TW202405183A - 經修飾以增加麥角硫醇生產力之核酸及經基因修飾之微生物 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係以於藉由培養會生產麥角硫醇的絲狀菌而進行之麥角硫醇生產中，提高麥角硫醇生產力為目的。

關於解決上述課題之手段，於會生產麥角硫醇的絲狀菌中，特定出促進麥角硫醇生產之基因突變。本發明提供在包含序列編號1之433位至440位之保存區域之對應序列編號1之序列中，使與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域缺失而成之核酸及含有此核酸之絲狀菌。

Description

經修飾以增加麥角硫醇生產力之核酸及經基因修飾之微生物
本揭示係有關以增加麥角硫醇(以下，亦有記載為ERG之情況)生產力之方式修飾之核酸及以增加ERG生產力之方式而基因修飾之微生物。更且，亦有關使用了經基因修飾之微生物之ERG生成方法。
麥角硫醇係作為從黑麥角菌(Claviceps purpurea)分離之含硫胺基酸而被發現，亦發現存在於植物或動物之生體內。惟，植物、動物不能合成麥角硫醇，生體內之麥角硫醇被認為係源自藉由擔子菌類等微生物所合成之麥角硫醇。已知尤其擔子菌類之一部分的菇，例如平菇(亦稱蠔菇)、香菇、舞菇、杏鮑菇等食用菇中亦含有，尤其於黃金菇(亦稱金頂側耳)中含有很多。關於麥角硫醇，已知從組胺酸之生合成路徑，硫原子係從半胱胺酸供給。麥角硫醇具有高抗氧化性，又，己報導有彈性蛋白酶抑制作用、酪胺酸酶抑制作用，並於美白或預防皺紋之美容/食品領域特別受到矚目。又，已判明麥角硫醇參予生體氧化防禦系統，亦嘗試應用於醫療領域。麥角硫醇之熱安定性、pH安定性高，即使於高溫， 亦可維持其抗氧化作用，除了期待生理作用而於食品中調配之外，亦期待作為抗氧化劑使用於食品。
就麥角硫醇之製造方法而言，使用從黃金菇等擔子菌之萃取、化學合成、使用微生物之發酵。從黃金菇等擔子菌之萃取在原材料的取得上費時，不適用於大量生產。化學合成雖適合大量生產，惟需使用高價位的合成試劑，並有精製成本變高之問題(專利文獻1)。因此，使用了C1化合物同化性之細菌或酵母之發酵(專利文獻2、非專利文獻1)、甚至於使用了經使麥角硫醇生合成基因過度表現之微生物之發酵(專利文獻3)作為製造方法為有力，就可將微生物發酵物直接使用或使用藉由簡單萃取操作而獲得之萃取物之點為有力。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2006-160748號公報
[專利文獻2]國際公開第2016/104437號
[專利文獻3]國際公開第2017/150304號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]PLOS One 2014 vol. 9(5) e97774
於藉由微生物培養而進行之ERG生產中，以提高ERG生產力為目的。
本發明人等以提高麴菌之ERG生產力為目的而進行深入研究時發現於功能未知之基因中，藉由導入特定的基因突變，而促進了麥角硫醇生產力，從而完成本發明。
此處，本發明為關於以下者：
[1]一種核酸，其編碼下列序列：在包含序列編號1所含有之保存區域之對應序列編號1之序列中，於與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域中含有會使該功能域之功能異常之突變之序列；或
與該序列至少具有90%同一性之序列，
並且當該核酸被導入會產生麥角硫醇的微生物中時，會促進麥角硫醇產生。
[2]如項目1所述之核酸，其中，前述保存區域為序列編號1之433位至440位之保存區域。
[3]如項目1所述之核酸，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變為與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域的缺失。
[4]如項目1所述之核酸，其中，前述經缺失之區域包含對應序列編號1之428位之位置。
[5]如項目1所述之核酸，其中，前述經缺失之區域為由1至120個胺基酸之缺失所構成。
[6]如項目4所述之核酸，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之427位至429位、427位至440位、427位至444位及419位至444位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
[7]如項目3所述之核酸，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之431位至475位、419位至475位及404位至515位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
[8]如項目1所述之核酸，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變係於對應序列編號1之428位之位置之G及/或對應459位之位置之C具有突變。
[9]如項目1所述之核酸，其中，前述核酸為源自選自由麴菌屬(Aspergillus)、青黴屬(Penicillium)、羅薩氏菌屬(Rasamsonia)、籃狀菌屬(Talaromyces)所構成之群組之微生物之核酸。
[10]一種載體，含有項目1至9中任一項所述之核酸。
[11]一種微生物，含有項目1至9中任一項所述之核酸。
[12]一種麥角硫醇之製造方法，包含將項目11所述之微生物培養。
[13]一種麥角硫醇產生能力經促進之微生物之製造方法，係包括：於含有序列編號1之433位至440位之保存區域之對應序列編號1之序列中，於與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域中導入會使該功能域之功能異常之突變；其中，前述微生物為選自由麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬及籃狀菌屬所構成之群組之會生成麥角硫醇的微生物。
[14]如項目13所述之製造方法，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變為與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域的缺失。
[15]如項目13所述之製造方法，其中，前述保存區域為序列編號1之433位至440位之保存區域。
[16]如項目14所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域包含對應序列編號1之428位之位置。
[17]如項目14所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域為由1至120個胺基酸所構成。
[18]如項目16所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之428位、427位至429位、427位至440位、427位至444位及419位至444位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
[19]如項目14所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之431位至475位、419位至475位及404位至515位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
[20]如項目14所述之製造方法，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變為於對應序列編號1之428位之位置之G及/或對應459位之位置之C具有突變。
根據本發明，於對應AO090005000664之基因中，於與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域中含有會使該功能域之功能異常之突變之微生物可促進ERG生產。
圖1表示AO090005000664之胺基酸序列(序列編號1)(A)及AO090005000664之鹼基序列(序列編號2)(B)。將411位至467位之保存區域著色表示。
圖2表示AO090005000664之胺基酸序列中，將保存區域(序列編號1之411位至479位：)與麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬及籃狀菌屬之直系同源基因經比較之圖。
圖3表示於米麴菌(Aspergillus oryzae)之AO090005000664中，已導入G428S突變及C459F突變之突變導入株之ERG生產量。
圖4表示於醬油麴菌(Aspergillus sojae)之AO090005000664直系同源基因中，已導入對應序列編號1之G428S之突變之突變導入株之ERG生產量。
圖5表示於黑麴菌(Aspergillus niger)之AO090005000664直系同源基因(An16g07990)中，已導入對應G428S之突變(G442S)之突變導入株之ERG生產量。
圖6表示將AO090005000664之胺基酸序列藉由BLAST分析而得之結果。將412位至462位再放大表示。
圖7A表示於AO090005000664基因所編碼之胺基酸序列中，於包含428位之區域(427位至429位之缺失(3DEL)、427至444位之缺失(18DEL)及419位至444位(26DEL))缺失之米麴菌之ERG產生量；圖7B表示於與AO090005000664基因具有98%同一性之直系同源基因所編碼之胺基酸序列中，於包含428位之區域(428位(1DEL)、427位至429位(3DEL)、427至440位(14DEL)、427至444位(18DEL)及419位至444位(26DEL))缺失之醬油麴菌之ERG產生量。
再者，圖7C表示於AO090005000664基因所編碼之胺基酸序列中，431位至475位之缺失(45DEL)、419至475位之缺失(57DEL)及404位至515位(112DEL))缺失之米麴菌之ERG產生量。
再者，圖7 D表示於與AO090005000664基因具有67%同一性之An16g07990基因所編碼之胺基酸序列中，於441至443位(3DEL)、441至458位(18DEL)、433至458位之缺失(26DEL)、433位至489位(57DEL)及418位至529位(112DEL)缺失之黑麴菌之ERG產生量。
圖8(A)表示使用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)針對由AO090005000664基因所表現之蛋白質進行同源性建模(homology modeling)而得之三維立體預測結構。圖8(B)表示將以點線所包圍之超二級結構的部分放大。
[用以實施發明之型態]
於本發明中，就欲將基因突變導入之微生物而言為具有麥角硫醇生產力之微生物。此種微生物較佳為絲狀菌，更佳可使用屬於麴菌(Aspergillus)屬、青黴(Penicillium)屬、羅薩氏菌(Rasamsonia)屬、籃狀菌(Talaromyces)屬之任意菌。麴菌屬之絲狀菌之一例可列舉米麴菌(Aspergillus oryzae)、醬油麴菌(Aspergillus sojae)、陸川麴菌(亦稱琉球麴菌)(Aspergillus luchuensis)、溜麴菌(Aspergillus tamarii)、黑麴菌(Aspergillus niger)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)。絲狀菌之菌株可使用例如米麴菌RIB40株、RIB326株等可公開取得之菌株、由麴種商店等所市售之麴種中含有之菌株、或從清酒、醬油釀造廠等之飲食品製造環境等所分離獲得之菌株。可使用分離獲得之菌株。
於本發明中，欲導入突變之基因係有關於米麴菌RIB40株中之被命名為AO090005000664之基因及其直系同源基因。此基因具有功能未知之轉譯區域，由將由657殘基之胺基酸序列(序列編號1)所構成之蛋白質予以編碼之鹼基序列(序列編號2)所構成。AO090005000664基因之醬油麴菌之直系同源基因之鹼基序列係對應Accession No.BaCA02000013之REGION 19840...21877(序列編號4)，其胺基酸序列以序列編號3表示。AO090005000664基因之溜麴菌、陸川麴菌、黑麴菌、小巢狀麴菌之直系同源基因分別為BDV40DRAFT_264902(胺基酸序列：序列編號5，鹼基序列：序列編號6)、AAWM_07753(胺基酸序列：序列編號7，鹼基序列：序列編號8)、An16g07990(胺基酸序列：序列編號9，鹼基序列：序列編號10)及ANIA_10201(胺基酸序列：序列編號11，鹼基序列：序列編號12)。於麴菌屬中被高度保存，於醬油麴菌具有98%、於溜麴菌具有96%、於陸川麴菌具有67%、於黑麴菌具有67%、於小巢狀麴菌具有62%之胺基酸序列之同一性。此等基因於醬油麴菌具有100%、於溜麴菌具有98%、於陸川麴菌具有79%、於黑麴菌具有79%、於小巢狀麴菌具有75%之胺基酸序列之相同性。
AO090005000664中存在與其他種以高度保存之複數個保存區域。就此種保存區域而言，尤其可列舉對應序列編號1之411至479位之區域(序列編號13)。從更高保存性之區域之觀點而言，保存區域較佳為對應序列編號1之411位至467位之區域(序列編號14)，更佳為對應411位至462位(序列編號15)之區域，再更佳為對應411位至444位(序列編號16)之區域，又更佳為對應427位至444位(序列編號17)之區域，又再更佳為對應433位至440位(序列編號18) 之區域。對應433位至440位(序列編號18)之區域於麴菌屬中以極高地被保存，更佳為可完全一致。
本發明之核酸可源自絲狀菌，例如麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬或籃狀菌屬。本發明之核酸於此等絲狀菌中之保存性高。源自屬於麴菌屬之絲狀菌之核酸係將相對於序列編號1具有75至100%相同性之胺基酸序列編碼。源自屬於青黴屬之絲狀菌之核酸係將相對於序列編號1具有68至75%相同性之胺基酸序列編碼。源自屬於羅薩氏菌屬之絲狀菌之核酸係將相對於序列編號1具有70%相同性之胺基酸序列編碼。源自屬於籃狀菌屬之絲狀菌之核酸係將相對於序列編號1具有64至68%相同性之胺基酸序列編碼。
於本發明中，對應序列編號1之序列係指特定之絲狀菌所具有之會成為AO090005000664之直系同源之基因之胺基酸序列。會成為直系同源之基因可藉由使用NCBI之blastp程式，從已登錄於NCBI之蛋白質資料庫中選擇。此種直系同源通常具有40%以上、50%以上或60%以上之相同性。此種對應序列編號1之序列更佳為麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬或籃狀菌屬之直系同源基因所編碼之胺基酸序列。更佳為米麴菌、醬油麴菌、溜麴菌、陸川麴菌、黑麴菌或小巢狀麴菌之直系同源基因之胺基酸序列。於本發明之一態樣中，對應序列編號1之序列可藉由含有保存區域來定義。因此，對應序列編號1之序列為將會成為AO090005000664之直系同源之基因編碼之胺基酸序列，且係藉由序列編號1所含有之既定之保存區域而特定。對應序列編號1之序列之具體例可列舉選自由序列編號1、3、5、7、9及11所構成之群組之胺基酸序列。
保存區域之一例為位於序列編號1之427位至444位(序列編號17)、411至444位(序列編號16)、411至462位(序列編號15)或433位至440位 (序列編號18)。其中，從於麴菌屬為一致之觀點而言，藉由含有序列編號1之433位至440位(序列編號18)之保存區域，可定義對應序列編號1之序列。對應序列編號1之序列所含有之保存區域也可由以下之序列替代此保存區域而特定：
Figure 112120151-A0202-12-0010-9
(序列編號43)[於序列中，
X430為至少1個選自由Q、H、P及D所構成之群組之胺基酸；
X431為至少1個選自由Q及L所構成之群組之胺基酸；
X432為至少1個選自由P、Q及G所構成之群組之胺基酸；
X433為至少1個選自由D及E所構成之群組之胺基酸；
X435為至少1個選自由R及W所構成之群組之胺基酸；
X437為至少1個選自由L及I所構成之群組之胺基酸；
X438為至少1個選自由V及M所構成之群組之胺基酸；
X441為至少1個選自由V、I及L所構成之群組之胺基酸]。
其他之例，保存區域尤其以於麴菌屬所保存之序列為較佳。此種保存區域可列舉下列者：
Figure 112120151-A0202-12-0010-10
(序列編號19)[於序列中，
X430為至少1個選自由Q、H及P所構成之群組之胺基酸；
X431為至少1個選自由Q及L所構成之群組之胺基酸；
X432為至少1個選自由P及G所構成之群組之胺基酸；
X441為至少1個選自由V及I所構成之群組之胺基酸]。
進一步之例，保存區域可列舉下列者：
Figure 112120151-A0202-12-0011-11
(序列編號44)[於序列中，
X412為至少1個選自由E及D所構成之群組之胺基酸；
X416為至少1個選自由Q、H及E所構成之群組之胺基酸；
X417為至少1個選自由N、H及D所構成之群組之胺基酸；
X418為至少1個選自由Y、F及C所構成之群組之胺基酸；
X422為至少1個選自由N及S所構成之群組之胺基酸；
X424為至少1個選自由W、C及M所構成之群組之胺基酸；
X425為至少1個選自由Y、Q、S、A及G所構成之群組之胺基酸；
X426為至少1個選自由L、I、V及M所構成之群組之胺基酸；
X430為至少1個選自由Q、H及P所構成之群組之胺基酸；
X431為至少1個選自由Q及L所構成之群組之胺基酸；
X432為至少1個選自由P及G所構成之群組之胺基酸；
X441為至少1個選自由V及I所構成之群組之胺基酸]。進一步之例，保存區域可列舉下列者：
Figure 112120151-A0202-12-0012-12
(序列編號45)[於序列中，
X412為至少1個選自由E及D所構成之群組之胺基酸；
X416為至少1個選自由Q、H及E所構成之群組之胺基酸；
X417為至少1個選自由N、H及D所構成之群組之胺基酸；
X418為至少1個選自由Y、F及C所構成之群組之胺基酸；
X422為至少1個選自由N及S所構成之群組之胺基酸；
X424為至少1個選自由W、C及M所構成之群組之胺基酸；
X425為至少1個選自由Y、Q、S、A及G所構成之群組之胺基酸；
X426為至少1個選自由L、I、V及M所構成之群組之胺基酸；
X430為至少1個選自由Q、H及P所構成之群組之胺基酸；
X431為至少1個選自由Q及L所構成之群組之胺基酸；
X432為至少1個選自由P及G所構成之群組之胺基酸；
X441為至少1個選自由V及I所構成之群組之胺基酸；
X445為至少1個選自由Y及F所構成之群組之胺基酸；
X446為至少1個選自由Q及K所構成之群組之胺基酸；
X447為至少1個選自由V及I所構成之群組之胺基酸；
X448為至少1個選自由F、V、I、Y、C及L所構成之群組之胺基酸；
X450為至少1個選自由N、G、D、H、E、Q及S所構成之群組之胺基酸；
X452為至少1個選自由S、G、D、H、A及E所構成之群組之胺基酸；
X453為至少1個選自由F、Y、D、C及H所構成之群組之胺基酸；
X454為至少1個選自由D、E、N、K及Q所構成之群組之胺基酸；
X456為至少1個選自由P、H、T、S及N所構成之群組之胺基酸；
X461為至少1個選自由D、N及S所構成之群組之胺基酸；
X464為至少1個選自由I、L及V所構成之群組之胺基酸；
X465為至少1個選自由N、D、S、C、Q、R、H及G所構成之群組之胺基酸；
X466為至少1個選自由H及R所構成之群組之胺基酸]。
可將屬於具有如此保存區域之胺基酸序列且相對於序列編號1之胺基酸序列具有至少60%之相同性之胺基酸序列定義為對應序列編號1之序列。對應序列編號1之序列可由在含有上述保存區域之同時，並且相對於序列編號1具有至少60%、至少63%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%之相同性或同一性來特定。
於本發明之一態樣中，本發明係有關於核酸，其編碼下列序列：在對應序列編號1之序列中，於與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域中含有會使該功能域之功能異常之突變之序列；或
與該序列具有至少90%之同一性之序列，並且當該核酸導入會產生麥角硫醇的微生物中時會促進麥角硫醇產生。
於本發明中，功能域係指於AO090005000664基因或其直系同源基因所編碼之蛋白質中之序列編號1之W404至Q515之功能域或對應該功能域 之功能域。如此功能域係表示存在由5個α螺旋所構成之呈超二級結構之域(圖8(A)及(B))。此功能域之具體功能仍未知，另一方面，從構成功能域之427位至429位的缺失(3DEL)、427至444位的缺失(18DEL)及419位至444位(26DEL)、431位至475位(45DEL)、419位至475位(57DEL)及404位至515位(112DEL)缺失時會促進麥角硫醇產生來看，功能域之功能異常有助於麥角硫醇產生。尤其是從藉由構成功能域之胺基酸的缺失而麥角硫醇產生增加之觀點而言，麥角硫醇產生的增加係需要妨礙功能域中之功能。又，序列編號1之428位及459位係位於5個α螺旋之連接區域，於如此位置之突變被認為影響超二級結構中之結構變化之可能性很高。
會使功能域之功能異常之突變若為能影響序列編號1之W404至Q515之功能域或是對應該功能域之功能域之功能之突變即可，如此突變可為該功能域中之1個或複數個胺基酸的缺失、添加或取代。對應之功能域係指被命名為AO090005000664之基因之直系同源基因之功能域。藉由影響如此功能域之功能，而於具有AO090005000664基因或其直系同源基因之會產生麥角硫醇的微生物，可促進麥角硫醇生產力。從促進麥角硫醇產生之觀點而言，會使功能域異常之突變為與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域的缺失、或是於對應428位之位置之G及/或對應459位之位置之C之突變，尤其是取代。
缺失之胺基酸之數量只要於產生缺失之微生物中ERG生產受到促進，則可為任意之數。作為一例，缺失之胺基酸之數量可為選自由1至120、1至112、1至60、1至57及1至47所構成之群組之任意範圍之數量缺失。缺失之胺基酸之數量較佳為1至30，更佳為1至26之任意數。作為一例，選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25及26所構成之群組之至少1種數量之胺基酸缺失。更具體而言，可為對應428位之位置之胺基酸缺失、或是含有對應428位之位置之胺基酸之複數個胺基酸缺失。於其他態樣，可為不包含對應428位之位置之胺基酸之胺基酸缺失。
作為一例，可為411位至462位之保存區域(序列編號15)所含有之包含428位之任意序列缺失。作為一例，可為與選自由428位、427位至429位、427位至440位(序列編號20)、427位至444位(序列編號17)及419位至444位(序列編號21)所構成之群組之至少一區域對應之區域缺失。再者，作為其他之例，可為與選自由431位至475位、419位至475位及404位至515位所構成之群組之至少一區域對應之區域缺失。
於本發明中，胺基酸位置係依據AO090005000664基因所編碼之序列編號1之胺基酸位置而表示，惟，於對應之基因，亦即於直系同源基因所編碼之蛋白質中表示對應之胺基酸位置。對應之位置可藉由將序列編號1之胺基酸序列之相同序列進行排比(alignment)來決定。
相對於與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域經缺失之序列之同一性具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性。具有如此同一性且於絲狀菌中與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域經缺失時，可選擇會增加麥角硫醇生產力之序列。
有助於麥角硫醇生成之功能係指於麥角硫醇之生成過程中擔任某種功能。作為此種功能，可為有助於麥角硫醇之合成路徑或分解路徑之酵素的轉錄調控相關之功能，亦可為有助於麥角硫醇之合成路徑之酵素反應，亦可為有助 於麥角硫醇或其前驅物之分解路徑之酵素反應。於對應序列編號1之序列中，將與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域經缺失之序列編碼之本發明之核酸導入於麥角硫醇產生性之絲狀菌中，藉此具有促進麥角硫醇產生之功能。
本發明更有關麥角硫醇產生能力經促進之微生物之製造方法。更具體而言，如此製造方法包含：於對應序列編號1之序列中，使與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域缺失。該缺失之區域通常為與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域，惟若可促進麥角硫醇產生能力，則404至511位之鄰接之區域亦可缺失。當與序列編號1之404位至511位之功能域對應之功能域所含有之區域缺失時，該缺失之區域可包含或不包含對應序列編號1之428位之位置。於缺失之區域中較佳為包含對應序列編號1之428位之位置。缺失之區域為與選自由序列編號1之428位、427位至429位、427位至440位、427位至444位及419位至444位所構成之群組之至少一區域對應之區域。缺失之區域可為使411位至462位(序列編號15)之保存區域全部缺失，再者亦可為使404位至515位之功能域全部缺失。關於缺失之範圍，若具有如此缺失之微生物可促進麥角硫醇產生，則可為任意的缺失。在W404至Q515之功能域內，尤其是在411位至462位(序列編號15)之保存區域內之連續之胺基酸序列缺失，亦可不連續之胺基酸序列缺失。前述微生物為選自由麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬及籃狀菌屬所構成之群組之會生成麥角硫醇的微生物。
於本發明之其他態樣中，亦關於核酸，其於對應序列編號1之序列中，於對應序列編號1之428位之位置之G及/或對應459位之位置之C具有突變，當該核酸導入會產生麥角硫醇的微生物中時，會促進麥角硫醇產生。於 如此位置之突變更具體而言可為G428S及/或C459F之取代。藉由具有於如此位置具有突變之核酸，促進會產生麥角硫醇的微生物之麥角硫醇產生。更具體而言，對應序列編號1之序列具有經由本說明書所定義之保存區域。
再者，本發明亦可關於核酸，其編碼下述1)或2)之胺基酸序列：
1)於選自由序列編號1、3、5、7、9及11所構成之群組之胺基酸序列中，在對應428位之位置具有S及/或在對應459位之位置具有F之胺基酸序列、或
2)相對於選自由序列編號1、3、5、7、9、11所構成之群組之胺基酸序列具有至少60%之同一性且在對應428位之位置具有S及/或在對應459位之位置具有F之胺基酸序列，
並且當該核酸被導入於會產生麥角硫醇的絲狀菌時，會促進麥角硫醇產生。藉由具有G428S、C459F突變，可促進麥角硫醇產生。
相對於序列編號1、3、5、7、9、11之同一性係具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%之同一性。尤其是醬油麴菌之直系同源基因及黑麴菌之直系同源基因分別為68%及67%之同一性，另一方面，藉由將對應G428S之突變(於黑麴菌中為G442S)導入於醬油麴菌及黑麴菌中，確認了ERG產生的促進(圖4及5)。
再者，本發明亦可關於核酸，其由下列鹼基序列所構成，
該鹼基序列係相對於序列編號2、4、6、8、10及12之鹼基序列具有至少60%之同一性，且於對應序列編號1之胺基酸序列之428位之位置及/或對應459位之位置編碼突變，
並且當該核酸被導入於會產生麥角硫醇的微生物時，會促進麥角硫醇之產生。藉由具有G428S、C459F突變，可促進麥角硫醇產生。
相對於序列編號2、4、6、8、10及12之同一性係具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%之同一性。尤其是，醬油麴菌之直系同源基因及黑麴菌之直系同源基因分別為68%及67%之同一性，另一方面，藉由將對應G428S之突變(於黑麴菌中為G442S)導入，確認了ERG產生的促進(圖4及5)。
本發明之核酸可源自於絲狀菌，例如麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬或籃狀菌屬。本發明之核酸於此等絲狀菌中之保存性高。被編碼為於源自屬於麴菌屬之絲狀菌之核酸之胺基酸序列相對於序列編號1具有75至100%之相同性。被編碼為於源自屬於青黴屬之絲狀菌之核酸之胺基酸序列相對於序列編號1具有68至75%之相同性。被編碼為於源自屬於羅薩氏菌屬之絲狀菌之核酸之胺基酸序列相對於序列編號1具有70%之相同性。被編碼為於源自屬於籃狀菌屬之絲狀菌之核酸之胺基酸序列相對於序列編號1具有64至68%之相同性。
有助於麥角硫醇生成之功能係指擔負麥角硫醇之生成過程中之某種酵素反應。可為有助於麥角硫醇合成路徑之酵素反應，亦可為有助於麥角硫醇或其前驅物之分解路徑之酵素反應。當擔負有助於合成路徑之酵素反應時，本發明之核酸所編碼之蛋白質可具有麥角硫醇或其前驅物之合成活性。當有助於分解路徑之酵素反應時，本發明之核酸所編碼之蛋白質可具有麥角硫醇或其前驅物或代謝物之分解活性。將在對應序列編號1之428位之位置具有S及/或在對應459位之位置具有F之胺基酸序列編碼之本發明之核酸藉由被導入於麥角硫醇產生性之絲狀菌中，而具有促進麥角硫醇產生之功能。
對應序列編號1之428位之位置及對應459位之位置可藉由將序列編號1之胺基酸序列之相同序列進行排比而決定。於一例中，可從鄰近之序列來決定，屬於428位之鄰近序列之LSGLQ之G位置係對應428位。藉由428位之G突變成S，而促進麥角硫醇生產力。屬於459位之鄰近序列之APCED之C位置係對應459位。藉由459位之C突變成F，而促進麥角硫醇生產力。對應428位之位置及對應459位之位置可個別導入突變，亦可同時導入突變。
本發明更有關麥角硫醇產生能力經促進之微生物之製造方法。更具體而言，如此製造方法包含：對於將本發明之保存區域編碼之微生物之基因組，於對應序列編號1之428位之位置及/或對應459位之位置導入突變。對應428位之位置之突變為G428S，459位之突變較佳為C459F。前述微生物為選自由麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬及籃狀菌屬所構成之群組之會生成麥角硫醇的微生物。作為一例，係關於前述製造方法，其包含：於對應序列編號1之部分序列(427位至444位)之以下之保存區域中，
Figure 112120151-A0202-12-0019-13
(序列編號43)[於序列中，
X430為至少1個選自由Q、H、P及D所構成之群組之胺基酸；
X431為至少1個選自由Q及L所構成之群組之胺基酸；
X432為至少1個選自由P、Q及G所構成之群組之胺基酸；
X433為至少1個選自由D及E所構成之群組之胺基酸；
X435為至少1個選自由R及W所構成之群組之胺基酸；
X437為至少1個選自由L及I所構成之群組之胺基酸；
X438為至少1個選自由V及M所構成之群組之胺基酸；
X441為至少1個選自由V、I及L所構成之群組之胺基酸]
對於將於428位之G及/或459位之C具有突變之保存區域編碼之基因組，於以下之對應428位之位置及/或對應459位之位置導入突變，其中，
前述微生物為選自由麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬及籃狀菌屬所構成之群組之會生成麥角硫醇的微生物。
對於基因組之突變導入可使用任意之手法導入。可使用常規方法之轉形(transformation；亦稱轉化)系導入，亦可將隨機突變導入之結果而導入，亦可利用基因組編集技術而導入。作為一例，於轉形系中，可使用基因盒(gene cassette)而導入，亦可進行部位特異性之基因導入，亦可藉由載體等而導入。於本發明之其他態樣中，亦可關於以可表現的方式插入了本發明之核酸之載體。隨機突變之突變導入方法可列舉例如：使DNA物理性損傷而導入突變之紫外線(UV)或X射線照射、使DNA化學性損傷而導入突變之藉由N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等烷基化試劑所進行之處理等。就基因組編集技術而言，作為一例，可利用：利用了CRISPR/Cas系統之部位特異性切斷及同源重組。本發明亦關於含有本發明之核酸之微生物。本發明之製造方法之結果取得之微生物。
藉由培養本發明之微生物，能以高生產力製造麥角硫醇。本發明之微生物能以固體培養或液體培養之任一種進行培養。作為一例，於蒸過的米飯中將本發明之微生物進行培養，可製造麥角硫醇含量高之米麴。使用如此之麴，經過本技術領域周知之步驟，可製造醬油、味噌、鹽麴、日本甘酒等，或可收集 麴菌而獲得真菌蛋白(mycoprotein)。因此，於本發明之一態樣中，本發明亦關於含有高含量之麥角硫醇之米麴之製造方法。所生成之麥角硫醇可從培養物中依據常規方法而精製。作為一例，可將培養物粉碎，使水蒸發而獲得乾燥粉末。對於經乾燥之含有麥角硫醇的原料，藉由添加含水乙醇，麥角硫醇被萃取至乙醇溶液中。除去不溶性物質，可將乙醇溶液中之麥角硫醇提供於層析儀而精製。
已知麥角硫醇係以抗氧化作用為首，而具有彈性蛋白酶抑制作用、酪胺酸酶抑制作用、多酚氧化酶(PPO)抑制作用等種種作用。因此，所製造之麥角硫醇可精製後或直接調配於食品、化粧品、準藥品及醫藥品等製品，亦可作為於製品中所調配之濃縮物而調製。作為食品而調配時，可製作成機能性表示食品。作為如此之機能性表示，可表示麥角硫醇之依據彈性蛋白酶抑制作用之抗皺紋作用、依據酪胺酸酶抑制活性之美肌或美白作用、依據過氧化脂質之生成之生活習慣病預防作用、依據除去活性氧之失智症或阿滋海默症之預防作用等功能。所製造之麥角硫醇亦可為著眼於尤其麥角硫醇之生理作用之機能性表示食品、營養機能食品、特定保健用食品或營養補充食品(補充劑)。
於本揭示中所提到之所有文獻皆藉由引用而將其全體援引於本說明書中。相同性係使用NCBI之blastp程式，並使用已登錄於NCBI之蛋白質資料庫來決定。於本揭示中相同性及同一性的%以外之「%」若未特別提及，則係意指質量%。
以下說明之本發明之實施例只為例示目的，本發明之技術範圍不限定於此等。本發明之技術範圍只受專利申請範圍之記載所限定。以不脫離本發明之宗旨作為條件，可進行本發明之變更，例如本發明構成要件之追加、削除及置換。
[實施例]
實施例1：ERG高生產株之分析
(1)培養基
麴菌屬之真核生物係使用以下之培養基進行培養。於液體培養中係使用Czapek-DOX(Cz-DOX)培養基(3.5%Czapek-DOX培養液(broth)，BD公司製造，pH6.0)、PD培養基(2%糊精、1%聚蛋白腖、0.5%KH2PO4、0.1%NaNO3、0.05% MgSO4、0.1%酪蛋白胺基酸，pH6.0)、PAFUMIN培養基(5%PAFUMIN SM、pH無調整)。於盤培養中主要使用Cz-DOX瓊脂培養基(3.5% zapek-DOX培養液，BD公司製造，添加0.1%微量元素(trace element)、2%Agar)或麥芽瓊脂培養基(4.5%Malt Agar Nissui，日水製藥公司製造，0.1%微量元素、0.5%酵母萃取物)。
(2)ERG高生產株之基因組分析
分析ERG高生產株之全基因組，發現其中功能未知之被稱為AO090005000664之基因中之G428S或C459F突變有助於促進ERG生產。AO090005000664之胺基酸序列(序列編號1)及鹼基序列(序列編號2)為如圖1所示。
針對AO090005000664之胺基酸序列，於NCBI(美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information))，以BLAST(基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))之預設值設定進行相同性搜索時發現於麴菌屬中高度地保存，於序列編號1之411至467位發現經高度保存之保存區域(圖2)。AO090005000664與米麴菌、醬油麴菌、溜麴菌、陸川麴菌、黑麴菌及小巢狀麴菌之直系同源基因之相同性各別為100%、98%、96%、67%、67%及62%。
實施例2：於米麴菌RIB40株之突變再現株之製作及ERG生產力之確認
(1)G428S盒之製作
將米麴菌RIB40_dKP株(△ku70、△pyrG)作為宿主，製作用以在AO090005000664基因中導入G428S突變之基因盒。表1表示引子(primer)。將RIB40株之基因組序列作為模板，以AoG428S_F1及R1、AoG428S_F2及R2、AoG428S_F3及R3、AopyrG F及R之引子組，藉由PCR，將基因片段增幅。PCR條件係依照隨附之實驗指南(protocol)。將精製之4個PCR增幅片段及線性化pUC19(Linerized pUC19)(Takara)(各0.5μL)與NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB)2.5μL混合，於60℃進行反應1小時。將反應物4μL導入ECOS Competent E.coli JM109(NIPPON GENE)中，進行轉形。接著，將從此轉形體所萃取之質體，使用模板AoG428S_NF及NR之引子組，將藉由PCR所增幅之基因片段製作成G428S盒。PCR產物50μL係經乙醇沉澱處理，並溶解於滅菌水10μL。
Figure 112120151-A0202-12-0024-14
(2)C459F盒之製作
進行與上述(1)相同之操作，製作C459F盒。引子為將AoG428S_R2變更為AoC459F_R2、將AoG428S_F3變更為AoC459F_F3而實施。
(3)A.oryzae RIB40_dKP之轉形
將RIB40_dKP株塗抹於含有10mM脲苷、10mM脲嘧啶之Cz-DOX_UraUri培養基，於30℃培養5日。於盤上生長，將分生孢子以接種環(microloop)刮取，於已放入150mL容量之三角燒瓶中之含有10mM脲苷、10mM脲嘧啶之PD培養基40mL中接種。於30℃以180rpm進行旋轉培養20小時，將菌體回收。
將培養後之菌體以MIRACLOTH進行集菌，以KCl緩衝液(0.6M KCl，0.1M NaH2PO4，pH5.5)洗淨。將回收之菌體懸浮於細胞壁溶解酵素20mL(0.5%裂解酶(Lysing enzyme)(Sigma-aldrich公司製造)、0.3% (Yatalase(Takara公司製造)、1.5%纖維素酶Onozuka(Cellurase Onozuka)(Yakult公司製造)/20mL KCl緩衝液)，於30℃振盪3小時後，通過70μm之細胞過濾器(cell strainer)將濾液回收。
酵素處理後，藉由離心處理(4℃、3000rpm、10分鐘)將原生質體沉澱，除去上清液。接著，加入SolB緩衝液(1.2M山梨糖醇，0.1M KCl，10mM Tris-HCl；pH7.5)30mL，將原生質體再懸浮，移到Eppendorf微量離心管，藉由離心處理將原生質體回收。進一步，加入30mL之SolB緩衝液，再度重覆進行同樣的洗淨操作。將回收之原生質體懸浮於0.4至0.8mL之Sol B。於該原生質體懸浮液100μL中加入G428S盒或C459F盒5至10μg、12.5μL之SolC(50% PEG3350，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl；pH7.5)，慢慢混合後，於冰上培養30分鐘。之後加入1mL之SolC，藉由移液使其混合後，於室溫靜置10分鐘。之後加入10mL之SolB，藉由離心處理將原生質體沉澱，除去上清液。將全量放在再生用瓊脂培養基(3.5%Czapek-DOX培養液、1.2M山梨糖醇、0.1%微量元素、2%瓊脂)上，將50℃之Top Agar(3.5%Cz-DOX培養液、1.2M山梨糖醇、0.1%微量元素、0.5%瓊脂)重疊，於30℃培養約1週。
所獲得之轉形體係在Cz-DOX瓊脂培養基(3.5%Czapek-DOX培養液、0.1%微量元素、1.5%瓊脂)點植3次，而純化。
(4)突變再現株之ERG生產量之確認
比較上述所獲得之轉形體及作為對照組之RIB40野生株之ERG生產量。
(4-1)培養/萃取
於50mL容量之三角燒瓶中調製PAFUMIN培養基(5%PAFUMIN SM，pH無調整)10mL，於120℃進行滅菌釜滅菌30分鐘。於此添加分生孢子懸浮液 (1.0×107個/ml)100μL，於30℃，以160rpm振盪培養4日。將培養液以熱水萃取(90℃，1小時)，將上清液0.5mL以Nanosep離心過濾裝置(日本頗爾公司(Nihon Pall Co.,Ltd)製造3K)過濾，適當地以超純水稀釋，而作為分析試樣。
(4-2)分析條件
根據下述之分析條件來測定分析試樣中之ERG量。
LC/MS分析條件：
分析裝置：UPLC CQ micro；Waters UPLC
管柱：2.5 HILIC 3.0mml.D.×150mm
溶劑A：0.1%甲酸/乙腈
溶劑B：0.1%甲酸/H2O
流速：0.5ml/分鐘80%A
注入：3μl
質量分析計
ESI：ES+
Cone V：21V
毛細管電壓(Capillary voltage)：4.5kV
源溫度(Source temperature)：120℃
溶劑揮散溫度(Desolvation temperature)：400℃
MS 掃描模式
於LC/MS/MS之ERG分析條件：
分析裝置：UPLC CQ micro；Waters UPLC
管柱：2.5 HILIC 3.0mml.D.×150mm
溶劑A：0.1%甲酸/乙腈
溶劑B：0.1%甲酸/H2O
流速：0.5ml/分鐘80%A
每隔1試樣逐一以100%B將管柱洗淨
注入：3μL
質量分析計
ESI：ES+
Cone V：21V
毛細管電壓：4.5kV
源溫度：120℃
溶劑揮散溫度：400℃
碰撞能量(Collision energy)：11V
Trace：m/z 230.1>186.1
碰撞能量：20V
Trace：m/z 230.1>127.0
(5)轉形株之序列確認
將於Cz-DOX瓊脂培養基培養4日之菌體之分生孢子以牙籤刮2次之程度的分量懸浮於100μL之TE而得到分生孢子懸浮液，將該分生孢子懸浮液0.8μL加入至19.2μL之KOD one(Toyobo公司製造)PCR反應液中，進行菌落PCR。將PCR產物以QIAquick PCR純化套組(purification kit)(QIAGEN公司製造)精製。從管柱之溶析係使用溶析緩衝液(Elution Buffer)(QIAGEN公司製造)，溶析量係 以與PCR系統同樣量之50μL而溶析。將經精製之PCR產物委託Fasmac公司確認序列。
於G428S突變再現之轉形體48株中，2株發生G428S突變。於C459F突變再現之轉形體40株中，1株發生C459F突變。
圖3表示各菌株之ERG生成量。比較突變導入株之ERG生產力的結果，相較於對照株及野生株，ERG生產力提昇。與G428S突變導入株相比，C459F突變導入株ERG生成量少，但明瞭C459F突變同樣是本基因突變與提昇ERG生產力有關。
實施例3：於醬油麴菌之突變再現株之製作及ERG生產力之確認
以與實施例1之米麴菌RIB40株之AO090005000664 G428S突變再現株之製作的項目中所述之方法相同地，將醬油麴菌NBRC4239_dKP株(△ku70、△pyrG)作為宿主，進行突變導入、轉形、ERG生產量之確認。於醬油麴菌之AO090005000664基因之直系同源基因之胺基酸同一性為98%，胺基酸相同性為100%。
Figure 112120151-A0202-12-0029-15
G428S突變再現之轉形體19株中，6株發生G428S突變。
圖4表示各菌株之ERG生成量。比較突變導入株之ERG生產力的結果，相較於對照株及野生株，ERG生產力提昇。明瞭於醬油麴菌中，本基因突變與提昇ERG生產力有關。
實施例4：於黑麴菌(Aspergillus niger)之突變再現株之製作及ERG生產力之確認
以與實施例1之米麴菌RIB40株AO090005000664 G428S突變再現株之製作的項目中所述之方法相同地，將黑麴菌A1179株(別名MA70.15、Genotyping：kusA：：amdS、cspA1(會成為短分生孢子梗(short conidiophores)之突變)、pyrG-)作為宿主，進行突變導入、轉形，將培養日數變更為6日，進行ERG生產量之確認。
Figure 112120151-A0202-12-0030-16
於黑麴菌之AO090005000664基因之直系同源基因之胺基酸同一性為67%，胺基酸相同性為79%。顯示ERG高生產力之米麴菌株之突變點(G428S及C459F)於黑麴菌中亦經保存(G442及C473)。因此，製作將與於米麴菌RIB40株中已確認突變效果之G428S對應之第442號之甘胺酸取代為絲胺酸而成之突變株。圖5顯示各菌株之ERG生成量。比較突變導入株之ERG生產力的結果，相較於對照株及野生株，ERG生產力提昇。明瞭於黑麴菌中，本基因突變與ERG生產力提昇有關。
實施例5：ERG高生產株之分析
(1)培養基
麴菌屬之真核生物係使用以下之培養基培養。於液體培養中係使用Czapek-DOX(Cz-DOX)培養基(3.5%Czapek-DOX培養液，BD公司製造，pH6.0)、PD培 養基(2%糊精、1%聚蛋白腖、0.5%KH2PO4、0.1%NaNO3、0.05%MgSO4、0.1%酪蛋白胺基酸，pH6.0)、PAFUMIN培養基(5%PAFUMIN SM，pH無調整)。於盤培養中主要使用Cz-DOX瓊脂培養基(3.5% zapek-DOX培養液，BD公司製造，添加0.1%微量元素、2%瓊脂)或麥芽瓊脂培養基(4.5%Malt Agar Nissui，日水製藥公司製造，0.1%微量元素、0.5%酵母萃取物)。
(2)ERG高生產株之基因組分析
分析ERG高生產株之全基因組，發現其中於功能未知之被稱為AO090005000664之基因之胺基酸缺損有助於促進ERG生產。AO090005000664之胺基酸序列(序列編號1)及鹼基序列(序列編號2)為如圖1所示。
針對AO090005000664之胺基酸序列，於NCBI(美國國家生物技術資訊中心)，以BLAST(基本局部比對搜索工具)之預設值設定進行相同性搜索時發現於麴菌屬中高度地被保存，於序列編號1之411至467位發現被高度保存之保存區域(圖6)。AO090005000664與米麴菌、醬油麴菌、溜麴菌、陸川麴菌、黑麴菌及小巢狀麴菌之直系同源基因之同一性各別為100%、98%、96%、67%、67%及62%。
實施例6：米麴菌RIB40株之胺基酸缺損株之製作
(1)胺基酸缺損盒之製作及米麴菌RIB40_dKP之轉形株之取得
將RIB40_dKP株(△ku70、△pyrG)作為宿主，製作胺基酸缺損之基因盒。缺損之胺基酸係設為將G428作為中心之保存性高之胺基酸(圖6)。具體而言，分別使428位、427位至429位、427位至440位、427位至444位及419位至444位缺失。表1表示使用之引子。
將RIB40株之基因組序列作為模板，以引子1及2、引子3及4、引子5及6之引子組，藉由PCR將基因片段增幅。PCR條件係依照隨附之實驗指南。將經精製之3個PCR增幅片段及線性化pUC19(Linerized pUC19)(Takara)(各0.5μL)與NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB)2.5μL混合，於60℃進行反應1小時。將反應物4μL導入ECOS Competent E.coli JM109(NIPPON GENE)中，進行轉形。接著，將從此轉形體所萃取之質體作為模板，以引子7及8(Ao3DEL)、引子9及8(Ao18DEL)、以及引子9及10(Ao26DEL)之組，藉由PCR將基因片段增幅。PCR條件係依照隨附之實驗指南。於各PCR反應液中添加DpnI，於37℃進行反應1小時。接著，將經DpnI處理之各PCR產物2μl與Ligation high Ver.2(Toyobo)5μl、T4多核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)1μl、滅菌水7μl混合，於16℃進行反應1小時。將各反應物5μL導入至ECOS Competent E.coli JM109(NIPPON GENE)中，進行轉形。接著，將從此轉形體所萃取之各質體作為模板，使用引子11及12之組，將藉由PCR所增幅之基因片段各別製作成胺基酸缺損盒AoXDEL盒(X=3、18、26)。PCR產物50μL係經乙醇沉澱處理，並溶解於滅菌水10μL。
將AoXDEL盒導入，將RIB40_dKP株進行轉形。轉形株係藉由於Cz-DOX瓊脂培養基點植來繼代3次，而純化。
(2)分生孢子PCR
針對盒導入位置，使用引子1及4，藉由帶(band)的大小來確認。又，將此PCR產物精製，進行序列分析，確認胺基酸缺損。
Figure 112120151-A0202-12-0033-17
(3)胺基酸缺損株之ERG生產量之確認
將上述所獲得之轉形體及對照組於50ml容量之三角燒瓶中以5%PAFUMIN SM培養基10ml於26℃培養7日。培養後以滅菌釜之溶解/保溫模式於90℃加熱1小時，將其上清液以Nanosep離心過濾裝置(日本頗爾公司製造3K)過濾，以LC/MS/MS定量(圖7A)。
(3-2)分析條件
根據下述之分析條件來測定分析試樣中之ERG量。
LC/MS分析條件：
分析裝置：UPLC CQ micro；Waters UPLC
管柱：2.5 HILIC 3.0mml.D.×150mm
溶劑A：0.1%甲酸/乙腈
溶劑B：0.1%甲酸/H2O
流速：0.5ml/分鐘80%A
注入：3μl
質量分析計
ESI：ES+
Cone V：21V
毛細管電壓：4.5kV
源溫度：120℃
溶劑揮散溫度：400℃
MS 掃描模式
於LC/MS/MS之ERG分析條件：
分析裝置：UPLC CQ micro；Waters UPLC
管柱：2.5 HILIC 3.0mml.D.×150mm
溶劑A：0.1%甲酸/乙腈
溶劑B：0.1%甲酸/H2O
流速：0.5ml/分鐘80%A
每隔1試樣逐一以100%B將管柱洗淨
注入：3μL
質量分析計
ESI：ES+
Cone V：21V
毛細管電壓：4.5kV
源溫度：120℃
溶劑揮散溫度：400℃
碰撞能量：11V
Trace：m/z 230.1>186.1
碰撞能量：20V
Trace：m/z 230.1>127.0
實施例7：醬油麴菌NBRC4239株之胺基酸缺損株之製作
(1)胺基酸缺損盒之製作及醬油麴菌NBRC4239_dKP之轉形株之取得
將NBRC4239_dKP株(△ku70、△pyrG)作為宿主，而與上述之米麴菌RIB40株同樣地製作胺基酸缺損之基因盒。將NBRC4239株之基因組序列作為模板，以引子13及14、引子3及15、引子5及6之引子組，藉由PCR將基因片段增 幅。PCR條件係依照隨附之實驗指南。將經精製之3個PCR增幅片段及線性化pUC19(Linerized pUC19)(Takara)(各0.5μL)與NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB)2.5μL混合，於60℃進行反應1小時。將反應物4μL導入至ECOS Competent E.coli JM109(NIPPON GENE)中，進行轉形。接著，將從此轉形體所萃取之質體作為模板，使用引子16及17(As1DEL)、引子7及8(As3DEL)、引子18及8(As14DEL)、引子9及8(As18DEL)、以及引子19及10(As26DEL)之組，藉由PCR將基因片段增幅，將與上述之米麴菌RIB40株同樣地取得之各質體作為模板，使用引子20及21之組，將藉由PCR所增幅之基因片段各別製作成胺基酸缺損盒AsXDEL盒(X=1、3、14、18、26)。PCR產物50μL係經乙醇沉澱處理，並溶解於滅菌水10μL。
將AsXDEL盒導入，將NBRC4239_dKP株轉形。轉形株係藉由於Cz-DOX瓊脂培養基點植來繼代3次，而純化。
(2)分生孢子PCR
針對盒導入位置，使用引子13及15，藉由帶的大小來確認。又，將此PCR產物精製，進行序列分析，確認胺基酸缺損。
(3)胺基酸缺損株之ERG生產量之確認
與實施例2(3)所述之米麴菌RIB40株同樣地進行，確認胺基酸缺損株之ERG生產量(圖7B)。
實施例8：米麴菌RIB40株之胺基酸缺損株之製作
(1)胺基酸缺損盒之製作及米麴菌RIB40_dKP之轉形株之取得
將RIB40_dKP株(△ku70、△pyrG)作為宿主，製作胺基酸缺損之基因盒。以實施例10之預測結構為基礎而製作域的一部分或全體缺失之胺基酸。具體而言 為分別使431位至475位、419位至475位及404位至515位缺失。表1表示使用之引子。
將實施例2製作之質體作為模板，以引子22及23(Ao45DEL)、引子22及10(Ao57DEL)、以及引子24及25(Ao112DEL)之組，藉由PCR將基因片段增幅。PCR條件係依照隨附之實驗指南。於各PCR反應液中添加DpnI，於37℃進行反應1小時。接著，將經DpnI處理之各PCR產物2μl與Ligation high Ver.2(Toyobo)5μl、T4多核苷酸激酶1μl、滅菌水7μl混合，於16℃進行反應1小時。將各反應物5μL導入至ECOS Competent E.coli JM109(NIPPON GENE)中，進行轉形。接著，將從此轉形體所萃取之各質體作為模板，使用引子11及12之組，將藉由PCR所增幅之基因片段各別製作成胺基酸缺損盒AoXDEL盒(X=45、57、112)。PCR產物50μL係經乙醇沉澱處理，並溶解於滅菌水10μL。
將AoXDEL盒導入，將RIB40_dKP株轉形。轉形株係藉由於Cz-DOX瓊脂培養基點植來繼代3次，而純化。
(2)分生孢子PCR
針對盒導入位置，使用引子1及4，藉由帶的大小來確認。又，將此PCR產物精製，進行序列分析，確認胺基酸缺損。
(3)胺基酸缺損株之ERG生產量之確認
與實施例2(3)所述之米麴菌RIB40株同樣地進行，確認胺基酸缺損株之ERG生產量(圖7C)。
實施例9：黑麴菌FGSC A1179株之胺基酸缺損株之製作
(1)胺基酸缺損盒之製作及黑麴菌FGSC A1179之轉形株之取得
將FGSC A1179株(△kusA、pyrG-)作為宿主，而與上述之米麴菌RIB40株同樣地製作胺基酸缺損之基因盒。將黑麴菌IAM2533株之基因組序列作為模板，以引子26及27、引子28及29之引子組，藉由PCR將基因片段增幅。PCR條件係依照隨附之實驗指南。將經精製之2個PCR增幅片段及實施例2所精製之引子5及6之基因片段及線性化pUC19(Linerized pUC19)(Takara)(各0.5μL)與NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB)2.5μL混合，於60℃進行反應1小時。將反應物4μL導入至ECOS Competent E.coli JM109(NIPPON GENE)中，進行轉形。接著，將從此轉形體所萃取之質體作為模板，使用引子30及31(Ang3DEL)、引子32及31(Ang18DEL)、引子32及33(Ang26DEL)、引子34及33(Ang57DEL)、以及引子35及36(Ang112DEL)之組，藉由PCR將基因片段增幅，將與上述之米麴菌RIB40株同樣地取得之各質體作為模板，使用引子37及38之組，將藉由PCR所增幅之基因片段各別製作成胺基酸缺損盒AsXDEL盒(X=3、18、26、57、112)。PCR產物50μL係經乙醇沉澱處理，並溶解於滅菌水10μL。
將AngXDEL盒導入，將FGSC A1179株進行轉形。轉形株係藉由於Cz-DOX瓊脂培養基點植來繼代3次，而純化。
(2)分生孢子PCR
針對盒導入位置，使用引子26及29，藉由帶的大小來確認。又，將此PCR產物精製，進行序列分析，確認胺基酸缺損。
(3)胺基酸缺損株之ERG生產量之確認
與實施例2(3)所述之米麴菌RIB40株同樣地進行，確認胺基酸缺損株之ERG生產量(圖7D)。
實施例10：從AO090005000664基因所表現之蛋白質之結構分析
使用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)之同源性建模功能，針對AO090005000664基因，將PAAG_04735之預測立體結構用於模板，進行立體結構預測(圖8)。就模板之立體結構而言，搜索與AO090005000664相同性高之基因之中，已明瞭立體結構者或是已公開預測立體結構者，選擇了同一性43%、源自魯氏副球孢子菌(Paracoccidioides lutzii)之PAAG_04735之預測立體結構。又，PAAG_04735之預測立體結構為以AlphaFold2所預測者。現在，與AO090005000664基因具有100%同一性之OAory_01008280之預測結構已公開於AlphaFold蛋白質結構資料庫(AlphaFold Protein Structure Database(https：//alphafold.com/)，同源性建模之預測結構與此為類似。又，當同源性建模時，OAory_01008280之預測結構尚未公開。
依據本發明人等之研究，於AO090005000664基因所編碼之胺基酸序列中，427位至429位之缺失(3DEL)、427至444位之缺失(18DEL)、及使419位至444位(26DEL)、431位至475位(45DEL)、419位至475位(57DEL)及404位至515位(112DEL)分別缺失(圖7A及C)。又，431位至475位係相當於由5個α螺旋所構成之超二級結構域中之第2個α螺旋及第3個螺旋。404位至515位係相當於所有的該超二級結構域。
又，於具有以從與AO090005000664基因具有98%同一性之直系同源基因所編碼之胺基酸序列有428位之缺失(1DEL)、427位至429位之缺失(3DEL)、427至440位之缺失(14DEL)、427至444位之缺失(18DEL)及419位至444位之缺失(26DEL)之方式而修飾過的基因之醬油麴菌(A.sojae)中，顯示促進麥角硫醇產生(圖7B)。
再者，於具有以從相對於AO090005000664基因只具有67%同一性之An16g07990基因有441位至443位之缺失(3DEL)、441位至458位之缺失(18DEL)、433位至458位之缺失(26DEL)、433位至489位之缺失(57DEL)及418位至529位之缺失(112DEL)之方式而修飾過的基因之黑麴菌(A.niger)中，顯示促進麥角硫醇產生(圖7D)。
關於AO090005000664基因及其對應之基因，含有G428位之W404至Q515所含有之超二級結構域之功能仍未知，惟，已顯示藉由阻礙該超二級結構域之功能的至少一部分，可提高麥角硫醇生產力。又，已提及於AO090005000664基因之位置，基因若不同，則其對應之位置亦不同，若為所屬技術領域中具有通常知識者則可充分了解。
TW202405183A_112120151_SEQL.xml

Claims (20)

  1. 一種核酸，其編碼下列序列：在包含序列編號1所含有之保存區域之對應序列編號1之序列中，於與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域中含有會使該功能域之功能異常之突變之序列；或
    與該序列至少具有90%同一性之序列，
    並且當該核酸被導入會產生麥角硫醇的微生物中時，會促進麥角硫醇產生。
  2. 如請求項1所述之核酸，其中，前述保存區域為序列編號1之433位至440位之保存區域。
  3. 如請求項1所述之核酸，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變為與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域的缺失。
  4. 如請求項1所述之核酸，其中，前述經缺失之區域包含對應序列編號1之428位之位置。
  5. 如請求項1所述之核酸，其中，前述經缺失之區域為由1至120個胺基酸之缺失所構成。
  6. 如請求項4所述之核酸，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之427位至429位、427位至440位、427位至444位及419位至444位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
  7. 如請求項3所述之核酸，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之431位至475位、419位至475位及404位至515位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
  8. 如請求項1所述之核酸，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變係於對應序列編號1之428位之位置之G及/或對應459位之位置之C具有突變。
  9. 如請求項1所述之核酸，其中，前述核酸為源自選自由麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬、籃狀菌屬所構成之群組之微生物之核酸。
  10. 一種載體，含有請求項1至9中任一項所述之核酸。
  11. 一種微生物，含有請求項1至9中任一項所述之核酸。
  12. 一種麥角硫醇之製造方法，包含將請求項11所述之微生物培養。
  13. 一種麥角硫醇產生能力經促進之微生物之製造方法，係包括：於含有序列編號1之433位至440位之保存區域之對應序列編號1之序列中，於與序列編號1之W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域中導入會使該功能域之功能異常之突變；其中，前述微生物為選自由麴菌屬、青黴屬、羅薩氏菌屬及籃狀菌屬所構成之群組之會生成麥角硫醇的微生物。
  14. 如請求項13所述之製造方法，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變為與W404至Q515之功能域對應之功能域所含有之區域的缺失。
  15. 如請求項13所述之製造方法，其中，前述保存區域為序列編號1之433位至440位之保存區域。
  16. 如請求項14所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域包含對應序列編號1之428位之位置。
  17. 如請求項14所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域為由1至120個胺基酸所構成。
  18. 如請求項16所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之428位、427位至429位、427位至440位、427位至444位及419位至444位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
  19. 如請求項14所述之製造方法，其中，前述經缺失之區域為與選自由序列編號1之431位至475位、419位至475位及404位至515位所構成之群組之至少一區域對應之區域。
  20. 如請求項14所述之製造方法，其中，前述會使該功能域之功能異常之突變為於對應序列編號1之428位之位置之G及/或對應459位之位置之C具有突變。
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