JP5921883B2 - 微生物醗酵による14−デヒドロエルゴステロールの生産法 - Google Patents
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Description
(1) アスペルギルス(Aspergillus)属、モナスカス(Monascus)属、リゾプス(Rhizopus)属、ペニシリウム(Penicillium)属及びサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する微生物を培地にて培養し、産生された14−デヒドロエルゴステロールを回収することを含むことを特徴とする、14−デヒドロエルゴステロール(14-DHE)の製造方法。
(2) 前記培養が液体培養であることを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(3) 前記微生物が、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae), アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae), アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari), アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori), アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus), アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii), アスペルギルス・フェニシス(Aspergillus phoenicis), アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger), モナスカス・ピロサス(Monascus pilosus), モナスカス・プルプレアス(Monasucus purpureus), モナスカス・ラバー(Monasucus rubber), リゾプス・アジゴスポラス(Rhizopus azygosporus), リゾプス・ミクロポラス(Rhizopus microporus), リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae),ペニシリウム・ロケフォルチ(Penicillium roqueforti), サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae), 及びサッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)からなる群から選択されることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記微生物が、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori), アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus), アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii), 及びアスペルギルス・フェニシス(Aspergillus phoenicis)からなる群から選択されることを特徴とする、上記(3)に記載の方法。
(5) 前記微生物の菌体が、前記培地に、初発の胞子数として104個/ml〜106個/mlで添加されることを特徴とする、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記培地が、麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼイン又はそれの混合物を含有することを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記回収が、前記微生物の培養菌体から抽出によって行われることを特徴とする、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記抽出が、アルカリ抽出又はアルコール抽出によって行われることを特徴とする、上記(7)に記載の方法。
(9) 前記抽出の前又は抽出と同時に、菌体破壊を行うことを特徴とする(8)に記載の方法。
(10) 前記抽出の前に、アルコールに培養菌体を浸漬し、その後に菌体破壊を行うことを特徴とする、上記(7)に記載の方法。
(11) 前記アルコールがイソプロパノールであることを特徴とする、上記(10)に記載の方法。
上述のように、本発明は、微生物醗酵による14-DHEの製造方法を提供する。
14-DHEは、慣用名14-デヒドロエルゴステロールであり、以下の構造式及び物理化学的特性を有する。
(2) 分子式:C28H42O
(3) 溶剤に対する溶解性:水に不溶、クロロホルムに易溶
(4) 紫外部吸収スペクトル(MeCN):391nm
(5) 1H-NMR(CD3OD)ppm: 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz)
(6) 13C-NMR(CD3OD)ppm: 149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s), 120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s)
(7) 例えばDevelosil C30-UG-5(10×250mm)(野村化学社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(アセトニトリル/イソプロパノール=99/1)にかけた場合、保持時間約32.5〜33.5分に溶出する。
2.1 菌類
本発明者らは、後述の表1に示される微生物のなかで14-DHE高生産種及び高生産株の探索を行った結果、以下の微生物、すなわち、アスペルギルス(Aspergillus)属、モナスカス(Monascus)属、リゾプス(Rhizopus)属、ペニシリウム(Penicillium)属及びサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する微生物が14-DHEを生産することを見出した。
上記微生物の菌種又はその胞子を栄養培地中で液体培養又は固体培養し、菌体内に14-DHEを産生させる。以下では、そのような培養条件について説明する。
14-DHEは、上記の培養により微生物菌体内に産生される。菌体内から14-DHEを回収する手法の例は、以下のとおりである。
(a) 初発の胞子数を104個/ml〜106個/mlで培地に添加すること、
(b) 麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼインなどに代表される富栄養窒素源を含有する培地を使用すること、
(c) 抽出時にはイソプロパノール中に一定時間浸漬した後に菌体破壊を行うこと、
などによって、14-DHEの高生産をもたらすことができる。
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。
[14-DHE高産生株のスクリーニング]
本出願人の出願(WO2010/150867)において14-DHEが極めて効果の高い免疫調節・免疫抑制物質として発見された。一方で、14-DHEの生合成経路については未知であり、化学合成法も確立されていないことから醗酵生産を考えるにあたっては、高生産種あるいは高生産株の同定が非常に有用である。そのため下記に示すような方法により、14-DHE高生産種及び高生産株の探索を行った。
(1) 固体培養、抽出、分析
下記の表1に示すAspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamari, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus niger, Monascus pilosus, Monasucus purpureus, Monasucus rubber, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microporus, Rhizopus oryzae, Penicillium candidum, Penicillium roquefortiについてポテトデキストロース寒天培地 (Difco, BD)に植菌し、25℃で7日間静置培養、Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianusについてはYPD寒天培地(2% glucose(wako), 1% yeast extract(Difco), 2% bacto peptone(Difco), 1.5% bacto peptone(Difco))に植菌し、25℃で静置培養した。なお、表中の菌株はIFO=財団法人醗酵研究所から、JCM=Japan Collection of Microorganisms(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター)から、ATCC=American Type Culture Collectionから、IAM=東京大学分子細胞生物学研究所からそれぞれ分譲されたものである。培養した菌体を回収し、イソプロパノールにて超音波抽出を行った。抽出液とヘキサンを液々分配し、ヘキサン画分を回収した。抽出物について、HPLCにて溶媒をヘキサン/イソプロパノール(=99/1)、カラムを、流速を1ml/分の条件で14-DHEの含有量を測定した。
39株について14-DHEの産生について解析した結果、Penicillium candidumを除くほぼ全ての菌種において産生が確認された(図1)。その結果、14-DHEは幅広い一般的な糸状菌からで産生されるものと言える。特にAspergillus awamori, Aspergillus foeditus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus kawachiiといった酒類製造種麹に多い傾向が確認された。その産生量は、WO2010/150867において14-DHEの発見に至ったAOK1597(図1の棒グラフ黒)と比しても同等以上の株が多く、これらのAspergillus種は14-DHE高産生種として結論するに至った。Barton,DHR.とBruun,T.(J.Chem.Soc.,2728-2733(1951))においてAspergillus nigerが14-DHEを産生することが知られているが、対照として試験したAspergillus niger NBRC4066株がAOK1597株の半分に満たない産生量であることからも、上記のAspergillus種の高産生能は明らかである。中でも、Aspergillus awamori(NBRC4033及び4125), Aspergillus foetidus NBRC4312, Aspergillus kawachii (NBRC4308), Aspergillus phoenicis (NBRC7523)株に至ってはAOK1597株と比して5倍以上の極めて高い産生が得られたため、これらの株は14-DHE高生産種の中でも特に実生産に適した高生産株であると言える。
[14-DHE液体培養からの生産法]
14-DHEは、WO2010/150867において小麦フスマにAspergillusカビを生やした固体培養にて生産を行ってきた。一方で固体培養法はハンドリングの点で難があり、スケールアップに適さず、抽出・精製にかかるコストも非常に大きい。そのため、極力余分な成分を含まずに抽出・精製を行う目的で液体培養法の開発を行い、下記のような生産法を確立するに至った。
14-DHE高生産株であるAspergillus kawachii (NBRC4308株)について高効率な抽出方法の検討を行った。ポテトデキストロース培地(Difco)で7日間120rpm、25度で振盪培養を行った。培養菌体を回収後、20%(w/v)水酸化カリウムで煮沸処理、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、ジクロロメタン/メタノール(=80/20)で超音波処理、イソプロパノールにて一晩浸漬後、超音波処理を行い、抽出液とする。抽出液についてヘキサンと分配を行い、ヘキサン画分に含まれる14-DHEの含有量を測定した。
(1) 14-DHEの抽出方法の検討を行った結果、イソプロパノールに浸漬後、超音波抽出する方法が最も効率よく抽出できた(図2)。
(2) 胞子添加数を103〜106個/mlの間で濃度を振って14-DHEの産生量を確認した結果、104個/mlで生産量が103個/ml時と比して3倍となり、105個/mlで7.5倍と極大量となり、106個/mlにおいても5.5倍の生産量を維持していた(図3)。
(3) 培地組成の違いによる14-DHEの産生量を検討した結果、モルトエクストラクト、イーストエクストラクト、ソイビーンカゼイン培地において、ポテトデキストロース培地を遥かに凌駕する産生量が確認され、14-DHEの産生においてはこれらの富栄養培地で液体培養を行うことにより、非常に効率よく生産が可能であることが証明された(図4)。
(4) 培養時間ごとの14-DHEの産生量を検討した結果、168時間までは非常に産生量が増加する事が判明した。168〜240時間の間も産生量が増大したが、比較的増大速度は緩やかになった。72時間時と比して、168時間以上では10倍以上の生産量であったことから、十分な生産には7日以上の培養が適していることが証明された。
(5) 小麦フスマAspergillus awamori AOK1597株醗酵物からイソプロパノール抽出し、ヘキサンと液液分配を行ったヘキサン画分を高速液体クロマトグラフィーにかけたものが図5中、固体培養(図5B)と示したものである。C30-UG-5(10x250mm)(野村化学社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(アセトニトリル/イソプロパノール=99/1)に分析した。この方法では14-DHEの溶出ピークの直前に副産物の大きなピークが存在しており(NMR解析により、副産物は(3β,5α,22E)-Ergosta-7,22,24(28)-trien-3β-olであると判明した。)、精製の際の大きな障害となっていた。一方、液体培養(図5A)ではこの混入ピークの生成が最小限に抑えられており、効率的な生産ができることが明らかとなった。
Claims (9)
- アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物、並びにモナスカス・ピロサス(Monascus pilosus)、モナスカス・プルプレアス(Monasucus purpureus)、モナスカス・ラバー(Monasucus rubber)、リゾプス・アジゴスポラス(Rhizopus azygosporus)、リゾプス・ミクロポラス(Rhizopus microporus)、リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)、ペニシリウム・ロケフォルチ(Penicillium roqueforti)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、及びサッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)からなる群から選択される微生物を、麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼイン又はそれの混合物を含有する培地にて液体培養し、産生された14−デヒドロエルゴステロールを回収することを含むことを特徴とする、14−デヒドロエルゴステロールの製造方法。
- 前記液体培養において、前記微生物の菌体が、前記培地に、初発の胞子数として104個/ml〜106個/mlで添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 初発の胞子数が10 5 個/ml〜10 6 個/mlである、請求項2に記載の方法。
- 前記回収が、前記微生物の培養菌体から抽出によって行われ、前記抽出の前又は抽出と同時に、菌体破壊を行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・フェニシス(Aspergillus phoenicis)、及びアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori), アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus), アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii), 及びアスペルギルス・フェニシス(Aspergillus phoenicis)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抽出が、アルカリ抽出又はアルコール抽出によって行われることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抽出の前に、アルコールに培養菌体を浸漬し、その後に菌体破壊を行うことを特徴とする、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルコールがイソプロパノールであることを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
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