ES2645980T3

ES2645980T3 - Método de fabricación de piripiropeno

Info

Publication number: ES2645980T3
Application number: ES11736899.3T
Authority: ES
Inventors: Hiroyuki Anzai; Kentaro Yamamoto; Kazuhiko Oyama; Mariko Tsuchida; Kimihiko Goto; Masaaki Mitomi
Original assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2017-12-11
Anticipated expiration: 2031-01-19
Also published as: EP2530164A4; AU2011210967A2; TWI633190B; RU2012136449A; MX341935B; BR112012019456B1; BR122021004512B8; WO2011093185A1; CN102762737B; DK2530164T3; BR122021004512B1; EP2530164A1; NZ601950A; CN102762737A; KR101840483B1; IL221128A0; IL221128A; KR20120120287A; TW201139680A; CN104531726A

Abstract

Un método para producir piripiropeno A, caracterizado por cultivar un microorganismo en el que los polinucleótidos de (IV) o (V) a continuación o vectores recombinantes que los comprenden se introducen con piripiropeno E y aislar piripiropeno A mediante piripiropeno O: (IV) polinucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos que codifica secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 269, 270 y 275, o secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 269, 270 y 275 que tiene de uno a cuarenta restos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados y que tienen la misma actividad enzimática que las SEQ ID NO: 269, 270 y 275, respectivamente; (V) polinucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos de (1), (2), (3) o (4) a continuación: (1) secuencias de nucleótidos que comprenden de (a) a (c) a continuación: (a) una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, (b) una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, y (c) una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266; (2) secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas que comprenden lavar con 2 x tampón de solución salina-citrato sódico (SSC) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5 % a 60 °C durante 20 minutos, y a continuación lavar con 0,2 x SSC y SDS al 0,1 % a 60 °C durante 15 minutos; (3) secuencias de nucleótidos de (1) en las que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden de uno a cuatro nucleótidos; o (4) secuencias de nucleótidos que son al menos un 90 % idénticas a las secuencias de nucleótidos en (1).

Description

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El piripiropeno O es capaz de ser obtenido, por ejemplo, mediante el método descrito en el documento J. Antibiot. 1996, 49, 292.

El 7-desacetil piripiropeno A es capaz de ser sintetizado, por ejemplo, mediante el método descrito en la publicación 5 de patente japonesa abierta a inspección pública N.º 259569/1996.

La 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona es capaz de ser sintetizada, por ejemplo, mediante el método descrito en el documento J. Org. Chem. 1983. 48. 3945.

10 De acuerdo con una realización preferida del método de producción de la presente invención, método que comprende cultivar con piripiropeno E, se proporciona un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo en el que los polinucleótidos de (IV) o (V) a continuación o vector recombinante que los comprende se introducen con piripiropeno E y aislar piripiropeno A mediante piripiropeno O:

15 (IV) polinucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos que codifica secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 269, 270 y 275, o secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 269, 270 y 275 que tienen de uno a cuarenta restos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados y que tienen la misma actividad enzimática que las SEQ ID NO: 269, 270 y 275, respectivamente;

(V) polinucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos de (1), (2), (3) o (4) a continuación: 20

(1) secuencias de nucleótidos que comprenden de (a) a (c) a continuación:

(a) una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

25 (b) una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, y

(c) una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

30 (2) secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas que comprenden lavar con 2 × tampón de solución salina-citrato sódico (SSC) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5 % a 60 °C durante 20 minutos, y a continuación lavar con 0,2 × SSC y SDS al 0,1 % a 60 °C durante 15 minutos;

35 (3) secuencias de nucleótidos de (1) en las que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden de uno a cuatro nucleótidos; o

(4) secuencias de nucleótidos que son al menos un 90 % idénticas a las secuencias de nucleótidos en (1).

De acuerdo con una realización más preferida del método de producción de la presente invención, método que

40 comprende cultivar con piripiropeno E, se proporciona un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende los plásmidos pPP2, pPP3 y pPP9 con piripiropeno E y aislar piripiropeno A mediante piripiropeno O.

De acuerdo con una realización preferida del método de producción de la presente invención, método que

45 comprende cultivar con desacetil piripiropeno E, un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo en el que los polinucleótidos de (VI) o (VII) a continuación o vectores recombinantes que los comprenden se introducen con desacetil piripiropeno E y aislar piripiropeno A mediante piripiropeno E y piripiropeno

O:

50 (VI) polinucleótidos que tienen la secuencia de polinucleótidos que codifica secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 269, 270, 274 y 275, o secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 269, 270, 274 y 275 que tienen de uno a cuarenta restos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados y que tienen la misma actividad enzimática que las SEQ ID NO: 269, 270, 274 y 275, respectivamente;

(VII) polinucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos de (1), (2), (3) o (4) a continuación: 55

(1) secuencias de nucleótidos que comprenden de (a) a (d) a continuación:

60 (b) una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(c) una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, y

(d) una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ 65 ID NO: 266;

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(2): secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas que comprenden lavar con 2 × tampón de solución salina-citrato sódico (SSC) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5 % a 60 °C durante 20 minutos, y a continuación lavar con 0,2 × SSC y SDS al 0,1 % a 60 °C durante 15 minutos;

(3): secuencias de nucleótidos de (1) en las que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden de uno a cuatro nucleótidos; o

(4): secuencias de nucleótidos que son al menos un 90 % idénticas a las secuencias de nucleótidos en (1).

De acuerdo con una realización más preferida del método de producción de la presente invención, método que comprende cultivar con desacetil piripiropeno E, se proporciona un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende los plásmidos pPP2, pPP3, pPP7 y pPP9 con desacetil piripiropeno E y aislar piripiropeno A mediante piripiropeno E y piripiropeno O.

De acuerdo con una realización preferida del método de producción de la presente invención, método que comprende cultivar con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona, se proporciona un método para producir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona y aislar 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona. En este caso, se prefiere que, como el microorganismo mencionado anteriormente, pueda usarse uno capaz de la biosíntesis de farnesilpirofosfato (FPP) dentro de la célula del cuerpo. Un ejemplo de dichos microorganismos incluye microorganismos que pertenecen al género Aspergillus.

De acuerdo con una realización preferida del método de producción de la presente invención, método que comprende cultivar con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona, se proporciona un método para producir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona y aislar 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona.

De acuerdo con una realización preferida del método de producción de la presente invención, método que comprende cultivar con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona, se proporciona un método para producir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona, caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (VIII) y (IX) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona y aislar 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10trienil)-2H-piran-2-ona:

(VIII) un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 273 o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 273 que tiene de uno a cuarenta restos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados y que tiene la misma actividad enzimática que la SEQ ID NO: 273;

(IX) un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos en (1) a (4) a continuación:

(1): una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

(2): una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas que comprenden lavar con 2 × tampón de solución salinacitrato sódico (SSC) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5 % a 60 °C durante 20 minutos, y a continuación lavar con 0,2 × SSC y SDS al 0,1 % a 60 °C durante 15 minutos;

(3): una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1) en la que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden de uno a cuatro nucleótidos;

(4): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad respecto a un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1).

De acuerdo con una realización más preferida del método de producción de la presente invención, método que comprende cultivar con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona, se proporciona un método para producir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende el plásmido pPP6 con 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona y aislar 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con desacetil piripiropeno E, un método para producir piripiropeno E caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con desacetil piripiropeno E y aislar piripiropeno E.

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La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con desacetil piripiropeno E, un método para producir piripiropeno E caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con desacetil piripiropeno E y aislar piripiropeno E.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con desacetil piripiropeno E, un método para producir piripiropeno E caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (X) y (XI) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con desacetil piripiropeno E y aislar piripiropeno E:

(X): un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a esta; y

(XI): un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos en (1) a (4) a continuación:

(1): una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(2): una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos;

(3): una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1) en la que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden uno o más nucleótidos, y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos; y

(4): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad respecto a un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1), y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con desacetil piripiropeno E, un método para producir piripiropeno E caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende el plásmido pPP7 con desacetil piripiropeno E y aislar piripiropeno E.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con piripiropeno E y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con piripiropeno E y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (XII) y (XIII) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con piripiropeno E y aislar piripiropeno O:

(XII) un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 269 y 275 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a esta; y

(XIII) un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos en (1) a (4) a continuación:

(1): una secuencia de nucleótidos en (a) a (b) a continuación:

(a): una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, y

(b): una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

(2): una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a una proteína codificada por cada secuencia de nucleótidos;

(3): una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1) en la que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden uno o más nucleótidos, y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a una proteína codificada por cada secuencia de nucleótidos; y

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(4) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad respecto a un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1), y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a una proteína codificada por cada secuencia de nucleótidos.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pPP2 y pPP9 con piripiropeno E y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende los plásmidos pPP2 y pPP9 con piripiropeno E y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir 11-desacetil piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con piripiropeno E y aislar 11-desacetil piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir 11-desacetil piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno

o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con piripiropeno E y aislar 11-desacetil piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir 11-desacetil piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (XIV) y (XV) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con piripiropeno E y aislar 11-desacetil piripiropeno:

(XIV) un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 269 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a esta; y

(XV) un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos en (1) a (4) a continuación:

(1): una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno E, un método para producir 11-desacetil piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende el plásmido pPP2 con piripiropeno E y aislar 11-desacetil piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 11-desacetil piripiropeno O, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con 11-desacetil piripiropeno O y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 11-desacetil piripiropeno O, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con 11-desacetil piripiropeno O y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 11-desacetil piripiropeno O, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (XIV) y (XV) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con 11-desacetil piripiropeno O y aislar piripiropeno O:

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(XIV) un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a esta; y

(1): una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 11-desacetil piripiropeno O, un método para producir piripiropeno O caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende el plásmido pPP9 con 11-desacetil piripiropeno O y aislar piripiropeno O.

La presente descripción también se refiere a un método que comprende cultivar con piripiropeno O, un método para producir 7-desacetil piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con piripiropeno O y aislar 7-desacetil piripiropeno A.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno O, un método para producir 7-desacetil piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con piripiropeno O y aislar 7-desacetil piripiropeno A.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno O, un método para producir 7-desacetil piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (XIV) y (XV) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con piripiropeno O y aislar 7-desacetil piripiropeno A:

(XIV) un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 270 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a esta; y

(1): una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con piripiropeno O, un método para producir 7-desacetil piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende el plásmido pPP3 con piripiropeno O y aislar 7-desacetil piripiropeno A.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 7-desacetil piripiropeno A, un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en los (I) a (III) mencionados anteriormente o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con 7-desacetil piripiropeno A y aislar piripiropeno A.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 7-desacetil piripiropeno A, un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende uno o más

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vectores seleccionados entre el grupo que consiste en los plásmidos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 y pPP9 con 7-desacetil piripiropeno A y aislar piripiropeno A.

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 7-desacetil piripiropeno A, un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo en el que al menos un polinucleótido en (XVI) y (XVII) a continuación o un vector recombinante que lo/los comprende se introduce con 7desacetil piripiropeno A y aislar piripiropeno A:

(XVI) un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a esta; y

(XVII) un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos en (1) a (4) a continuación:

La presente descripción también se refiere a un método, método que comprende cultivar con 7-desacetil piripiropeno A, un método para producir piripiropeno A caracterizado por cultivar un microorganismo que comprende el plásmido pPP9 con 7-desacetil piripiropeno A y aislar piripiropeno A.

El microorganismo usado en la presente invención puede introducirse con un polinucleótido usando el vector recombinante descrito a continuación. Sin embargo, el polinucleótido puede introducirse en el microorganismo, por ejemplo, mediante un método de electroporación, un método con polietilenglicol, un método con Agrobacterium, un método con litio, un método con cloruro cálcico o similares.

El microorganismo usado en la presente invención no está particularmente restringido siempre que pueda introducirse con un polinucleótido o un vector recombinante que lo/los comprende. Se prefieren microorganismos que pertenecen al género Aspergillus y se prefiere particularmente Aspergillus oryzae.

En la presente invención, el cultivo de microorganismos puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante cultivo sólido en condiciones aerobias, cultivo con agitación, cultivo con burbujeo en agitación o cultivo aerobio profundo, en particular, se prefiere el cultivo con agitación. Como medio para el cultivo de microorganismos, pueden usarse componentes utilizados comúnmente, por ejemplo, como fuentes de carbono, glucosa, sacarosa, jarabe de almidón, dextrina, almidón, glicerol, melazas, aceites animales y vegetales, o similares. Además, como fuentes de nitrógeno, pueden usarse harina de soja, germen de trigo, licor de maíz fermentado, harina de semilla de algodón, extracto de carne, polipeptona, extracto de malta, extracto de levadura, sulfato de amonio, nitrato sódico, urea o similares. Además, según se requiera, la adición de sodio, potasio, calcio, magnesio, cobalto, cloro, ácido fosfórico (hidrogenofosfato dipotásico o similares), ácido sulfúrico (sulfato de magnesio o similares) o sales inorgánicas que pueden generar otros iones es eficaz. Además, según sea necesario, pueden añadirse diversas vitaminas tales como tiamina (clorhidrato de tiamina o similares), aminoácidos tales como ácido glutámico (glutamato de sodio o similares) o asparagina (DL-asparagina o similares), oligonutrientes, tales como nucleótidos o agentes de selección tales como antibióticos. Además, pueden añadirse apropiadamente sustancias orgánicas o sustancias inorgánicas que ayudan al crecimiento de un hongo y promueven la producción de piripiropeno A.

El pH del medio es, por ejemplo, de aproximadamente pH 5,5 a pH 8. La temperatura apropiada para el cultivo es de 15 °C a 40 °C y, en muchos casos, el crecimiento tiene lugar alrededor de 22 °C a 30 °C. La producción de 4-hidroxi6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona, desacetil piripiropeno E, piripiropeno E, piripiropeno O y piripiropeno A varía dependiendo del medio y las condiciones de cultivo, o el hospedador usado. En cualquier método para el cultivo, la acumulación habitualmente alcanza un máximo en de 2 días a 10 días. El cultivo termina en el momento en el que la cantidad de piripiropeno A en el cultivo alcanza el máximo y una sustancia deseada se aísla y se purifica a partir del cultivo.

Para aislar ácido 5-(3-piridil)-3,5-dioxopentanoico, 4-oxo-6-(3-piridil)--pirona, desacetil piripiropeno E, piripiropeno E, piripiropeno O, 7-desacetil piripiropeno A, piripiropeno A o similares a partir del cultivo, este puede extraerse y purificarse mediante un medio de separación habitual usando propiedades del mismo, tales como un método de extracción con disolvente, un método con resina de intercambio iónico, un método de cromatografía en columna de

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(a): una secuencia de nucleótidos de 3342 a 5158 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(b): una secuencia de nucleótidos de 5382 a 12777 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(c): una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(d): una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(e): una secuencia de nucleótidos de 18506 a 19296 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(f): una secuencia de nucleótidos de 19779 a 21389 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(g): una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(h): una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, y

(i): una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266;

(2): una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos de (1) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a la proteína codificada por cada secuencia de nucleótidos;

(3): una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos en (1) en la que se delecionan, sustituyen, insertan o añaden uno o más nucleótidos, y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a la proteína codificada por cada secuencia de nucleótidos; y

(4): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad respecto al polinucleótido de la secuencia de nucleótidos de (1), y que codifica una proteína sustancialmente equivalente a la proteína codificada por cada secuencia de nucleótidos.

De acuerdo con una realización más preferida de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado entre los siguientes (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) y (h):

(a): un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 266,

(b): un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 269, 270, 273, 274 y 275,

(c): un polinucleótido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la mostrada en la SEQ ID NO: 269, y que codifica un polipéptido que tiene actividad hidroxilasa,

(d): un polinucleótido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la mostrada en la SEQ ID NO: 270, y que codifica un polipéptido que tiene actividad hidroxilasa,

(e): un polinucleótido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la mostrada en la SEQ ID NO: 273, y que codifica un polipéptido que tiene actividad preniltransferasa,

(f): un polinucleótido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la mostrada en la SEQ ID NO: 274, y que codifica un polipéptido que tiene actividad acetilasa,

(g): un polinucleótido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la mostrada en la SEQ ID NO: 275, y que codifica un polipéptido que tiene actividad acetilasa, y

(h): un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las siguientes (i), (ii), (iii),

(iv): y (v):

(i): una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(ii): una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(iii) una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266,

(iv): una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266, y

(v): una secuencia de nucleótidos de 25824 a 27178 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 266.

De acuerdo con una realización más preferida de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado entre los siguientes (A), (B) y (C):

(A): un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 275,

(B): un polinucleótido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la mostrada en la SEQ ID NO: 275, y que codifica un polipéptido que tiene actividad acetilasa, y

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[Tabla 2]

Nombre de la enzima: Origen Número de secuencias de homología SEQ ID NO.

Policétido: PKS de 2146 aminoácidos de A. fumigatus 89 4 a 92

sintasas: Ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 aminoácidos de P. griseofluvum 86 93 a 178

PKS de 2146 aminoácidos de A. fumigatus: 19 (Secuencias cóntigo) 179 a 197

Ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 aminoácidos de P. 0griseofluvum: 23 (Secuencias cóntigo) 198 a 220

Preniltransferasas: Preniltransferasa de A. fumigatus 2 221, 222

Preniltransferasa (4-hidroxibezoato octapreniltransferasa) de A. fumigatus: 1 223

Preniltransferasa de P. marneffei: 3 224 a 226

Ejemplo 4: Amplificación por PCR de ADN genómico

A partir de los resultados de búsqueda de blastx obtenidos en el ejemplo 3, para policétido sintasas, se sintetizaron 13 tipos de pares de cebadores mostrados en las SEQ ID NO: 227 a 252. Análogamente, para preniltransferasas, se sintetizaron 5 tipos de pares de cebadores mostrados en las SEQ ID NO: 253 a 262. Cuando se llevó a cabo PCR para el ADN genómico usando estos cebadores, se observaron fragmentos amplificados con el tamaño esperado para todos los pares de cebadores (figura 1 y figura 2).

Ejemplo 5: Construcción de biblioteca genómica en fagos

Se construyó una biblioteca genómica en fago  de Penicillium coprobium, cepa PF1169, usando el kit BlueSTAR Xho I Half-site Arms (fabricado por Takara Bio Inc., N.º de catálogo 69242-3) de acuerdo con el manual adjunto. Es decir, el ADN genómico se digirió parcialmente usando una enzima de restricción, Sau3A1. El fragmento de ADN con aproximadamente 20 kb (0,5 g) se ligó con 0,5 g de ADN BlueSTAR adjunto al kit. Esta solución de ligamiento se sometió a empaquetamiento in vitro usando el kit de empaquetamiento Lambda INN (fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) basándose en el manual adjunto al kit para obtener 1 ml de una solución. Esta solución con fagos empaquetados (10 l) se infectó en 100 l de la cepa ER1647 de E. coli y se cultivó en un medio de formación de placas a 37 ºC durante la noche, obteniendo de este modo aproximadamente 500 clones de placas. De este modo, se construyó la biblioteca genómica compuesta por aproximadamente 50.000 clones de fagos en los que se introdujeron de 10 a 20 kb de ADN genómico de Penicillium coprobium, cepa PF1169, mediante infección de clones.

Ejemplo 6: Cribado a partir de una biblioteca de fagos

Para 10.000 clones de la biblioteca en fagos preparada en el ejemplo 5, se llevó a cabo el cribado primario mediante hibridación en placa usando, como sonda, el producto de PCR amplificado por el par de cebadores LC1-LC2c preparado anteriormente. Para el etiquetado y la detección de la sonda, se usó el sistema AlkPhos Direct Labelling and Detection con CDP-Star (fabricado por GE Healthcare, N.º de catálogo RPN3690). La hibridación mencionada anteriormente se llevó a cabo de acuerdo con el manual adjunto.

Mediante el cribado primario, 6 clones permanecieron como candidatos. Además, como resultado del cribado secundario por hibridación en placa, se obtuvieron 4 clones. Estos clones positivos se infectaron en E. coli, cepa BM25.8, y los fagos se convirtieron a plásmidos de acuerdo con el manual adjunto, obteniendo de este modo 4 tipos de plásmidos que contenían una región deseada.

Ejemplo 7: Preparación de una biblioteca genómica en fósmidos

Se construyó una biblioteca genómica de Penicillium coprobium, cepa PF1169, de acuerdo con el manual adjunto el al kit CopyControl Fosmid Library Production (fabricado por EPICENTRE, N.º de catálogo CCFOS110). Es decir, 0,25 g de fragmento de ADN de aproximadamente 40 kb de ADN genómico se hicieron romos en sus extremos y a continuación se incorporaron en el vector fósmido pCCFOS (fabricado por Epicentre). Esta solución de ligamiento se sometió a empaquetamiento in vitro usando el MaxPlac Lambda Packaging Extract adjunto al kit basándose en el manual adjunto al kit. Esta solución con virus empaquetados (10 l) se infectó en 100 l de E. coli, cepa EPI300™-T1R, y se cultivó en un medio que contenía cloranfenicol a 37 ºC durante una noche y se seleccionó, obteniendo de este modo aproximadamente 300 clones de colonias. De este modo, se obtuvieron aproximadamente 30.000 clones de los fósmidos en los que se introdujeron 40 kb del ADN genómico de Penicillium coprobium, cepa PF1169, mediante infección. Estos se dividieron en partes alícuotas en una placa de 96 pocillos de modo que hubiera aproximadamente 50 clones por pocillo. De este modo, se construyó la biblioteca genómica compuesta por 96 conjuntos, aproximadamente 4800 clones.

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Ejemplo 8: Cribado de la biblioteca de fósmidos

De acuerdo con el manual adjunto al fósmido, los ADN plasmídicos se prepararon individualmente a partir de los 96 conjuntos de la biblioteca preparada en el ejemplo 7. Usando los cebadores degenerados para la amplificación de la policétido sintasa sintetizados en el ejemplo 2, se llevó a cabo una PCR para los 96 conjuntos de estas muestras de ADN de plásmido. Como resultado, se amplificaron fragmentos de ADN de aproximadamente 700 pb de 9 conjuntos. Además, se preparó una placa de Petri que contenía colonias de aproximadamente 300 clones o más a partir de los conjuntos positivos y se volvieron a cribar por hibridación de colonias. Como resultado, usando el par de cebadores LC1-LC2c, se obtuvieron 9 tipos de fósmidos de aproximadamente 4800 clones.

Ejemplo 9: Secuenciación a gran escala de ADN genómico y búsqueda de homología de secuencias de aminoácidos

El ADN genómico de Penicillium coprobium, cepa PF1169, obtenido en el ejemplo 1 se sometió a secuenciación a gran escala y búsqueda de homología para secuencias de aminoácidos. Específicamente, parte de 50 g del ADN genómico se pretrató y a continuación se sometió a secuenciador de ADN Roche 454FLX para obtener 1405 secuencias de fragmentos con una longitud media de cóntigo de 19,621 kb (secuencia de una longitud total de bases de 27,568160 Mb).

Para estas secuencias, como secuencias conocidas entre policétido sintasas y preniltransferasas, se seleccionaron las siguientes cinco secuencias (secuencias derivadas de policétido sintasas: ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 aminoácidos de Penicillium (P.) griseofluvum (P22367) y PKS de 2146 aminoácidos de Aspergillus (A.) fumigatus (Q4WZA8); así como preniltransferasas: preniltransferasa de Penicillium (P.) marneffei (Q0MRO8), preniltransferasa de Aspergillus (A.) fumigatus (Q4WBI5) y preniltransferasa de Aspergillus (A.) fumigatus (4-hidroxibezoato octapreniltransferasa) (Q4WLD0)) y se llevó a cabo una búsqueda mediante el software de búsqueda de secuencia de homología blastx, obteniendo de este modo 22 (P22367), 21 (Q4WZA8), 2 (Q0MRO8), 3 (Q4WBI5) y 3 (Q4WLD0) de las secuencias homólogas, respectivamente.

Ejemplo 10: Cribado de la biblioteca en fósmidos y análisis de secuencia de genes agrupados

De acuerdo con el manual ajunto al kit de fósmidos (fabricado por EPICENTRE, Kit CopyControl Fosmid Library Production), los ADN plasmídicos se prepararon individualmente a partir de 96 conjuntos de la biblioteca preparada en el ejemplo 7. Basándose en las secuencias de bases determinadas por el secuenciador de ADN Roche 454FLX, se llevó cabo una búsqueda de homología para secuencias de aminoácidos para buscar regiones adyacentes a policétido sintasa y preniltransferasa. Basándose en la secuencia de bases de preniltransferasa de la región obtenida, se sintetizó un par de cebadores (N.º 27) capaz de amplificar un fragmento de ADN de 400 pb. Usando los cebadores, se llevó a cabo PCR para estos 48 conjuntos de muestras de ADN plasmídico. Como resultado, se amplificaron fragmentos de ADN esperados de aproximadamente 400 pb (SEQ ID NO: 263) a partir de 11 conjuntos (véase la figura 3). Además, se preparó una placa de Petri que contenía colonias de aproximadamente 300 clones o más a partir de 6 conjuntos de los conjuntos positivos y se llevó a cabo un cribado de nuevo por hibridación de colonias. Como resultado, usando el par de cebadores 27F + 27R (cebador 27F: SEQ ID NO: 264, cebador 27R: SEQ ID NO: 265), se obtuvieron 4 tipos de fósmidos a partir de aproximadamente 4800 clones. Uno de ellos se nombró pCC1-PP1 y se determinó la secuencia entera del fragmento insertado (SEQ ID NO: 266).

El pCC1-PP1 obtenido se transformó en Escherichia coli, cepa EPI300™-T1R, (adjunta al kit de fósmidos), obteniendo de esta manera Escherichia coli, cepa EPI300™-T1R/pCC1-PP1.

Cuando se llevó a cabo una búsqueda de homología entre la secuencia mencionada anteriormente de la SEQ ID NO: 266 y cada una de CoA ligasa; policétido sintasa (PKS) similar a LovB; citocromo P450 monooxigenasa, ciclasa (IMP: proteína integral de membrana), monooxigenasa dependiente de FAD (FMO), que son hidroxilasas; preniltransferasa similar a UbiA (UbiAPT); acetiltransferasa (AT), acetiltransferasa-2 (AT-2), que son acetiltransferasas; y ATPasa transportadora de cationes (las enzimas mencionadas anteriormente derivan todas de Aspergillus fumigatus, cepa Af293), se observó una alta homología del 70 % o más en cada búsqueda.

Los nucleótidos 3342 a 5158 de la SEQ ID NO: 266 codifican CoA ligasa y el polipéptido correspondiente se muestra con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 267; los nucleótidos 5382 a 12777 de la SEQ ID NO: 266 codifican la policétido sintasa (PKS) similar a LovB y el polipéptido correspondiente se muestra con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 268; los nucleótidos 13266 a 15144 de la SEQ ID NO: 266 (en lo sucesivo en el presente documento, una proteína codificada por esta secuencia de polinucleótidos se denomina citocromo P450 monooxigenasa (1) (P450-1)) y los nucleótidos 16220 a 18018 (en lo sucesivo en el presente documento, una proteína codificada por esta secuencia de polinucleótidos se denomina citocromo P450 monooxigenasa (2) (P450-2)) codifican citocromo P450 monooxigenasas y los polipéptidos correspondientes se muestran con las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID NO: 269 y 270, respectivamente; los nucleótidos 18506 a 19296 de la SEQ ID NO: 266 codifica ciclasa y el polipéptido correspondiente se muestra con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 271; los nucleótidos 19779 a 21389 de la SEQ ID NO: 266 codifican la monooxigenasa dependiente de FAD (FMO) y el polipéptido correspondiente se muestra con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 272; los nucleótidos 21793 a 22877 de la SEQ ID NO:

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descrito anteriormente pUSA-HSG, obteniendo de este modo un plásmido pPP7 mostrado en la figura 12.

3) Preparación del plásmido pPP9 (AT-2)

5 Con el fósmido pCC1-PP1 como modelo, un fragmento de toxina se amplificó usando una infusión de par de cebadores F de toxina (SEQ ID NO: 297) e infusión R de toxina (SEQ ID NO:298), y se insertó entre los sitios de KpnI y SmaI del vector de hongo filamentoso descrito anteriormente pUSA-HSG usando el kit In-Fusion Advantage PCR Cloning (fabricado por Clontech, N.º de catálogo 639619), basándose en el manual del kit, obteniendo de este modo un plásmido pPP9 mostrado en la figura 12.

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(5) Obtención de transformante de Aspergillus oryzae (A. oryzae)

En un medio de agar CD-Met (que contiene L-metionina 40 g/ml), se cultivó A. oryzae (cepa HL-1105) a 30 ºC durante una semana. A partir de esta placa de Petri, se recogieron conidios (>108) y se sembraron en 100 ml de

15 medio líquido YPD en un matraz de 500 ml. Después de cultivar 20 horas (30 ºC, 180 rpm), se obtuvieron células fúngicas que tenían forma de bola de musgo. Las células fúngicas se recogieron con un filtro de vidrio 3G-1, se lavaron con NaCl 0,8 M, y se eliminó el agua minuciosamente. El resultante se suspendió en solución TF I (solución de formación de protoplastos) y después se agitó a 30 ºC, a 60 rpm durante 2 horas. A un intervalo de 30 minutos, se llevó a cabo observación con el microscopio y se comprobó la presencia de protoplastos. Seguidamente, el medio

20 de cultivo se filtró y se sometió a centrifugado (2000 rpm, 5 minutos) para recoger los protoplastos, que se lavaron después con solución TF II. Después de lavar, se añadieron 0,8 volúmenes de solución TF II y 0,2 volúmenes de solución TF III y se mezcló, obteniendo de esta manera una suspensión de protoplastos.

A 200 l de esta suspensión, se le añadieron 10 g de ADN de plásmido (pPP2 o pPP3). La mezcla se dejó reposar

25 en hielo 30 minutos y se añadió solución TF III (1 ml). La mezcla resultante se mezcló suavemente y a continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de ello, el ADN plasmídico se introdujo en los protoplastos mencionados anteriormente. A esto se le añadió solución TF II (8 ml) y se sometió a centrifugado (a 2000 rpm durante 5 minutos). Además, los protoplastos se recuperaron a continuación dejándose de 1 a 2 ml. La solución de protoplastos recuperada se añadió gota a gota a un medio de regeneración (capa inferior) y se vertió un

30 medio de regeneración (capa superior). El resultante se mezcló volteando una placa de Petri y a continuación se cultivó a 30 ºC durante de 4 a 5 días. Los clones generados se aislaron en el medio de regeneración (capa inferior), se subcultivaron y purificaron, obteniendo de este modo un transformante (Aspergillus oryzae PP2-1 y Aspergillus oryzae PP3-2).

35 Basándose en el método descrito en el ejemplo 11 (5) mencionado anteriormente, se obtuvieron transformantes en las que se introdujeron cada uno de los ADN plasmídicos (pPP6, pPP7 y pPP9) (Aspergillus oryzae PP6, Aspergillus oryzae PP7 y Aspergillus oryzae PP9).

La solución TF I mencionada anteriormente (solución de formación de protoplastos) se preparó con las siguientes 40 composiciones.

Nombre del compuesto Concentración

Yatalasa (fabricado por Takara Bio Inc.) 20 mg/ml Sulfato de amonio 0,6 M Ácido maleico-NaOH 50 mM

Después de preparar las composiciones mencionadas anteriormente (pH 5,5), se llevó a cabo esterilización por filtración.

45 La solución TF II mencionada anteriormente se preparó con las siguientes composiciones.

Nombre del compuesto Cantidad Sorbitol 1,2 M (PM=182,17) 43,72 g CaCl2 50 mM 10 ml de CaCl2 1 M (1/20) NaCl 35 mM 1,4 ml de NaCl 5 M Tris-HCl 10 mM 2 ml de Tris-HCl 1 M (1/100)

Se añadió agua adicional hasta alcanzar un volumen total de 200 ml.

50 Después de preparar las composiciones mencionadas anteriormente, se llevó a cabo esterilización con autoclave.

La solución TF III mencionada anteriormente se preparó con las siguientes composiciones.

Nombre del compuesto Cantidad PEG4000al 60 % 6g CaCl2 50 mM 500 l de CaCl2 1 M (1/20)

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4. Espectro de 1H-RMN (CD3CN, 2H: 3,134, 3,157 H-11) Los gráficos del espectro de 1H-RMN de piripiropeno E y el espectro de 1H-RMN de acuerdo con 4 descrito anteriormente se muestran en la figura 8 y la figura 9, respectivamente.

(7) Análisis de función y ensayo de cultivo de adición de P450-2

A un medio YPD (extracto de levadura al 1 % (p/v), peptona al 2 % (p/v), dextrosa al 2 % (p/v)) que contenía maltosa al 1 % (p/v), se le añadió 1/100 volumen de una solución en dimetilsulfóxido de piripiropeno E 2 mg/ml para proporcionar el medio A, y análogamente se añadió 1/100 volumen de una solución en dimetilsulfóxido de piripiropeno O 2 mg/ml para proporcionar el medio B. A partir de flora de Aspergillus oryzae PP3-2 cultivada en medio agar de Czapek Dox, se recogieron conidios de los mismos y se suspendieron en agua esterilizada. Esta suspensión de conidios se ajustó a 104 esporas/ml. Además, se añadieron 100 l de esta suspensión de conidios ajustada a 50 ml de medio A o medio B y se cultivaron con agitación a 25 ºC durante 96 horas. A esta solución de cultivo, se le añadieron 50 ml de acetona y la mezcla se mezcló bien. Seguidamente, la acetona se eliminó usando un concentrador centrífugo. A esto se le añadieron 50 ml de acetato de etilo y la mezcla resultante se mezcló bien y a continuación solamente se recuperó la capa de acetato de etilo. Un producto seco obtenido eliminando el acetato de etilo usando el concentrador centrífugo se disolvió en 1500 l de metanol. Esto se usó como una muestra y se analizó por LC-MS (fabricado por Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separación 2695, columna: Waters Xterra C18 ( 4,5x50 mm, 5 m)) y LC-RMN (fabricado por Burker Daltonik, Avance500). Como resultados de la medida por LC-MS, de una muestra obtenida del medio A, se detectó el compuesto B que aumentó en un peso molecular de 32 en comparación con piripiropeno E. Además, a partir de una muestra obtenida del medio B, se detectó el compuesto C que aumentó en un peso molecular de 32 en comparación con piripiropeno O. Además, como resultados de la medición por LC-RMN, se confirmó que este compuesto C era un hidróxido en la posición 7 y la posición 13 de piripiropeno O. Se confirmó que la citocromo P450 monooxigenasa (2) mencionada anteriormente tenía una actividad hidroxilasa de la posición 7 y la posición 13 de cada uno de piripiropeno E o piripiropeno O.

Las propiedades fisicoquímicas del compuesto B anteriormente mencionado se muestran a continuación:

1.: Espectro de masas: ES-MS 484M/Z (M+H)+

2.: Fórmula molecular: C27H33NO7

3.: HPLC: Columna: columna Waters Xterra C18 (5 m, 4,6 mmx50 mm), 40 ºC, Fase móvil: de solución de acetonitrilo acuosa al 20 % a acetonitrilo al 100 % en 10 minutos (gradiente lineal), Caudal: 0,8 ml/min, Detección: tiempo de retención 5,614 minutos a UV 323 nm.

Las propiedades fisicoquímicas del compuesto C anteriormente mencionado se muestran a continuación:

1.: Espectro de masas: ES-MS 542M/Z (M+H)+

2.: Fórmula molecular: C29H35NO9

3.: HPLC: Columna: columna Waters Xterra C18 (5 m, 4,6 mmx50 mm), 40 ºC, Fase móvil: de solución de acetonitrilo acuosa al 20 % a acetonitrilo al 100 % en 10 minutos (gradiente lineal), Caudal: 0,8 ml/min, Detección: tiempo de retención 5,165 minutos a UV 323 nm.

4.: Espectro de 1H-RMN (CD3CN, 1H 4,858 H-13), (CD3CN, 1H 3,65 H-7),

Los gráficos del espectro de 1H-RMN de piripiropeno O y el compuesto C mencionado anteriormente se muestran en la figura 10 y la figura 11, respectivamente.

(8) Análisis de la función y ensayo de cultivo de adición de preniltransferasa

A un medio YPD (extracto de levadura al 1 % (p/v), peptona al 2 % (p/v), dextrosa al 2 % (p/v)) que contenía un 1 % (p/v) de maltosa, se le añadió un 1/100 volumen de 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido del compuesto D (4-oxo6-(3-piridil)--pirona, esto se aplica en lo sucesivo) (véase el ejemplo de referencia 1) para proporcionar medio C. A partir de flora de Aspergillus oryzae PP6 cultivado en medio agar de Czapek Dox, se recogieron conidios del mismo y se suspendieron en agua esterilizada. Esta suspensión de conidios se ajustó a 104 esporas/ml. Además, se añadieron 200 l de esto a 20 ml de medio C y se cultivó con agitación a 25 °C durante 96 horas. A esta solución de cultivo, se le añadieron 20 ml de acetona y la mezcla se mezcló bien. Seguidamente, la acetona se retiró usando un concentrador centrífugo. A esto se le añadieron 20 ml de acetato de etilo y la mezcla resultante se mezcló bien y a continuación solamente se recuperó la capa de acetato de etilo. Un producto seco obtenido retirando acetato de etilo usando el concentrador centrífugo se disolvió en 1000 l de metanol. Esto se usó como muestra y se analizó mediante LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separación 2695, Columna: Waters XTerra C18 ( 4,5×50 mm, 5 m)).

Como resultados de la medición por LC-MS, se detectó compuesto F (4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona, esto se aplica en lo sucesivo) en el que un grupo farnesilo se añade al compuesto D. Se confirmó que este compuesto tenía el mismo tiempo de retención, picos iónicos moleculares y absorción UV en LC-MS que el compuesto F descrito en el ejemplo de referencia 2. A partir de esto se confirmó que

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la preniltransferasa tenía una actividad preniltransferasa para añadir el grupo farnesilo al compuesto D.

(9) Análisis de la función y ensayo de cultivo de adición de acetiltransferasa-1

A un medio YPD (extracto de levadura al 1 % (p/v), peptona al 2 % (p/v), dextrosa al 2 % (p/v)) que contenía un 1 % (p/v) de maltosa, se le añadió un 1/100 volumen de 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido de desacetil piripiropeno E (véase el ejemplo de referencia 3) para proporcionar medio D; se la añadió un 1/100 volumen de 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido de 11-desacetil piripiropeno O (véase el ejemplo de referencia 4) para proporcionar medio E y se le añadieron 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido de 7-desacetil piripiropeno A (véase el ejemplo de referencia 5) para proporcionar medio F. A partir de flora de Aspergillus oryzae PP7 cultivado en medio agar de Czapek Dox, se recogieron conidios del mismo y se suspendieron en agua esterilizada. Esta suspensión de conidios se ajustó a 104 esporas/ml. Además, se añadieron 200 l de esto a 20 ml de medio D, medio E o medio F y se cultivó con agitación a 25 °C durante 96 horas. A esta solución de cultivo, se le añadieron 20 ml de acetona y la mezcla se mezcló bien. Seguidamente, la acetona se retiró usando un concentrador centrífugo. A esto se le añadieron 20 ml de acetato de etilo y la mezcla resultante se mezcló bien y a continuación solamente se recuperó la capa de acetato de etilo. Un producto seco obtenido retirando acetato de etilo usando el concentrador centrífugo se disolvió en 1000 l de metanol. Esto se usó como muestra y se analizó mediante LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separación 2695, Columna: Waters XTerra C18 ( 4,5×50 mm, 5 m)).

Como resultados de la medición por LC-MS, se detectó un único compuesto que aumentaba un peso molecular de 42 en comparación con desacetil piripiropeno E a partir del medio D. Se confirmó que el compuesto tenía el mismo tiempo de retención, picos iónicos moleculares y absorción UV que piripiropeno E (véase el ejemplo de referencia 6). Mientras tanto, no se detectaron compuestos recién generados a partir del medio E y el medio F. A partir de esto, se confirmó que la acetiltransferasa-1 tenía una actividad acetiltransferasa que acetilaba específicamente la posición 1 de desacetil piripiropeno E.

(10) Análisis de la función y ensayo de cultivo de adición de acetiltransferasa-2

A un medio YPD (extracto de levadura al 1 % (p/v), peptona al 2 % (p/v), dextrosa al 2 % (p/v)) que contenía un 1 % (p/v) de maltosa, se le añadió un 1/100 volumen de 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido de desacetil piripiropeno E (véase el ejemplo de referencia 3) para proporcionar medio D; se añadió un 1/100 volumen de 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido de 11-desacetil piripiropeno O (véase el ejemplo de referencia 4) para proporcionar medio E y se añadieron 2 mg/ml de solución en dimetilsulfóxido de 7-desacetil piripiropeno A (véase el ejemplo de referencia 5) para proporcionar medio F. A partir de flora de Aspergillus oryzae PP9 cultivado en medio agar de Czapek Dox, se recogieron conidios del mismo y se suspendieron en agua esterilizada. Esta suspensión de conidios se ajustó a 104 esporas/ml. Además, se añadieron 200 l de esto a 20 ml de medio D, medio E o medio F y se cultivó con agitación a 25 °C durante 96 horas. A esta solución de cultivo, se le añadieron 20 ml de acetona y la mezcla se mezcló bien. Seguidamente, la acetona se retiró usando un concentrador centrífugo. A esto se le añadieron 20 ml de acetato de etilo y la mezcla resultante se mezcló bien y a continuación solamente se recuperó la capa de acetato de etilo. Un producto seco obtenido retirando acetato de etilo usando el concentrador centrífugo se disolvió en 1000 l de metanol. Esto se usó como muestra y se analizó mediante LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separación 2695, Columna: Waters XTerra C18 ( 4,5×50 mm, 5 m)).

Como resultados de la medición por LC-MS, se detectó un único compuesto que aumentaba un peso molecular de 42 en comparación con 11-desacetil piripiropeno O a partir del medio E. Se confirmó que este compuesto tenía el mismo tiempo de retención, picos iónicos moleculares y absorción UV que piripiropeno O (véase el ejemplo de referencia 7). Además, se detectó un único compuesto que aumentaba un peso molecular de 42 en comparación con 7-desacetil piripiropeno A, a partir del medio F. Se confirmó que el compuesto tenía el mismo tiempo de retención, picos iónicos moleculares y absorción UV que piripiropeno A (véase el ejemplo de referencia 8). Mientras tanto, no se detectaron compuestos recién generados a partir del medio D. A partir de esto, se confirmó que acetiltransferasa-2 tiene una actividad acetiltransferasa que acetilaba específicamente la posición 11 de 11-desacetil piripiropeno O y la posición 7 de 7-desacetil piripiropeno A.

Ejemplo de referencia 1: Síntesis del compuesto D (4-oxo-6-(3-piridil)--pirona)

El compuesto D mencionado anteriormente se obtuvo mediante el método descrito en el documento J. Org. Chem. 1983. 48. 3945.

Ejemplo de referencia 2: Obtención y análisis estructural del compuesto F (4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona)

Un caldo de cultivo que contenía piripiropenos obtenido mediante el método descrito en el documento Journal of Technical Disclosure (documento de patente 3) se extrajo con acetato de butilo y seguidamente se filtró usando Celite. El Celite (2,5 g) usado durante la filtración se retiró y se añadió metanol (30 ml). El resultante se agitó a temperatura ambiente durante 23 horas. La materia insoluble se retiró por filtración y el metanol se evaporó a

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Claims

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