WO2023234307A1 - エルゴチオネイン生産性を高めるように改変された核酸、並びに遺伝子改変された微生物 - Google Patents

エルゴチオネイン生産性を高めるように改変された核酸、並びに遺伝子改変された微生物 Download PDF

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WO2023234307A1
WO2023234307A1 PCT/JP2023/020131 JP2023020131W WO2023234307A1 WO 2023234307 A1 WO2023234307 A1 WO 2023234307A1 JP 2023020131 W JP2023020131 W JP 2023020131W WO 2023234307 A1 WO2023234307 A1 WO 2023234307A1
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region
amino acid
ergothioneine
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遼子 田嶋
惠一 市川
考太郎 伊藤
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キッコーマン株式会社
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Definitions

  • the present disclosure relates to a nucleic acid modified to increase ergothioneine (hereinafter sometimes referred to as ERG) productivity, and a microorganism genetically modified to increase ERG productivity.
  • ERG ergothioneine
  • the present invention also relates to a method for producing ERG using genetically modified microorganisms.
  • Ergothioneine was discovered as a sulfur-containing amino acid isolated from Claviceps purpurea, and has also been found to exist in living organisms of plants and animals. However, plants and animals cannot synthesize ergothioneine, and ergothioneine in living organisms is thought to be derived from ergothioneine synthesized by microorganisms such as basidiomycetes. In particular, it is also contained in some edible mushrooms of the Basidiomycete family, such as oyster mushrooms, shiitake mushrooms, maitake mushrooms, and eryngii mushrooms, and is known to be particularly contained in large amounts in Tamogitake mushrooms.
  • Ergothioneine is known to have a biosynthetic pathway from histidine, and the sulfur atom is supplied from cysteine. Ergothioneine has high antioxidant properties, and has been reported to have elastase and tyrosinase inhibitory effects, and is attracting particular attention in the beauty and food fields such as skin whitening and wrinkle prevention. Furthermore, it has been found that ergothioneine is involved in the biological oxidative defense system, and attempts are being made to apply it in the medical field. Ergothioneine has high thermal stability and pH stability, and can maintain its antioxidant effect even at high temperatures.In addition to being added to foods for its physiological effects, it is also expected to be used in foods as an antioxidant. has been done.
  • Methods for producing ergothioneine include extraction from basidiomycetes such as Tamogitake, chemical synthesis, and fermentation using microorganisms. Extraction from basidiomycetes such as Tamogitake takes time to obtain raw materials and is not suitable for mass production. Although chemical synthesis is suitable for mass production, it requires the use of expensive synthetic reagents and also has the problem of high purification costs (Patent Document 1). Therefore, fermentation using bacteria or yeast capable of converting C1 compounds (Patent Document 2, Non-Patent Document 1), and fermentation using a microorganism overexpressing the ergothioneine biosynthetic gene (Patent Document 3) are methods of production. It is a promising method in that it can be used as a microbial fermentation product as it is, or as an extract obtained by a simple extraction procedure.
  • the purpose is to increase ERG productivity in ERG production by microbial culture.
  • the present inventors conducted intensive research with the aim of increasing the ERG productivity of Aspergillus aspergillus and found that ergothioneine productivity was enhanced by introducing a specific genetic mutation into a gene whose function is unknown. This led to the present invention.
  • the invention therefore relates to: [1] In the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, which includes the conserved region included in SEQ ID NO: 1, the function of the functional domain is added to the region included in the functional domain corresponding to the functional domain W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1. or a nucleic acid encoding a sequence having at least 90% identity to said sequence, which enhances ergothioneine production when introduced into an ergothioneine-producing microorganism.
  • nucleic acid according to item 1 wherein the conserved region is the conserved region at positions 433 to 440 of SEQ ID NO: 1.
  • the mutation that modulates the function of the functional domain is a deletion of a region included in a functional domain corresponding to functional domains W404 to Q515.
  • the nucleic acid according to item 1, wherein the deleted region includes a position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid according to item 1, wherein the deleted region consists of a deletion of 1 to 120 amino acids.
  • the deleted region is at least one region selected from the group consisting of positions 427 to 429, positions 427 to 440, positions 427 to 444, and positions 419 to 444 of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid according to item 4 which is a corresponding region.
  • the deleted region corresponds to at least one region selected from the group consisting of positions 431 to 475, positions 419 to 475, and positions 404 to 515 of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid according to item 1 wherein the mutation that modulates the function of the functional domain has a mutation in G at the position corresponding to position 428 and/or C at the position corresponding to position 459 of SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid according to item 1 wherein the nucleic acid is derived from a microorganism selected from the group consisting of the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Rasamsonia, and the genus Talaromysis.
  • a vector comprising the nucleic acid according to any one of items 1 to 9.
  • a method for producing ergothioneine which comprises culturing the microorganism according to item 11.
  • a method for producing a microorganism with enhanced ergothioneine-producing ability which comprises the steps of W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, including the conserved region from positions 433 to 440 of SEQ ID NO: 1.
  • the method comprises introducing a mutation that modulates the function of the functional domain into a region included in the functional domain corresponding to the functional domain, and the microorganism is selected from the group consisting of the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Rasamsonia, and the genus Talaromysis.
  • the above-mentioned production method which is an ergothioneine-producing microorganism.
  • the production method according to item 13, wherein the mutation that modulates the function of the functional domain is a deletion of a region included in a functional domain corresponding to the functional domains W404 to Q515.
  • the conserved region is the conserved region at positions 433 to 440 of SEQ ID NO: 1.
  • the production method according to item 14, wherein the deleted region includes a position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1.
  • the deleted region consists of 1 to 120 amino acids.
  • the deleted region is at least one selected from the group consisting of positions 428, 427 to 429, 427 to 440, 427 to 444, and 419 to 444 of SEQ ID NO: 1.
  • the manufacturing method according to item 16 wherein the region corresponds to the region.
  • the deleted region corresponds to at least one region selected from the group consisting of positions 431 to 475, positions 419 to 475, and positions 404 to 515 of SEQ ID NO: 1.
  • the manufacturing method according to item 14. [20]
  • the production method according to item 14, wherein the mutation that modulates the function of the functional domain has a mutation in G at the position corresponding to position 428 and/or C at the position corresponding to position 459 of SEQ ID NO: 1. .
  • a microorganism containing a mutation that modulates the function of the functional domain in the region included in the functional domain corresponding to the functional domains W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1 produces ERG. can be promoted.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of AO090005000664 (SEQ ID NO: 1) (A) and the base sequence of AO090005000664 (SEQ ID NO: 2) (B).
  • the conserved region from positions 411 to 467 is shown in color.
  • FIG. 2 shows a diagram comparing the conserved region (positions 411 to 479 of SEQ ID NO: 1:) of the amino acid sequence of AO090005000664 with orthologous genes of the genus Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia, and Talaromysis.
  • FIG. 3 shows the amount of ERG produced in a mutant strain in which the G428S mutation and C459F mutation were introduced in Aspergillus oryzae AO090005000664.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of AO090005000664 (SEQ ID NO: 1) (A) and the base sequence of AO090005000664 (SEQ ID NO: 2) (B).
  • FIG. 4 shows the ERG production amount in a mutant strain in which a mutation corresponding to G428S of SEQ ID NO: 1 was introduced in the AO090005000664 ortholog gene of Aspergillus sojae.
  • FIG. 5 shows the ERG production amount in a mutant strain in which a mutation (G442S) corresponding to G428S was introduced in the AO090005000664 ortholog gene (An16g07990) of Aspergillus niger.
  • FIG. 6 shows the results of BLAST analysis of the amino acid sequence of AO090005000664. Ranks 412 to 462 are further enlarged.
  • Figure 7 shows the region including position 428 (deletion from position 427 to 429 (3DEL), deletion from position 427 to 444 (18DEL), and deletion from position 419 to 444 (26DEL) in the amino acid sequence encoded by the AO090005000664 gene. )) ERG production amount in Aspergillus oryzae (A) deleted, and the region including position 428 (1DEL) and 427 in the amino acid sequence encoded by the ortholog gene that has 98% identity with the AO090005000664 gene.
  • FIG. 8 shows the predicted three-dimensional structure of the protein expressed from the AO090005000664 gene by homology modeling using SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (A). An enlarged view of the supersecondary structure surrounded by the dotted line is shown in FIG. 8B (B).
  • the microorganism into which genetic mutations are introduced is a microorganism that has ergothioneine productivity.
  • Such microorganisms are preferably filamentous fungi, and more preferably any fungi belonging to the genus Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia, and Talaromyces can be used.
  • filamentous fungi of the genus Aspergillus include Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus luchuensis, Aspergillus tamarii, Aspergillus niger, Examples include Aspergillus nidulans.
  • filamentous fungal strains examples include publicly available strains such as Aspergillus oryzae RIB40 strain and RIB326 strain, strains contained in seed koji commercially available from seed koji shops, and food and beverage sources such as sake and soy sauce breweries.
  • Bacterial strains isolated from product manufacturing environments can be used. A strain obtained by isolation can be used.
  • the gene to be mutated relates to the gene named AO090005000664 in Aspergillus oryzae RIB40 strain and its ortholog gene.
  • This gene has a translated region of unknown function and consists of a base sequence (SEQ ID NO: 2) that encodes a protein consisting of a 657-residue amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).
  • the base sequence of the Aspergillus sojae ortholog gene of the AO090005000664 gene corresponds to REGION 19840...21877 of Accession No. BaCA02000013 (SEQ ID NO: 4), and its amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 3.
  • the ortholog genes of the AO090005000664 gene in Aspergillus tamari, Aspergillus luthuensis, Aspergillus niger, and Aspergillus nidulans are BDV40DRAFT_264902 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 5, nucleotide sequence: SEQ ID NO: 6) and AAWM_07753 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 7, base sequence: SEQ ID NO: 8), An16g07990 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 9, base sequence: SEQ ID NO: 10), and ANIA_10201 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 11, base sequence: SEQ ID NO: 12).
  • AO090005000664 has multiple conserved regions that are highly conserved with other species.
  • An example of such a conserved region is the region corresponding to positions 411 to 479 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 13).
  • the conserved region is preferably a region corresponding to positions 411 to 467 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 14), and a region corresponding to positions 411 to 462 (SEQ ID NO: 15) is preferable.
  • the region corresponding to positions 411 to 444 is even more preferred, the region corresponding to positions 427 to 444 (SEQ ID NO: 17) is even more preferred, and the region corresponding to positions 433 to 440 (SEQ ID NO: 18) is more preferred. Corresponding regions are even more preferred.
  • the region corresponding to positions 433 to 440 (SEQ ID NO: 18) is highly conserved among Aspergillus species, and more preferably can be completely identical.
  • the nucleic acids of the present invention may be derived from filamentous fungi, such as Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia or Talaromysis.
  • the nucleic acid of the present invention is highly conserved in these filamentous fungi.
  • a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus encodes an amino acid sequence having 75-100% homology to SEQ ID NO:1.
  • a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus Penicillium encodes an amino acid sequence having 68-75% homology to SEQ ID NO:1.
  • a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus La Samsonia encodes an amino acid sequence with 70% homology to SEQ ID NO:1.
  • a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus Talaromysis encodes an amino acid sequence having 64-68% homology to SEQ ID NO:1.
  • the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 refers to the amino acid sequence of a gene that is an ortholog of AO090005000664, which is possessed by a specific filamentous fungus.
  • Orthologous genes can be selected from the protein database registered at NCBI by using NCBI's blastp program. Such orthologs typically have 40% or more, 50% or more, or 60% or more homology.
  • the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence encoded by an orthologous gene of the genus Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia, or Talaromysis.
  • the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 can be defined by including conserved regions. Therefore, the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence encoding a gene that is an ortholog of AO090005000664, and is specified by a predetermined conserved region included in SEQ ID NO: 1. Specific examples of sequences corresponding to SEQ ID NO: 1 include amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11.
  • the conserved regions are, for example, positions 427 to 444 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 17), positions 411 to 444 (SEQ ID NO: 16), positions 411 to 462 (SEQ ID NO: 15), or positions 433 to 440 (SEQ ID NO: 15). Located at number 18).
  • the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 can be defined by including the conserved region of positions 433 to 440 (SEQ ID NO: 18) of SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of matching in the genus Aspergillus.
  • the conserved region included in the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 is the following sequence instead of this conserved region: 427 444
  • X430 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q, H, P, and D
  • X431 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q and L
  • X432 is at least one amino acid selected from the group consisting of P, Q and G
  • X433 is at least one amino acid selected from the group consisting of D and E
  • X435 is at least one amino acid selected from the group consisting of R and W
  • X437 is at least one amino acid selected from the group consisting of L and I
  • X438 is at least one amino acid selected from the group consisting of V and M
  • X441 is at least one amino acid selected from the group consisting of V, I and L] It may be specified by
  • the conserved region is preferably a sequence that is conserved, particularly in the genus Aspergillus.
  • Such storage areas include: 427 444
  • X430 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q, H, and P
  • X431 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q and L
  • X432 is at least one amino acid selected from the group consisting of P and G
  • X441 is at least one amino acid selected from the group consisting of V and I] can be mentioned.
  • X412 is at least one amino acid selected from the group consisting of E and D;
  • X416 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q, H and E;
  • X417 is at least one amino acid selected from the group consisting of N, H and D;
  • X418 is at least one amino acid selected from the group consisting of Y, F and C;
  • X422 is at least one amino acid selected from the group consisting of N and S;
  • X424 is at least one amino acid selected from the group consisting of W, C, and M;
  • X425 is at least one amino acid selected from the group consisting of Y, Q, S, A and G;
  • X426 is at least one amino acid selected from the group consisting of L, I, V and M;
  • X430 is at least one amino acid selected from the group consisting of E and D;
  • X417 is at least one amino acid selected from the group consisting of N, H and D;
  • X412 is at least one amino acid selected from the group consisting of E and D;
  • X416 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q, H and E;
  • X417 is at least one amino acid selected from the group consisting of N, H and D;
  • X418 is at least one amino acid selected from the group consisting of Y, F and C;
  • X422 is at least one amino acid selected from the group consisting of N and S;
  • X424 is at least one amino acid selected from the group consisting of W, C, and M;
  • X425 is at least one amino acid selected from the group consisting of Y, Q, S, A and G; X426
  • amino acid sequence having such a conserved region and having at least 60% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be defined as a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1.
  • the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 includes the above-mentioned conserved region and is at least 60%, at least 63%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 94%, with respect to SEQ ID NO: 1.
  • the present invention in the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, modulates the function of the functional domain in a region included in the functional domain corresponding to the functional domain W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a sequence containing a mutation; or a sequence having at least 90% identity to the sequence, and which enhances ergothioneine production when introduced into an ergothioneine-producing microorganism.
  • the functional domain refers to the functional domain W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1, or a functional domain corresponding to the functional domain in a protein encoded by the AO090005000664 gene or its ortholog gene. It has been shown that such a functional domain has a supersecondary structure composed of five ⁇ -helices (FIGS. 8A and B). While the specific function of this functional domain is unknown, there are deletions from positions 427 to 429 (3DEL), deletions from positions 427 to 444 (18DEL), and deletions from positions 419 to 444 (26DEL), which constitute the functional domain.
  • 3DEL deletions from positions 427 to 429
  • 18DEL deletions from positions 427 to 444
  • 26DEL deletions from positions 419 to 444
  • positions 428 and 459 of SEQ ID NO: 1 are located in the connecting region of five ⁇ -helices, and mutations at these positions are considered to have a high possibility of causing structural changes in the super-secondary structure.
  • a mutation that modulates the function of a functional domain may be any mutation that affects the function of the functional domain W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1 or the functional domain corresponding to the functional domain. may be a deletion, addition or substitution of one or more amino acids in.
  • the corresponding functional domain refers to a functional domain in the ortholog gene of the gene named AO090005000664.
  • mutations that modulate the functional domain are deletions in the regions included in the functional domains corresponding to the functional domains W404 to Q515, or deletions of G and/or at the position corresponding to position 428. Mutations, especially substitutions, at position C corresponding to position 459.
  • the number of amino acids to be deleted is any number as long as the production of ERG is enhanced in the microorganism in which the deletion occurs.
  • the number of amino acids to be deleted may be in any range selected from the group consisting of 1 to 120, 1 to 112, 1 to 60, 1 to 57, and 1 to 47.
  • the number of amino acids deleted is preferably any number from 1 to 30, more preferably from 1 to 26. For example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, At least one number of amino acids selected from the group consisting of 25 and 26 is deleted.
  • amino acid at the position corresponding to position 428 may be deleted, or a plurality of amino acids including the amino acid at the position corresponding to position 428 may be deleted. In another embodiment, amino acids not including the amino acid at the position corresponding to position 428 may be deleted.
  • any sequence included in the conserved region from position 411 to position 462 (SEQ ID NO: 15) and including position 428 may be deleted.
  • it is selected from the group consisting of positions 428, 427 to 429, 427 to 440 (SEQ ID NO: 20), 427 to 444 (SEQ ID NO: 17), and 419 to 444 (SEQ ID NO: 21).
  • a region corresponding to at least one region may be deleted.
  • a region corresponding to at least one region selected from the group consisting of positions 431-475, 419-475, and 404-515 may be deleted.
  • amino acid positions are indicated based on the amino acid positions of SEQ ID NO: 1 encoded by the AO090005000664 gene, and represent the corresponding amino acid positions in the protein encoded by the corresponding gene, that is, the ortholog gene. Corresponding positions can be determined by aligning homologous sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the identity to the sequence in which the region included in the functional domain corresponding to the functional domain of W404 to Q515 is deleted is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, At least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical.
  • a sequence that has such identity and that increases ergothioneine productivity when a region included in a functional domain corresponding to the functional domains W404 to Q515 in a filamentous fungus is deleted can be selected.
  • the function of contributing to ergothioneine production means that it plays some function in the ergothioneine production process.
  • Such functions may be functions related to transcriptional regulation of enzymes that contribute to the synthetic pathway or decomposition pathway of ergothioneine, enzymatic reactions that contribute to the synthetic pathway of ergothioneine, or functions of ergothioneine or its decomposition pathway. It may also be an enzymatic reaction that contributes to the decomposition pathway of the precursor.
  • the nucleic acid of the present invention which encodes a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 in which a region included in the functional domain corresponding to the functional domain W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1 is deleted, can be used in an ergothioneine-producing filamentous fungus. When introduced, it has the function of enhancing ergothioneine production.
  • the present invention further relates to a method for producing a microorganism with enhanced ergothioneine-producing ability. More specifically, such a production method includes deleting, in the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, a region included in a functional domain corresponding to functional domains W404 to Q515 of SEQ ID NO: 1.
  • the region to be deleted is usually a region included in the functional domain corresponding to the functional domain W404 to Q515, but the adjacent region from positions 404 to 511 may also be deleted as long as it is possible to enhance the ergothioneine production ability. It's okay.
  • the deleted region may include a position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1. However, it may not be included.
  • the region to be deleted includes a position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1.
  • the region to be deleted corresponds to at least one region selected from the group consisting of positions 428, 427 to 429, 427 to 440, 427 to 444, and 419 to 444 of SEQ ID NO: 1. This is an area where The region to be deleted may be the entire conserved region from positions 411 to 462 (SEQ ID NO: 15), or even the entire functional domain from positions 404 to 515. good.
  • the scope of the deletion may be any deletion as long as the microorganism having such deletion can enhance ergothioneine production.
  • Contiguous amino acid sequences within the functional domain W404 to Q515, particularly within the conserved region from positions 411 to 462 (SEQ ID NO: 15), are deleted, but discontinuous amino acid sequences may also be deleted.
  • the microorganism is an ergothioneine-producing microorganism selected from the group consisting of Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia, and Talaromysis.
  • the corresponding sequence of SEQ ID NO: 1 has a mutation in G at the position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1 and/or C at the position corresponding to position 459 of SEQ ID NO: 1, and the ergothioneine-producing microorganism It may also relate to a nucleic acid that enhances ergothioneine production when introduced. Mutations at such positions may more specifically be G428S and/or C459F substitutions. By having a nucleic acid having a mutation at such a position, an ergothioneine-producing microorganism enhances ergothioneine production. More specifically, the corresponding sequence of SEQ ID NO: 1 has conserved regions as defined herein.
  • the present invention provides: 1) In the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11, S is present at the position corresponding to position 428, and/or F is present at the position corresponding to position 459. or 2) has at least 60% identity to the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11, and at the position corresponding to position 428. It may also relate to a nucleic acid that encodes an amino acid sequence that has S and/or has F at the position corresponding to position 459, and that enhances ergothioneine production when introduced into an ergothioneine-producing filamentous fungus. By having the G428S and C459F mutations, ergothioneine production can be enhanced.
  • Identity to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 includes at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, or at least 95% identity.
  • the orthologous genes of Aspergillus sojae and Aspergillus niger share 68% and 67% identity, respectively, while the mutation corresponding to G428S (G442S in Aspergillus niger) - Increased ERG production has been confirmed by introducing it into Niger ( Figures 4 and 5).
  • the present invention provides: Having at least 60% identity to the base sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12, and corresponding to position 428 and/or position 459 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence that encodes the mutation at the position that It may also relate to a nucleic acid consisting of the following, which enhances ergothioneine production when introduced into an ergothioneine-producing microorganism. By having the G428S and C459F mutations, ergothioneine production can be enhanced.
  • Identity to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12 is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, or at least 95% identity has.
  • the orthologous genes of Aspergillus sojae and Aspergillus niger have 68% and 67% identity, respectively, by introducing the mutation corresponding to G428S (G442S in Aspergillus niger), Enhancement of ERG production has been confirmed ( Figures 4 and 5).
  • the nucleic acids of the present invention may be derived from filamentous fungi, such as Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia or Talaromysis.
  • the nucleic acid of the present invention is highly conserved in these filamentous fungi.
  • the amino acid sequence encoded by a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus has 75 to 100% homology to SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence encoded by a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus Penicillium has 68 to 75% homology to SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence encoded by a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus La Samsonia has 70% homology to SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence encoded by a nucleic acid derived from a filamentous fungus belonging to the genus Talaromysis has 64 to 68% homology to SEQ ID NO:1.
  • the function of contributing to ergothioneine production refers to being responsible for some enzymatic reaction in the ergothioneine production process. It may be an enzymatic reaction that contributes to the synthetic pathway of ergothioneine, or an enzymatic reaction that contributes to the decomposition pathway of ergothioneine or its precursor.
  • the protein encoded by the nucleic acid of the present invention may have an activity for synthesizing ergothioneine or its precursor.
  • the protein encoded by the nucleic acid of the present invention may have an activity to decompose ergothioneine or its precursor or metabolite.
  • the nucleic acid of the present invention encoding an amino acid sequence having S at the position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1 and/or having F at the position corresponding to position 459 is introduced into an ergothioneine-producing filamentous fungus. Thus, it has the function of enhancing ergothioneine production.
  • the positions corresponding to positions 428 and 459 of SEQ ID NO: 1 can be determined by aligning homologous sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it can be determined from the neighboring sequences, and the position of G in LSGLQ, which is the neighboring sequence at position 428, corresponds to position 428.
  • Mutation of G at position 428 to S increases ergothioneine productivity.
  • the position C of APCED, which is a neighboring sequence to position 459, corresponds to position 459.
  • Mutation of C at position 459 to F increases ergothioneine productivity. Mutations may be introduced into the positions corresponding to position 428 and 459 separately, or at the same time.
  • the present invention further relates to a method for producing a microorganism with enhanced ergothioneine-producing ability. More specifically, such a production method involves introducing a mutation at a position corresponding to position 428 and/or position corresponding to position 459 of SEQ ID NO: 1 into the genome of a microorganism encoding the conserved region according to the present invention. including.
  • the mutation at the position corresponding to position 428 is G428S
  • the mutation at position 459 is C459F.
  • the microorganism is an ergothioneine-producing microorganism selected from the group consisting of Aspergillus, Penicillium, Rasamsonia, and Talaromysis.
  • X430 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q, H, P, and D;
  • X431 is at least one amino acid selected from the group consisting of Q and L;
  • X432 is at least one amino acid selected from the group consisting of P, Q and G;
  • X433 is at least one amino acid selected from the group consisting of D and E;
  • X435 is at least one amino acid selected from the group consisting of R and W;
  • X437 is at least one amino acid selected from the group consisting of L and I;
  • X438 is at least one amino acid selected from the group consisting of V and M;
  • X441 is at least one amino acid selected from the group consisting of V, I and L] , the following: the microorganism is an er
  • Mutations may be introduced into the genome using any method. It may be introduced using a standard transformation system, it may be introduced as a result of introducing random mutations, or it may be introduced using genome editing technology.
  • the gene may be introduced using a gene cassette, site-specific gene introduction may be performed, or a vector or the like may be used.
  • Another aspect of the invention may relate to a vector into which the nucleic acid of the invention can be expressed.
  • Random mutation introduction methods include, for example, ultraviolet (UV) and X-ray irradiation, which physically damage DNA and introduce mutations, and N-methyl-N'-nitro irradiation, which chemically damages DNA and introduces mutations.
  • Examples include treatment with an alkylating reagent such as -N-nitrosoguanidine (NTG) and ethyl methanesulfonic acid (EMS).
  • NVG -N-nitrosoguanidine
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • site-specific cleavage and homologous recombination using the CRISPR/Cas system can be used.
  • the invention also relates to microorganisms containing the nucleic acids according to the invention. These are microorganisms obtained as a result of the production method according to the present invention.
  • ergothioneine By culturing the microorganism according to the present invention, ergothioneine can be produced with high productivity.
  • the microorganism according to the present invention may be cultured in either solid culture or liquid culture.
  • ergothioneine can be produced with high productivity by culturing the microorganism according to the present invention.
  • the microorganism according to the present invention may be cultured in either solid culture or liquid culture.
  • rice malt with high ergothioneine content can be produced by culturing the microorganism according to the present invention in steamed rice. Using such koji, soy sauce, miso, salt koji, amazake, etc.
  • the invention may relate to a method for producing rice malt containing a high content of ergothioneine.
  • the produced ergothioneine can be purified from the culture based on a conventional method.
  • the culture can be ground and the water evaporated to obtain a dry powder.
  • aqueous ethanol By adding aqueous ethanol to the dried ergothioneine-containing raw material, ergothioneine is extracted into an ethanol solution. Insoluble substances may be removed and the ergothioneine in the ethanol solution may be purified by subjecting it to chromatography.
  • Ergothioneine is known to have various effects, including antioxidant effects, elastase inhibitory effects, tyrosinase inhibitory effects, and polyphenol oxidase (PPO) inhibitory effects. Therefore, the produced ergothioneine may be purified or directly blended into products such as foods, cosmetics, quasi-drugs, and pharmaceuticals, or may be prepared as a concentrate to be blended into products. When formulated as a food, it can also be a food with functional claims.
  • Such functional claims include ergothioneine's anti-wrinkle effect based on elastase inhibitory activity, skin beautification or whitening effect based on tyrosinase inhibitory activity, lifestyle-related disease preventive effect based on the production of lipid peroxide, and anti-dementia and Alzheimer's effect based on active oxygen removal. It can display functions such as disease prevention.
  • the produced ergothioneine may be a food with functional claims, a food with nutritional function claims, a food for specified health uses, or a nutritional supplement, which focuses on the physiological effects of ergothioneine.
  • Example 1 Analysis of ERG high-producing strains (1)
  • Eukaryotes of the genus Aspergillus were cultured using the following medium.
  • Czapek-DOX (Cz-DOX) medium (3.5% Czapek-DOX broth, manufactured by BD, pH 6.0)
  • PD medium 2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.1% NaNO 3 , 0.05% MgSO 4 , 0.1% Casamino Acid, pH 6.0
  • Pafmin medium 5% Pafmin SM, pH not adjusted).
  • Cz-DOX agar medium (3.5% zapek-DOX broth, manufactured by BD, supplemented with 0.1% trace element, 2% Agar) or Malt's agar medium (4.5% Malt Agar Nissui, Japan). (manufactured by Mizuyaku Co., Ltd., 0.1% trace element, 0.5% yeast extract) was used.
  • the homology between AO090005000664 and the orthologous genes of Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamari, Aspergillus lutuensis, Aspergillus niger, and Aspergillus nidulans is 100%, 98%, 96%, 67%, respectively. They were 67% and 62%.
  • Example 2 Preparation of mutation reproduction strain in Aspergillus oryzae RIB40 strain and confirmation of ERG productivity
  • G428S cassette G428S mutation is introduced into the AO090005000664 gene using Aspergillus oryzae RIB40_dKP strain ( ⁇ ku70, ⁇ pyrG) as a host.
  • Primers are shown in Table 1.
  • Gene fragments were amplified by PCR using the genome sequence of RIB40 strain as a template and primer sets of AoG428S_F1 and R1, AoG428S_F2 and R2, AoG428S_F3 and R3, and AopyrG F and R. PCR conditions followed the attached protocol.
  • the four purified PCR amplified fragments and Linerized pUC19 (Takara) were mixed with 2.5 ⁇ L of NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB) and reacted at 60° C. for 1 hour. 4 ⁇ L of the reaction was added to ECOS Competent E.
  • the cells were introduced into E.coli JM109 (Nippon Gene) and transformed.
  • the plasmid extracted from this transformant was used as a template AoG428S_NF and a primer set of NR, and the gene fragment amplified by PCR was made into a G428S cassette.
  • 50 ⁇ L of the PCR product was subjected to ethanol precipitation and dissolved in 10 ⁇ L of sterile water.
  • the bacterial cells were collected with Miraclose and washed with KCl buffer (0.6 M KCl, 0.1 M NaH 2 PO 4 , pH 5.5).
  • the collected cells were suspended in 20 mL of cell wall lytic enzyme (0.5% Lysing enzyme (Sigma-Aldrich), 0.3% Yatalase (Takara), 1.5% Cellulase Onozuka (Yakult) /20 mL KCl buffer).
  • the filtrate was collected through a 70 ⁇ m cell strainer.
  • the obtained transformant was purified by plating three times on a Cz-DOX agar medium (3.5% Czapek-DOX borth, 0.1% trace element, 1.5% Agar).
  • the culture solution was extracted with hot water (90° C., 1 hour), and 0.5 mL of the supernatant was filtered using a Nanosep centrifugal filtration device (3K, manufactured by Nippon Pall Co., Ltd.), and diluted with ultrapure water as appropriate to prepare an analysis sample.
  • FIG. 3 shows the amount of ERG produced by each strain. When the ERG productivity of the mutant strain was compared, it was found that the ERG productivity was improved compared to the control strain and the wild strain. Although the C459F mutation-introduced strain produced less ERG than the G428S mutation-introduced strain, it became clear that the C459F mutation was also involved in improving ERG productivity.
  • Example 3 Preparation of a mutation-reproducing strain in Aspergillus sojae and confirmation of ERG productivity Aspergillus oryzae RIB40 strain AO090005000664 G428S in Example 1
  • Aspergillus sojae Using the NBRC4239_dKP strain ( ⁇ ku70, ⁇ pyrG) as a host, mutation introduction, transformation, and ERG production were confirmed.
  • the ortholog of the AO090005000664 gene in Aspergillus sojae has 98% amino acid identity and 100% amino acid homology.
  • Six of the 19 transformants that reproduced the G428S mutation contained the G428S mutation.
  • Figure 4 shows the amount of ERG produced by each strain. When the ERG productivity of the mutant strain was compared, it was found that the ERG productivity was improved compared to the control strain and the wild strain. It has also been revealed that this gene mutation is involved in improving ERG productivity in Aspergillus sojae.
  • Example 4 Preparation of a mutation-reproducing strain in Aspergillus niger and confirmation of ERG productivity Same method as described in the section of Aspergillus oryzae RIB40 strain AO090005000664 G428S mutation-reproducing strain of Example 1.
  • Aspergillus niger strain A1179 also known as MA70.15, Genotyping: kusA::amdS, cspA1 (mutation resulting in short conidiophores), pyrG -
  • the amino acid identity of the ortholog of the AO090005000664 gene in Aspergillus niger is 67%, and the amino acid homology is 79%.
  • the mutation points of the Aspergillus oryzae strain that showed high ERG production are also conserved in Aspergillus niger (G442 and C473). Therefore, a mutant strain was created in which glycine at position 442, which corresponds to G428S, whose mutational effect was confirmed in Aspergillus oryzae RIB40 strain, was replaced with serine.
  • Figure 5 shows the amount of ERG produced by each strain. When the ERG productivity of the mutant strain was compared, it was found that the ERG productivity was improved compared to the control strain and the wild strain. It has also been revealed that this gene mutation is involved in improving ERG productivity in Aspergillus niger.
  • Example 5 Analysis of ERG high-producing strains (1)
  • Medium Aspergillus eukaryotes were cultured using the following medium.
  • Czapek-DOX (Cz-DOX) medium (3.5% Czapek-DOX broth, manufactured by BD, pH 6.0)
  • PD medium 2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.1% NaNO 3 , 0.05% MgSO 4 , 0.1% Casamino Acid, pH 6.0
  • Pafmin medium 5% Pafmin SM, pH not adjusted).
  • Cz-DOX agar medium (3.5% zapek-DOX broth, manufactured by BD, supplemented with 0.1% trace element, 2% Agar) or Malt's agar medium (4.5% Malt Agar Nissui, Japan). (manufactured by Mizuyaku Co., Ltd., 0.1% trace element, 0.5% yeast extract) was used.
  • AO090005000664 A phasic search was performed on the amino acid sequence of AO090005000664 using the default settings of BLAST (Basic Logical Alignment Search Tool) at NCBI (National Center for Biotechnology Information), and it was found that it is highly conserved in the Aspergillus genus, and that SEQ ID NO. A highly conserved conserved region was found at positions 411-467 ( Figure 6).
  • the identity of AO090005000664 to the orthologous genes of Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamari, Aspergillus lutuensis, Aspergillus niger, and Aspergillus nidulans is 100%, 98%, 96%, 67%, respectively. They were 67% and 62%.
  • Example 6 Preparation of amino acid-deficient strain of Aspergillus oryzae RIB40 strain (1) Preparation of amino acid deletion cassette and acquisition of transformed strain of Aspergillus oryzae RIB40_dKP Using RIB40_dKP strain ( ⁇ ku70, ⁇ pyrG) as a host, a gene for deleting amino acids A cassette was made. The amino acids to be deleted were highly conserved amino acids centered around G428 ( Figure 6). Specifically, positions 428, 427-429, 427-440, 427-444, and 419-444 were deleted, respectively. Table 1 shows the primers used.
  • a gene fragment was amplified by PCR using primer sets of primers 1 and 2, primers 3 and 4, and primers 5 and 6. PCR conditions followed the attached protocol.
  • the three purified PCR amplified fragments and Linerized pUC19 (Takara) (0.5 ⁇ L each) were mixed with 2.5 ⁇ L of NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB) and reacted at 60° C. for 1 hour. 4 ⁇ L of the reaction was added to ECOS Competent E.
  • the cells were introduced into E.coli JM109 (Nippon Gene) and transformed.
  • a gene fragment was extracted by PCR using the sets of primers 7 and 8 (Ao3DEL), primers 9 and 8 (Ao18DEL), and primers 9 and 10 (Ao26DEL). Amplified. PCR conditions followed the attached protocol. DpnI was added to each PCR reaction solution and reacted at 37°C for 1 hour. Next, 2 ⁇ l of each DpnI-treated PCR product was added to Ligation high Ver. 2 (Toyobo), 1 ⁇ l of T4 Polynucleotide Kinase, and 7 ⁇ l of sterile water, and reacted at 16° C. for 1 hour.
  • Example 7 Preparation of an amino acid-deficient strain of Aspergillus sojae NBRC4239 (1) Preparation of an amino acid-deficient cassette and acquisition of a transformed strain of Aspergillus sojae NBRC4239_dKP Using the NBRC4239_dKP strain ( ⁇ ku70, ⁇ pyrG) as a host, the above-mentioned Aspergillus oryzae A gene cassette with amino acid deletion was created in the same way as for the RIB40 strain. Using the genome sequence of NBRC4239 strain as a template, a gene fragment was amplified by PCR with primer sets of primers 13 and 14, primers 3 and 15, and primers 5 and 6. PCR conditions followed the attached protocol.
  • the three purified PCR amplified fragments and Linerized pUC19 (Takara) (0.5 ⁇ L each) were mixed with 2.5 ⁇ L of NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB) and reacted at 60° C. for 1 hour. 4 ⁇ L of the reaction was added to ECOS Competent E. The cells were introduced into E.coli JM109 (Nippon Gene) and transformed.
  • primers 16 and 17 (As1DEL), primers 7 and 8 (As3DEL), primers 18 and 8 (As14DEL), primers 9 and 8 (As18DEL), and The gene fragment was amplified by PCR using a set of primers 19 and 10 (As26DEL).
  • As26DEL a set of primers 19 and 10
  • the AsXDEL cassette was introduced to transform the NBRC4239_dKP strain.
  • the transformed strain was purified by spot planting on Cz-DOX agar medium three times.
  • Example 8 Preparation of an amino acid-deficient strain of Aspergillus oryzae RIB40 strain (1) Preparation of an amino acid deletion cassette and acquisition of a transformed strain of Aspergillus oryzae RIB40_dKP Using the RIB40_dKP strain ( ⁇ ku70, ⁇ pyrG) as a host, a gene for deleting an amino acid A cassette was made. Based on the predicted structure of Example 10, amino acids were selected to delete part or all of the domain. Specifically, positions 431-475, 419-475, and 404-515 were deleted. Table 1 shows the primers used.
  • a gene fragment was amplified by PCR with a set of primers 22 and 23 (Ao45DEL), primers 22 and 10 (Ao57DEL), and primers 24 and 25 (Ao112DEL).
  • PCR conditions followed the attached protocol.
  • DpnI was added to each PCR reaction solution and reacted at 37°C for 1 hour.
  • 2 ⁇ l of each DpnI-treated PCR product was added to Ligation high Ver. 2 (Toyobo), 1 ⁇ l of T4 Polynucleotide Kinase, and 7 ⁇ l of sterile water, and reacted at 16° C. for 1 hour.
  • Example 9 Preparation of amino acid-deficient strain of Aspergillus niger FGSC A1179 strain
  • Preparation of amino acid deletion cassette and acquisition of transformed strain of Aspergillus niger FGSC A1179 The above-mentioned procedure was carried out using FGSC A1179 strain ( ⁇ kusA, pyrG-) as a host.
  • a gene cassette with amino acid deletion was prepared in the same manner as in Aspergillus oryzae RIB40 strain.
  • a gene fragment was amplified by PCR using primer sets of primers 26 and 27 and primers 28 and 29. PCR conditions followed the attached protocol.
  • Linearized pUC19 (Takara) (0.5 ⁇ L each) of the two purified PCR amplified fragments and the gene fragments of primers 5 and 6 purified in Example 2 was mixed with 2.5 ⁇ L of NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB), The reaction was carried out at 60°C for 1 hour. 4 ⁇ L of the reaction was added to ECOS Competent E. The cells were introduced into E.coli JM109 (Nippon Gene) and transformed.
  • primers 30 and 31 (Ang3DEL), primers 32 and 31 (Ang18DEL), primers 32 and 33 (Ang26DEL), primers 34 and 33 (Ang57DEL), and The gene fragment was amplified by PCR using a set of primers 35 and 36 (Ang112DEL).
  • Ang112DEL a set of primers 35 and 36
  • RNA sample 50 ⁇ L of the PCR product was subjected to ethanol precipitation and dissolved in 10 ⁇ L of sterile water.
  • the AngXDEL cassette was introduced to transform FGSC A1179 strain.
  • the transformed strain was purified by spot planting on Cz-DOX agar medium three times.
  • Example 10 Structural analysis of protein expressed from AO090005000664 gene Using the homology modeling function of SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/), the predicted three-dimensional structure of PAAG_04735 was used as a template for the AO090005000664 gene. The three-dimensional structure was predicted ( Figure 8). Regarding the 3D structure of the template, we searched for genes with high homology to AO090005000664 whose 3D structure has been clarified or whose predicted 3D structure has been published, and found that the identity was 43% and was derived from Paracoccidioides lutzii. The predicted three-dimensional structure of PAAG_04735 was selected.
  • deletion at position 428 (1DEL), deletion at positions 427-429 (3DEL), and deletion at positions 427-440 (14DEL) from the amino acid sequence encoded by an orthologous gene with 98% identity with the AO090005000664 gene.
  • a deletion from positions 427 to 444 (18DEL) was shown that ergothioneine production was enhanced in S. sojae (FIG. 7B).
  • a deletion of positions 441 to 443 (3DEL), a deletion of positions 441 to 458 (18DEL), and a deletion of positions 433 to 458 were detected.
  • the function of the super-secondary structure domain contained in W404 to Q515 including position G428 is still unknown, but by at least partially inhibiting the function of the super-secondary structure domain, , it was shown that ergothioneine productivity can be increased. Note that the position in the AO090005000664 gene is referred to, and those skilled in the art can fully understand that the corresponding position differs depending on the gene.

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Abstract

エルゴチオネイン生産糸状菌を培養することによるエルゴチオネイン生産において、エルゴチオネイン生産性を高めることを目的とする。　エルゴチオネイン生産糸状菌において、エルゴチオネイン生産を亢進する遺伝子変異を特定した。配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域を含む、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域を欠失させた核酸、及び当該核酸を含む糸状菌を提供する。

Description

エルゴチオネイン生産性を高めるように改変された核酸、並びに遺伝子改変された微生物
　本開示は、エルゴチオネイン（以下、ＥＲＧと表記する場合がある。）生産性を高めるように改変された核酸、並びにＥＲＧ生産性を高めるように遺伝子改変された微生物に関する。さらに遺伝子改変された微生物を用いたＥＲＧ生成方法にも関する。
　エルゴチオネインは、ライ麦角菌（Claviceps purpurea）から単離された含硫アミノ酸として発見され、植物や動物の生体内にも存在することが見いだされている。しかしながら、植物や動物は、エルゴチオネインを合成することはできず、生体内のエルゴチオネインは、担子菌類などの微生物により合成されたエルゴチオネインに由来すると考えられている。特に担子菌類の一部のキノコ、例えば、ヒラタケ、シイタケ、マイタケ、エリンギなどの食用キノコにも含まれており、特にタモギタケに多く含まれていることが知られている。エルゴチオネインは、ヒスチジンからの生合成経路が知られており、硫黄原子はシステインから供給される。エルゴチオネインは、高い抗酸化性を有しており、また、エラスターゼ阻害作用、チロシナーゼ阻害作用が報告されており、美白やしわ予防といった美容・食品分野で特に注目されている。また、エルゴチオネインが生体酸化防御システムに関与することが判明してきており、医療分野での応用も試みられている。エルゴチオネインは、熱安定性やｐＨ安定性が高く、高温でもその抗酸化作用を維持することができ、生理作用を期待して食品へ配合される他、抗酸化剤としての食品への使用も期待されている。
　エルゴチオネインの製造方法としては、タモギタケなどの担子菌からの抽出、化学合成、微生物を用いた発酵が用いられている。タモギタケなどの担子菌からの抽出は、原材料の取得に時間がかかり、大量生産には適していない。大量生産には化学合成が適しているが高価な合成試薬を用いる必要があり、また、精製コストが高くなるという問題がある（特許文献１）。したがって、Ｃ１化合物資化性の細菌や酵母を用いた発酵（特許文献２、非特許文献１）、さらにはエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物を用いた発酵（特許文献３）が製造方法としては有力であり、微生物発酵物をそのまま、または簡易な抽出操作により得られた抽出物を使用できる点で有力である。
特開２００６－１６０７４８号公報 国際公開第２０１６／１０４４３７号 国際公開第２０１７／１５０３０４号
ＰＬＯＳ　Ｏｎｅ　２０１４　ｖｏｌ．　９（５）　ｅ９７７７４
　微生物培養によるＥＲＧ生産において、ＥＲＧ生産性を高めることを目的とする。
　本発明者らが、麹菌のＥＲＧ生産性を高めることを目的として、鋭意研究を行ったところ、機能未知の遺伝子において、特定の遺伝子変異を導入することにより、エルゴチオネイン生産性が亢進したことを見出し本発明に至った。
　そこで、本発明は以下に関する：
［１]　配列番号１に含まれる保存領域を含む、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域に、当該機能ドメインの機能を変調する変異を含む配列；又は
　当該配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列
をコードし、エルゴチオネイン産生微生物に導入された場合にエルゴチオネイン産生を亢進する、核酸。
［２]　前記保存領域が、配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域である、項目１に記載の核酸。
［３]　前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域の欠失である、項目１に記載の核酸。
［４]　前記欠失された領域が、配列番号１の４２８位に対応する位置を含む、項目１に記載の核酸。
［５]　前記欠失された領域が、１～１２０個のアミノ酸の欠失からなる、項目１に記載の核酸。
［６]　前記欠失された領域が、配列番号１の４２７位～４２９位、４２７位～４４０位、４２７位～４４４位、及び４１９位～４４４位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、項目４に記載の核酸。
［７]　前記欠失された領域が、配列番号１の４３１位～４７５位、４１９位～４７５位、及び４０４位～５１５位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、項目３に記載の核酸。
［８]前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、配列番号１の４２８位に対応する位置のＧ及び/又は４５９位に対応する位置のＣにおいて変異を有する、項目１に記載の核酸。
［９]　前記核酸が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属、タラロマイシス属からなる群から選ばれる微生物由来の核酸である、項目１に記載の核酸。
［１０]　項目１～９のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
［１１]　項目１～９のいずれか一項に記載の核酸を含む微生物。
［１２]　項目１１に記載の微生物を培養することを含む、エルゴチオネインの製造方法。
［１３]　エルゴチオネイン産生能を亢進された微生物の製造方法であって、配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域を含む、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域に、当該機能ドメインの機能を変調する変異を導入することを含み、前記微生物が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属及びタラロマイシス属からなる群から選ばれるエルゴチオネイン生成微生物である、前記製造方法。
［１４]前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域の欠失である、項目１３に記載の製造方法。
［１５]　前記保存領域が、配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域である、項目１３に記載の製造方法。
［１６]　前記欠失された領域が、配列番号１の４２８位に対応する位置を含む、項目１４に記載の製造方法。
［１７]　前記欠失された領域が、１～１２０個のアミノ酸からなる、項目１４に記載の製造方法。
［１８]　前記欠失された領域が、配列番号１の４２８位、４２７位～４２９位、４２７位～４４０位、４２７位～４４４位、及び４１９位～４４４位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、項目１６に記載の製造方法。
［１９]　前記欠失された領域が、配列番号１の４３１位～４７５位、４１９位～４７５位、及び４０４位～５１５位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、項目１４に記載の製造方法。
［２０]前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、配列番号１の４２８位に対応する位置のＧ及び/又は４５９位に対応する位置のＣにおいて変異を有する、項目１４に記載の製造方法。
　本発明によれば、ＡＯ０９０００５０００６６４に対応する遺伝子において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域に、当該機能ドメインの機能を変調する変異を含む微生物は、ＥＲＧ生産を亢進することができる。
図１は、ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列（配列番号１）（Ａ）及びＡＯ０９０００５０００６６４の塩基配列（配列番号２）を示す（Ｂ）。４１１位～４６７位の保存領域を着色して示す。 図２は、ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列のうち、保存領域（配列番号１の４１１位～４７９位：）を、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属およびタラロマイシス属のオルソログ遺伝子と比較した図を示す。 図３は、アスペルギルス・オリゼーのＡＯ０９０００５０００６６４において、Ｇ４２８Ｓ変異及びＣ４５９Ｆ変異を導入した変異導入株におけるＥＲＧ生産量を示す。 図４は、アスペルギルス・ソーヤのＡＯ０９０００５０００６６４オルソログ遺伝子において、配列番号１のＧ４２８Ｓに対応する変異を導入した変異導入株におけるＥＲＧ生産量を示す。 図５は、アスペルギルス・ニガーのＡＯ０９０００５０００６６４オルソログ遺伝子（Ａｎ１６ｇ０７９９０）において、Ｇ４２８Ｓに対応する変異（Ｇ４４２Ｓ）を導入した変異導入株におけるＥＲＧ生産量を示す。 図６は、ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴにより解析した結果を示す。４１２位～４６２位をさらに拡大して示す。 図７は、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子がコードするアミノ酸配列において、４２８位を含む領域（４２７位～４２９位の欠失（３ＤＥＬ）、４２７～４４４位の欠失（１８ＤＥＬ）、及び４１９位から４４４位（２６ＤＥＬ））を欠失させたアスペルギルス・オリゼー（Ａ）におけるＥＲＧ産生量と、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子と９８％同一性を有するオルソログ遺伝子がコードするアミノ酸配列において、４２８位を含む領域４２８位（１ＤＥＬ）、４２７位～４２９位（３ＤＥＬ）、４２７～４４０位（１４ＤＥＬ）、４２７～４４４位（１８ＤＥＬ）、及び４１９位から４４４位（２６ＤＥＬ）を欠失させたアスペルギルス・ソーヤ（Ｂ）におけるＥＲＧ産生量を示す。 さらに、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子がコードするアミノ酸配列において、４３１位～４７５位の欠失（４５ＤＥＬ）、４１９～４７５位の欠失（５７ＤＥＬ）、及び４０４位から５１５位（１１２ＤＥＬ））を欠失させたアスペルギルス・オリゼーにおけるＥＲＧ産生量を示す（Ｃ）。　さらに、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子と、６７％同一性を有するＡｎ１６ｇ０７９９０遺伝子がコードするアミノ酸配列において、４４１～４４３位（３ＤＥＬ）、４４１～４５８位（１８ＤＥＬ）、４３３～４５８位の欠失（２６ＤＥＬ）、４３３位～４８９位（５７ＤＥＬ）、および４１８位～５２９位（１１２ＤＥＬ）を欠失させたアスペルギルス・ニガーにおけるＥＲＧ産生量とを示す（Ｄ）。 図８は、　ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（https://swissmodel.expasy.org/）を用いてＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子から発現されるタンパク質についてホモロジーモデリングした３次元立体予測構造を示す（Ａ）。点線で囲った超二次構造の部分の拡大を図８Ｂに示す（Ｂ）。
　本発明において遺伝子変異を導入する微生物としては、エルゴチオネイン生産性を有する微生物である。そのような微生物としては、糸状菌が好ましく、より好ましくはアスペルギルス（Asperugillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ラサムソニア属（Rasamsonia）、タラロマイシス（Talaromyces）属に属する任意の菌を使用することができる。アスペルギルス属の糸状菌の一例として、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Aspergillus luchuensis）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans)が挙げられる。糸状菌の菌株としては、例えば、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株、ＲＩＢ３２６株など公的に入手可能な菌株、種麹屋などから市販されている種麹に含まれる菌株、又は清酒、醤油醸造蔵等の飲食品製造環境などから分離して得られる菌株を使用することができる。分離して得られる菌株を使用することができる。
　本発明において、変異を導入する遺伝子は、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株におけるＡＯ０９０００５０００６６４と名付けられた遺伝子、及びそのオルソログ遺伝子に関する。この遺伝子は機能未知の翻訳領域を有しており、６５７残基のアミノ酸配列（配列番号１）からなるタンパク質をコードする塩基配列（配列番号２）からなる。ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子の、アスペルギルス・ソーヤのオルソログ遺伝子の塩基配列は、Accession No.BaCA02000013のREGION 19840...21877に対応し（配列番号４）、そのアミノ酸配列は配列番号３で表される。ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子の、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニジュランスでのオルソログ遺伝子は、それぞれ、ＢＤＶ４０ＤＲＡＦＴ＿２６４９０２（アミノ酸配列：配列番号５、塩基配列：配列番号６）、ＡＡＷＭ＿０７７５３（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）、Ａｎ１６ｇ０７９９０（アミノ酸配列：配列番号９、塩基配列：配列番号１０）、及びＡＮＩＡ＿１０２０１（アミノ酸配列：配列番号１１、塩基配列：配列番号１２）である。アスペルギルス属において高く保存されており、アスペルギルス・ソーヤでは９８％、アスペルギルス・タマリでは９６％、アスペルギルス・ルチュエンシスでは６７％、アスペルギルス・ニガーでは６７％、アスペルギルス・ニジュランスでは６２％のアミノ酸配列の同一性を有する。これらの遺伝子は、アスペルギルス・ソーヤでは１００％、アスペルギルス・タマリでは９８％、アスペルギルス・ルチュエンシスでは７９％、アスペルギルス・ニガーでは７９％、アスペルギルス・ニジュランスでは７５％のアミノ酸配列の相同性を有する。
　ＡＯ０９０００５０００６６４には、他の種と高度に保存される複数の保存領域が存在する。このような保存領域として、特に配列番号１の４１１～４７９位に対応する領域（配列番号１３）が挙げられる。より保存性の高い領域という観点から、保存領域は、配列番号１の４１１位～４６７位に対応する領域（配列番号１４）が好ましく、４１１位～４６２位（配列番号１５）に対応する領域がより好ましく、４１１位～４４４位（配列番号１６）に対応する領域がさらに好ましく、４２７位～４４４位（配列番号１７）に対応する領域がさらに好ましく、４３３位～４４０位（配列番号１８）に対応する領域がさらにより好ましい。４３３位～４４０位（配列番号１８）に対応する領域は、アスペルギルス属で極めて高く保存されており、より好ましくは完全に一致しうる。
　本発明の核酸は、糸状菌、例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属又はタラロマイシス属に由来してもよい。本発明の核酸は、これらの糸状菌において保存性が高い。アスペルギルス属に属する糸状菌由来の核酸は、配列番号１に対し７５～１００％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする。ペニシリウム属に属する糸状菌由来の核酸は、配列番号１に対し６８～７５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする。ラサムソニア属に属する糸状菌由来の核酸は、配列番号１に対し７０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする。タラロマイシス属に属する糸状菌由来の核酸は、配列番号１に対し６４～６８％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする。
　本発明において、配列番号１に対応する配列とは、特定の糸状菌が有する、ＡＯ０９０００５０００６６４のオルソログとなる遺伝子のアミノ酸配列をいう。オルソログとなる遺伝子はＮＣＢＩのｂｌａｓｔｐのプログラムを用いることで、ＮＣＢＩに登録されたタンパク質データベースの中から選択可能である。このようなオルソログは、通常４０％以上、５０％以上、又は６０％以上の相同性を有する。より好ましくは、斯かる配列番号１に対応する配列は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属又はタラロマイシス属のオルソログ遺伝子がコードするアミノ酸配列である。より好ましくは、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ニガー、又はアスペルギルス・ニジュランスのオルソログ遺伝子のアミノ酸配列である。本発明の１の態様では、配列番号１に対応する配列は、保存領域を含むことにより定義することができる。したがって、配列番号１に対応する配列は、ＡＯ０９０００５０００６６４のオルソログとなる遺伝子をコードするアミノ酸配列であり、配列番号１に含まれる所定の保存領域により特定される。配列番号１に対応する配列の具体例としては配列番号１、３、５、７、９、及び１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列が挙げられる。
　保存領域は、一例として、配列番号１の４２７位～４４４位（配列番号１７）、４１１～４４４位（配列番号１６）、４１１～４６２位（配列番号１５）、又は４３３位～４４０位（配列番号１８）に位置する。なかでも、アスペルギルス属で一致する観点から、配列番号１の４３３位～４４０位（配列番号１８）の保存領域を含むことにより、配列番号１に対応する配列は定義されうる。配列番号１に対応する配列が含む保存領域は、この保存領域に代えて、以下の配列：
　　　　　　　　427　　　　　　　444
　　　　　　　　|　　　　　　　　|　
　　　　　　　　SGLXXXXWXGXXAAXDSH　　（配列番号４３）
［配列中において、
　X430は、Q、H、P、及びDからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X431は、Q、及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X432は、P、Q及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X433は、D、及びEからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X435は、R、及びWからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X437は、L及びIからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X438は、V、及びMからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X441は、V、I及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である］
　により特定されてもよい。
　さらに別の例としては、保存領域は、特にアスペルギルス属で保存される配列が好ましい。そのような保存領域として、以下の：
　　　　　　　　427　　　　　　 444
　　　　　　　　|　　　　　　　　|　
　　　　　　　　SGLXXXDWRGLVAAXDSH　　（配列番号１９）
［配列中において、
　X430は、Q、H、及びPからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X431は、Q、及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X432は、P、及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X441は、V及びIからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である］
　が挙げられる。
更なる例として、保存領域として、以下の
411　　　　　　　428　　　　　　 444
|　　　　　　　　|　　　　　　　 |　
YXAYNXXXELDXLXXXSGLXXXDWRGLVAAXDSH　　（配列番号４４）
［配列中において、
　X412は、E及びDからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X416は、Q、H及びEからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X417は、N、H及びDからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X418は、Y、F及びCからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X422は、N及びSからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X424は、W、C、及びMからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X425は、Y、Q、S、A及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X426は、L、I、V及びMからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X430は、Q、H、及びPからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X431は、Q、及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X432は、P、及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X441は、V及びIからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である］
が挙げられる。更なる例として、保存領域として、以下の
411　　　　　　　428　　　　　　　　　　　　　　459　　 467
|　　　　　　　　|　　　　　　　　　　　　　　　|　　　 |
YXAYNXXXELDXLXXXSGLXXXDWRGLVAAXDSHXXXXXHXXXXCXAPCEXEXXXXI　　（配列番号４５）
［配列中において、
　X412は、E及びDからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X416は、Q、H及びEからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X417は、N、H及びDからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X418は、Y、F及びCからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X422は、N及びSからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X424は、W、C、及びMからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X425は、Y、Q、S、A及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X426は、L、I、V及びMからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X430は、Q、H、及びPからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X431は、Q、及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X432は、P、及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X441は、V及びIからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X445は、Y、及びFからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X446は、Q、及びKからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X447は、V、及びIからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X448は、F、V、I、Y、C、及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X450は、N、G、D、H、E、Q、及びSからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X452は、S、G、D、H、A、及びEからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X453は、F、Y、D、C、及びHからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X454は、D、E、N、K、及びQからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X456は、P、H、T、S、及びNからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X461は、D、N、及びSからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X464は、I、L、及びVからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X465は、N、D、S、C、Q、R、H、及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X466は、H、及びRからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である］
　が挙げられる。
　かかる保存領域を有するアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を、配列番号１に対応する配列と定義することができる。配列番号１に対応する配列は、上述の保存領域を含むとともに、配列番号１に対し少なくとも６０％、少なくとも６３％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９８％、又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有することにより特定されうる。
　本発明の一の態様では、本発明は、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域に、当該機能ドメインの機能を変調する変異を含む配列；又は
　当該配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列
をコードし、エルゴチオネイン産生微生物に導入された場合にエルゴチオネイン産生を亢進する、核酸に関する。
　本発明において、機能ドメインとは、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子又はそのオルソログ遺伝子がコードするタンパク質における、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメイン、又は当該機能ドメインに対応する機能ドメインを指す。かかる機能ドメインは５つのαヘリックスから構成される超二次構造をとるドメインが存在することが示されている（図８Ａ及びＢ）。この機能ドメインの具体的な機能は不明である一方、機能ドメインを構成する４２７位～４２９位の欠失（３ＤＥＬ）、４２７～４４４位の欠失（１８ＤＥＬ）、及び４１９位から４４４位（２６ＤＥＬ）、４３１位～４７５位（４５ＤＥＬ）、４１９位～４７５位（５７ＤＥＬ）、及び４０４位～５１５位（１１２ＤＥＬ）が欠失された際に、エルゴチオネイン産生を亢進することから、機能ドメインの機能変調が、エルゴチオネイン産生に寄与しうる。特に、機能ドメインを構成するアミノ酸の欠失によりエルゴチオネイン産生が増大する観点から、エルゴチオネイン産生増大には、機能ドメインにおける機能の妨害が必要とされうる。また、配列番号１の４２８位及び４５９位は、５つのαヘリックスの接続領域に位置しており、かかる位置における変異は、超二次構造における構造変化を及ぼす可能性が高いと考えられる。
　機能ドメインの機能を変調する変異とは、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメイン、又は当該機能ドメインに対応する機能ドメインの機能に影響を及ぼす変異であればよく、かかる変異は、当該機能ドメインにおける１又は複数のアミノ酸の欠失、付加又は置換でありうる。対応する機能ドメインとは、ＡＯ０９０００５０００６６４と名付けられた遺伝子のオルソログ遺伝子における、機能ドメインをいう。かかる機能ドメインの機能に影響を及ぼすことにより、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子又はそのオルソログ遺伝子を有するエルゴチオネイン産生微生物において、エルゴチオネイン生産性を亢進することができる。エルゴチオネイン産生を亢進する観点から、機能ドメインを変調する変異は、Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域の欠失であるか、又は４２８位に対応する位置のＧ及び/又は４５９位に対応する位置のＣにおける変異、特に置換である。　
　欠失されるアミノ酸の数は、欠失が生じた微生物においてＥＲＧの生産が亢進される限り任意の数である。一例として、欠失されるアミノ酸の数は、１～１２０、１～１１２、１～６０、１～５７及び１～４７からなる群から選ばれる任意の範囲の数が欠失されうる。欠失されるアミノ酸の数は、好ましくは１～３０、さらに好ましくは１～２６の任意の数である。一例として１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選ばれる少なくとも１の数のアミノ酸が欠失される。より具体的には、４２８位に対応する位置アミノ酸が欠失されるか、又は４２８位に対応する位置のアミノ酸を含む複数のアミノ酸が欠失されうる。別の態様では、４２８位に対応する位置のアミノ酸を含まないアミノ酸が欠失されてもよい。
　一例として、４１１位～４６２位の保存領域（配列番号１５）に含まれ、４２８位を含む任意の配列が欠失されうる。一例として４２８位、４２７位～４２９位、４２７位～４４０位（配列番号２０）、４２７位～４４４位（配列番号１７）、及び４１９位～４４４位（配列番号２１）からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域が欠失されうる。さらに、別の例として、４３１位～４７５位、４１９位～４７５位、及び４０４位～５１５位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域が欠失されてもよい。
　本発明において、アミノ酸位置は、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子がコードする配列番号１のアミノ酸位に基づいて示されるが、対応する遺伝子、すなわちオルソログ遺伝子がコードするタンパク質において対応するアミノ酸位置を表す。対応する位置は、配列番号１のアミノ酸配列の相同配列をアライメントすることにより決定することができる。
　Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域が欠失された配列に対する同一性は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。かかる同一性を有し、かつ糸状菌においてＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域が欠失された場合に、エルゴチオネイン生産性を高める配列を選択することができる。
　エルゴチオネイン生成に寄与するという機能は、エルゴチオネインの生成過程における、何らかの機能を担うことをいう。このような機能として、エルゴチオネインの合成経路や分解経路に寄与する酵素の転写調節に関わる機能であってもよいし、エルゴチオネインの合成経路に寄与する酵素反応であってもよいし、エルゴチオネインの又はその前駆体の分解経路に寄与する酵素反応であってもよい。配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域が欠失された配列をコードする本発明の核酸が、エルゴチオネイン産生性の糸状菌に導入されることで、エルゴチオネイン産生を亢進する機能を有する。
　本発明は、さらに、エルゴチオネイン産生能を亢進された微生物の製造方法にも関する。より具体的に、かかる製造方法は、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域を欠失させることを含む。当該欠失される領域は、通常、Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域であるが、エルゴチオネイン産生能を亢進可能な限り、４０４～５１１位の隣接する領域も欠失されてもよい。配列番号１の４０４位～５１１位の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域が欠失される場合、当該欠失される領域は、配列番号１の４２８位に対応する位置を含んでもよいし、含まなくてもよい。欠失される領域には、配列番号１の４２８位に対応する位置が含まれることが好ましい。欠失される領域は、配列番号１の４２８位、４２７位～４２９位、４２７位～４４０位、４２７位～４４４位、及び４１９位～４４４位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である。欠失される領域は、４１１位～４６２位（配列番号１５）の保存領域のすべてを欠失していてもよいし、さらには４０４位～５１５位の機能ドメインすべてを欠失していてもよい。欠失の範囲は、かかる欠失を有する微生物が、エルゴチオネイン産生を亢進可能な限り任意の欠失であってよい。Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメイン内、特に４１１位～４６２位（配列番号１５）の保存領域内の連続するアミノ酸配列が欠失されるが、不連続のアミノ酸配列が欠失されていてもよい。前記微生物としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属及びタラロマイシス属からなる群から選ばれるエルゴチオネイン生成微生物である。
　本発明の別の態様では、配列番号１の対応する配列において、配列番号１の４２８位に対応する位置のＧ及び/又は４５９位に対応する位置のＣにおいて変異を有し、エルゴチオネイン産生微生物に導入された場合にエルゴチオネイン産生を亢進する、核酸に関してもよい。かかる位置における変異は、より具体的にはＧ４２８Ｓ及び／又はＣ４５９Ｆの置換であってもよい。かかる位置に変異を有する核酸を有することにより、エルゴチオネイン産生微生物はエルゴチオネイン産生を亢進する。より具体的には、配列番号１の対応する配列は、本明細書により定義される保存領域を有する。
　さらに、本発明は以下の： 
　１）配列番号１、３、５、７、９、及び１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、４２８位に対応する位置にＳを有するか、及び／又は４５９位に対応する位置にＦを有する、アミノ酸配列、又は
　２）配列番号１、３、５、７、９、１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも６０％の同一性を有し、かつ４２８位に対応する位置にＳを有するか、及び／又は４５９位に対応する位置にＦを有する、アミノ酸配列
　をコードし、エルゴチオネイン産生糸状菌に導入された場合にエルゴチオネイン産生を亢進する、核酸に関してもよい。Ｇ４２８Ｓ、Ｃ４５９Ｆ変異を有することにより、エルゴチオネイン産生を亢進することができる。
　配列番号１、３、５、７、９、１１に対する同一性は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有する。特に、アスペルギルス・ソーヤのオルソログ遺伝子及びアスペルギルス・ニガーのオルソログ遺伝子とは、それぞれ６８％及び６７％の同一性である一方で、Ｇ４２８Ｓに対応する変異（アスペルギルス・ニガーではＧ４４２Ｓ）をアスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・ニガーに導入することで、ＥＲＧ産生の亢進が確認されている（図４及び５）。
　さらに、本発明は以下の：
　配列番号２、４、６、８、１０、及び１２の塩基配列に対し、少なくとも６０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列の４２８位に対応する位置及び／又は４５９位に対応する位置に変異をコードする、塩基配列、
　からなり、エルゴチオネイン産生微生物に導入された場合にエルゴチオネイン産生を亢進する、核酸に関してもよい。Ｇ４２８Ｓ、Ｃ４５９Ｆ変異を有することにより、エルゴチオネイン産生を亢進することができる。
　配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に対する同一性は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有する。特に、アスペルギルス・ソーヤのオルソログ遺伝子及びアスペルギルス・ニガーのオルソログ遺伝子とは、それぞれ６８％及び６７％の同一性である一方で、Ｇ４２８Ｓに対応する変異（アスペルギルス・ニガーではＧ４４２Ｓ）を導入することで、ＥＲＧ産生の亢進が確認されている（図４及び５）。
　本発明の核酸は、糸状菌、例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属又はタラロマイシス属に由来してもよい。本発明の核酸は、これらの糸状菌において保存性が高い。アスペルギルス属に属する糸状菌由来の核酸にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１に対し７５～１００％の相同性を有する。ペニシリウム属に属する糸状菌由来の核酸にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１に対し６８～７５％の相同性を有する。ラサムソニア属に属する糸状菌由来の核酸にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１に対し７０％の相同性を有する。タラロマイシス属に属する糸状菌由来の核酸にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１に対し６４～６８％の相同性を有する。
　エルゴチオネイン生成に寄与するという機能は、エルゴチオネインの生成過程における何らかの酵素反応を担うことをいう。エルゴチオネインの合成経路に寄与する酵素反応であってもよいし、エルゴチオネインの又はその前駆体の分解経路に寄与する酵素反応であってもよい。合成経路に寄与する酵素反応を担う場合、本発明の核酸がコードするタンパク質は、エルゴチオネイン又はその前駆体の合成活性を有しうる。分解経路に寄与する酵素反応である場合、本発明の核酸がコードするタンパク質は、エルゴチオネイン又はその前駆体若しくは代謝物の分解活性を有しうる。配列番号１の４２８位に対応する位置にＳを有するか、及び／又は４５９位に対応する位置にＦを有するアミノ酸配列をコードする本発明の核酸は、エルゴチオネイン産生性の糸状菌に導入されることで、エルゴチオネイン産生を亢進する機能を有する。
　配列番号１の４２８位に対応する位置及び４５９位に対応する位置は、配列番号１のアミノ酸配列の相同配列をアライメントすることにより決定することができる。１の例では近傍の配列から決定することができ、４２８位の近傍配列であるＬＳＧＬＱのＧの位置が４２８位に対応する。４２８位のＧがＳに変異することでエルゴチオネイン生産性が亢進する。４５９位の近傍配列であるＡＰＣＥＤのＣの位置が４５９位に対応する。４５９位のＣがＦに変異することでエルゴチオネイン生産性が亢進する。４２８位に対応する位置及び４５９位に対応する位置は、別個に変異が導入されていてもよいし、同時に変異が導入されていてもよい。
　本発明は、さらに、エルゴチオネイン産生能を亢進された微生物の製造方法にも関する。より具体的に、かかる製造方法は、本発明に係る保存領域をコードする微生物のゲノムに対し、配列番号１の４２８位に対応する位置及び/又は４５９位に対応する位置に変異を導入することを含む。４２８位に対応する位置の変異は、Ｇ４２８Ｓであり、４５９位の変異はＣ４５９Ｆであることが好ましい。前記微生物が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属及びタラロマイシス属からなる群から選ばれるエルゴチオネイン生成微生物である。一例として、配列番号１の部分配列（４２７位～４４４位）に対応する以下の保存領域：
　　　　　　　　427　　　　　　　444
　　　　　　　　|　　　　　　　　|　
　　　　　　　　SGLXXXXWXGXXAAXDSH　　（配列番号４３）
［配列中において、
　X430は、Q、H、P、及びDからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X431は、Q、及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X432は、P、Q及びGからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X433は、D、及びEからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X435は、R、及びWからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X437は、L及びIからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X438は、V、及びMからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸であり；
　X441は、V、I及びLからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である］
において、４２８位のＧ及び/又は４５９位のＣにおいて変異を有する保存領域をコードするゲノムに対し、以下の：
　４２８位に対応する位置及び/又は４５９位に対応する位置に変異を導入することを含み、前記微生物が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属及びタラロマイシス属からなる群から選ばれるエルゴチオネイン生成微生物である、前記製造方法に関する。
　ゲノムに対する変異の導入は、任意の手法を用いて導入されてもよい。定法の形質転換系を用いて導入されてもよいし、ランダム変異を導入した結果導入されてもよいし、ゲノム編集技術を利用して導入されてもよい。一例として、形質転換系では、遺伝子カセットを用いて導入されてもよいし、部位特異的な遺伝子導入を行ってもよいし、ベクターなどによって導入されてもよい。本発明の別の態様では、本発明の核酸を発現可能に組み込まれたベクターに関してもよい。ランダム変異の変異導入方法としては、例えば、物理的にＤＮＡを損傷し変異を導入する紫外線（ＵＶ）やＸ線照射、化学的にＤＮＡを損傷し変異を導入するＮ―メチル―Ｎ’―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）などのアルキル化試薬による処理などが挙げられる。ゲノム編集技術としては、一例として、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓシステムを利用した部位特異的切断と相同組換えを利用することができる。発明は、本発明に係る核酸を含む微生物にも関する。本発明に係る製造方法の結果取得された微生物である。
　本発明に係る微生物を培養することにより、高い生産性でエルゴチオネインを製造することができる。本発明に係る微生物は、固体培養又は液体培養のいずれで培養されてもよい。一例として、本発明に係る微生物を培養することにより、高い生産性でエルゴチオネインを製造することができる。本発明に係る微生物は、固体培養又は液体培養のいずれで培養されてもよい。一例として、蒸し米において本発明に係る微生物を培養することで、エルゴチオネイン含有量が高い米麹を製造することができる。かかる麹を用い、本技術分野の周知の工程を経て、醤油、味噌、塩麹、甘酒などを製造することができ、また麹菌を収集してマイコプロテインを得ることもできる。したがって、本発明の１の態様では、本発明は、高含量のエルゴチオネインを含む米麹の製造方法に関していてもよい。生成されたエルゴチオネインは、培養物中から定法に基づいて精製することができる。一例として、培養物を粉砕し、水を蒸発させて乾燥粉末を得ることができる。乾燥されたエルゴチオネイン含有原料に対し、含水エタノールを添加することにより、エルゴチオネインがエタノール溶液中に抽出される。不溶性物質を除去し、エタノール溶液中のエルゴチオネインを、クロマトグラフィーに供することで精製してもよい。
　エルゴチオネインは、抗酸化作用をはじめ、エラスターゼ阻害作用、チロシナーゼ阻害作用、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害作用など種々の作用を有することが知られている。したがって、製造されたエルゴチオネインは、精製されて又はそのまま食品、化粧品、医薬部外品、及び医薬品などの製品に配合されてもよいし、製品に配合される濃縮物として調製されてもよい。食品として配合される場合、機能性表示食品とすることもできる。かかる機能性表示として、エルゴチオネインの、エラスターゼ阻害作用に基づく抗しわ作用、チロシナーゼ阻害活性に基づく美肌又は美白作用、過酸化脂質の生成に基づく生活習慣病予防作用、活性酸素除去に基づく認知症やアルツハイマー病の予防作用がなどの機能を表示することができる。製造されたエルゴチオネインは、特にエルゴチオネインの生理作用に着目した、機能性表示食品、栄養機能食品、特定保健用食品、又は栄養補助食品（サプリメント）であってもよい。
　本開示において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。相同性は、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔｐのプログラムを用いて、ＮＣＢＩに登録されたタンパク質データベースを用いて決定される。本開示において相同性及び同一性の％を除き、特に言及がない限り質量％を意味する。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：ＥＲＧ高生産株の解析
（１）培地
　アスペルギルス属の真核生物は、以下の培地を用いて培養した。液体培養ではＣｚａｐｅｋ－ＤＯＸ（Ｃｚ－ＤＯＸ）培地（３．５％Ｃｚａｐｅｋ－ＤＯＸ　ｂｒｏｔｈ、ＢＤ社製、ｐＨ６．０）、ＰＤ培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％ＮａＮＯ3、０．０５％ＭｇＳＯ4、０．１％カザミノ酸、ｐＨ６．０）、パフミン培地（５％パフミンＳＭ、ｐＨ無調整）を用いた。プレート培養では主にＣｚ－ＤＯＸ寒天培地（３．５％　ｚａｐｅｋ－ＤＯＸ　ｂｒｏｔｈ、ＢＤ社製、０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％Ａｇａｒ添加）又はマルツ寒天培地（４．５％Ｍａｌｔ　Ａｇａｒ　Ｎｉｓｓｕｉ，日水製薬社製，０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）を用いた。
（２）ＥＲＧ高生産株のゲノム解析
　ＥＲＧ高生産株の全ゲノムを解析し、その中で機能未知のＡＯ０９０００５０００６６４という遺伝子におけるＧ４２８Ｓ又はＣ４５９Ｆの変異がＥＲＧ生産亢進に寄与することを見出した。ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列（配列番号１）、及び塩基配列（配列番号２）は、図１のとおりである。
　ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列について、NCBI（National　Center for Biotechnology Information）でBLAST（Basic Logical Alignment Search Tool）のデフォルト設定で相動性検索を行ったところ、アスペルギルス属で高度に保存されており、配列番号１の４１１～４６７位において、高度に保存された保存領域が見いだされた（図２）。ＡＯ０９０００５０００６６４と、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ニガー、及びアスペルギルス・ニジュランスのオルソログ遺伝子との相同性は、それぞれ１００％、９８％、９６％、６７％、６７％、及び６２％であった。
実施例２：アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株における変異再現株の作製およびＥＲＧ生産性の確認
（１）　Ｇ４２８Ｓカセットの作製
　アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０＿ｄＫＰ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）を宿主として、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子にＧ４２８Ｓ変異を導入するための、遺伝子カセットを作製した。プライマーを表１に示す。ＲＩＢ４０株のゲノム配列を鋳型とし、ＡｏＧ４２８Ｓ＿Ｆ１とＲ１、ＡｏＧ４２８Ｓ＿Ｆ２とＲ２、ＡｏＧ４２８Ｓ＿Ｆ３とＲ３、ＡｏｐｙｒＧ　ＦとＲのプライマーセットで、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は添付のプロトコルに従った。精製した４つのＰＣＲ増幅断片とＬｉｎｅｒｉｚｅｄ　ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ）（各０．５μＬ）をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＮＥＢ）２．５μＬと混合し、６０℃、１時間反応させた。反応物４μＬをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン）に導入して形質転換を行った。次に、この形質転換体から抽出したプラスミドを鋳型ＡｏＧ４２８Ｓ＿ＮＦとＮＲのプライマーセットを用いて、ＰＣＲにより増幅された遺伝子断片をＧ４２８Ｓカセットとした。ＰＣＲ産物５０μＬはエタノール沈殿処理して滅菌水１０μＬに溶解させた。
（２）Ｃ４５９Ｆカセットの作製
　上述の（１）と同様にしてＣ４５９Ｆカセットを作製した。プライマーはＡｏＧ４２８Ｓ＿Ｒ２をＡｏＣ４５９Ｆ＿Ｒ２に、ＡｏＧ４２８Ｓ＿Ｆ３をＡｏＣ４５９Ｆ＿Ｆ３に変えて実施した。
（３）　Ａ．　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０＿ｄＫＰの形質転換
　ＲＩＢ４０＿ｄＫＰ株を１０ｍＭウリジン、１０ｍＭウラシルを含んだＣｚ－ＤＯＸ＿ＵｒａＵｒｉ培地に塗布し、５日間、３０℃で培養した。プレート上で生育させ、分生子をマイクロループで掻き取り、１５０ｍＬ容三角フラスコに入れた１０ｍＭウリジン、１０ｍＭウラシルを含んだＰＤ培地４０ｍＬに植菌した。３０℃、１８０ｒｐｍで旋回培養を２０時間行い、菌体を回収した。
　培養後の菌体をミラクロースで集菌し、ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．６　Ｍ　ＫＣｌ，　０．１Ｍ　ＮａＨ2ＰＯ4，　ｐＨ５．５）で洗浄した。回収した菌体を細胞壁溶解酵素２０ｍＬ（０．５％Ｌｙｓｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３％Ｙａｔａｌａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）、１．５％Ｃｅｌｌｕｒａｓｅ　Ｏｎｏｚｕｋａ（Ｙａｋｕｌｔ）　／２０ｍＬ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ）に懸濁し、３０℃、で３時間振とうした後、７０μｍのセルストレーナーに通してろ液を回収した。
　酵素処理後、遠心処理（４℃、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）によりプロトプラストを沈殿させ、上清を除去した。次に、ＳｏｌＢ　ｂｕｆｆｅｒ（１．２Ｍ　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，０．１Ｍ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．５）３０ｍＬを加えてプロトプラストを再懸濁させてエッペンチューブに移し、遠心処理によりプロトプラストを回収した。さらに、３０ｍＬのＳｏｌＢ　ｂｕｆｆｅｒを加えて同様の洗浄操作を再度繰り返した。回収したプロトプラストを０．４～０．８ｍＬのＳｏｌ　Ｂに懸濁させた。該プロトプラスト懸濁液１００μＬにＧ４２８Ｓカセット、または、Ｃ４５９Ｆカセット５～１０μｇ、１２．５μＬのＳｏｌＣ（５０％ＰＥＧ３３５０，５０ｍＭ　ＣａＣｌ2，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．５）を加えてゆっくり混合した後、氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。その後、１ｍＬのＳｏｌＣを加えて、ピペッティングにより混合させた後、室温で１０ｍｉｎ静置した。その後、１０ｍＬのＳｏｌＢを加え、遠心処理によりプロトプラストを沈殿させ、上清を除去した。再生用寒天培地（３．５％Ｃｚａｐｅｋ－ＤＯＸ　ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍソルビトール、０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％Ａｇａｒ）上に全量をのせ、５０℃のＴｏｐ　Ａｇａｒ（３．５％Ｃｚ－ＤＯＸ　ｂｏｒｔｈ、１．２Ｍソルビトール、０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、０．５％Ａｇａｒ）を重層し、３０℃で約１週間培養した。
　得られた形質転換体は、Ｃｚ－ＤＯＸ寒天培地（３．５％Ｃｚａｐｅｋ－ＤＯＸ　ｂｏｒｔｈ、０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、１．５％Ａｇａｒ）で３回点植して純化した。
（４）　変異再現株のＥＲＧ生産量の確認
　上記で得られた形質転換体、および、コントロールとしてＲＩＢ４０野生株のＥＲＧ生産量を比較した。
（４－１）培養・抽出
　　５０ｍＬ容三角フラスコにパフミン培地（５％パフミンＳＭ、ｐＨ無調整）１０ｍＬを調製し、１２０℃、３０分オートクレーブ滅菌した。そこに分生子懸濁液（１．０×１０7個／ｍｌ）を１００μＬ添加し、３０℃、１６０ｒｐｍ、４日間振盪培養した。培養液を熱水抽出（９０℃、１時間）し、上清０．５ｍＬをナノセップ遠心ろ過デバイス（日本ポール社製　３Ｋ）でろ過し、適宜超純水で希釈して分析サンプルとした。
（４－２）分析条件
　下記の分析条件により、分析サンプル中のＥＲＧ量を測定した。
ＬＣ／ＭＳ解析条件：
分析装置：　ＵＰＬＣ　ＣＱ　ｍｉｃｒｏ　；　Ｗａｔｅｒｓ　ＵＰＬＣ
カラム：　２．５　ＨＩＬＩＣ　３．０　ｍｍｌ．Ｄ．×１５０　ｍｍ
溶媒Ａ：　０．１％　ギ酸／アセトニトリル
溶媒Ｂ：　０．１％　ギ酸／Ｈ2Ｏ
流速：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ　８０％Ａ
ｉｎｊｅｃｔ：　３　μｌ
質量分析計
ＥＳＩ：　ＥＳ＋
Ｃｏｎｅ　Ｖ：　２１　Ｖ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｖ：　４．５　ｋＶ
Ｓｏｕｒｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　１２０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　４００℃
ＭＳ　Ｓｃａｎモード
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでのＥＲＧ分析条件：
分析装置：　ＵＰＬＣ　ＣＱ　ｍｉｃｒｏ　；　Ｗａｔｅｒｓ　ＵＰＬＣ
カラム：　２．５　ＨＩＬＩＣ　３．０　ｍｍｌ．Ｄ．×１５０　ｍｍ
溶媒Ａ：　０．１％　ギ酸／アセトニトリル
溶媒Ｂ：　０．１％　ギ酸／Ｈ2Ｏ
流速：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ　８０％Ａ
１サンプル毎に１００％Ｂでカラムを洗浄
ｉｎｊｅｃｔ：　３　μＬ
質量分析計
ＥＳＩ：　ＥＳ＋
Ｃｏｎｅ　Ｖ：　２１　Ｖ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｖ：　４．５　ｋＶ
Ｓｏｕｒｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　１２０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　４００℃
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ：１１　Ｖ
Ｔｒａｃｅ：　ｍ／ｚ　２３０．１　＞　１８６．１
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ：２０　Ｖ
Ｔｒａｃｅ：　ｍ／ｚ　２３０．１　＞　１２７．０
（５）　形質転換株の配列確認
　Ｃｚ－ＤＯＸ寒天培地で４日培養した菌体の分生子を爪楊枝で２掻き程度分、１００μＬのＴＥに懸濁させた分生子懸濁液０．８μＬを１９．２μＬのＫＯＤ　ｏｎｅ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）ＰＣＲ反応液に加え、コロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。カラムからの溶出にはＥｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、溶出量は、ＰＣＲの系と同様量の５０μＬで溶出した。精製したＰＣＲ産物をＦａｓｍａｃ社に委託して配列を確認した。
　Ｇ４２８Ｓ変異再現の形質転換体４８株のうち２株にＧ４２８Ｓ変異が入っていた。Ｃ４５９Ｆ変異再現の形質転換体４０株のうち１株においてＣ４５９Ｆ変異が入っていた。
　　各菌株のＥＲＧ生成量を図３に示す。変異導入株のＥＲＧ生産性を比較したところ、対照株および野生株と比較してＥＲＧ生産性が向上した。Ｇ４２８Ｓ変異導入株に比べてＣ４５９Ｆ変異導入株の方がＥＲＧ生成量が少なかったが、Ｃ４５９Ｆ変異も本遺伝子変異がＥＲＧ生産性向上に関わることが明らかとなった。
実施例３：アスペルギルス・ソーヤにおける変異再現株の作製およびＥＲＧ生産性の確認
　実施例１のアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０　株ＡＯ０９０００５０００６６４　Ｇ４２８Ｓ　変異再現株の作製の項に記載されている方法と同様に、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９＿ｄＫＰ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）を宿主として、変異導入、形質転換、ＥＲＧ生産量の確認を行った。アスペルギルス・ソーヤにおけるＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子のオルソログ遺伝子は、アミノ酸同一性で９８％、アミノ酸相同性では、１００％である。
　Ｇ４２８Ｓ変異再現の形質転換体１９株のうち６株にＧ４２８Ｓ変異が入っていた。
　各菌株のＥＲＧ生成量を図４に示す。変異導入株のＥＲＧ生産性を比較したところ、対照株および野生株と比較してＥＲＧ生産性が向上した。アスペルギルス・ソーヤでも本遺伝子変異がＥＲＧ生産性向上に関わることが明らかとなった。
実施例４：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）における変異再現株の作製およびＥＲＧ生産性の確認
　実施例１のアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０　株ＡＯ０９０００５０００６６４　Ｇ４２８Ｓ　変異再現株の作製の項に記載されている方法と同様に、アスペルギルス・ニガーＡ１１７９株　（別名ＭＡ７０．１５、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｋｕｓＡ：：ａｍｄＳ、ｃｓｐＡ１（ｓｈｏｒｔ　ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅｓとなる変異）、ｐｙｒＧ-）を宿主として、変異導入、形質転換し、培養日数を６日に変更してＥＲＧ生産量の確認を行った。
　アスペルギルス・ニガーにおけるＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子のオルソログ遺伝子のアミノ酸同一性は６７％、アミノ酸相同性では、７９％である。ＥＲＧ高生産性を示したアスペルギルス・オリゼー株の変異点（Ｇ４２８ＳおよびＣ４５９Ｆ）は、アスペルギルス・ニガーでも保存されている（Ｇ４４２およびＣ４７３）。そこで、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株で変異効果が確認されたＧ４２８Ｓに相当する４４２番目のグリシンをセリンに置換した変異株を作製した。各菌株のＥＲＧ生成量を図５に示す。変異導入株のＥＲＧ生産性を比較したところ、対照株および野生株と比較してＥＲＧ生産性が向上した。アスペルギルス・ニガーでも本遺伝子変異がＥＲＧ生産性向上に関わることが明らかとなった。
実施例５：ＥＲＧ高生産株の解析
（１）培地
　アスペルギルス属の真核生物は、以下の培地を用いて培養した。液体培養ではＣｚａｐｅｋ－ＤＯＸ（Ｃｚ－ＤＯＸ）培地（３．５％Ｃｚａｐｅｋ－ＤＯＸ　ｂｒｏｔｈ、ＢＤ社製、ｐＨ６．０）、ＰＤ培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％ＮａＮＯ3、０．０５％ＭｇＳＯ4、０．１％カザミノ酸、ｐＨ６．０）、パフミン培地（５％パフミンＳＭ、ｐＨ無調整）を用いた。プレート培養では主にＣｚ－ＤＯＸ寒天培地（３．５％　ｚａｐｅｋ－ＤＯＸ　ｂｒｏｔｈ、ＢＤ社製、０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％Ａｇａｒ添加）又はマルツ寒天培地（４．５％Ｍａｌｔ　Ａｇａｒ　Ｎｉｓｓｕｉ，日水製薬社製，０．１％ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）を用いた。
（２）ＥＲＧ高生産株のゲノム解析
　ＥＲＧ高生産株の全ゲノムを解析し、その中で機能未知のＡＯ０９０００５０００６６４という遺伝子におけるアミノ酸欠損がＥＲＧ生産亢進に寄与することを見出した。ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列（配列番号１）、及び塩基配列（配列番号２）は、図１のとおりである。
　ＡＯ０９０００５０００６６４のアミノ酸配列について、NCBI（National　Center for Biotechnology Information）でBLAST（Basic Logical Alignment Search Tool）のデフォルト設定で相動性検索を行ったところ、アスペルギルス属で高度に保存されており、配列番号１の４１１～４６７位において、高度に保存された保存領域が見いだされた（図６）。ＡＯ０９０００５０００６６４と、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ニガー、及びアスペルギルス・ニジュランスのオルソログ遺伝子との同一性は、それぞれ１００％、９８％、９６％、６７％、６７％、及び６２％であった。
実施例６：アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株のアミノ酸欠損株の作製
（１）　アミノ酸欠損カセットの作製およびアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０＿ｄＫＰの形質転換株の取得
　ＲＩＢ４０＿ｄＫＰ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）を宿主として、アミノ酸を欠損させる遺伝子カセットを作製した。欠損させるアミノ酸はＧ４２８を中心とした保存性の高いアミノ酸とした（図６）。具体的に４２８位、４２７位～４２９位、４２７位～４４０位、４２７位～４４４位、及び４１９位～４４４位をそれぞれ欠失させた。用いたプライマーを表１に示す。
　ＲＩＢ４０株のゲノム配列を鋳型とし、プライマー１と２、プライマー３と４、プライマー５と６のプライマーセットで、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は添付のプロトコルに従った。精製した３つのＰＣＲ増幅断片とＬｉｎｅｒｉｚｅｄ　ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ）（各０．５μＬ）をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＮＥＢ）２．５μＬと混合し、６０℃、１時間反応させた。反応物４μＬをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン）に導入して形質転換を行った。次に、この形質転換体から抽出したプラスミドをテンプレートにして、プライマー７と８（Ａｏ３ＤＥＬ）、プライマー９と８（Ａｏ１８ＤＥＬ）、および、プライマー９と１０（Ａｏ２６ＤＥＬ）のセットで、ＰＣＲより遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は添付のプロトコルに従った。各ＰＣＲ反応液にＤｐｎＩを添加して３７℃、１時間反応させた。次に、ＤｐｎＩ処理した各ＰＣＲ産物２μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ）５μｌ、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ　１μｌ、滅菌水　７μｌと混合し１６℃、１時間反応させた。各反応物５μＬをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ニッポンジーン）に導入して形質転換を行った。次に、この形質転換体から抽出した各プラスミドを鋳型として、プライマー１１と１２のセットを用いて、ＰＣＲにより増幅された遺伝子断片をそれぞれアミノ酸欠損カセットＡｏＸＤＥＬカセット（Ｘ＝３、１８、２６）とした。ＰＣＲ産物５０μＬはエタノール沈殿処理して滅菌水１０μＬに溶解させた。
　ＡｏＸＤＥＬカセットを導入してＲＩＢ４０＿ｄＫＰ株を形質転換した。形質転換株
はＣｚ－ＤＯＸ寒天培地に点植により３回植え継いで純化した。
（２）　分生子ＰＣＲ
　　カセット導入位置について、プライマー１と４を用いて、バンドの大きさにより確認した。また、このＰＣＲ産物を精製してシーケンス解析を行い、アミノ酸欠損を確認した。
（３）　アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量の確認
　　上記で得られた形質転換体、および、コントロールを５０ｍｌ容三角フラスコで５％パフミンＳＭ培地１０ｍｌ、２６℃で７日間培養した。培養後、オートクレーブの溶解・保温モードで９０℃、１時間加熱し、その上清をナノセップ遠心ろ過デバイス（日本ポール社製　３Ｋ）で濾過し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで定量した（図７Ａ）。
（３－２）分析条件
　下記の分析条件により、分析サンプル中のＥＲＧ量を測定した。
ＬＣ／ＭＳ解析条件：
分析装置：　ＵＰＬＣ　ＣＱ　ｍｉｃｒｏ　；　Ｗａｔｅｒｓ　ＵＰＬＣ
カラム：　２．５　ＨＩＬＩＣ　３．０　ｍｍｌ．Ｄ．×１５０　ｍｍ
溶媒Ａ：　０．１％　ギ酸／アセトニトリル
溶媒Ｂ：　０．１％　ギ酸／Ｈ2Ｏ
流速：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ　８０％Ａ
ｉｎｊｅｃｔ：　３　μｌ
質量分析計
ＥＳＩ：　ＥＳ＋
Ｃｏｎｅ　Ｖ：　２１　Ｖ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｖ：　４．５　ｋＶ
Ｓｏｕｒｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　１２０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　４００℃
ＭＳ　Ｓｃａｎモード
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでのＥＲＧ分析条件：
分析装置：　ＵＰＬＣ　ＣＱ　ｍｉｃｒｏ　；　Ｗａｔｅｒｓ　ＵＰＬＣ
カラム：　２．５　ＨＩＬＩＣ　３．０　ｍｍｌ．Ｄ．×１５０　ｍｍ
溶媒Ａ：　０．１％　ギ酸／アセトニトリル
溶媒Ｂ：　０．１％　ギ酸／Ｈ2Ｏ
流速：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ　８０％Ａ
１サンプル毎に１００％Ｂでカラムを洗浄
ｉｎｊｅｃｔ：　３　μＬ
質量分析計
ＥＳＩ：　ＥＳ＋
Ｃｏｎｅ　Ｖ：　２１　Ｖ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｖ：　４．５　ｋＶ
Ｓｏｕｒｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　１２０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：　４００℃
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ：１１　Ｖ
Ｔｒａｃｅ：　ｍ／ｚ　２３０．１　＞　１８６．１
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ：２０　Ｖ
Ｔｒａｃｅ：　ｍ／ｚ　２３０．１　＞　１２７．０
実施例７：アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のアミノ酸欠損株の作製
（１）　アミノ酸欠損カセットの作製およびアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９＿ｄＫＰの形質転換株の取得
　ＮＢＲＣ４２３９＿ｄＫＰ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）を宿主として、上述したアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様にアミノ酸欠損させる遺伝子カセットを作製した。ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列を鋳型とし、プライマー１３と１４、プライマー３と１５、プライマー５と６のプライマーセットで、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は添付のプロトコルに従った。精製した３つのＰＣＲ増幅断片とＬｉｎｅｒｉｚｅｄ　ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ）（各０．５μＬ）をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＮＥＢ）２．５μＬと混合し、６０℃、１時間反応させた。反応物４μＬをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン）に導入して形質転換を行った。次に、この形質転換体から抽出したプラスミドをテンプレートにして、プライマー１６と１７（Ａｓ１ＤＥＬ）、プライマー７と８（Ａｓ３ＤＥＬ）、プライマー１８と８（Ａｓ１４ＤＥＬ）、プライマー９と８（Ａｓ１８ＤＥＬ）、および、プライマー１９と１０（Ａｓ２６ＤＥＬ）のセットで、ＰＣＲより遺伝子断片を増幅した。上述したアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様に取得した各プラスミドを鋳型として、プライマー２０と２１のセットを用いて、ＰＣＲにより増幅された遺伝子断片をそれぞれアミノ酸欠損カセットＡｓＸＤＥＬカセット（Ｘ＝１、３、１４、１８、２６）とした。ＰＣＲ産物５０μＬはエタノール沈殿処理して滅菌水１０μＬに溶解させた。
　ＡｓＸＤＥＬカセットを導入してＮＢＲＣ４２３９＿ｄＫＰ株を形質転換した。形質転換株はＣｚ－ＤＯＸ寒天培地に点植により３回植え継いで純化した。
（２）　分生子ＰＣＲ
　カセット導入位置について、プライマー１３と１５を用いて、バンドの大きさにより確認した。また、このＰＣＲ産物を精製してシーケンス解析を行い、アミノ酸欠損を確認した。
（３）　アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量の確認
　実施例２（３）に記載のアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様に行い、アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量を確認した（図７Ｂ）。
実施例８：アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株のアミノ酸欠損株の作製
（１）　アミノ酸欠損カセットの作製およびアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０＿ｄＫＰの形質転換株の取得
　ＲＩＢ４０＿ｄＫＰ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）を宿主として、アミノ酸を欠損させる遺伝子カセットを作製した。実施例１０の予測構造をもとに、ドメインの一部または全体を欠失させるアミノ酸とした。具体的に４３１位～４７５位、４１９位～４７５位、及び４０４位～５１５位をそれぞれ欠失させた。用いたプライマーを表１に示す。
　実施例２で作製したプラスミドをテンプレートにして、プライマー２２と２３（Ａｏ４５ＤＥＬ）、プライマー２２と１０（Ａｏ５７ＤＥＬ）、および、プライマー２４と２５（Ａｏ１１２ＤＥＬ）のセットで、ＰＣＲより遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は添付のプロトコルに従った。各ＰＣＲ反応液にＤｐｎＩを添加して３７℃、１時間反応させた。次に、ＤｐｎＩ処理した各ＰＣＲ産物２μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ）５μｌ、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ　１μｌ、滅菌水　７μｌと混合し１６℃、１時間反応させた。各反応物５μＬをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ニッポンジーン）に導入して形質転換を行った。次に、この形質転換体から抽出した各プラスミドを鋳型として、プライマー１１と１２のセットを用いて、ＰＣＲにより増幅された遺伝子断片をそれぞれアミノ酸欠損カセットＡｏＸＤＥＬカセット（Ｘ＝４５、５７、１１２）とした。ＰＣＲ産物５０μＬはエタノール沈殿処理して滅菌水１０μＬに溶解させた。
　ＡｏＸＤＥＬカセットを導入してＲＩＢ４０＿ｄＫＰ株を形質転換した。形質転換株はＣｚ－ＤＯＸ寒天培地に点植により３回植え継いで純化した。
（２）　分生子ＰＣＲ
　カセット導入位置について、プライマー１と４を用いて、バンドの大きさにより確認した。また、このＰＣＲ産物を精製してシーケンス解析を行い、アミノ酸欠損を確認した。
（３）　アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量の確認
　実施例２（３）に記載のアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様に行い、アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量を確認した（図７Ｃ）。
実施例９：アスペルギルス・ニガーＦＧＳＣ　Ａ１１７９株のアミノ酸欠損株の作製
（１）　アミノ酸欠損カセットの作製およびアスペルギルス・ニガーＦＧＳＣ　Ａ１１７９の形質転換株の取得
　ＦＧＳＣ　Ａ１１７９株（ΔｋｕｓＡ、ｐｙｒＧ－）を宿主として、上述したアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様にアミノ酸欠損させる遺伝子カセットを作製した。アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株のゲノム配列を鋳型とし、プライマー２６と２７、プライマー２８と２９のプライマーセットで、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は添付のプロトコルに従った。精製した２つのＰＣＲ増幅断片および実施例２で精製したプライマー５と６の遺伝子断片をＬｉｎｅｒｉｚｅｄ　ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ）（各０．５μＬ）をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＮＥＢ）２．５μＬと混合し、６０℃、１時間反応させた。反応物４μＬをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン）に導入して形質転換を行った。次に、この形質転換体から抽出したプラスミドをテンプレートにして、プライマー３０と３１（Ａｎｇ３ＤＥＬ）、プライマー３２と３1（Ａｎｇ１８ＤＥＬ）、プライマー３２と３３（Ａｎｇ２６ＤＥＬ）、プライマー３４と３３（Ａｎｇ５７ＤＥＬ）、および、プライマー３５と３６（Ａｎｇ１１２ＤＥＬ）のセットで、ＰＣＲより遺伝子断片を増幅した。上述したアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様に取得した各プラスミドを鋳型として、プライマー３７と３８のセットを用いて、ＰＣＲにより増幅された遺伝子断片をそれぞれアミノ酸欠損カセットＡｓＸＤＥＬカセット（Ｘ＝３、１８、２６、５７、１１２）とした。ＰＣＲ産物５０μＬはエタノール沈殿処理して滅菌水１０μＬに溶解させた。
　ＡｎｇＸＤＥＬカセットを導入してＦＧＳＣ　Ａ１１７９株を形質転換した。形質転換株はＣｚ－ＤＯＸ寒天培地に点植により３回植え継いで純化した。
（２）　分生子ＰＣＲ
　カセット導入位置について、プライマー２６と２９を用いて、バンドの大きさにより確認した。また、このＰＣＲ産物を精製してシーケンス解析を行い、アミノ酸欠損を確認した。
（３）　アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量の確認
　実施例２（３）に記載のアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株と同様に行い、アミノ酸欠損株のＥＲＧ生産量を確認した（図７Ｄ）。
実施例１０：ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子から発現されるタンパク質の構造解析
　ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（https://swissmodel.expasy.org/）のホモロジーモデリング機能を使用し、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子について、ＰＡＡＧ＿０４７３５の予測立体構造をテンプレートに用いて立体構造予測を行った（図８）。テンプレートの立体構造としては、ＡＯ０９０００５０００６６４と相同性が高い遺伝子のうち、立体構造が明らかとなっているもの、もしくは、予測立体構造が公開されているものを検索し、同一性４３％、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｌｕｔｚｉｉ由来のＰＡＡＧ＿０４７３５の予測立体構造を選択した。なお、ＰＡＡＧ＿０４７３５の予測立体構造はＡｌｐｈａＦｏｌｄ２で予測されたものである。現在、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子と１００％同一性を有するＯＡｏｒｙ＿０１００８２８０の予測構造がＡｌｐｈａＦｏｌｄＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅＤａｔａｂａｓｅ（https://alphafold.com/）で公開されているが、ホモロジーモデリングした予測構造は、これと類似していた。なお、ホモロジーモデリング当時、ＯＡｏｒｙ＿０１００８２８０の予測構造は公開されていなかった。
　本発明者らの研究により、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子がコードするアミノ酸配列において４２７位～４２９位の欠失（３ＤＥＬ）、４２７～４４４位の欠失（１８ＤＥＬ）、及び４１９位から４４４位（２６ＤＥＬ）、４３１位～４７５位（４５ＤＥＬ）、４１９位～４７５位（５７ＤＥＬ）、及び４０４位～５１５位（１１２ＤＥＬ）をそれぞれ欠失させた（図７Ａ及びＣ）。なお４３１位～４７５位は、５つのαヘリックスから構成される超二次構造ドメインのうち、２本目のαヘリックス及び３本目のヘリックスに相当した。４０４位～５１５位は、当該超二次構造ドメインのすべてに相当した。
　また、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子と９８％同一性を有するオルソログ遺伝子がコードするアミノ酸配列から４２８位の欠失（１ＤＥＬ）、４２７位～４２９位の欠失（３ＤＥＬ）、４２７～４４０位の欠失（１４ＤＥＬ）、４２７～４４４位の欠失（１８ＤＥＬ）、及び４１９位から４４４位の欠失（２６ＤＥＬ）を有するように改変された遺伝子を有するＡ．ｓｏｊａｅにおいて、エルゴチオネイン産生が亢進することが示された（図７Ｂ）。
　さらに、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子に対し、６７％同一性しか有さないＡｎ１６ｇ０７９９０遺伝子から、４４１位～４４３位の欠失（３ＤＥＬ）、４４１位～４５８位の欠失（１８ＤＥＬ）、４３３位～４５８位の欠失（２６ＤＥＬ）、４３３位～４８９位の欠失（５７ＤＥＬ）、および４１８位～５２９位の欠失（１１２ＤＥＬ）を有するように改変された遺伝子を有するＡ．ｎｉｇｅｒにおいて、エルゴチオネイン産生が亢進することが示された（図７Ｄ）。
　ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子及びその対応する遺伝子について、Ｇ４２８位を含むＷ４０４～Ｑ５１５に含まれる超二次構造ドメインの機能は依然として不明であるが、当該超二次構造ドメインの機能を少なくとも部分的に阻害することにより、エルゴチオネイン生産性を高めることができることが示された。なお、ＡＯ０９０００５０００６６４遺伝子における位置が言及されており、遺伝子が異なればその対応する位置が異なることは当業者であれば十分に理解することができる。

Claims (20)

  1. 　配列番号１に含まれる保存領域を含む、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域に、当該機能ドメインの機能を変調する変異を含む配列；又は
    　当該配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列
    をコードし、エルゴチオネイン産生微生物に導入された場合にエルゴチオネイン産生を亢進する、核酸。
  2. 　前記保存領域が、配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域である、請求項１に記載の核酸。
  3. 　前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域の欠失である、請求項１に記載の核酸。
  4. 　前記欠失された領域が、配列番号１の４２８位に対応する位置を含む、請求項１に記載の核酸。
  5. 　前記欠失された領域が、１～１２０個のアミノ酸の欠失からなる、請求項１に記載の核酸。
  6. 　前記欠失された領域が、配列番号１の４２７位～４２９位、４２７位～４４０位、４２７位～４４４位、及び４１９位～４４４位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、請求項４に記載の核酸。
  7. 　前記欠失された領域が、配列番号１の４３１位～４７５位、４１９位～４７５位、及び４０４位～５１５位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、請求項３に記載の核酸。
  8. 前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、配列番号１の４２８位に対応する位置のＧ及び/又は４５９位に対応する位置のＣにおいて変異を有する、請求項１に記載の核酸。
  9. 　前記核酸が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属、タラロマイシス属からなる群から選ばれる微生物由来の核酸である、請求項１に記載の核酸。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸を含む微生物。
  12. 　請求項１１に記載の微生物を培養することを含む、エルゴチオネインの製造方法。
  13. 　エルゴチオネイン産生能を亢進された微生物の製造方法であって、配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域を含む、配列番号１に対応する配列において、配列番号１のＷ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域に、当該機能ドメインの機能を変調する変異を導入することを含み、前記微生物が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ラサムソニア属及びタラロマイシス属からなる群から選ばれるエルゴチオネイン生成微生物である、前記製造方法。
  14. 前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、Ｗ４０４～Ｑ５１５の機能ドメインに対応する機能ドメインに含まれる領域の欠失である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　前記保存領域が、配列番号１の４３３位～４４０位の保存領域である、請求項１３に記載の製造方法。
  16. 　前記欠失された領域が、配列番号１の４２８位に対応する位置を含む、請求項１４に記載の製造方法。
  17. 　前記欠失された領域が、１～１２０個のアミノ酸からなる、請求項１４に記載の製造方法。
  18. 　前記欠失された領域が、配列番号１の４２８位、４２７位～４２９位、４２７位～４４０位、４２７位～４４４位、及び４１９位～４４４位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、請求項１６に記載の製造方法。
  19. 　前記欠失された領域が、配列番号１の４３１位～４７５位、４１９位～４７５位、及び４０４位～５１５位からなる群から選ばれる少なくとも１の領域に対応する領域である、請求項１４に記載の製造方法。
  20. 前記当該機能ドメインの機能を変調する変異が、配列番号１の４２８位に対応する位置のＧ及び/又は４５９位に対応する位置のＣにおいて変異を有する、請求項１４に記載の製造方法。
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