た納豆菌培養液から抽出したそれぞれの油状物質
について、重量を測定し、さらに上述したMK-7の定量法
によりMK-7濃度を測定した。得られた測定結果を表4に
示す。表4に示した結果から以下の事実が判明した。 （１）表4から明らかなように、 実施例1の培養液から
得た油状物質中のMK-7濃度は、19786ppmであったのに対
して、比較例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度
は1258mg/lであり、比較例2の培養液から得た油状物質
中のMK-7濃度は3414mg/lであった。即ち、実施例1の培
養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、比較例1の培養
液から得た油状物質中のMK-7濃度の約15.7倍であり、比
較例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の約5.8倍
であることが判明した。 （２）同様に、実施例2の培養液から得た油状物質中のM
K-7濃度は5186ppmであったのに対して、比較例3の培養
液から得た油状物質中のMK-7濃度は1084mg/lであった。
即ち、実施例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度
は、比較例3の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の
約4.8倍であることが判明した。 以上のことから、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生
する焼酎蒸留残液から得られた培地を使用した場合に
は、大豆煮汁廃液から得た培地、或いは大豆煮汁廃液に
グリセロールを添加することにより得た培地を用いた場
合に比べて、MK-7を高含有する油状物質が得られること
が判明した。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】

【表４】

【００３８】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明のMK-7含有
物の製造方法によれば、以下の効果を奏する。即ち、大
麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を
固液分離して、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及
びグリセロールを含有する液体分を得、該液体分に含ま
れる酸を実質的に中和して調製液を得、該調製液を滅菌
処理することにより得られた培地を使用して、Bacillus
subtilisに属するMK−7生産菌を培養することにより、
該培地に他の栄養成分を一切添加することなくしてMK−
7濃度の極めて高いMK-7含有物を効率的に安定して得る
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図1】 本発明のMK-7の製造工程を模式的に示す製造
工程図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平11−131399（ＪＰ，Ａ) 特開2001−204459（ＪＰ，Ａ) 特開2001−204400（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−32787（ＪＰ，Ａ) 特開2001−136959（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−73396（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 3/00 - 11/00 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項1】 大麦を使用する蒸留酒の製造において副
   生する蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフェノ
   ール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分を
   得、該液体分に含まれる酸を実質的に中和処理して得ら
   れる調製液を培地に使用し、Bacillus subtilisに属す
   るメナキノン−7生産菌を培養することを特徴とするメ
   ナキノン−７含有物質の製造方法。
2. 【請求項2】前記蒸留残液が大麦を使用する焼酎の製造
   において副生する蒸留残液である請求項1に記載のメナ
   キノン−７含有物質の製造方法。
3. 【請求項3】前記が蒸留残液が大麦を使用するウイスキ
   ーの製造において副生する蒸留残液である請求項1に記
   載のメナキノン−７含有物質の製造方法。
4. 【請求項４】前記メナキノン−7含有物質を精製して高
   純度のメナキノン−7含有物質にする工程を包含する請
   求項１乃至３のいずれかに記載のメナキノン−7含有物
   質の製造方法。