CN104017839A - 生产啶南平的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物制备啶南平的方法，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。
Description
本申请为2011年1月19日提交的、发明名称为“生产啶南平的方法”的PCT申请PCT/JP2011/050851的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年7月26日，申请号为201180007262.5。
[与相关申请的交叉引用]
此专利申请要求在2010年1月26日提交的日本专利申请号14727/2010的优先权，将其全部公开引入本文作为参考。
[发明背景]
发明领域
本发明涉及一种生产啶南平(pyripyropene)的方法，更具体地，一种生产啶南平A，E，O等的方法。
背景技术
如在日本专利特开公报号(Laid-Open Publication No.)360895/1992(专利文件1)和Journal of Antibiotics(1993)，46(7)，1168-9(非专利文件1)中公开的啶南平A，具有针对ACAT(酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶)的抑制活性，有望将其应用于治疗由胆固醇积累引起的疾病等等。
作为产啶南平A的真菌，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)FO-1289菌株已在日本专利特开公报号360895/1992(专利文件1)中公开；Eupenicillium reticulosporum NRRL-3446菌株已在Applied andEnvironmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35(非专利文件2)中公开；灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F1959菌株已在WO2004/060065(专利文件2)中公开；和粪生青霉(Penicillium coprobium)PF1169菌株已在Journal of Technical Disclosure500997/2008(专利文件3)中公开。
此外，作为啶南平A的生物合成途径，在Journal of OrganicChemistry(1996)，61，882-886(非专利文件3)和Chemical Review(2005)，105，4559-4580(非专利文件4)中已公开了在烟曲霉FO-1289菌株中假定的生物合成途径。这些文件公开了在烟曲霉FO-1289菌株中，通过环化酶连接分别由聚酮合酶或异戊烯转移酶合成的部分结构以合成啶南平A。
[现有技术参考]
[专利文件]
[专利文件1]日本专利特开公报号360895/1992
[专利文件2]WO2004/060065
[专利文件3]Journal of Technical Disclosure500997/2008
[非专利文件]
[非专利文件1]Journal of Antibiotics(1993)，46(7)，1168-9.
[非专利文件2]Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35.
[非专利文件3]Journal of Organic Chemistry(1996)，61，882-886.
[非专利文件4]Chemical Review(2005)，105，4559-4580.
[发明概述]
本发明者现在发现，能够通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物生产啶南平A或类似物，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。已基于这些发现产生了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种生产啶南平A的方法。
此外，根据本发明的一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养导入有以下(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A:
(I)分离的多核苷酸，其具有选自以下(a)至(d)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266的核苷酸序列,
(b)核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQ ID NO:266的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白,
(c)SEQ ID NO:266的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQ ID NO:267至275的至少一个氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分离的多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)在以下(a)至(i)中的核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列，
(b)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列,
(c)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列,
(d)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列,
(e)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列,
(f)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列,
(g)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列,
(h)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
另外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，其中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮(4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl)-2H-pyran-2-one)的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮(4-oxo-6-(3-pyridyl)-α-pyrone)培养微生物，其中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
根据本发明的另一个实施方案，提供了上述(I)至(III)中的至少一种分离的多核苷酸。
此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了重组载体，其选自pPP6(用质粒pPP6转化的米曲霉(Aspergillus oryzae)的登记号:FERMBP-11218)，pPP7(用质粒pPP7转化的米曲霉的登记号:FERM BP-11219)和pPP9(用质粒pPP9转化的米曲霉的登记号:FERM BP-11220)。
此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了转化体，其包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体。
根据本发明的另一个实施方案，提供了上述重组载体用于生产啶南平A的用途。
根据本发明的另一个实施方案，提供了上述转化体用于生产啶南平A的用途。
根据本发明的生产方法，能够通过基因重组技术生产啶南平A，E，O等等。因此本发明的生产方法对啶南平A，E，O等等的大量生产技术具有重大贡献。
[附图简述]
[图1]图1显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:M:分子量标记(100bp梯)，泳道1:SEQ ID NO:1和2的引物，泳道2:SEQ ID NO:239和240的引物，泳道3:SEQ ID NO:237和238的引物，泳道4:SEQ ID NO:241和242的引物，泳道5:SEQ ID NO:247和248的引物，泳道6:SEQ ID NO:251和252的引物，泳道7:SEQ ID NO:245和246的引物，泳道8:SEQ ID NO:243和244的引物，泳道9:SEQ ID NO:249和250的引物，泳道10:SEQ ID NO:235和236的引物，泳道11:SEQ IDNO:233和234的引物，泳道12:SEQ ID NO:227和228的引物，泳道13:SEQID NO:229和230的引物，泳道14:SEQ ID NO:231和232的引物。
[图2]类似图1，图2显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:M:分子量标记(100bp梯)，泳道1:SEQID NO:253和254的引物，泳道2:SEQ ID NO:257和258的引物，泳道3:SEQ ID NO:259和260的引物，泳道4:SEQ ID NO:255和256的引物，泳道5:SEQ ID NO:261和262的引物。
[图3]类似图1，图3显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:泳道1:分子量标记(100bp梯)，泳道2:SEQ ID NO:264和265的引物(400bp扩增片段)。
[图4]图4显示了pUSA的质粒图谱。
[图5]图5显示了pPP2的质粒图谱。
[图6]图6显示了P450-2cDNA扩增的方案。
[图7]图7显示了pPP3的质粒图谱。
[图8]图8显示了啶南平E在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图9]图9显示了用质粒pPP2转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图10]图10显示了啶南平O在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图11]图11显示了显示了用质粒pPP3转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图12]图12显示了质粒pPP6，pPP7和pPP9的质粒图谱。
[发明详述]
微生物保藏
用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌(Escherichia coli)(大肠杆菌EPI300TM-T1R)已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(地址:日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566)(AISTTsukuba Central6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan，305-8566))，登记号为自2008年10月9日(原始保藏日期)起的FERM BP-11133(从登记号为FERM P-21704的国内保藏移管)(保藏者所用的识别标识(identification reference):大肠杆菌EPI300TM-T1R/pCC1-PP1)。
用质粒pPP2转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址:日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566))，登记号为自2009年6月23日起的FERM BP-11137(保藏者所用的识别标识:米曲霉PP2-1)。
用质粒pPP3转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址:日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566))，登记号为自2009年7月3日起的FERM BP-11141(保藏者所用的识别标识:米曲霉PP3-2)。
用质粒pPP6转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址:日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERM BP-11218(保藏者所用的识别标识:米曲霉PP6)。
用质粒pPP7转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址:日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERM BP-11219(保藏者所用的识别标识:米曲霉PP7)。
用质粒pPP9转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址:日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERM BP-11220(保藏者所用的识别标识:米曲霉PP9)。
生产啶南平的方法
本发明涉及一种生产啶南平的方法，其中通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物得到次级代谢产物，在所述微生物中引入参与啶南平A生物合成的基因。
啶南平A生物合成途径的实例包括以下方案1。
[表1]
方案1
下面将详细描述上述方案1的每个生物合成途径。
1.允许烟酸与辅酶A连接酶反应，并进一步允许得到的产物与LovB样聚酮合酶(PKS)反应，由此产生5-(3-吡啶基)-3,5-二氧戊酸。
2.允许5-(3-吡啶基)-3,5-二氧戊酸与LovB样聚酮合酶(PKS)反应，由此产生4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮。
3.允许4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮和法尼焦磷酸(FPP)与UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)反应，由此产生4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
4.允许4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮与FAD依赖性单加氧酶(FMO)反应，并进一步允许得到的产物与环化酶(IMP:整合膜蛋白(Integral membrane protein))反应，由此产生去乙酰啶南平E。
5.允许去乙酰啶南平E与乙酰基转移酶(AT)反应，由此产生啶南平E。
6.允许啶南平E与细胞色素P450单加氧酶(1)(P450-1)反应，由此产生11-去乙酰啶南平O。
7.允许11-去乙酰啶南平O与乙酰基转移酶-2(AT-2)反应，由此产生啶南平O。
8.允许啶南平O与细胞色素P450单加氧酶(2)(P450-2)反应，由此产生7-去乙酰啶南平A。
9.允许7-去乙酰啶南平A与乙酰基转移酶-2(AT-2)反应，由此产生啶南平A。
例如，通过下文的参考实施例3中的方法能够合成去乙酰啶南平E。
例如，通过日本专利特开公报号239385/1996中描述的方法能够合成啶南平E。
例如，通过下文的参考实施例4中描述的方法能够合成11-去乙酰啶南平O。
例如，通过在J.Antibiot.1996，49，292中描述的方法能够得到啶南平O。
例如，通过在日本专利特开公报号259569/1996中描述的方法能够合成7-去乙酰啶南平A。
例如，通过在J.Org.Chem.1983.48.3945中描述的方法能够合成4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(IV)和(V)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平O分离啶南平A:
(IV)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQ ID NO:269，270和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(V)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)以下(a)至(c)中的核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列,
(b)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，和
(c)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，所述微生物包含选自质粒pPP2，pPP3和pPP9的一种或多种载体，并通过啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2，pPP3和pPP9的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(VI)和(VII)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A:
(VI)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQ ID NO:269，270，274和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(VII)分离的多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)以下(a)至(d)中的核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列,
(b)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列,
(c)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，所述微生物包含选自质粒pPP2，pPP3，pPP7和pPP9的一种或多种载体，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2，pPP3，pPP7和pPP9的微生物，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养)的优选实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。在此情况下，优选使用能够在体细胞内生物合成法尼焦磷酸(FPP)的微生物作为上述微生物。这样的微生物的实例包括属于曲霉属(Aspergillus)的微生物。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养)的优选实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养)的优选实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养微生物，在所述微生物中引入以下(VIII)和(IX)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮:
(VIII)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQ ID NO:273的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；
(IX)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:和
(1)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养包含质粒pPP6的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平E。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平E。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(X)和(XI)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平E:
(X)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQ ID NO:274的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XI)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列,
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP7的微生物，并分离啶南平E。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案,提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案,提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案,提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(XII)和(XIII)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平O:
(XII)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQ ID NO:269和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XIII)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)以下(a)至(b)中的核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，和
(b)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案,提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，所述微生物包含选自质粒pPP2和pPP9的一种或多种载体，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案,提供了一种生产啶南平O的方法其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2和pPP9的微生物，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离11-去乙酰啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离11-去乙酰啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离11-去乙酰啶南平O:
(XIV)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQ ID NO:269的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白.
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平O的方法，其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2的微生物，并分离11-去乙酰啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平O培养)的优选实施方案,提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平O培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平O培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平O培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平O培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平O培养微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平O:
(XIV)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQ ID NO:275的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平O培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平O的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平O培养包含质粒pPP9的微生物，并分离啶南平O。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平O培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平O培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离7-去乙酰啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平O培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平O培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离7-去乙酰啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平O培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平O培养微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离7-去乙酰啶南平A:
(XIV)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQ ID NO:270的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平O培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平O培养包含质粒pPP3的微生物，并分离7-去乙酰啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养包含选自质粒pCC1-PP1，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平A。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养微生物，在所述微生物中引入以下(XVI)和(XVII)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平A:
(XVI)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQ ID NO:275的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XVII)多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养包含质粒pPP9的微生物，并分离啶南平A。
可使用下面描述的重组载体将多核苷酸引入用于本发明的微生物。然而，可通过例如电穿孔法、聚乙二醇法、农杆菌法、锂法、氯化钙法等等将多核苷酸引入微生物。
用于本发明的微生物没有特别的限制，只要其可引入多核苷酸，或包含其的重组载体。优选属于曲霉属的微生物，特别优选米曲霉。
在本发明中，可通过例如在需氧条件下的固体培养、振荡培养、在搅拌下起泡培养或深部需氧培养，特别地，优选振荡培养。可使用通常使用的成分作为培养微生物的培养基，例如，使用葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物和植物油等等作为碳源。另外，可使用大豆粉、小麦胚芽、玉米浆、棉籽粕(cotton seed meal)、肉膏、聚蛋白胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等作为氮源。此外，根据需要加入钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(磷酸氢二钾等等)、硫酸(硫酸镁等等)或可产生其他有效离子的无机盐。另外，根据需要可加入多种微生素如硫胺(盐酸硫胺等等)，氨基酸如谷氨酸(谷氨酸钠等等)或天冬酰胺(DL-天冬酰胺等等)，微量营养物如核苷酸，或选择剂如抗生素。此外，可适当地加入帮助真菌生长和促进啶南平A生产的有机物或无机物。
培养基的pH为，例如约pH5.5至pH8。合适的培养温度为15℃至40℃，在许多情况下，生长在约22℃至30℃下进行。4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮、去乙酰啶南平E、啶南平E、啶南平O和啶南平A的生产根据培养基和培养条件，或使用的宿主而变化。在任意培养方法中，积累通常在2天至10天中达到峰值。当培养物中的啶南平A的量达到峰值时终止培养，并从培养物中分离和纯化期望的物质。
为了从培养物中分离5-(3-吡啶基)-3,5-二氧戊酸、4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮、去乙酰啶南平E、啶南平E、啶南平O、7-去乙酰啶南平A、啶南平A等等，可根据其性能通过通常的分离手段提取和纯化上述产物，如溶剂提取法、离子交换树脂法、吸附或分配柱层析法、凝胶过滤法、透析、沉淀法，所述方法可单独使用或适当地组合使用。特别优选溶剂提取法。
在本发明中，术语"基本等同的氨基酸序列"指不影响多肽活性的氨基酸序列，尽管一个或多个氨基酸已通过取代、缺失、添加或插入而改变。优选地，通过氨基酸取代、缺失、添加或插入改变的氨基酸序列与改变前的氨基酸序列等具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，更优选95％或更高,和更优选98％或更高的序列同一性。此外，改变的氨基酸残基数为，优选1至40，更优选1至20，更优选1至10，更优选1至8,和最优选1至4。
此外，不影响活性的改变的一个实例包括保守取代。术语"保守取代"指用其他化学性质类似的氨基酸残基取代优选1至40，更优选1至20，更优选1至10，更优选1至8,和最优选1至4个氨基酸残基，使得基本不改变多肽的活性。其实例包括用另一种疏水氨基酸残基取代特定的疏水氨基酸残基的情况，和用另一种具有相同电荷的极性氨基酸残基取代特定的极性氨基酸残基的情况。能够取代每种氨基酸的功能类似的氨基酸是本领域已知的。具体地，非极性(疏水)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等等。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等等。正电荷(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸等等。负电荷(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸、谷氨酸等等。
术语"严格条件"在本发明中指下述条件，其中在高温下和具有低盐浓度的溶液中进行杂交后的膜洗涤操作，本领域技术人员将能够适当地确定所述条件，例如所述条件包括在具有2×SSC(1×SSC:15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)和0.5％SDS的溶液中在60℃下洗涤20分钟的条件,和在具有0.2×SSC(1×SSC:15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)和0.1％SDS的溶液中在60℃下洗涤15分钟的条件。
可依照已知方法进行杂交。另外，当使用市售的文库时，可依照其附带的说明中描述的方法进行杂交。
在本说明书中，术语核苷酸序列的"同一性"(又称同源性)指在待比较的序列之间，组成各个序列的碱基的匹配程度。在比较时考虑缺口的存在和氨基酸特征。在本说明书中显示的任意“同一性”值可为使用本领域技术人员已知的同源性检索程序计算的值。例如，通过使用FASTA，BLAST等等中的默认(初始设置)参数，可容易地计算所述值。
在本说明书中，核苷酸序列的"同一性"为90％或更高，优选95％或更高，更优选98％或更高，更优选99％或更高。
在本说明书中，术语"在多核苷酸中缺失、取代、插入或添加一个或多个核苷酸"指通过已知方法如位点特异性诱变法，或多个核苷酸的取代等进行的改变，改变的程度是其可天然发生的。改变的核苷酸数为一个或多个核苷酸(例如，1至几个核苷酸，或1，2，3或4个核苷酸)。
术语"编码与所述(各个)核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白的核苷酸序列"指核苷酸序列编码的蛋白质与“所述(各个)核苷酸序列编码的蛋白质”具有等同的活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有辅酶A连接酶活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有LovB样聚酮合酶(PKS)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有细胞色素P450单加氧酶(1)(P450-1)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有细胞色素P450单加氧酶(2)(P450-2)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有环化酶(IMP:整合膜蛋白)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有FAD依赖性单加氧酶(FMO)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有乙酰基转移酶(AT)活性。
优选地，与SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有乙酰基转移酶-2(AT-2)活性。
获得分离的多核苷酸
不特别限制获得本发明的分离的多核苷酸的方法。可通过以下方法从粪 生青霉PF1169菌株或丝状真菌中分离多核苷酸。具体地，基于以下实施例9等方法得到的同源序列，合成了能够特异性扩增任意参与啶南平A合成的一种或多种以下基因的引物：聚酮合酶基因，异戊烯转移酶基因，羟化酶基因，乙酰基转移酶基因或腺苷酸合成酶基因。对粪生青霉PF1169菌株的福斯质粒(fosmid)基因组文库进行PCR，单独制备了文库并进一步进行了菌落杂交，由此获得用于本发明的分离的多核苷酸。
根据本发明的优选实施方案，提供了上述(I)至(III)的至少一种分离的多核苷酸。特别地，提供了以下(I)至(III)的至少一种多核苷酸:
(I)分离的多核苷酸，其具有选自以下(a)至(d)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266的核苷酸序列,
(b)核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQ ID NO:266的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白,
(c)SEQ ID NO:266的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQ ID NO:267至275的至少一个氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分离的多核苷酸，其具有选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(1)在以下(a)至(i)中的核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列,
(b)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列,
(c)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列,
(d)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列,
(e)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列,
(f)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列,
(g)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列,
(h)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与和(1)的核苷酸序列互补的序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(1)的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％的同一性,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的更优选的实施方案，提供了选自以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)和(h)的分离的多核苷酸:
(a)多核苷酸，其具有SEQ ID NO:266的核苷酸序列,
(b)多核苷酸，其编码由选自SEQ ID NO:269，270，273，274和275的氨基酸序列组成的多肽,
(c)多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:269显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有羟化酶活性的多肽,
(d)多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:270显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列,且其编码具有羟化酶活性的多肽,
(e)多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:273显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列,且其编码具有异戊烯转移酶活性的多肽,
(f)多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:274显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列,且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽,
(g)多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:275显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列,且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，和
(h)分离的多核苷酸，其具有选自以下(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(v)的核苷酸序列:
(i)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列,
(ii)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列,
(iii)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列,
(iv)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(v)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列。
根据本发明的更优选的实施方案，提供了选自以下(A)，(B)和(C)的分离的多核苷酸:
(A)多核苷酸，其编码由选自SEQ ID NO:275的氨基酸序列组成的多肽,
(B)多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列275，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，和
(C)分离的多核苷酸，其具有在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列。
根据本发明的更优选的实施方案，提供了所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸，其中所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:269，270，273，274和275中显示的氨基酸序列具有90％或更高的序列同一性。
根据本发明的更优选的实施方案，提供了所述(B)的多核苷酸，其中所述(B)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:275中显示的氨基酸序列具有90％或更高的序列同一性。
重组载体
可依照常规方法，例如,在[Sambrook，J.等人，"Molecular cloning:alaboratory manual"，(USA)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989]中描述的基因重组技术，通过将上述(I)至(III)中的任一种或多种多核苷酸根据目的修饰为适当的形式，并将其连接至载体制备根据本发明的重组载体。
用于本发明的重组载体可适当地选自病毒、质粒、福斯质粒、粘粒载体等等。例如，当宿主细胞是大肠杆菌时，其实例包括基于λ噬菌体的噬菌体和基于pBR和pUC的质粒。在枯草芽孢杆菌的情况下，实例包括基于pUB的质粒。在酵母的情况下，实例包括基于YEp，YRp，YCp和YIp的质粒。
优选地，在使用的质粒中的至少一种质粒包含用于选择转化体的选择标记。可使用编码药物抗性和基因互补营养缺陷体的基因作为选择标记。其具体的优选实例包括，当使用的宿主是细菌时为氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等等；在酵母的情况下为色氨酸生物合成基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等等；在真菌的情况下为潮霉素抗性基因、双丙氨膦(bialaphos)抗性基因、博来霉素抗性基因、短梗霉素(aureobasidin)抗性基因等等；和在植物的情况下为卡那霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因等等。
另外，用于本发明的作为表达载体的DNA分子优选具有表达各个基因所必需的DNA序列，例如，转录调控信号和翻译调控信号，如启动子、转录起始信号、核糖体结合位点、翻译终止信号、终止子。优选的启动子的实例包括大肠杆菌中的乳糖操纵子、色氨酸操纵子等的启动子；在酵母中的醇脱氢酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖代谢基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因等的启动子；在真菌中的α-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纤维二糖水解酶基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因、abp1基因等的启动子；在植物中的CaMV35S RNA启动子、CaMV19S RNA启动子或胭脂氨酸合成酶基因启动子。
根据本发明的重组载体优选地是选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的重组载体。
另外，根据本发明的优选实施方案，举例说明了选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的重组载体用于生产啶南平A的用途。
转化体
根据使用的载体的类型，其中引入根据本发明的分离的多核苷酸的宿主可适当地选自放线菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌、植物细胞等等。
根据检测的宿主细胞，将重组载体引入宿主的方法可选自接合转移、通过噬菌体的转导以及例如钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、农杆菌法或基因枪法的转化方法。
在引入多个基因至本发明的宿主细胞中的情况下，基因可包含在单个DNA分子中或分别包含在不同的DNA分子中。此外，当宿主细胞是细菌时，可将各个基因设计为以多顺反子mRNA的形式表达并成为1个DNA分子。
根据本发明的转化体优选地是包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的转化体。
根据本发明的优选实施方案，举例说明了包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的转化体用于生产啶南平A的用途。
[实施例]
通过以下实施例将进一步详细说明本发明，所述实施例无意限制本发明。
实施例1：制备粪生青霉PF1169株的基因组DNA
将无菌NB培养基(500ml)置于三角瓶(1L)。将在1/2CMMY琼脂培养基中28℃预培养4天的粪生青霉PF1169株(Journal of TechnicalDisclosure No.500997/2008(专利文献3))加入上述培养基，并在28℃液体培养4天。用Miracloth过滤，获得5g真菌细胞。从这些真菌细胞根据基因组DNA纯化试剂盒Genomic-tip100/G(Qiagen K.K.制)所附的手册获得30μg基因组DNA。
实施例2：用于扩增聚酮化合物合酶(PKS)的简并引物和其扩增片段
基于多种丝状真菌聚酮化合物合酶中保守的氨基酸序列，设计并合成下列引物作为简并引物用于扩增：
LC1：GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(SEQ ID NO：1)
LC2c：GTICCIGTICCRTGCATYTC(SEQ ID NO：2)
(其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，I＝肌苷)。
使用这些简并引物，将实施例1中制备的基因组DNA和ExTaq聚合酶(Takara Bio Inc.制)按照所附的手册进行反应。检测到约700bp的扩增片段(图1)。进一步地，分析上述扩增片段来特定其内部的500bp序列(SEQID NO：3)。
实施例3：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索
将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预处理并随后供Roche454FLX DNA测序仪测序，获得了103000个约250bp片段序列(总计49Mb的序列)。
对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：烟曲霉PKS2146a.a.和灰黄青霉(Penicillium(P.)griseofluvum)6-甲基水杨酸(methylsalycilic acid)合酶1744a.a.；异戊烯转移酶：烟曲霉异戊烯转移酶，烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)和马尼菲青霉(Penicillium(P.)marneffei)异戊烯转移酶)，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得89个、86个、2个、1个和3个同源序列(见表2)。进一步地，从烟曲霉PKS2146a.a.和灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的同源序列，分别获得19个和23个叠连序列(烟曲霉PKS2146a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：179至197；灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：198至220)(见表2)。
表2
实施例4：基因组DNA的PCR扩增
从实施例3获得的blastx的检索结果，对于聚酮化合物合酶，合成了SEQ ID NO：227至252所示的13种引物对。类似地，对于异戊烯转移酶，合成了SEQ ID NO：253至262所示的5种引物对。当使用这些引物对基因组DNA进行PCR时，对所有的引物对观察到了预期大小的扩增片段(见图1和图2)。
实施例5：构建噬菌体基因组文库
使用λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit(Takara Bio Inc.制，目录号69242-3)按照所附的手册构建粪生青霉PF1169株的λ噬菌体基因组文库。即，用限制性酶Sau3A1部分消化基因组DNA。将约20kb的DNA片段(0.5μg)连接至试剂盒所附的0.5μgλBlueSTAR DNA。将该连接溶液使用Lambda INN Packaging试剂盒(Nippon Gene Co.，Ltd.制)，根据该试剂盒所附的手册进行体外包装，获得1ml溶液。将该经包装的噬菌体溶液(10μl)感染100μl大肠杆菌ER1647株，并在噬斑形成培养基上37℃过夜培养，从而获得约500个克隆的噬斑。因此，构建了包含通过克隆感染导入了10至20kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA的噬菌体约50000个克隆的基因组文库。
实施例6：自噬菌体文库的筛选
从实施例5制备的噬菌体文库的10000个克隆，使用自上述制备的LC1-LC2c引物对扩增的PCR产物作为探针通过噬斑杂交进行初步筛选。对于探针的标记和检测，使用AlkPhos Direct Labelling and DetectionSystem with CDP-Star(GE Healthcare制，目录号RPN3690)。上述杂交按照所附的手册进行。
通过初步筛选后，留下6个克隆作为候补。进一步地，作为通过噬斑杂交进行的二次筛选的结果，获得了4个克隆。将这些阳性克隆感染大肠杆菌BM25.8株，并按照所附的手册将噬菌体变换为质粒，从而获得了含有目的区域的4种质粒。
实施例7：制备F粘粒基因组文库
根据CopyControl Fosmid Library Production Kit(EPICENTRE制，目录号CCFOS110)所附的手册，构建粪生青霉PF1169株的基因组文库。即，将约40kb基因组DNA0.25μg的DNA片段末端平端化后掺入F粘粒载体pCCFOS(Epicentre制)。将该连接溶液使用该试剂盒所附的MaxPlax Lambda Packaging Extract，根据该试剂盒所附的手册进行体外包装。将该经包装的病毒溶液10μl感染100μl大肠杆菌EPI300TM-T1R株，并在含有氯霉素的培养基上37℃过夜培养并选择，从而获得约300个克隆的菌落。因此，获得了通过感染导入了40kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA的F粘粒约30000个克隆。将它们以每孔约50个克隆注入96孔板。从而构建了包含96个池的约4800个克隆的基因组文库。
实施例8：筛选F粘粒文库
按照F粘粒所附的手册，分别从实施例7制备的文库的96个池制备质粒DNA。使用实施例2中合成的用于聚酮化合物合酶扩增的简并引物，对96个池的这些质粒DNA样本实施PCR。结果，从9个池扩增了约700bp的DNA片段。进一步地，从所述阳性池制备含有约300个或以上克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用LC1-LC2c引物对，自约4800个克隆获得了9种F粘粒。
实施例9：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索
将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预处理并随后供Roche454FLX DNA测序仪测序，获得了平均重叠群长度19.621kb的1405个片段序列(总碱基长27.568160Mb的序列)。
对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.(P22367)和烟曲霉PKS2146a.a.(Q4WZA8)；以及异戊烯转移酶：马尼菲青霉异戊烯转移酶(Q0MRO8)、烟曲霉异戊烯转移酶(Q4WBI5)和烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)(Q4WLD0))，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得22个(P22367)、21个(Q4WZA8)、2个(Q0MRO8)、3个(Q4WBI5)和3个(Q4WLD0)同源序列。
实施例10：F粘粒文库筛选和簇集基因的序列分析
按照F粘粒试剂盒(EPICENTRE制，CopyControl FosmidLibrary Production Kit)所附的手册，从实施例7制备的文库的96个池分别制备各质粒DNA。基于Roche454FLX DNA测序仪确定的碱基序列，进行氨基酸序列的同源性检索，以检索与聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶邻近的区域。基于所获得的区域的异戊烯转移酶碱基序列，合成能够扩增400bp DNA片段的引物对(No.27)。使用该引物，对48个池的质粒DNA样本进行PCR。结果，从11个池扩增了约400bp的预期DNA片段(SEQ ID NO：263)(见图3)。进一步地，从该阳性池中的6个池制备含有约300个或以上克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用27F+27R引物对(27F引物：SEQ ID NO：264，27R引物：SEQ IDNO：265)，自约4800个克隆获得了4种F粘粒。其中之一命名为pCC1-PP1，并且确定了插入片段的全序列(SEQ ID NO：266)。
将获得的pCC1-PP1转化进入大肠杆菌EPI300TM-T1R菌株中(F黏粒试剂盒附带)，从而得到大肠杆菌EPI300TM-T1R菌株/pCC1-PP1。
当在上文提到的SEQ ID NO:266序列和辅酶A连接酶；LovB样聚酮化合物合酶(PKS)；为羟化酶的细胞色素P450加单氧酶、环化酶(IMP:整合膜蛋白)和FAD依赖的加单氧酶(FMO)；UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)；为乙酰转移酶的乙酰转移酶(AT)、乙酰转移酶-2(AT-2)；和阳离子转运腺苷三磷酸酶(上文提到的酶全部来源于烟曲霉Af293菌株)中的每种之间进行同源性搜索时，在任一搜索中可见70％或者以上的高同源性。
SEQ ID NO：266的核苷酸3342至5158编码CoA连接酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：267所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸5382至12777编码LovB样聚酮化合物合酶(PKS)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：268所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸13266至15144(此后将该多核苷酸序列编码的蛋白质称为细胞色素P450单加氧酶(1)(P450-1))和核苷酸16220至18018(此后将该核苷酸序列编码的蛋白质称为细胞色素P450单加氧酶(2)(P450-2))编码细胞色素P450单加氧酶，相应的多肽分别显示为SEQ ID NO：269和270所示的氨基酸序列；SEQID NO:266的核苷酸18506至19296编码环化酶，其相应的多肽显示为SEQID NO：271所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸19779至21389编码FAD依赖的单加氧酶(FMO)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO:272所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸21793至22877编码UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO:273所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸23205至24773编码乙酰转移酶(AT)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：274所示的氨基酸序列；SEQ IDNO：266的核苷酸25824至27178编码乙酰转移酶-2(AT-2)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：275所示的氨基酸序列；和SEQ ID NO：266的核苷酸27798至31855编码转运阳离子的ATPase，其相应的多肽显示为SEQ IDNO：276所示的氨基酸序列。
实施例11:通过转化米曲霉的基因功能分析
下面使用的啶南平E能够通过基于日本专利特开公报号239385/1996，WO94/09147或美国专利号5597835中描述的方法，或在TetrahedronLetters，vol.37，No.36，6461-6464，1996中描述的全合成方法的培养微生物的方法产生。另外，下面使用的啶南平O能够通过基于J.Antibiotics49，292-298，1996或WO94/09147中描述的方法的培养微生物的方法产生。
(1)制备用于引入丝状真菌的表达载体
分别用KpnI消化pUSA(图4)和pHSG399(Takara Bio Inc.)并连接，由此得到pUSA-HSG。以提及的顺序用SmaI和KpnI消化此质粒，并进行凝胶纯化，由此得到具有KpnI粘性末端和SmaI平末端的线性载体DNA。
(2)制备质粒pPP2
用福斯质粒pCC1-PP1作为模板，使用引物对P450-1with Kpn F(SEQID NO:277)/P450-1with Swa R(SEQ ID NO:278)扩增上述P450-1的多核苷酸。将纯化的DNA片段克隆进pCR-Blunt(Invitorogen，货号K2700-20)。用KpnI和SwaI消化得到的质粒。将上述P450-1片段连接至上述载体pUSA-HSG，由此得到在图5中显示的质粒pPP2。
(3)制备质粒pPP3
用福斯质粒pCC1-PP1作为模板，依照图6中所示的流程，首先使用引物对F1(SEQ ID NO:279)/R1(SEQ ID NO:280)，F2(SEQ ID NO:281)/R2(SEQID NO:282)，F3(SEQ ID NO:283)/R3(SEQ ID NO:284)，F4(SEQ IDNO:285)/R4(SEQ ID NO:286)，F5(SEQ ID NO:287)/R5(SEQ ID NO:288)和F6(SEQ ID NO:289)/R6(SEQ ID NO:290)单独扩增外显子，由此得到6个片段。其次，用这些片段作为模板，使用引物对F1/R2，F3/R4和F5/R6进行扩增，由此得到更长的片段。此外，通过使用引物对F1/R4和F1/R6的重复扩增，制备不含上述P450-2的多核苷酸的内含子的cDNA。将此cDNA片段插入pCR-Blunt(Invitorogen，货号K2700-20)，将得到的质粒用作模板用于通过引物对infusion F of P450-2-cDNA(SEQ IDNO:291)/infusion R of P450-2-cDNA(SEQ ID NO:292)的扩增。基于试剂盒的手册，使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech)，得到图7中显示的质粒pPP3。
(4)制备各个质粒pPP6，pPP7和pPP9
使用在上述实施例11(1)中得到的用于丝状真菌转化的载体pUSA-HSG，得到了各个以下质粒，即pPP6，pPP7,和pPP9。
1)制备质粒pPP6(UbiA PT)
用福斯质粒pCC1-PP1作为模板，使用UbiA PT F with Kpn(SEQ ID NO:293)和UbiA PT R with Swa(SEQ ID NO:294)分别扩增上述UbiA PT的多核苷酸。将纯化的DNA片段克隆进用于PCR片段的载体，pCR-Blunt(Invitorogen，货号K2700-20)。用KpnI和SwaI消化得到的质粒。在纯化各个片段后，将其连接在上述丝状真菌载体pUSA-HSG的KpnI和SmaI位点之间，由此得到图12中显示的质粒pPP6。
2)制备质粒pPP7(AT)
用福斯质粒pCC1-PP1作为模板，使用AT F with Swa(SEQ ID NO:295)和AT R with Kpn(SEQ ID NO:296)扩增各AT多核苷酸。将纯化的DNA片段克隆进用于PCR片段的载体，pCR-Blunt(Invitorogen，货号K2700-20)。用KpnI和SwaI消化得到的质粒。在纯化各个片段后，将其连接在上述丝状真菌载体pUSA-HSG的KpnI和SmaI位点之间，由此得到图12中显示的质粒pPP7。
3)制备质粒pPP9(AT-2)
用福斯质粒pCC1-PP1作为模板，使用引物对infusion F of Toxin(SEQID NO:297)和infusion R of Toxin(SEQ ID NO:298)扩增Toxin片段,并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech制造，货号639619)，基于试剂盒的手册将其插入上述丝状真菌载体pUSA-HSG的KpnI和SmaI位点之间，由此得到图12中显示的质粒pPP9。
(5)得到米曲霉(A.oryzae)的转化体
在CD-Met(包含40μg/ml L-甲硫氨酸)琼脂培养基中在30℃下培养米曲霉(HL-1105菌株)一周。从此培养皿中收集分生孢子(>108)并接种在500ml烧瓶中的100ml YPD液体培养基中。在培养20小时后(30℃，180rpm)，得到具有苔藓球形状的真菌细胞。用3G-1玻璃滤器收集真菌细胞，用0.8M NaCl洗涤,并彻底去除水。将得到的细胞用TF溶液I(原生质体形成溶液)重悬，然后在30℃下，以60rpm摇动2小时。每隔30分钟在显微镜下进行观察，检查原生质体的存在。之后过滤培养基并离心(2000rpm，5分钟)收集原生质体，然后用TF溶液II洗涤。洗涤后，加入0.8倍体积的TF溶液II和0.2倍体积的TF溶液III并混合，由此得到原生质体悬浮物。
对200μl此悬浮物加入10μg质粒DNA(pPP2或pPP3)。混合物在冰上静置30分钟，然后加入TF溶液III(1mL)。轻轻地混合得到的混合物，然后在室温静置15分钟。之后将质粒DNA引入上述原生质体。为此，加入TF溶液II(8mL)并离心(以2000rpm离心5分钟)。此外，然后保留1至2ml以回收原生质体。将回收的原生质体溶液滴至重生培养基(底层)，倒入重生培养基(上层)。通过旋转培养皿混合原生质体溶液和培养基，然后在30℃下培养4至5天。在重生培养基(底层)中分离产生的克隆，再培养和纯化，由此得到转化体(米曲霉PP2-1和米曲霉PP3-2)。
基于上述实施例11(5)中描述的方法，得到引入各个质粒DNA(pPP6，pPP7和pPP9)的转化体(米曲霉PP6，米曲霉PP7和米曲霉PP9)。
用以下组分制备上述TF溶液I(原生质体形成溶液)。
在制备了上述组分(pH5.5)后，进行过滤除菌。
用以下组分制备上述TF溶液II。
此外加入水至达到200ml的总体积。
在制备了上述组分后，进行高压灭菌。
用以下组分制备上述TF溶液III。
此外加入水至达到10ml的总体积。
在制备了上述组分后，进行过滤除菌。
用以下组分制备上述重生培养基。
此外加入水至达到1L的总体积。
在制备了上述组分(pH5.5)后，进行高压灭菌。
另外，用以下组分制备上面使用的微量元素溶液。
此外加入水至达到1L的总体积。
在制备了上述组分后，进行高压灭菌。
(6)P450-1的功能分析和添加培养试验
对包含1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)，加入1/100体积的2mg/mL啶南平E的二甲亚砜溶液以得到培养基A。从在Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP2-1的菌落中收集其分生孢子并在无菌水中悬浮。将此分生孢子悬浮物调整为104孢子/mL。此外，将100μL此调整的分生孢子悬浮物加入10mL培养基A，并在25℃下振荡培养96小时。对此培养溶液加入10mL丙酮并将混合物混合均匀。之后，使用离心浓缩机移去丙酮。对此加入10mL乙酸乙酯并将得到的混合物混合均匀，然后仅回收乙酸乙酯层。在1000μL甲醇中溶解通过使用离心浓缩机移除乙酸乙酯得到的干燥产物。将其用作样品并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱:Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))和LC-NMR(Burker Daltonik制造，Avance500)分析。
上述LC-MS测量的结果证明，得到的化合物是单一化合物A，其比啶南平E增加了16的分子量。此外，LC-NMR测量的结果证明，此化合物A是啶南平E的11-位羟化物。这证明，上述细胞色素P450单加氧酶(1)具有以啶南平E作为底物的啶南平E的11-位的羟化酶活性。
上述化合物A的物理化学性质显示如下:
1.质谱:ES-MS468M/Z(M+H)+
2.分子式:C27H33NO6
3.HPLC:柱:Waters XTerra C18柱(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，流动相:在10分钟内从20％水性乙腈溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速:0.8ml/min，检测:在UV323nm处的保留时间6.696分钟
4.1H-NMR谱(CD3CN，2H:3.134，3.157H-11)
啶南平E的1H-NMR谱和根据上述4的1H-NMR谱的图表分别在图8和图9中显示。
(7)P450-2的功能分析和添加培养试验
对包含1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)，加入1/100体积的2mg/mL啶南平E的二甲亚砜溶液以得到培养基A，类似地加入1/100体积的2mg/mL啶南平O的二甲亚砜溶液以得到培养基B。从在Czapek Dox琼脂培养基中培养的米 曲霉PP3-2的菌落中收集其分生孢子并在无菌水中悬浮。将此分生孢子悬液调整为104孢子/mL。此外，将500μL调整的分生孢子悬液加入50mL培养基A或培养基B，并在25℃下振荡培养96小时。对此培养溶液加入50mL丙酮并将混合物混合均匀。之后，使用离心浓缩机移取丙酮。对此加入50mL乙酸乙酯并将得到的混合物混合均匀，然后仅回收乙酸乙酯层。在1500μL甲醇中溶解通过使用离心浓缩机移除乙酸乙酯得到的干燥产物。将其用作样品并通过LC-MS(Waters制造，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱:Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))和LC-NMR(Burker Daltonik制造，Avance500)分析。作为LC-MS测量的结果，从培养基A得到的样品中检测到化合物B，其比啶南平E增加了32的分子量。此外，从培养基B得到的样品中检测到化合物C，其比啶南平O增加了32的分子量。此外，LC-NMR测量结果证明，化合物C是啶南平O的7-位和13-位羟化物。这证明上述细胞色素P450单加氧酶(2)具有啶南平E或啶南平O各自的7-位和13-位的羟化酶活性。
上述化合物B的物理化学性质显示如下:
1.质谱:ES-MS484M/Z(M+H)+
2.分子式:C27H33NO7
3.HPLC:柱:Waters XTerra C18柱(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，流动相:在10分钟内从20％水性乙腈溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速:0.8ml/min，检测:在UV323nm处的保留时间5.614分钟
上述化合物C的物理化学性质显示如下:
1.质谱:ES-MS542M/Z(M+H)+
2.分子式:C29H35NO9
3.HPLC:柱:Waters XTerra C18柱(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，流动相:在10分钟内从20％水性乙腈溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速:0.8ml/min，检测:在UV323nm处的保留时间5.165分钟
4.1H-NMR谱(CD3CN，1H4.858H-13)，(CD3CN，1H3.65H-7)
啶南平O和上述化合物C的1H-NMR谱的图表分别显示在图10和图11中。
(8)异戊烯转移酶的功能分析和添加培养试验
对包含1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)，加入1/100体积的2mg/mL化合物D(4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮，在下文中应用此名称)(见参考实施例1)的二甲亚砜溶液以得到培养基C。从在Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲 霉PP6的菌落中收集其分生孢子并在无菌水中悬浮。将此分生孢子悬液调整为104孢子/mL。此外，将200μL此调整的分生孢子悬液加入20mL培养基C，并在25℃下振荡培养96小时。对此培养溶液加入20mL丙酮并将混合物混合均匀。之后，使用离心浓缩机移取丙酮。对此加入20mL乙酸乙酯并将得到的混合物混合均匀，然后仅回收乙酸乙酯层。在1000μL甲醇中溶解通过使用离心浓缩机移除乙酸乙酯得到的干燥产物。将其用作样品并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱:Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))分析。
作为LC-MS测量的结果，检测到化合物F(4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮，在下文中应用此名称)，其中在化合物D上添加了法尼基。证明了此化合物与参考实施例2中描述的化合物F在LC-MS上具有相同的保留时间，分子离子峰和UV吸收。由此，证明异戊烯转移酶具有对化合物D添加法尼基的异戊烯转移酶活性。
(9)乙酰基转移酶-1的功能分析和添加培养试验
对包含1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)，加入1/100体积的2mg/mL去乙酰啶南平E(见参考实施例3)的二甲亚砜溶液以得到培养基D；加入1/100体积的2mg/mL11-去乙酰啶南平O(见参考实施例4)的二甲亚砜溶液以得到培养基E，加入2mg/mL7-去乙酰啶南平A(见参考实施例5)的二甲亚砜溶液以得到培养基F。从在Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP7的菌落中收集其分生孢子并在无菌水中悬浮。将此分生孢子悬液调整为104孢子/mL。此外，将200μL此调整的分生孢子悬液加入20mL培养基D，培养基E或培养基F，并在25℃下振荡培养96小时。对此培养溶液加入20mL丙酮并将混合物混合均匀。之后，使用离心浓缩机移取丙酮。对此加入20mL乙酸乙酯并将得到的混合物混合均匀，然后仅回收乙酸乙酯层。在1000μL甲醇中溶解通过使用离心浓缩机移除乙酸乙酯得到的干燥产物。将其用作样品并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱:Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))分析。
作为LC-MS测量的结果，从培养基D中检测到单一化合物，其比去乙酰啶南平E增加了42的分子量。证明了此化合物与啶南平E(见参考实施例6)具有相同的保留时间，分子离子峰和UV吸收。同时，从培养基E和培养基F中检测到新生成的化合物。由此证明乙酰基转移酶-1具有特异性乙酰化去乙酰啶南平E的1-位的乙酰基转移酶活性。
(10)乙酰基转移酶-2的功能分析和添加培养试验
对包含1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)，加入1/100体积的2mg/mL去乙酰啶南平E(见参考实施例3)的二甲亚砜溶液以得到培养基D；加入1/100体积的2mg/mL11-去乙酰啶南平O(见参考实施例4)的二甲亚砜溶液以得到培养基E，加入2mg/mL7-去乙酰啶南平A(见参考实施例5)的二甲亚砜溶液以得到培养基F。从在Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP9的菌落中收集其分生孢子并在无菌水中悬浮。将此分生孢子悬液调整为104孢子/mL。此外，将200μL此调整的分生孢子悬液加入20mL培养基D，培养基E或培养基F，并在25℃下振荡培养96小时。对此培养溶液加入20mL丙酮并将混合物混合均匀。之后，使用离心浓缩机移取丙酮。对此加入20mL乙酸乙酯并将得到的混合物混合均匀，然后仅回收乙酸乙酯层。在1000μL甲醇中溶解通过使用离心浓缩机移除乙酸乙酯得到的干燥产物。将其用作样品并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱:Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))分析。
作为LC-MS测量的结果，从培养基E中检测到单一化合物，其比11-去乙酰啶南平O增加了42的分子量。证明了此化合物与啶南平O(见参考实施例7)具有相同的保留时间，分子离子峰和UV吸收。此外，从培养基F中检测到单一化合物，其比7-去乙酰啶南平A增加了42的分子量。证明了此化合物与啶南平A(见参考实施例8)具有相同的保留时间，分子离子峰和UV吸收。同时，从培养基D中没有检测到新生成的化合物。由此证明乙酰基转移酶-2具有特异性乙酰化11-去乙酰啶南平O的11-位和7-去乙酰啶南平A的7-位的乙酰基转移酶活性。
参考实施例1:化合物D(4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮)的合
成
通过J.Org.Chem.1983.48.3945中描述的方法得到上述化合物D。
参考实施例2:化合物F(4-羟基-6-(吡啶-3-
基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮)的
获取和结构分析
用乙酸丁酯提取通过在Journal of Technical Disclosure500997/2008(专利文件3)中描述的方法得到的包含啶南平的培养液，之后使用Celite(硅藻土)过滤。去除在过滤中使用的Celite(2.5g)并加入甲醇(30mL)。在室温搅拌23小时此生成物。通过过滤去除不可溶物质并在减压下蒸发甲醇，由此得到化合物F(191mg)。
ESI-MS；m/z394(M+H)+
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)1.48(3H，s)，1.51(3H，s)，1.55(3H，s)，1.69(3H，s)，1.85(2H，t，J＝7.5Hz)，1.91-1.95(4H，m)，2.01(2H，dt，J＝6.9，6.9Hz)，3.03(2H，d，J＝7.1Hz)，4.98(1H，t，J＝7.0Hz)，5.02(1H，t，J＝6.9Hz)，5.13(1H，t，J＝7.0Hz)，6.75(1H，s)，7.54(1H，dd，J＝4.8，8.2Hz)，8.09(1H，ddd，J＝1.4，1.9，8.2Hz)，8.66(1H，dd，J＝1.4，4.8Hz)，8.91(1H，d，J＝1.9Hz)
参考实施例3:去乙酰啶南平E的合成和结构分析
在甲醇-水(19:1，1mL)中溶解啶南平E(29mg)并对其加入碳酸钾(53mg)。搅拌44小时此生成物。之后在减压下蒸发溶剂并加入氯仿-甲醇(10:1)混合溶剂。通过过滤去除不可溶物质并在减压下蒸发溶剂，由此得到粗产物。通过制备型薄层层析纯化粗产物(Merck硅胶60F254，0.5mm，氯仿:甲醇＝10:1)，由此得到去乙酰啶南平E(18mg)。
ESI-MS；m/z410(M+H)+
1H-NMR(CDCL3)δ(ppm)0.82(3H，s)，0.92(3H，s)，1.00-1.03(1H，m)，1.04(3H，s)，1.12(1H，dt，J＝4.0，13.2Hz)，1.27(3H，s)，1.41-1.53(2H，m)，1.59-1.75(3H，m)，1.80-1.84(2H，m)，2.15(1H，dt，J＝3.2，12.4Hz)，2.18-2.29(1H，m)，2.54(1H，dd，J＝3.2，17.6Hz)，3.25(1H，dd，J＝4.4，11.2Hz)，6.43(1H，s)，7.39(1H，dd，J＝4.8，8.0Hz)，8.11(1H，d，J＝8.0Hz)，8.65(1H，d，J＝4.8Hz)，8.99(1H，d，J＝1.6Hz)
参考实施例4:11-去乙酰啶南平O的合成和结构分析
在甲醇-水(19:1，2mL)中溶解啶南平O(30mg)并对其加入碳酸钾(20mg)。搅拌22小时生成物,之后加入乙酸(0.1mL)，并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯和水，然后用乙酸乙酯进行提取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层并用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶剂，由此得到粗产物1,11-双去乙酰啶南平O(30mg)。
在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中溶解粗产物1,11-双去乙酰啶南平O(23mg)，并对其加入三乙胺(8mg)和乙酸酐(7mg)。在室温搅拌23小时得到的混合物后，加入水，然后用乙酸乙酯进行提取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层并用无水硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，由此得到粗产物1-去乙酰啶南平O(28mg)。
在甲苯中溶解粗产物1-去乙酰啶南平O(28mg)，并加入1,8-重氮二环[5,4,0]-7-十一碳烯(1,8-diazabicyclo[5,4,0]-7-undecene)(20mg)。在70℃下搅拌混合物20小时，允许其冷却。加入乙酸乙酯和水，并用乙酸乙酯进行提取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层并用无水硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，由此得到粗产物11-去乙酰啶南平O(20mg)。
在溶解于甲醇后，将此用作样品并重复进行HPLC(SHIMADZU制造，LC-6AD，SPD-M20A PDA，CBM-20A，柱；Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm，流动相在25分钟内从30％水性乙腈溶液至55％水性乙腈溶液(线性梯度)，流速:1.0ml/min，保留时间18至19分钟)以制备分离，由此得到11-去乙酰啶南平O(4.0mg)。
ESI-MS；m/z468(M+H)+
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)；0.68(3H，s)，0.95(3H，s)，1.21-2.21(10H，m)，1.25(3H，s)，2.05(3H，s)，2.20(1H，dd，J＝4.63，17.3Hz)，2.50(1H，dd，J＝4.63，17.3Hz)，2.94(1H，d，J＝12.5Hz)，3.33(1H，d，J＝12.5Hz)，4.87(1H，dd，J＝4.6，12.2Hz)，6.48(1H，s)，7.57(1H，dd，J＝5.1，8.1Hz)，8.29(1H，d，J＝8.3Hz)，8.68(1H，d，J＝4.6Hz)，9.04(1H，s)
参考实施例5:7-去乙酰啶南平A的合成
通过在日本专利特开公报号259569/1996中描述的方法合成7-去乙酰啶南平A。
参考实施例6:啶南平E的获得
通过在日本专利特开公报号239385/1996中描述的方法得到啶南平E。
参考实施例7:啶南平O的获得
通过在J.Antibiot.1996，49，292中描述的方法得到啶南平O。
参考实施例8:啶南平A的合成
通过在WO94/09147中描述的方法得到啶南平A。
[登记号]
FERM BP-11133
FERM BP-11137
FERM BP-11141
FERM BP-11218
FERM BP-11219
FERM BP-11220
Claims (7)
1.一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养导入有下面(VIII)至(IX)中的至少一种所述多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮：
(VIII)分离的多核苷酸，其为编码SEQ ID NO:273的氨基酸序列的核苷酸序列；
(IX)多核苷酸，其为SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α-吡喃酮培养包含下述质粒，即包含SEQ ID NO:266的从21793至22877的核苷酸的质粒的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
3.至少一种分离的多核苷酸，其选自以下(b)和(h):
(b)多核苷酸，其编码由SEQ ID NO:273的氨基酸序列组成的多肽,和
(h)分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列。
4.重组载体，其为包含SEQ ID NO:266的从21793至22877的核苷酸的质粒。
5.包含载体的转化体，所述载体为包含SEQ ID NO:266的从21793至22877的核苷酸的质粒。
6.根据权利要求4的所述重组载体用于生产啶南平A和/或生产其中间体的用途。
7.根据权利要求5的所述转化体用于生产啶南平A和/或生产其中间体的用途。
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