TWI633190B - 比利比洛邊（ｐｙｒｉｐｙｒｏｐｅｎｅ）的製造方法 - Google Patents

比利比洛邊（ｐｙｒｉｐｙｒｏｐｅｎｅ）的製造方法 Download PDF

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Abstract

本發明係提供將導入特定多核苷酸或含有其所成的重組載體所成微生物，與比利比洛邊A的生物合成上為必要的中間化合物同時進行培養的方法。藉由本發明的方法可製造比利比洛邊。

Description

比利比洛邊(pyripyropene)的製造方法
本發明係關於比利比洛邊之製造法，更詳細係關於比利比洛邊A、E、O等製造法。
比利比洛邊A係如特開平4-360895號公報(專利文獻1)及Journal of Antibiotics(1993),46(7),1168-9(非專利文獻1)所揭示，具有ACAT(醯基CoA‧膽固醇乙醯轉移酶)阻礙活性，可期待應用於膽固醇蓄積所引起的疾病治療等。
另一方面，作為比利比洛邊A之生產菌，於特開平4-360895號公報(專利文獻1)中記載薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)FO-1289株，於Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12),4429-35.(非專利文獻2)中記載Eupenicillium reticulisporumNRRL-3446株，於WO2004/060065號公報(專利文獻2)中記載Penicillium griseofulvumF1959株及於公開技報2008-500997號(專利文獻3)中記載青黴可比洛比PF1169株。
又，作為比利比洛邊A的生物合成流程，於Journal of Organic Chemistry(1996),61,882-886.(非專利文獻3)及Chemical Review(2005),105,4559-4580.(非專利文獻4)中揭示薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)FO-1289株所推定之生物合成流程，對於薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)FO-1289株藉由各聚酮合酶(Polyketide synthase)及異戊二烯基轉移酶所合成之部分結構被結合，藉由環化酶合成比利比洛邊A。
[先行技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]特開平4-360895號公報
[專利文獻2]WO2004/060065號公報
[專利文獻3]公開技報2008-500997號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Journal of Antibiotics(1993),46(7),1168-9
[非專利文獻2]Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12),4429-35.
[非專利文獻3]Journal of Organic Chemistry(1996),61,882-886.
[非專利文獻4]Chemical Review(2005),105,4559-4580.
本發明者們發現將現今導入特定多核苷酸或含有此的重組載體所成的微生物，與在比利比洛邊A之生物合成上為必要的中間化合物共同培養，製造出比利比洛邊A等。本發明係以此為準而完成者。
因此，本發明的目的為提供比利比洛邊A之製造法。
而本發明的一型態為提供一種將導入下述(I)~(III)所記載之至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成微生物，與比利比洛邊E同時培養，經由比利比洛邊O分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法：(I)分離具有選自下述(a)~(d)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列的多核苷酸：(a)序列號碼266的核苷酸序列、(b)與序列號碼266的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等的蛋白質之核苷酸序列、(c)對於由序列號碼266的核苷酸序列所成的核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等的蛋白質之核苷酸序列、(d)具有與由序列號碼266的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等的蛋白質之核苷酸序列、(II)具有編碼選自序列號碼267~275的至少一個胺基酸序列或與此實質同等之胺基酸序列的核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(III)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸： (1)下述(a)-(i)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的3342號至5158號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的5382號至12777號為止的核苷酸序列、(c)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(d)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(e)序列號碼266所示核苷酸序列的18506號至19296號為止的核苷酸序列、(f)序列號碼266所示核苷酸序列的19779號至21389號為止的核苷酸序列、(g)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(h)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及(i)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、 (4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
又，本發明的另一型態為提供一種將導入前述(I)～(III)所記載的至少一種多核苷酸或含此所成重組載體而成微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
且，本發明的另一型態為提供一種將導入前述(I)～(III)所記載的至少一種多核苷酸或含此所成重組載體而成微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮(4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl)-2H-pyran-2-one)為特徵之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮的製造法。
本發明的另一型態為提供一種前述(I)～(III)所記載的至少一種經分離之多核苷酸。
又，本發明的另一型態為提供一種選自pPP6(以質體pPP6進行轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)(米麴菌)的寄存號碼：FERM BP-11218)、pPP7(以質體pPP7進行轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)的寄存號碼：FERM BP-11219)、及pPP9(以質體pPP9進行轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)的寄存號碼：FERM BP-11220)所群之重組載體。
且，本發明的另一型態為提供一種含有1種或1種以上選自質體pPP6、pPP7、及pPP9所成群的載體之轉形體。
本發明的另一型態為提供一種使用於比利比洛邊A之製造的前述重組載體的使用。
本發明的另一型態為提供一種使用於比利比洛邊A的製造之前述轉形體的使用。
本發明的製造方法為可將比利比洛邊A、E、O等藉由基因重組技術而製造。因此，本發明的製造方法為對比利比洛邊A、E、O等大量生產技術上大貢獻者。
[發明之具體說明] [微生物的寄存]
以質體pCC1-PP1轉形的大腸菌(Escherichia coli EPI300TM-T1R)於2008年10月9日(原寄存日)在獨立行政法人產業技術綜合硏究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11133(經國內寄存FERM P-21704移管)(寄存者所給予的識別表示：Escherichia coli EPI300TM-T1R/pCC1-PP1)進行寄存。
以質體pPP2所轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)於2009年6月23日在獨立行政法人產業技術綜合硏究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11137(寄存者所給予的識別表示：麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP2-1)進行寄存。
以質體pPP3所轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)於2009年7月3日在獨立行政法人產業技術綜合硏究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11141(寄存者所給予的識別表示：麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP3-2)進行寄存。
以質體pPP6進行轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)於2009年12月21日在獨立行政法人產業技術綜合硏究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11218(寄存者所給予的識別表示：麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP6)進行寄存。
以質體pPP7進行轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)於2009年12月21日在獨立行政法人產業技術綜合硏究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11219(寄存者所給予的識別表示：麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP7)進行寄存。
以質體pPP9進行轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)於2009年12月21日在獨立行政法人產業技術綜合硏究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11220(寄存者所給予的識別表示：麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP9)進行寄存。
比利比洛邊的製造法
本發明係關於將導入與比利比洛邊A的生物合成相關的基因之微生物與於比利比洛邊A的生物合成為必要之中間化合物同時進行培養，得到二次代謝產物之比利比洛邊的製造方法。
若要舉出比利比洛邊A之生物合成經路，例如可舉出以下流程1。
上述流程1的各生物合成經路詳細記載於以下。
1.將煙酸與CoA ligase(CoA連接酶)進行反應，進一步將該生成物與LovB-like polyketide synthase(擬LovB聚酮合酶)(PKS)進行反應後生成5-(3-吡啶基)-3,5-二側氧戊烷酸。
藉由將2.5-(3-吡啶基)-3,5-二側氧戊烷酸與擬LovB聚酮合酶(PKS)進行反應，生成4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮。
藉由將3.4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮與法尼焦磷酸(farnesylpyrophosphate)(FPP)與UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiA樣異戊二烯基轉移酶)(UbiAPT)進行反應，生成4-hydroxy-6-(pyridin-3-y1)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trieny1)-2H-pyran-2-one(4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮)。
藉由將4.4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮與FAD-dependent monooxygenase(FAD依賴型單加氧酶)(FMO)進行反應，再將該生成物與環化酶(Cyclase)(IMP：膜主體蛋白Integral membrane protein)進行反應後生成脫乙醯基比利比洛邊E。
5.藉由將脫乙醯基比利比洛邊E與乙醯基轉移酶(Acetyltransferase)(AT)進行反應，生成比利比洛邊E。
6.藉由將比利比洛邊E與細胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenase)(1)(P450-1)進行反應，生成第11位脫乙醯基比利比洛邊O。
7.藉由將第11位脫乙醯基比利比洛邊O與乙醯基轉移酶-2(AT-2)進行反應，生成比利比洛邊O。
8.藉由將比利比洛邊O與細胞色素P450單加氧酶(2)(P450-2)進行反應，生成第7位脫乙醯基比利比洛邊A。
9.藉由將第7位脫乙醯基比利比洛邊A與乙醯基轉移酶-2(AT-2)進行反應，生成比利比洛邊A。
脫乙醯基比利比洛邊E例如可藉由下述參考例3所記載的方法進行合成。
比利比洛邊E例如可藉由特開平8-239385號公報所記載的方法取得。
第11位脫乙醯基比利比洛邊O例如可藉由下述參考例4所記載的方法進行合成。
比利比洛邊O例如可藉由J.Antibiot.1996,49,292.所記載的方法取得。
7位脫乙醯基比利比洛邊A例如可藉由特開平8-259569號公報所記載的方法進行合成。
4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮例如可藉由J.Org.Chem.1983.48.3945.所記載的方法進行合成。
所謂可與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群的載體之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入下述(IV)~(V)所記載的至少一種多核苷酸或含有此的重組載體所成微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法：(IV)具有選自編碼選自序列號碼269、270、及275所成群的至少一個胺基酸序列或與此實質上同等之胺基酸序列的核苷酸序列的至少1個的核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(V)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)下述(a)-(c)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、及(c)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於由(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上 同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pPP2、pPP3、及pPP9所成群的載體之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養的本發明之製造方法的較佳型態為提供一種將含有質體pPP2、pPP3、及pPP9之微生物與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體的微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體的微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養 ，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入含有下述(VI)及(VII)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法：(VI)具有選自編碼選自序列號碼269、270、274、及275所成群的至少一個胺基酸序列或與此實質上同等之胺基酸序列的多核苷酸序列之至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(VII)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸：(1)下述(a)-(d)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(c)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及(d)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、 (3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、 (4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pPP2、pPP3、pPP7、及pPP9所成群的載體之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
所謂與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有質體pPP2、pPP3、pPP7、及pPP9的微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
所謂與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時培養之本發明的製造方法之較佳型態，將導入上述(I)～(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮為特徵之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮之製造法。此時，前述微生物使用可將法尼焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)在該體內進行生物合成者為佳，作為如此微生物可舉出屬於麴菌屬之微生物。
所謂與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體的微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮為特徵之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮之製造法。
所謂與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入下述(VIII)及(IX)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮為特徵之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮的製造法：
(VIII)具有選自編碼序列號碼273之胺基酸序列或與此實質上同等之胺基酸序列的核苷酸序列之至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(IX)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於由(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養的本發明之製造方法的較佳型態為提供一種將含有質體pPP6之微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮為特徵之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)- 2H-吡喃-2-酮的製造法。
脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入含有上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊E為特徵之比利比洛邊E的製造法。
脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體的微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊E為特徵之比利比洛邊E的製造法。
所謂與脫乙醯基所謂與比利比洛邊E同時培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入下述(X)及(XI)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體所成之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊E為特徵之比利比洛邊E的製造法：(X)具有選自編碼序列號碼274的胺基酸序列或與此為實質上同等之胺基酸序列的核苷酸序列之至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(XI)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹 條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有質體pPP7之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊E為特徵之比利比洛邊E的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群的載體之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有下述(XII)及(XIII)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法：(XII)具有選自編碼選自序列號碼269及275所成群的至少1個胺基酸序列或與此實質上同等之胺基酸序列的核苷酸序列之至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(XIII)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)下述(a)-(b)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列(b)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷 酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pPP2及pPP9所成群的載體之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有質體pPP2及pPP9之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離第11位脫乙醯基比利比洛邊O為特徵之11位脫乙醯基比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體的微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離第11位脫乙醯基比利比洛邊O為特徵之11位脫乙醯基比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方 法之較佳型態為提供一種將導入下述(XIV)及(XV)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離第11位脫乙醯基比利比洛邊O為特徵之11位脫乙醯基比利比洛邊O的製造法：(XIV)具有選自編碼序列號碼269的胺基酸序列或與此為實質上之同等胺基酸序列的核苷酸序列之至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(XV)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與比利比洛邊E同時進行培養之本發明的製造方 法之較佳型態為提供一種將含有質體pPP2之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，分離第11位脫乙醯基比利比洛邊O為特徵之11位脫乙醯基比利比洛邊O的製造法。
所謂與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體的微生物，與11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入下述(XIV)及(XV)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法：(XIV)具有選自編碼序列號碼275的胺基酸序列或與此為實質上之同等胺基酸序列之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、 (XV)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養的本發明之製造方法的較佳型態為提供一種將含有質體pPP9之微生物，與第11位脫乙醯基比利比洛邊O同時進行培養，分離比利比洛邊O為特徵之比利比洛邊O的製造法。
所謂與比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊O同時進行培養，分離第7位脫乙醯基比利比洛邊A為特徵之7位脫乙醯基比利比洛邊A的製造法。
所謂與比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體的微生物，與比利比洛邊O同時進行培養，分離第7位脫乙醯基比利比洛邊A為特徵之7位脫乙醯基比利比洛邊A的製造法。
所謂與比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入下述(XIV)及(XV)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊O同時進行培養，分離第7位脫乙醯基比利比洛邊A為特徵之第7位脫乙醯基比利比洛邊A的製造法：(XIV)具有選自編碼序列號碼270的胺基酸序列或與此為實質上之同等胺基酸序列之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(XV)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸 序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與比利比洛邊O同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有質體pPP3之微生物，與比利比洛邊O同時進行培養，分離第7位脫乙醯基比利比洛邊A為特徵之7位脫乙醯基比利比洛邊A的製造法。
所謂與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入上述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養，分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
所謂與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1、pPP2、pPP3、pPP6、pPP7、及pPP9所成群的載體之微生物，與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養，分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
所謂與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將導入下述(XVI )及(XVII)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養，分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法：(XVI)具有選自編碼序列號碼275的胺基酸序列或與此為實質上之同等胺基酸序列的核苷酸序列之至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(XVII)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列之至少1個核苷酸序列的多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養之本發明的製造方法之較佳型態為提供一種將含有質體pPP9之 微生物，與第7位脫乙醯基比利比洛邊A同時進行培養，分離比利比洛邊A為特徵之比利比洛邊A的製造法。
其中本發明所使用的微生物可使用下述重組載體導入多核苷酸，例如可藉由電穿孔法、聚乙二醇法、土壤肝菌法、鋰法、或氯化鈣法等將多核苷酸導入於微生物中。
本發明所使用的微生物若為可導入多核苷酸或含有此所成重組載體之微生物即可，並無特別限定，以麴菌屬之微生物為佳，以麴霉菌(Aspergillus oryzae)為特佳。
本發明中，微生物之培養例如可藉由好氣條件下的固體培養法、振動培養法、通氣攪拌培養法、或深部好氣培養法進行，但以振動培養法為特佳。作為使用於微生物之培養的培養基，可使用慣用成分，例如作為碳源之葡萄糖、蔗糖、水飴、糊精、澱粉、甘油、糖蜜、動‧植物油等。又，作為氮源可使用大豆粉、小麥胚芽、玉米浸漬液(Corn steep liquor)、綿實粕、肉萃取物、多價蛋白腖、麥芽萃取物、酵母萃取物、硫酸銨、硝酸鈉、尿素等。其他視必要添加可生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸(磷酸氫2鉀等)、硫酸(硫酸鎂等)、及其他離子之無機鹽類亦為有效。有，視必要可添加硫胺(硫胺鹽酸鹽等)等各種維他命、麩胺酸(麩胺酸鈉等)、天冬醯胺(DL-天冬醯胺等)等胺基酸、核苷酸等微量營養素、抗生物質等選抜藥劑。
且，欲幫助菌之發育，可適當地添加如促進比利比洛邊A之生產的有機物及無機物。
培養基的pH，例如為pH 5.5～pH 8程度。培養之適當溫度為15℃～40℃，但大多於22℃～30℃之附近生長。4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮、脫乙醯基比利比洛邊E、比利比洛邊E、比利比洛邊O、及比利比洛邊A之生產雖依培養基及培養條件、或使用之宿主而相異，對於任一培養法一般在2天～10天可達到最高蓄積。培養中之比利比洛邊A的量達到最高時停止培養，由培養物將目的物質進行分離、純化。
由培養物分離5-(3-吡啶基)-3,5-二側氧戊烷酸、4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮、脫乙醯基比利比洛邊E、比利比洛邊E、比利比洛邊O、7位脫乙醯基比利比洛邊A、及比利比洛邊A等時，可藉由利用該性狀之一般分離手段，例如溶劑萃取法、離子交換樹脂法、吸著或分配管柱層析法、凝膠過濾法、透析法、沈澱法、結晶化法等可單獨或適宜地組合後進行萃取純化，以溶劑萃取法為特佳。
本發明中所謂「實質上同等之胺基酸序列」表示具有藉由一個或複數個胺基酸之取代、缺失、加成、或插入之改變，但不影響到聚肽之活性的胺基酸序列而言。藉由胺基酸的取代、缺失、加成、或插入而經改變的胺基酸序列，對於經改變等前的胺基酸序列，以具有70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，特佳為95%以上，進一步更佳為98%以上之序列相同性為佳。又經改變之胺基酸殘基之數目，以1～40個為佳，較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步更佳為1～8個，最佳為1～4個。
而作為不影響活性的改變之例子，可舉出保存性取代。所謂「保存性取代」為，將聚肽之活性於實質上無變化之1～40個為佳，較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步更佳為1～8個，最佳為1～4個的胺基酸殘基藉由與其他化學性類似之胺基酸殘基進行取代的意思。例如可舉出將某疏水性胺基酸殘基藉由其他疏水性胺基酸殘基取代之情況、將某極性胺基酸殘基藉由具有相同電荷之其他極性胺基酸殘基取代之情況。可進行如此取代之功能性類似之胺基酸在每個胺基酸之該技術領域上為公知。若要舉出具體例，可舉出作為非極性(疏水性)胺基酸之丙胺酸、纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸、甲硫胺酸等。作為極性(中性)胺基酸可舉出甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸等。作為具有陽電荷之(鹼性)胺基酸，可舉出精胺酸、組胺酸、賴胺酸等。又，作為具有負電荷之(酸性)胺基酸，可舉出天冬醯胺酸、麩胺酸等。
本發明中所謂「嚴謹條件」表示將雜交後之膜的洗淨操作在高溫度低鹽濃度溶液中進行的意思，若為斯業者該條件可適宜地決定，例如表示在2×SSC濃度(1×SSC：15mM檸檬酸3鈉，150mM氯化鈉)、0.5%SDS溶液中，以60℃且20分鐘之洗淨條件，或在0.2×SSC濃度(1×SSC：15mM檸檬酸3鈉、150mM氯化鈉)、0.1%SDS溶液中，以60℃且15分鐘之洗淨條件的意思。
雜交可依據公知方法進行。又，使用購買的基因庫時，可依據所添付的使用說明書所記載的方法進行。
本案說明書中，所謂對於核苷酸序列之「相同性」表示對於經比較的序列間，構成各序列之鹼基的一致程度的意思。此時，考慮到差異性存在及胺基酸的性質。本說明書中所示「相同性」之數值皆由、斯業者使用公知相同性檢索程式所算出的數值即可，例如於FASTA、BLAST等藉著使用預設(初期設定)之參數可容易地算出。
本案說明書中，對於核苷酸序列之「相同性」以90%以上為佳，較佳為95%以上，更佳為98%以上，進一步更佳為99%以上。
本案說明書中，所謂「對於多核苷酸，1或複數個的核苷酸經缺失、取代、插入或加成」表示藉由部位專一性突然變異誘發法等周知方法，或天然所產生程度之複數個核苷酸的取代等而改變所成的意思。核苷酸之改變個數為1個或複數個(例如1個至數個或1、2、3、或4個)。
所謂「編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列」表示編碼具有與「與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質」為同等活性的蛋白質之核苷酸序列的意思。
與序列號碼266所示核苷酸序列的3342號至5158號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有CoA ligase活性者為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的5382號至12777號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有擬LovB聚酮合酶(PKS)活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有細胞色素P450單加氧酶(1)(P450-1)活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有細胞色素P450單加氧酶(2)(P450-2)活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的18506號至19296號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有環化酶(IMP：膜主體蛋白(Integral embrane protein))活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的19779號至21389號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有FAD-依賴型單加氧酶(FMO)活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiAPT)活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有乙醯基轉移酶(AT)活性為佳。
與序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有乙醯基轉移酶-2(AT-2)活性為佳。
分離多核苷酸的取得
本發明的分離多核苷酸之取得方法雖無特別限定，可藉由以下方法可由青黴可比洛比PF1169株或紗狀菌分離。本發明的分離多核苷酸之取得方法，具體為例如將下述實施例9的方法等所得之相同序列為準，合成將與比利比洛邊A的生物合成相關之聚酮合酶基因、異戊二烯基轉移酶基因、氫氧化酶基因、乙醯基化酶基因、或單磷酸腺苷合成酶基因等任一或此以上之基因進行專一性增大的引子，對於另外作成的青黴可比洛比PF1169株之F黏粒(fosmid)基因組基因庫進行PCR，進一步進行菌落雜交，取得使用於本發明的分離多核苷酸。
所謂本發明的較佳型態為提供一種經分離的多核苷酸為上述(I)~(III)所記載的至少一種經分離之多核苷酸。具體的為提供下述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸：(I)具有選自下述(a)~(d)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸：(a)序列號碼266的核苷酸序列、(b)與序列號碼266的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等的蛋白質之核苷酸序列、(c)對於由序列號碼266的核苷酸序列所成的核苷酸 ，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等的蛋白質之核苷酸序列、(d)具有與由序列號碼266的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等的蛋白質之核苷酸序列、(II)具有編碼選自序列號碼267~275的至少一個胺基酸序列或與此實質同等之胺基酸序列的核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(III)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸：(1)下述(a)-(i)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的3342號至5158號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的5382號至12777號為止的核苷酸序列、(c)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(d)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(e)序列號碼266所示核苷酸序列的18506號至19296號為止的核苷酸序列、(f)序列號碼266所示核苷酸序列的19779號至21389 號為止的核苷酸序列、(g)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(h)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及(i)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。
所謂本發明的更佳型態為提供經分離之多核苷酸為選自下述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、及(h)的經分離之多核苷酸：(a)具有序列號碼266的核苷酸序列之多核苷酸、(b)編碼選自序列號碼269、270、273、274、及275之胺基酸序列所成聚肽之多核苷酸、 (c)具有與序列號碼269所記載的胺基酸序列為實質上同等之胺基酸序列，編碼具有氫氧化酶活性之聚肽的多核苷酸、(d)具有與序列號碼270所記載的胺基酸序列為實質上同等之胺基酸序列，編碼具有氫氧化酶活性之聚肽的多核苷酸、(e)具有與序列號碼273所記載的胺基酸序列為實質上同等之胺基酸序列，編碼具有異戊二烯基轉移酶活性之聚肽的多核苷酸、(f)具有與序列號碼274所記載的胺基酸序列為實質上同等之胺基酸序列，編碼具有乙醯基化酶活性的聚肽之多核苷酸、及(g)具有與序列號碼275所記載的胺基酸序列為實質上同等之胺基酸序列，編碼具有乙醯基化酶活性之聚肽的多核苷酸(h)具有選自下述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、及(v)之核苷酸序列的經分離之多核苷酸：(i)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(ii)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(iii)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(iv)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及 (v)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列。
所謂本發明的更佳型態為提供一種多核苷酸為選自下述(A)、(B)、及(C)之經分離的多核苷酸：
(A)編碼選自序列號碼275的胺基酸序列所成聚肽之多核苷酸、
(B)具有與序列號碼275所記載的胺基酸序列為實質上同等之胺基酸序列，編碼具有乙醯基化酶活性之聚肽的多核苷酸
(C)具有序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列的經分離之多核苷酸。
所謂本發明的更佳型態為提供藉由前述(c)、(d)、(e)、(f)、及(g)的多核苷酸所編碼之聚肽的胺基酸序列各具有與序列號碼269、270、273、274、及275所記載的胺基酸序列為90%以上之序列同等性的多核苷酸。
所謂本發明的更佳型態為提供一種藉由前述(B)所記載的多核苷酸所編碼之聚肽的胺基酸序列為具有與序列號碼275所記載的胺基酸序列為90%以上之序列同等性的多核苷酸。
重組載體
本發明的重組載體為將上述(I)～(III)所記載的多核苷酸中任一種或此以上，例如依據[Sambrook,J.著,Molecular cloning：a laboratory manual」,(美國)，第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,1989年]所記載的基因重組技術的常法，配合目的修飾成適當形態，可藉由連結於載體而製作。
本發明中所使用之重組載體可由病毒、質體、F黏粒(fosmid)、或黏接質體(cosmid)載體等做適宜選擇。例如宿主細胞為大腸菌時，可舉出λ噬菌體系之細菌噬菌體、pBR、pUC系之質體，為枯草菌時可舉出pUB系之質體，為酵母時可舉出YEp、YRp、YCp、YIp系之質體載體。
所使用之質體內至少一個含有使用於選擇轉形體時的選擇標識體者為佳，作為選擇標識體可使用藥劑耐性基因、互補營養要求性之基因。作為該較佳具體例，所使用的宿主為細菌時，有安比西林耐性基因、卡納黴素耐性基因、四週期素耐性基因等，酵母的情況可舉出色胺酸生物合成基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮胺酸生物合成基因(LEU2)等，黴菌的場合可舉出濕黴素耐性基因、雙丙胺磷耐性基因、bleomycin耐性基因、aureobasidin耐性基因等，植物的情況為可舉出卡納黴素耐性基因、雙丙胺磷耐性基因等。
又，作為本發明所利用之表現載體的DNA分子為各基因之表現上為必要之DNA序列，例如具有啟動子、轉印開始信號、核糖體結合部位、翻譯停止信號、轉印終結信號等轉印調節信號、翻譯調節信號者為佳。作為啟動子，可舉出大腸菌中使用乳糖操縱子、色胺酸操縱子等啟動子，酵母中使用醇脫氫酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖資化性基因、甘油醛3磷酸脫氫酶基因等啟動子，黴菌中使用α-澱粉酶基因、葡萄糖澱粉酶基因、纖維二糖水解酶基因、甘油醛3磷酸脫氫酶基因、abp1基因等啟動子，植物中使用CaMV 35S RNA啟動子、CaMV 19SRNA啟動子、胭脂鹼(nopaline)合成酶基因啟動子為佳者。
本發明的重組載體，較佳為選自質體pPP6、pPP7、及pPP9所成群之重組載體。
又，所謂本發明之較佳型態，可舉出使用選自於比利比洛邊A的製造之質體pPP6、pPP7、及pPP9所成群的重組載體。
轉形體
本發明的導入經分離之多核苷酸的宿主，配合所使用的載體種類，可適宜地選自放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、紗狀菌、植物細胞等中為佳。
作為對重組載體的宿主之導入方法，使用藉由接合傳達、噬菌體之形質導入，進一步由鈣離子法、鋰離子法、電穿孔法、PEG法、土壤肝菌法、粒子槍法之轉形方法配合供試宿主細胞使用即可。
將本發明的複數基因導入於宿主細胞時，各基因可含於相同或各別DNA分子。且，宿主細胞為細菌時，設計成將各基因作為多順反子(polycistron)性mRNA使其表現，亦可成為一個DNA分子。
本發明的轉形體較佳為含有1種或1種以上選自質體pPP6、pPP7、及pPP9所成群的載體所成轉形體。
所謂本發明之較佳型態可舉出於比利比洛邊A的製造上使用含有1種或1種以上選自質體pPP6、pPP7、及pPP9所成群之載體所成之轉形體。
 [實施例]
以下舉出實施例對於本發明做具體說明，但本發明並未受到這些實施例之限定。
實施例1：青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA之調製
於三角燒杯(1L)放入經滅菌的NB培養基500ml，對於1/2CMMY寒天培養基，將在28℃進行4天前培養之青黴可比洛比PF1169株(公開技報2008-500997號(專利文獻3))加入於上述培養基，在28℃進行4天液體培養。藉由Miracross進行過濾，得到菌體5g。藉由該菌體將基因組DNA純化套組Genomic-tip 100/G(QIAGEN股份有限公司製)依據添付之手冊，取得30μg之基因組DNA。
實施例2：聚酮合酶(PKS)增幅用縮聚引子與其增幅片段
作為藉由保存於種種紗狀菌聚酮合酶之胺基酸序列的增幅用縮聚引子，設計下述引子而進行合成：
LC1：GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(序列號碼1)
LC2c：GTICCIGTICCRTGCATYTC(序列號碼2)
(但，R=A/G、Y=C/T、M=A/C、I=肌苷)。
使用該縮聚引子，將在實施例1所調製之基因組DNA與ExTaq聚合酶(Takarabio股份有限公司製)依據添付之手冊進行反應，檢測約700bp之增幅片段(參照圖1)。而解析前述增幅片段，特定該內部500bp之序列(序列號碼3)。
實施例3：基因組DNA的大量排序與胺基酸序列相同性檢索
將實施例1中所得之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA進行大量排序以及提供胺基酸序列的相同性檢索。具體為將基因組DNA 50μg的一部份在前處理後提供於Roche公司454FLX DNA排序機，取得約250bp、10.3萬條片段序列(總計49Mb之序列)。
對於該序列，以聚酮合酶及異戊二烯基轉移酶，作為既知序列選定下述五種序列(聚酮合酶：來自Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.及Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.、異戊二烯基轉移酶：Aspergillus(A.)fumigatus Prenyltransferase、Aspergillus(A.)fumigatus Prenyltransferase(4-hydroxybezoate octaprenyltransferase)、及Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase的序列)，藉由相同序列檢索軟體blastx實施檢索。取得各89條、86條、2條、1條、及3條的相同序列(參照表1)。進一步由A. fumigatus PKS 2146a.a.及P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.之相同序列各取得19條、23條之contig序列(A. fumigatus PKS 2146a.a.的contig序列：序列號碼179～197、P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.之contig序列：序列號碼198～220)(參照表2)。
實施例4：由基因組DNA之PCR增幅
藉由實施例3所取得之blastx的檢索結果，對於聚酮合酶，合成序列號碼227～252所示13種引子對。同樣地對於異戊二烯基轉移酶，合成序列號碼253～262所示5種引子對。使用這些引子，進行對於基因組DNA之PCR後，確認對於全引子對所期待的尺寸之增幅片段(參照圖1及圖2)。
實施例5：噬菌體基因組基因庫的製作
將青黴可比洛比PF1169株的λ噬菌體基因組基因庫，使用λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit(Takarabio股份有限公司製Cat. No. 69242-3)，依據添付之手冊進行構築。即，將基因組DNA使用限制酶Sau3A1進行部分分解，將約20kb之DNA片段0.5μg連結於套組所添付之λBlueSTAR DNA0.5μg。將該接合溶液使用Lambda INN Packaging kit(NIPPON GENE股份有限公司製)，依據套組所添付之手冊進行活體外封包(packaging)，取得1ml之溶液。將該經封包之噬菌體溶液10μl感染於大腸菌ER1647株100μl，於溶菌斑形成培養基中，在37℃進行一晚培養後，得到約500克隆之溶菌斑。藉由如此感染製作出導入10～20kb之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA之噬菌體約50000克隆所成基因組基因庫。
實施例6：由噬菌體基因庫之篩選
對於實施例5中所調製之噬菌體基因庫10000克隆，藉由上述所調製的LC1-LC2c引子對所增幅的PCR產物作為探測物(probe)，藉由溶菌斑雜交進行1次篩選。探測物的標識與檢測則使用AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star(GEHealth care股份有限公司製Cat. No. RPN3690)。前述雜交依據添付之手冊實施。
藉由1次篩選，剩下6克隆之候補。且藉由溶菌斑雜交進行2次篩選之結果，取得4克隆。這些陽性克隆感染於大腸菌BM25.8株，依據添付之手冊使噬菌體轉換為質體，取得含有目的區域之4種質體。
實施例7：F黏粒(fosmid)基因組基因庫的製作
青黴可比洛比PF1169株的基因組基因庫為將CopyControl Fosmid Library Production Kit(EPICENTRE公司製、Cat. No.CCFOS110)依據添付手冊而構築。即，將約40kb之基因組DNA0.25μg的DNA片段進行末端平滑化後，插於F黏粒(fosmid)載體pCCFOS(Epicentre公司製)。將該接合溶液使用同套組添付之MaxPlaxLambdackaging Extract，依據套組所添付之手冊，進行活體外封包(packaging)。將該經封包(packaging)之病毒溶液10μl感染於大腸菌EPI300TM-T1R株100μl，於含有氯霉素(Chloramphenicol)之培養基中，在37℃進行一晚培養並篩選後，取得300克隆之菌落。藉由如此感染取得導入40kb之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA之F黏粒(fosmid)約30000克隆。分注於每1well約50克隆之96well培養盤，換言之製作出96槽約4800克隆所成基因組基因庫。
實施例8：F黏粒(fosmid)基因庫篩選
依據F黏粒(fosmid)添付之手冊，藉由實施例7中所作成之基因庫的96槽調製出各質體DNA。使用實施例2所合成之聚酮合酶增幅用縮聚引子，對於該96槽之質體DNA樣品進行PCR。其結果約700bp的DNA片段藉由9槽增幅。且由該正型槽，製作出含有約300克隆以上菌落之培養皿，藉由菌落雜交進行再篩選。其結果使用LC1-LC2c引子對，藉由約4800克隆取得9種F黏粒(fosmid)。
實施例9：基因組DNA的大量排序與胺基酸序列相同性檢索
將實施例1中所得之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA進行大量排序、與提供胺基酸序列的相同性檢索。具體為將基因組DNA 50μg的一部在前處理後提供於Roche公司454FLX DNA排序機，取得平均contig長19.621kb、1405條之片段序列(總鹼基長27.568160Mb的序列)。
對於該序列，以聚酮合酶及異戊二烯基轉移酶，作為既知序列，選定下述五種序列(聚酮合酶：來自Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.(P22367)及Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.(Q4WZA8)、異戊二烯基轉移酶：Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase(Q0MRO8)、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(Q4WBI5)、及Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(4-hydroxybezoate octaprenyltransferase)(Q4WLD0)的序列)，藉由相同序列檢索軟體blastx實施檢索。各取得22條(P22367)、21條(Q4WZA8)、2條(Q0MR08)、3條(Q4WBI5)、及3條(Q4WLD0)之相同序列。
實施例10：F黏粒(fosmid)基因庫篩選及集群基因的序列解析
依據F黏粒(fosmid)套組(EPICENTRE公司製CopyControl Fosmid Library Production Kit)所添付之手冊，藉由實施例7所作成之基因庫的96槽調製出各質體DNA。藉由Roche公司454FLX DNA排序機所決定之鹼基序列為準進行胺基酸序列的相同性檢索，檢索出聚酮合酶與異戊二烯基轉移酶的鄰接區域。藉由所得區域的異戊二烯基轉移酶的鹼基序列，增幅400bp之DNA片段而合成引子對(No.27)。
使用該引子，對於該48槽之質體DNA樣品進行PCR。其結果期待的約400bp的DNA片段(序列號碼263)由11槽增幅(參照圖3)。且由該正型槽中6槽，製作出含有約300克隆以上之菌落的培養皿，藉由菌落雜交進行再篩選。其結果使用27F+27R的引子對(27F引子：序列號碼264、27R引子：序列號碼265)，藉由約4800克隆取得4種F黏粒(fosmid)。將此內一個命名為pCC1-PP1，決定插入片段之全序列(序列號碼266)。
藉由所得之pCC1-PP1轉形大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株(F黏粒(fosmid)套組付屬)而得到大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株/pCC1-PP1。
且，進行各前述序列號266的序列與CoA ligase、擬LovB聚酮合酶(PKS)、氫氧化酶之細胞色素P450單加氧酶、環化酶(IMP：膜主體蛋白(Integral membraneprotein))、FAD-依賴型單加氧酶(FMO)、UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiAPT)、乙醯基化酶之乙醯基轉移酶(AT)、乙醯基轉移酶-2(AT-2)、及Cation transporting ATPase(上述酶皆來自薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)Af293株)之相同性檢索後，皆顯示70%以上的高相同性。
序列號碼266之核苷酸3342-5158為，編碼CoA ligase，所對應之聚肽為序列號碼267所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸5382-12777為編碼擬LovB聚酮合酶(PKS)，所對應之聚肽為序列號碼268所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸13266-15144(以下將藉由該多核苷酸序列所編碼之蛋白質作為細胞色素P450單加氧酶(1)(P450-1))及16220-18018(以下將藉由該多核苷酸序列所編碼之蛋白質作為細胞色素P450單加氧酶(2)(P450-2))為編碼細胞色素P450單加氧酶，所對應之聚肽各為序列號碼269、270所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸18506-19296為編碼環化酶，所對應之聚肽為序列號碼271所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸19779-21389為編碼FAD-依賴型單加氧酶(FMO)，所對應之聚肽為序列號碼272所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸21793-22877為編碼UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiAPT)，所對應之聚肽為序列號碼273所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸23205-24773為編碼乙醯基轉移酶(AT)，所對應之聚肽為序列號碼274所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸25824-27178為編碼乙醯基轉移酶-2(AT-2)，所對應之聚肽為序列號碼275所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸27798-31855為編碼Cation transporting ATPase，所對應之聚肽為序列號碼276所記載之胺基酸序列所示。
實施例11：藉由麴霉菌(Aspergillus oryzae)之轉形的基因之功能解析
以下所使用的比利比洛邊E可依據特開平8-239385號公報、WO94/09147號公報、或美國專利5597835號公報所記載之方法，藉由微生物培養法，或藉由Tetrahedron Letters,vol. 37,No.36,6461-6464,1996所記載之全合成的方法而製造。又，以下所使用的比利比洛邊O可依據J. Antibiotics 49,292-298,1996或WO94/09147號公報所記載之方法，藉由微生物培養法而製造。
(1)紗狀菌導入用表現載體的製作
將各pUSA(圖4)與pHSG399(Takarabio公司)以KpnI切斷，經連結後取得pUSA-HSG。將該質體以SmaI、KpnI的順序切斷，使其凝膠純化後，取得具有KpnI之黏著末端與SmaI之平滑末端的線狀載體DNA。
(2)pPP2之質體製作
將Fosmid pCC1-PP1作為鑄型，使用引子對P450-1 with Kpn F(序列號碼277)/P450-1 with Swa R(序列號碼278)增幅前述P450-1之多核苷酸，將純化之DNA片段克隆化成pCR-Blunt(Invitorogen公司Cat.No.K2700-20)。
將所得之質體以KpnI與SwaI切斷，將前述P450-1片段皆合於上述載體pUSA-HSG，取得圖5所示pPP2之質體。
(3)pPP3之質體製作
將Fosmid pCC1-PP1作為鑄型，依據圖6所示流程，首先使用引子對F1(序列號碼279)/R1(序列號碼280)、F2(序列號碼281)/R2(序列號碼282)、F3(序列號碼283)/R3(序列號碼284)、F4(序列號碼285)/R4(序列號碼286)、F5(序列號碼287)/R5(序列號碼288)、及F6(序列號碼289)/R6(序列號碼290)，僅增幅外顯子，取得六個片段。其次將這些片段作為鑄型，藉由F1/R2、F3/R4、及F5/R6的引子對進行增幅，取得較長片段。再藉由F1/R4及F1/R6的引子對重複進行增幅後製作出不含前述P450-2之多核苷酸的內含子之cDNA。將該cDNA片段導入於pCR-Blunt(Invitorogen公司Cat.No.K2700-20)，將所得之質體作為鑄型，藉由引子對infusion F of P450-2-cDNA(序列號碼291)/infusion R of P450-2-cDNA(序列號碼292)進行增幅。依據套組手冊，使用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(Clontech公司)後取得圖7所示pPP3的質體。
(4)　pPP6、pPP7、及pPP9之各質體的製作
使用上述實施例11(1)所取得之紗狀菌轉形用載體pUSA-HSG，取得以下之pPP6、pPP7、及pPP9的各質體。
1)　質體pPP6的製作(UbiA PT)
將Fosmid pCC1-PP1作為鑄型，使用UbiA PT F with Kpn(序列號碼293)與UbiA PT R with Swa(序列號碼294)，各增幅前述UbiA PT之多核苷酸，將經純化的DNA片段克隆化成PCR片段用載體pCR-Blunt(Invitorogen公司Cat.No.K2700-20)。將所得之質體以KpnI與SwaI切斷，純化各片段後接合於前述紗狀菌載體pUSA-HSG之KpnI與SmaI，取得圖12所示pPP6之質體。
2)　pPP7之質體的製作(AT)
將Fosmid pCC1-PP1作為鑄型，使用引子對AT F with Swa(序列號碼295)與AT R with Kpn(序列號碼296)，各增幅AT之多核苷酸，將經純化之片段克隆化為PCR片段用載體pCR-Blunt(Invitorogen公司Cat.No.K2700-20)。將所得之質體以KpnI與SwaI切斷，將各片段接合於前述紗狀菌載體pUSA-HSG之KpnI與SmaI，取得如圖12所示pPP7之質體。
3)pPP9之質體的製作(AT-2)
將Fosmid pCC1-PP1作為鑄型，使用引子對infusion F of Toxin(序列號碼297)與infusion R of Toxin(序列號碼298)，增幅Toxin片段，將In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(Clontech公司製Cat.No.639619)依據套組之手冊，插入於前述紗狀菌載體pUSA-HSG的KpnI與SmaI之間，取得圖12所示pPP9之質體。
(5)麴霉菌(Aspergillus oryzae)之轉形體的取得
在CD-Met(含有L-Methionine 40μg/ml)寒天培養基將A. oryzae(HL-1105株)在30℃進行1週培養。由該培養皿回收分生子(>108)，於500ml之燒杯中接種於100ml之YPD液體培養基。經20小時培養(30℃、180rpm)後取得毬藻狀菌體。將菌體以3G-1玻璃過濾器收集，並以0.8MNaCl洗淨，充分脫水以TF溶液I(原生質體化溶液)懸浮後，在30℃進行60rpm之2小時振盪。且各30分鐘以顯微鏡觀察，確認原生質體之存在。其後將培養液過濾並離心(2000rpm、5分鐘)回收原生質體後，以TF溶液II洗淨。洗淨後加入0.8容量之TF溶液II及0.2容量之TF溶液III並混合，取得原生質體懸浮液。
於該懸浮液200μl中加入質體DNA(pPP2或pPP3)10μg，在冰上靜置30分鐘，加入TF溶液III(1mL)後緩和混合。其後在室溫靜置15分鐘，於前述原生質體導入質體DNA。於此加入TF溶液II(8mL)並進行離心(在2000rpm進行5分鐘)，回收殘留的1～2ml之原生質體。滴入回收於再生培養基(下層)之原生質體液，流入再生培養基(上層)，轉動培養皿並使其混合後，在30℃進行4～5天培養。將作成的克隆於再生培養基(下層)進行分離，植入後繼續純化而取得轉形體(麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP2-1及麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP3-2)。
依據上述實施例11之(5)所記載的方法，取得導入各質體DNA(pPP6、pPP7、及pPP9)之轉形體(麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP6、麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP7、及麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP9)。
上述TF溶液I(原生質體化溶液)使用下述組成而調製。
將上述組成經調製後(pH5.5)進行過濾滅菌。
上述TF溶液II使用下述組成而調製。
進一步加入使全量成200ml。
調製上述組成後，進行高壓釜滅菌。
上述TF溶液III使用下述組成而調製。
進一步加入水後使全量成10ml。
調製上述組成後，進行過濾滅菌。
上述再生培養基使用下述組成而調製。
進一步加入更使全量成1L。
調製上述組成後(pH 5.5)進行高壓釜滅菌。
又，上述所使用的Trace elements solution為使用下述組成而調製。
進一步加入水使全量成1L。
調製上述組成後進行高壓釜滅菌。
(6)P450-1之功能解析及添加培養試驗
於含有1%(w/v)麥芽糖之YPD培養基(1%(w/v)酵母萃取物(Yeast Extract)、2%(w/v)蛋白腖、2%(w/v)葡萄糖(Dextrose))中添加1/100容量的比利比洛邊E之2mg/mL二甲基亞碸溶液的培養基作為培養基A。於Czapek-Dox寒天培養基所培養之麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP2-1的菌叢中採取分生子，並懸浮於滅菌水中。
將該分生子懸浮液調製成104spore/mL，將該調製之分生子懸浮液100μL添加於10mL之培養基A，在25℃進行96小時振盪培養。於該培養液添加10mL之丙酮，充分混合後，使用離心濃縮器，餾去丙酮。於此添加10mL之乙酸乙酯，充分混合後，僅分取乙酸乙酯層。將使用離心濃縮器將乙酸乙酯餾去後所得之乾固物溶解於1000μL之甲醇。將此作為樣品使用，藉由LC-MS(Waters公司、Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm、5μm))、及LC-NMR(Burker Daltonik公司製Avance500)進行分析。
上述LC-MS測定之結果，確認所得之化合物為比比利比洛邊E更增加16分子量的單一化合物A。又，LC-NMR測定之結果，確認該化合物A為比利比洛邊E的第11位氫氧化物。前述細胞色素P450單加氧酶(1)係將比利比洛邊E作為基質，具有將比利比洛邊E的第11位進行氫氧化之酶活性者。
前述化合物A之物理化學的性狀如下所示。
1.質普儀：ES-MS 468M/Z(M+H)+
2.分子式：C27H33NO6
3.HPLC：管柱Waters XTerra Column C18(5μm、4.6mm×50mm)、40℃、移動相為自20%乙腈水在10分鐘為100%乙腈(線性漸層)、流速0.8ml/分鐘檢測：在UV323nm之保持時間6.696分鐘
4.1H-NMR光譜(CD3CN,2H：3.134、3.157 H-11)
比利比洛邊E及上述4所記載的1H-NMR光譜之柱狀圖各如圖8及圖9所示。
(7)P450-2之功能解析及添加培養試驗
將於含有1%(w/v)麥芽糖之YPD培養基(1%(w/v)酵母萃取物、2%(w/v)蛋白腖、2%(w/v)葡萄糖)中添加1/100容量的比利比洛邊E之2mg/mL二甲基亞碸溶液的培養基作為培養基A，、相同地添加1/100容量的比利比洛邊O之2mg/mL二甲基亞碸溶液的培養基作為培養基B。由於Czapek-Dox寒天培養基我培養之麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP3-2的菌叢採出分生子，於滅菌水懸浮。將該分生子懸浮液調製出104spore/mL，其中500μL添加於50mL的培養基A或培養基B，在25℃進行96小時振盪培養。於此培養液添加50mL的丙酮，充分混合後，使用離心濃縮器餾去丙酮。於此添加50mL之乙酸乙酯，充分混合後，僅分取出乙酸乙酯層。使用離心濃縮器餾去乙酸乙酯後所得之乾固物溶解於1500μL之甲醇。將此作為樣品，以LC-MS(Waters公司製Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm、5μm))及LC-MNR(Burker Daltonik公司製Avance500)進行分析。由LC-MS測定之結果，檢測出由培養基A所得之樣品為比比利比洛邊E增加32分子量之化合物B。又，檢測出遊培養基B所得之樣品為比比利比洛邊O增加32分子量的化合物C。且LC-NMR測定之結果確認化合物C為比利比洛邊O的第7位及第13位氫氧化物。確認前述細胞色素P450單加氧酶(2)具有將比利比洛邊E或比利比洛邊O之各第7位及第13位進行氫氧化的酶活性。
化合物B的物理化學性狀如下所示。
1.質普儀：ES-MS 484M/Z(M+H)+
2.分子式：C27H33NO7
3.HPLC：管柱Waters XTerra Column C18(5μm、4.6mm×50mm)、40℃、移動相為自20%乙腈水在10分鐘為100%乙腈(線性漸層)、流速0.8ml/分鐘檢測：在UV323nm之保持時間為5.614分鐘
化合物C之物理化學性狀如下所示。
1.質普儀：ES-MS 542M/Z(M+H)+、
2.分子式：C29H35NO9
3.HPLC：管柱Waters XTerra Column C18(5μm、4.6mm×50mm)、40℃、移動相為自20%乙腈水在10分鐘為100%乙腈(線性漸層)、流速0.8ml/分鐘檢測：在UV323nm的保持時間為5.165分鐘
4.1H-NMR光譜(CD3CN,1H 4.858 H-13)、(CD3CN,1H 3.65 H-7)比利比洛邊O及上述化合物C的1H-NMR光譜之柱狀圖各如圖10及圖11所示。
(8)Prenyltransferase的功能解析及添加培養試驗
於含有1%(w/v)麥芽糖之YPD培養基(1%(w/v)酵母萃取物、2%(w/v)蛋白腖、2%(w/v)葡萄糖)添加1/100容量的化合物D(4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮，以下相同)(參照參考例1)的2mg/mL二甲基亞碸溶液之培養基作為培養基C。於Czapek-Dox寒天培養基進行培養之麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP6得菌叢中採出分生子，並懸浮於滅菌水。將該分生子懸浮液調整為104spore/mL，將其中200μL添加於20mL的培養基C中，在25℃進行96小時振盪培養。於該培養液中添加20mL之丙酮，充分混合後，使用離心濃縮器餾去丙酮。於此添加20mL的乙酸乙酯，充分混合後，僅分取出乙酸乙酯層。將使用離心濃縮器餾去乙酸乙酯後所得之乾固物溶解於1,000μL之甲醇。將此作為樣品，以LC-MS(Waters公司製Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column;Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm、5μm))進行分析。
LC-MS測定的結果，檢測出於化合物D加成法呢基(farnesyl)的化合物F(4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮，以下相同)，與參考例2所記載的化合物F之在LC-MS上之保持時間、分子離子波峰、UV吸收一致。
由此可確認Prenyltransferase為具有於化合物D加成法呢基(farnesyl)的異戊二烯基轉移酶活性。
(9)　乙醯基轉移酶-1之功能解析及添加培養試驗
於含有1%(w/v)麥芽糖之YPD培養基(1%(w/v)酵母萃取物、2%(w/v)蛋白腖、2%(w/v)葡萄糖)添加1/100容量的脫乙醯基比利比洛邊E(參考例3參照)之2mg/mL二甲基亞碸溶液之培養基作為培養基D，將添加1/100容量的第11位脫乙醯基比利比洛邊O(參照參考例4)的2mg/mL二甲基亞碸溶液之培養基作為培養基E，將添加第7位脫乙醯基比利比洛邊A(參照參考例5)的2mg/mL二甲基亞碸溶液之培養基作為培養基F。由培養於Czapek-Dox寒天培養基之麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP7的菌叢所採取的分生子，於滅菌水懸浮。將該分生子懸浮液調整為104spore/mL，將其中200μL添加於20mL之培養基D、培養基E、或培養基F，在25℃進行96小時振盪培養。於該培養液添加20mL之丙酮，充分混合後，使用離心濃縮器餾去丙酮。於此添加20mL之乙酸乙酯，充分混合後，僅分取乙酸乙酯層。使用離心濃縮器餾去乙酸乙酯所得之乾固物溶解於1,000μL之甲醇。將此作為樣品，以LC-MS(Waters公司製Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column;Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm、5μm))進行分析。
LC-MS測定的結果，由培養基D檢測出比脫乙醯基比利比洛邊E增加42分子量的單一化合物，確認與比利比洛邊E(參照參考例6)的保持時間、分子離子波峰、UV吸收一致。另一方面，由培養基E及培養基F並無檢測出新生成之化合物。由此可確認乙醯基轉移酶-1為具有使脫乙醯基比利比洛邊E的第1位成專一性乙醯基化的乙醯基化酶活性者。
(10)乙醯基轉移酶-2之功能解析及添加培養試驗
於含有1%(w/v)麥芽糖之YPD培養基(1%(w/v)酵母萃取物、2%(w/v)蛋白腖、2%(w/v)葡萄糖)中添加1/100容量的脫乙醯基比利比洛邊E(參照參考例3參照)之2mg/mL二甲基亞碸溶液的培養基作為培養基D，將添加1/100容量的第11位脫乙醯基比利比洛邊O(參考例4參照)之2mg/mL二甲基亞碸溶液的培養基作為培養基E，將添加第7位脫乙醯基比利比洛邊A(參照參考例5)的2mg/mL二甲基亞碸溶液之培養基作為培養基F。於Czapek-Dox寒天培養基所培養之麴霉菌(Aspergillus oryzae)PP9的菌叢中採取分生子，於滅菌水中懸浮。將該分生子懸浮液調整成104spore/mL，將其中200μL添加於20mL之培養基D、培養基E或培養基F，在25℃進行96小時振盪培養。於該培養液中添加20mL的丙酮，充分混合後，使用離心濃縮器餾去丙酮。於此添加20mL之乙酸乙酯，充分混合後，僅分取乙酸乙酯層。將使用離心濃縮器餾去乙酸乙酯後所得之乾固物溶解於1,000μL之甲醇。將此作為樣品，以LC-MS(Waters公司製Micromass ZQ、2996PDA、2695Separation module、Column;Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm、5μm))進行分析。
LC-MS測定之結果，由培養基E檢測出比第11位脫乙醯基比利比洛邊O增加42分子量的單一化合物，確認與比利比洛邊O(參照參考例7)的保持時間、分子離子波峰、UV吸收一致。又，由培養基F檢測出比第7位脫乙醯基比利比洛邊A增加42分子量的單一化合物，確認與比利比洛邊A(參照參考例8)之保持時間、分子離子波峰、UV吸收一致。另一方面，由培養基D未檢測到新生成之化合物。由此可確認乙醯基轉移酶-2為具有將第11位脫乙醯基比利比洛邊O之第11位及第7位脫乙醯基比利比洛邊A的第7位進行專一性乙醯基化的乙醯基化酶活性。
參考例1：化合物D(4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮)之合成
前述化合物D係藉由J. Org. Chem. 1983. 48. 3945.所記載的方法取得。
參考例2：化合物F(4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮)之取得及結構解析
含有公開技法2008-500997號(專利文獻3)所記載的方法所取得之比利比洛邊類的培養液以乙酸丁酯萃取後，使用矽藻石過濾。取出使用於過濾時之矽藻石(2.5g)，加入甲醇(30mL)。在室溫進行23小時攪拌後，過濾取出不溶物，在減壓下餾去甲醇後得到化合物F(191mg)。
SI-MS;m/z 394(M+H)+
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)1.48(3H,s),1.51(3H,s),1.55(3H,s),1.69(3H,s),1.85(2H,t,J=7.5Hz),1.91-1.95(4H,m),2.01(2H,dt,J=6.9,6.9Hz),3.03(2H,d,J=7.1Hz),4.98(1H,t,J=7.0Hz),5.02(1H,t,J=6.9Hz),5.13(1H,t,J=7.0Hz),6.75(1H,s),7.54(1H,dd,J=4.8,8.2Hz),8.09(1H,ddd,J=1.4,1.9,8.2Hz),8.66(1H,dd,J=1.4,4.8Hz),8.91(1H,d,J=1.9Hz)
參考例3：脫乙醯基比利比洛邊E之合成及結構解析
將比利比洛邊E(29mg)溶解於甲醇-水(19：1、1mL)，加入碳酸鉀(53mg)。經44小時攪拌後，在減壓下將溶劑餾去，加入氯仿-甲醇(10：1)之混合溶劑。藉由過濾取出不溶物，減壓下將溶劑餾去後得到粗生成物。將粗生成物以分取薄層層析(Merck二氧化矽凝膠60F254 0.5mm、氯仿：甲醇=10：1)進行純化後得到脫乙醯基比利比洛邊E(18mg)。
ESI-MS;m/z 410(M+H)+
1H-NMR(CDCL3)δ(ppm)0.82(3H,s),0.92(3H,s),1.00-1.03(1H,m),1.04(3H,s),1.12(1H,dt,J=4.0,13.2Hz),1.27(3H,s),1.41-1.53(2H,m),1.59-1.75(3H,m),1.80-1.84(2H,m),2.15(1H,dt,J=3.2,12.4Hz),2.18-2.29(1H,m),2.54(1H,dd,J=3.2,17.6Hz),3.25(1H,dd,J=4.4,11.2Hz),6.43(1H,s),7.39(1H,dd,J=4.8,8.0Hz),8.11(1H,d,J=8.0Hz),8.65(1H,d,J=4.8Hz),8.99(1H,d,J=1.6Hz)
參考例4：11位脫乙醯基比利比洛邊O之合成及結構解析
將比利比洛邊O(30mg)溶解於甲醇-水(19：1、2mL)，加入碳酸鉀(20mg)。進行22小時攪拌後，加入乙酸(0.1ml)，在減壓下將溶劑餾去。加入乙酸乙酯與水，以乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉進行乾燥後，在減壓下餾去溶劑後得到第1位、第11位脫乙醯基比利比洛邊O之粗生成物(30mg)。
將第1位、第11位脫乙醯基比利比洛邊O的粗生成物(23mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(0.4mL)並加入三乙胺(8mg)、乙酸酐(7mg)。在室溫下進行23小時攪拌後，加入水，並以乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鎂進行乾燥後，在減壓下將溶劑餾去後得到第1位脫乙醯基比利比洛邊O之粗生成物(28mg)。
將第1位脫乙醯基比利比洛邊O的粗生成物(28mg)溶解於甲苯，並加入1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(20mg)。在70℃進行20小時攪拌後，放冷並加入乙酸乙酯與水，以乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層以飽和食鹽水洗淨，並以無水硫酸鎂乾燥後，在減壓下將溶劑餾去後得到第11位脫乙醯基比利比洛邊O之粗生成物(20mg)。
將此以甲醇溶解後作為樣品，在HPLC(SHIMADZU製LC-6AD,SPD-M20A DA,CBM-20A,Column;Waters XTerra 18(Φ4.5×50mm、5μm))以移動相自30%乙腈水在25分鐘為55%乙腈水(線性漸層)、流速1.0ml/分鐘保持時間18分鐘至19分鐘重複分取後得到第11位脫乙醯基比利比洛邊O(4.0mg)。
ESI-MS;m/z 468(M+H)+
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm);0.68(3H,s)0.95(3H,s),1.21-2.21(10H,m),1.25(3H,s),2.05(3H,s),2.20(1H,dd,J=4.63,17.3Hz),2.50(1H,dd,J=4.63,17.3Hz),2.94(1H,d,J=12.5Hz),3.33(1H,d,J=12.5Hz),4.87(1H,dd,J=4.6,12.2Hz),6.48(1H,s),7.57(1H,dd,J=5.1,8.1Hz),8.29(1H,d,J=8.3Hz),8.68(1H,d,J=4.6Hz),9.04(1H,s)
參考例5：7位脫乙醯基比利比洛邊A之合成
第7位脫乙醯基比利比洛邊A以特開平8-259569號公報所記載的方法進行合成。
參考例6：比利比洛邊E之取得
比利比洛邊E係以特開平8-239385號公報所記載的方法取得。
參考例7：比利比洛邊O之取得
比利比洛邊O係以J. Antibiot. 1996,49,292所記載的方法取得。
參考例8：比利比洛邊A之合成比利比洛邊A係以WO94/09147號公報所記載的方法取得。
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[圖1]表示PCR產物藉由瓊脂凝膠的電泳圖型。電泳為使用以下引子所增大的PCR產物。M：分子量標識體(100bp梯度)、路線1：序列號碼1及2的引子、路線2：序列號碼239及240的引子、路線3：序列號碼237及238的引子、路線4：序列號碼241及242的引子、路線5：序列號碼247及248的引子、路線6：序列號碼251及252的引子、路線7：序列號碼245及246的引子、路線8：序列號碼243及244的引子、路線9：序列號碼249及250的引子、路線10：序列號碼235及236的引子、路線11：序列號碼233及234的引子、路線12：序列號碼227及228的引子、路線13：序列號碼229及230的引子、路線14：序列號碼231及232的引子。
[圖2]表示與圖1同樣地PCR產物藉由瓊脂凝膠之電泳圖型。電泳為使用以下引子使其增大之PCR產物。M：分子量標識體(100bp梯度)、路線1：序列號碼253及254的引子、路線2：序列號碼257及258的引子、路線3：序列號碼259及260的引子、路線4：序列號碼255及256的引子、路線5：序列號碼261及262的引子。
[圖3]表示與圖1同樣地PCR產物藉由瓊脂凝膠之電泳圖型。電泳為使用以下引子使其增大之PCR產物。路線1：分子量標識體(100bp梯度)、路線2：序列號碼264及265的引子(400bp增大片段)。
[圖4]表示pUSA的質體圖譜。
[圖5]表示pPP2的質體圖譜。
[圖6]表示P450-2cDNA增大之流程。
[圖7]表示pPP3的質體圖譜。
[圖8】表示比利比洛邊E在重乙腈中之1H-NMR光譜。
[圖9]表示以質體pPP2所轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)的培養生成物在重乙腈中之1H-NMR光譜。
[圖10]表示比利比洛邊O在重乙腈中之1H-NMR光譜。
[圖11]表示以質體pPP3所轉形之麴霉菌(Aspergillus oryzae)的培養生成物在重乙腈中之1H-NMR光譜。
[圖12]表示質體pPP6、pPP7、及pPP9的質體圖譜。

Claims (12)

  1. 一種比利比洛邊A的製造法，其特徵為將導入下述(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O分離比利比洛邊A者；(I)具有選自下述(a)~(d)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸：(a)序列號碼266的核苷酸序列、(b)與序列號碼266的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等的蛋白質之核苷酸序列、(c)對於由序列號碼266的核苷酸序列所成的核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等的蛋白質之核苷酸序列、(d)具有與由序列號碼266的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等的蛋白質之核苷酸序列、(II)具有編碼選自序列號碼267~275的至少一個胺基酸序列或與此活性同等之胺基酸序列的核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(III)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸：(1)下述(a)-(i)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的3342號至5158號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的5382號至12777號為止的核苷酸序列、(c)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(d)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(e)序列號碼266所示核苷酸序列的18506號至19296號為止的核苷酸序列、(f)序列號碼266所示核苷酸序列的19779號至21389號為止的核苷酸序列、(g)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(h)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及(i)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之比利比洛邊A的製造法，其中將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1(BCRC940635)、pPP2(BCRC930148)、pPP3(BCRC930149)、pPP6(BCRC930150)、pPP7(BCRC930151)、及pPP9(BCRC930152)所成群之載體的微生物，與比利比洛邊E同時進行培養後經由比利比洛邊O分離比利比洛邊A者。
  3. 如申請專利範圍第1項之比利比洛邊A的製造法，其中將導入下述(IV)~(V)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O分離比利比洛邊A者；(IV)具有選自編碼選自序列號碼269、270、及275所成群的至少1個胺基酸序列或與此為活性同等胺基酸序列的核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(V)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)下述(a)-(c)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、及(c)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列。
  4. 如申請專利範圍第2項之比利比洛邊A的製造法，其中將含有質體pPP2、pPP3、及pPP9之微生物，與比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊O分離比利比洛邊A者。
  5. 一種比利比洛邊A的製造法，其特徵為將導入如申請專利範圍第1項之(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A者。
  6. 如申請專利範圍第5項之比利比洛邊A的製造法，其中將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1(BCRC940635)、pPP2(BCRC930148)、pPP3(BCRC930149)、pPP6(BCRC930150)、pPP7(BCRC930151)、及pPP9(BCRC930152)所成群的載體的微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A者。
  7. 如申請專利範圍第5項之比利比洛邊A的製造法，其中將導入下述(VI)及(VII)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A者；(VI)具有選自編碼選自序列號碼269、270、274、及275所成群的至少1個胺基酸序列或與此為活性同等胺基酸序列的多核苷酸序列之至少1個核苷酸序列的經分離之多核苷酸、(VII)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸：(1)下述(a)-(d)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(c)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及(d)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列。
  8. 如申請專利範圍第6項之比利比洛邊A的製造法，其中將含有質體pPP2、pPP3、pPP7、及pPP9之微生物，與脫乙醯基比利比洛邊E同時進行培養，經由比利比洛邊E及比利比洛邊O而分離比利比洛邊A者。
  9. 一種4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮的製造法，其中將導入如申請專利範圍第1項之(I)~(III)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮者。
  10. 如申請專利範圍第9項之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮的製造法，其為將含有1種或1種以上選自質體pCC1-PP1(BCRC940635)、pPP2(BCRC930148)、pPP3(BCRC930149)、pPP6(BCRC930150)、pPP7(BCRC930151)、及pPP9(BCRC930152)所成群的載體的微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮者。
  11. 如申請專利範圍第9項之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮的製造法，其中將導入下述(VIII)及(IX)所記載的至少一種多核苷酸或含有此所成重組載體而成之微生物，與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮；(VIII)具有選自編碼序列號碼273的胺基酸序列或與此為活性同等胺基酸序列之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之經分離的多核苷酸、(IX)具有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之多核苷酸：(1)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列。
  12. 如申請專利範圍第11項之4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮的製造法，其中將含有質體pPP6之微生物與4-側氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮同時進行培養，分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基)-2H-吡喃-2-酮者。
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