WO2013073689A1 - ピリピロペン生合成遺伝子発現植物体 - Google Patents

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WO2013073689A1
WO2013073689A1 PCT/JP2012/079859 JP2012079859W WO2013073689A1 WO 2013073689 A1 WO2013073689 A1 WO 2013073689A1 JP 2012079859 W JP2012079859 W JP 2012079859W WO 2013073689 A1 WO2013073689 A1 WO 2013073689A1
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nucleotide sequence
seq
polynucleotide
protein
plant
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PCT/JP2012/079859
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English (en)
French (fr)
Inventor
安西　弘行
憲太朗 山本
賢司 梅村
正明 三冨
Original Assignee
Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Definitions

  • the present invention relates to a plant for expressing a pyripyropene biosynthetic gene.
  • Non-patent Document 1 WO 2004/060065
  • Patent Document 1 It is described that it has an insecticidal activity, and that pyripyropene A has an insecticidal activity against white moth larvae and the white rice beetle.
  • many insect-resistant insect-transferred plants have been reported so far, most of which have been obtained by introducing genes such as insecticidal proteins and peptides.
  • genes such as insecticidal proteins and peptides.
  • Non-Patent Document 2 JP-A-4-360895 (Patent Document 2) describes the production of pyripyropene A as an Aspergillus fumigatus FO-1289 strain, Applied Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-35.
  • Non-Patent Document 1 includes Eupenicillium reticulosporum NRRL-3446 strain, WO 2004/060065 (Patent Literature 1), Penicillium griseofulbum F1959 strain, and published technical report 2008-500997 (Patent Literature 3). Discloses Penicillium copirobium PF1169 strain.
  • Non-Patent Document 3 Aspergillus fumigatus FO-1289 strain has been disclosed as a putative biosynthetic route.
  • Aspergillus fumigatus FO-1289 strain the partial structures synthesized by polyketide synthase and prenyltransferase are combined, and cyclylase forms pyripyropene A. It is disclosed to be synthesized.
  • the present inventors have now found a plant body into which a polynucleotide encoding at least one polypeptide involved in the biosynthesis of pyripyropene A or a recombinant vector containing the same is introduced.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • an object of the present invention is to provide a plant obtained by introducing a polynucleotide encoding at least one polypeptide involved in biosynthesis of pyripyropene A or a recombinant vector comprising the same.
  • a plant obtained by introducing a polynucleotide encoding at least one polypeptide involved in biosynthesis of pyripyropene A or a recombinant vector comprising the same.
  • the plant according to (1) wherein the plant is tobacco or rice.
  • the polypeptide is a polypeptide consisting of one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, and 8, or a substantially equivalent amino acid sequence thereof (1) or The plant according to (2).
  • the isolated polynucleotide is a polynucleotide having at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in (I) and (II) below:
  • the described plant body (I) Nucleotide sequences described in (a) to (d) below: (A) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, (B) a nucleotide sequence that is capable of hybridizing under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and that encodes a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 , (C) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which is a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and is substantially the same as the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 a nucleotide sequence from No. 16220 to No. 18018 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • Iv a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the complementary sequence of the nucleotide sequence described in (i) to (iii), and a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence A nucleotide sequence encoding,
  • V a polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (i) to (iii), wherein one or more nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and each nucleotide sequence is A nucleotide sequence encoding a protein substantially equivalent to the encoding protein, (V)
  • a production method comprising the step of introducing a nucleotide or a recombinant vector comprising the nucleotide: (III) an isolated polynucleotide having a nucleotide sequence encoding at least one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 5, and 8 or an amino acid sequence substantially equivalent thereto, (IV) An isolated polynucleotide having at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in (i) to (iv) below: (I) Nucleotide sequences described in (a) to (c) below: (A) a nucleotide sequence from No.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (B) a nucleotide sequence from No. 16220 to No. 18018 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, (C) a nucleotide sequence from 21793 to 22877 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a nucleotide sequence capable of hybridizing under the strict conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence described in (i), and encoding a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence , (Iii) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (i), wherein one or more nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and the protein encoded by each nucleotide sequence; A nucleotide sequence encoding a substantially equivalent protein, (Iv) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the
  • FIG. 1 represents the plasmid maps of pIG6-CL, pIG6-PT, and pIG6-P450-2.
  • FIG. 2 shows the result of agarose electrophoresis by the genomic PCR method of tobacco transformed with the introduced Prenyltransferase gene.
  • FIG. 3 shows the results of agarose electrophoresis by genomic PCR of tobacco transformed with the P450-2 gene introduced.
  • FIG. 4 shows the results of agarose electrophoresis by tobacco PCR using a CoA ligase gene introduced and transformed.
  • FIG. 5 shows the result of agarose electrophoresis of rice transformed with the introduction of the Prenyltransferase gene by the genomic PCR method.
  • FIG. 6 shows the results of agarose electrophoresis of rice transformed with the P450-2 gene by genomic PCR.
  • FIG. 7 shows the result of agarose electrophoresis of rice transformed with the CoA ligase gene by genomic PCR.
  • FIG. 8 shows the results of agarose electrophoresis by RT-PCR of tobacco transformed with the introduced prenyltransferase gene.
  • FIG. 9 shows the results of agarose electrophoresis of tobacco transformed with the P450-2 gene introduced by RT-PCR.
  • FIG. 10 shows the results of agarose electrophoresis by RT-PCR of tobacco transformed with the CoA ligase gene introduced.
  • FIG. 11 shows the results of agarose electrophoresis of rice transformed with the P450-2 gene by RT-PCR.
  • FIG. 12 shows the results of agarose electrophoresis by RT-PCR of rice transformed with the CoA ligase gene.
  • FIG. 13 shows the results of agarose electrophoresis by RT-PCR of rice transformed with a prenyltransferase gene.
  • Escherichia coli EPI300 TM -T1 R transformed with the microbial deposit plasmid pCC1-PP1 has been released on October 9, 2008 (original deposit date) by the National Institute of Technology and Evaluation Biological Center (National Institute of Technology and Evaluation). (Former name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center) (1st, 1st, East 1st, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8856) and the deposit number FERM BP-11133 (Domestic Deposit FERMP (Transferred from -21704) (denoted by the depositor for identification: Escherichia coli EPI300 TM -T1 R / pCC1-PP1).
  • Aspergillus oryzae transformed with the plasmid pPP3 was issued on July 3, 2009 by the National Institute of Technology and Evaluation Patent Biology Center (former name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Center) ( ⁇ 305 -8566
  • the deposit number is FERM BP-11141 (indication for identification given by the depositor: Aspergillus oryzae PP3-2) in Tsukuba City, 1-1-1 Higashi 1-chome, Ibaraki Prefecture, Japan.
  • Aspergillus oryzae transformed with the plasmid pPP6 was patented biological deposit center, National Institute of Technology and Evaluation (former name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center) on December 21, 2009 ( ⁇ 305 -8566 The deposit number is FERM BP-11218 (indication for identification attached by the depositor: Aspergillus oryzae PP6) at Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, 1-1-1 Higashi 1-chome, Central 6th.
  • Plant The plant of the present invention is a plant into which an isolated polynucleotide encoding at least one polypeptide involved in biosynthesis of pyripyropene A or a recombinant vector comprising the same is introduced.
  • the biosynthetic pathway of pyripyropene A is as described in Scheme 1 of WO 2011/093185, and is specifically as follows.
  • the plant body is not particularly limited, but rice, wheat (wheat, barley, etc.), miscellaneous cereals (corn, whey, acne, sorghum, edible sorghum, etc.), fruit trees (citrus, Apples, grapes, etc.), vegetables (cucumbers, pumpkins, melons, cabbage, eggplants, tomatoes, strawberries, etc.), potatoes (eg, potatoes, sweet potatoes, sweet potatoes, etc.), beans (soybeans, red bean, sweet peas, etc.), forage crops ( Grass, sorghum, corn for feed, etc.), flowering plants, foliage plants, trees, tea, sugar beet, sugar cane, sunflower, rapeseed, hops, cotton, tobacco, coffee tree, turf, mushrooms, etc., preferably rice, wheat , Cereals, vegetables, potatoes, beans, flowers, rapeseed, cotton and tobacco.
  • the plant body of the present invention may be any of a grown plant individual, a plant cell, a plant tissue, a callus, or a seed, as long as it can finally grow to a plant individual as described above. Any embodiment is included in the plant of the present invention.
  • a polynucleotide encoding at least one polypeptide involved in the biosynthesis of pyripyropene A or a recombinant vector comprising the same pyripyropene A can be produced.
  • the plant body which acquired pest resistance is provided.
  • Examples of the pests to which the plant of the present invention has resistance include lepidopterous pests (for example, Spodoptera litura, Coleoptera, Aguayotou, Aomushi, Konaiga, Shirochimojiyoto, Nikameiga, Kofomoga, Clamidae, Sinkiga, Clamidae, Dokuga, Agrotis Agrotis spp), Helicocoverpa ppspp, or Heliothis spp), Hemiptera pests (eg, peach aphids, cotton aphids, Aphis fabae, corn aphids, pea aphids, diatoms aphids) , Bean aphid, tulip beetle aphid, Macrosiphum avenae, Methopolophium dirhodum, wheat beetle aphid, wheat midria aphid, radish aphid, phantom
  • the polypeptide involved in the biosynthesis of pyripyropene A is not particularly limited, but from the group consisting of polyketide synthase activity, prenyl transferase activity, hydroxylase activity, acetylase activity, and adenylate synthase activity.
  • the polypeptide has one or more selected activities, more preferably, the polypeptide has one or more activities selected from the group consisting of ligase activity, hydroxylase activity, and prenyltransferase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence substantially equivalent thereto has ligase activity, and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence substantially equivalent thereto.
  • the polypeptide has oxygenase activity (eg, hydroxy acid With enzymatic activity), a polypeptide consisting of an amino acid sequence or a substantially equivalent amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 has a prenyl transferase activity.
  • one or more vectors selected from the group consisting of plasmids pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7, and pPP9 described in WO2011 / 093185 are included in the plant. Plasmids can be introduced to provide transformed plants.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from No. 3342 to No. 5158 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 preferably has ligase activity, particularly CoA ligase (CoA ligase) activity.
  • ligase activity particularly CoA ligase (CoA ligase) activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 5382 to 12777 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is polyketide synthase activity, particularly LovB-like polyketide synthase (LovB-like polyketide synthase) ( PKS) activity is preferred.
  • PKS LovB-like polyketide synthase
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence of Nos. 13266 to 15144 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is oxygenase (eg, hydroxylase) activity, particularly Cytochrome P450 monooxygenase (cytochrome P450 monooxygenase) ) (1) It is preferable to have (P450-1) activity.
  • oxygenase eg, hydroxylase
  • Cytochrome P450 monooxygenase cytochrome P450 monooxygenase
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 16220 to 18018 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is oxygenase (eg, hydroxylase) activity, particularly Cytochrome P450 monooxygenase (cytochrome P450 monooxygenase) ) (2) It is preferable to have (P450-2) activity.
  • oxygenase eg, hydroxylase
  • Cytochrome P450 monooxygenase cytochrome P450 monooxygenase
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 18506 to 19296 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 preferably has cyclase activity, particularly Cyclase (IMP: Integral membrane protein) activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from No. 19779 to No. 21389 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is oxygenase activity, particularly FAD-dependent monooxygenase (FMO-dependent monooxygenase) (FMO) activity It is preferable to have.
  • FAD-dependent monooxygenase FMO-dependent monooxygenase
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 21793 to 22877 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a prenyltransferase activity, in particular, UbiA-like prenyltransferase (UbiA-like prenyltransferase) (UbiAPT) activity. It is preferable to have.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 23205 to 24773 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has acetyltransferase (AT) activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 25824 to 27178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 preferably has acetyltransferase, particularly Acetyltransferase-2 (AT-2) activity.
  • the protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 27798 to 31855 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 preferably has ATP synthase activity, particularly Cation transporting ATPase activity.
  • nucleotides 3342 to 5158 of SEQ ID NO: 1 encode CoA ligase (CoA ligase), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • Nucleotides 5382 to 12777 of SEQ ID NO: 1 encode LovB-like polyketide synthase (LovB-like polyketide synthase) (PKS), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
  • Nucleotides 13266 to 15144 of SEQ ID NO: 1 (hereinafter, the protein encoded by this polynucleotide sequence is referred to as Cytochrome P450 monooxygenase (1) (P450-1)) and 16220 to 18018 (Hereinafter referred to as Cytochrome P450 monooxygenase (2) (P450-2) as the protein encoded by this polynucleotide sequence) encodes Cytochrome P450 monooxygenase.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 are shown.
  • nucleotides 18506 to 19296 of SEQ ID NO: 1 encode Cyclase, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6.
  • the nucleotides 19779 to 21389 of SEQ ID NO: 1 encode FAD-dependent monooxygenase (FMO), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7.
  • FMO FAD-dependent monooxygenase
  • Nucleotides 21793 to 22877 of SEQ ID NO: 1 encode UbiA-like prenyltransferase (UbiA-like prenyltransferase) (UbiAPT), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleotides 23205 to 24773 of SEQ ID NO: 1 encode Acetyltransferase (AT), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
  • the nucleotides 25824 to 27178 of SEQ ID NO: 1 encode Acetyltransferase-2 (AT-2), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10.
  • nucleotides 27798 to 31855 of SEQ ID NO: 1 encode Cation transporting ATPase, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11.
  • a “substantially equivalent amino acid sequence” refers to an amino acid that has a modification by substitution, deletion, addition, or insertion of one or more amino acids, but does not affect the activity of the polypeptide. Means an array.
  • the amino acid sequence modified by amino acid substitution, deletion, addition, or insertion is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably with respect to the amino acid sequence before the modification or the like. Preferably have a sequence identity of 95% or more, even more preferably 98% or more.
  • the number of amino acid residues to be modified is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 4. It is a piece.
  • a polymorphism comprising an amino acid sequence modified by substitution, deletion, addition or insertion of 1 to 40 (preferably 1 to 8) amino acids from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a plant preferably tobacco
  • an amino acid sequence modified by substitution, deletion, addition or insertion of 1 to 40 (preferably 1 to 8) amino acids from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 An isolated polynucleotide encoding the polypeptide, wherein the polypeptide comprising the amino acid sequence has oxygenase activity (preferably hydroxylase activity) or a recombinant vector comprising the same
  • An introduced plant body preferably tobacco or rice
  • amino acid sequence modified by substitution, deletion, addition or insertion of 1 to 40 (preferably 1 to 8) amino acids from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 A plant obtained by introducing a polynucleotide having the prenyltransferase activity, or a recombinant vector comprising the same, wherein the polypeptide comprising the amino acid sequence is an isolated polynucleotide encoding the polypeptide comprising Tobacco or rice) is provided.
  • the amino acid sequence modified by amino acid substitution, deletion, addition, or insertion from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is changed to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 before being modified or the like.
  • the amino acid sequence modified by amino acid substitution, deletion, addition, or insertion from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is changed to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 before being modified or the like.
  • more than 90% (preferably, 95% or more) a polypeptide consisting of an isolated polynucleotide encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity and the modified amino acid sequence Is provided with a plant (preferably tobacco or rice) into which a polynucleotide having oxygenase activity (preferably hydroxylase activity) or a recombinant vector comprising the same is introduced.
  • the amino acid sequence modified by amino acid substitution, deletion, addition, or insertion from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is changed to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 before being modified or the like.
  • more than 90% (preferably, 95% or more) a polypeptide consisting of an isolated polynucleotide encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity and the modified amino acid sequence Is provided with a plant (preferably tobacco or rice) into which a polynucleotide having prenyltransferase activity or a recombinant vector comprising the same is introduced.
  • modifications that do not affect activity include conservative substitutions.
  • the “conservative substitution” is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 1, so as not to substantially change the activity of the polypeptide. It means that 8 and most preferably 1-4 amino acid residues are replaced by another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic amino acid residue is substituted by another hydrophobic amino acid residue, a certain polar amino acid residue is substituted by another polar amino acid residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • nonpolar amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine and the like.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • “strict conditions” means that the membrane washing operation after hybridization is performed in a high-temperature, low-salt concentration solution, and those conditions can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • 2 ⁇ SSC concentration (1 ⁇ SSC: 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride) in 0.5% SDS solution at 60 ° C. for 20 minutes 0.2 ⁇ SSC concentration (1 ⁇ SSC: 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride), washing conditions at 60 ° C.
  • Hybridization can be performed according to a known method. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • identity (sometimes referred to as homology) with respect to nucleotide sequences is used to mean the degree of coincidence of bases constituting each sequence among the sequences to be compared. At this time, the existence of gaps and the nature of amino acids are considered. Any numerical value of “identity” shown in the present specification may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, a default (initial setting) parameter in FASTA, BLAST, or the like. Can be easily calculated.
  • the “identity” with respect to the nucleotide sequence is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and further preferably 99% or more.
  • nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in a polynucleotide” may occur by a known method such as site-directed mutagenesis or naturally. It means that the modification was made by substitution of a plurality of nucleotides or the like.
  • the number of nucleotide modifications is one or more (for example, one to several, 1, 2, 3, or 4).
  • nucleotide sequence encoding a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence means “substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence” It means a nucleotide sequence encoding a protein having an activity equivalent to “protein”.
  • 1 to 40 nucleotides are missing in the polynucleotide having the nucleotide sequence from 3342 to 5158 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence deleted, substituted, inserted or added, and a protein encoded by the nucleotide sequence having a ligase activity, or a recombinant vector comprising the same, or A plant body is provided.
  • 1 to 40 (preferably 1 to 8) nucleotides in the polynucleotide having the nucleotide sequence from 16220 to 18018 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • transduces the recombinant vector consisting of is provided.
  • 1 to 40 (preferably 1 to 8) nucleotides in the polynucleotide having the nucleotide sequence from 21793 to 22877 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a plant body is provided.
  • it has 90% or more (preferably 95% or more) identity of a polynucleotide having a nucleotide sequence from No. 3342 to No. 5158 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a plant obtained by introducing a polynucleotide having a nucleotide sequence and a protein encoded by the nucleotide sequence having a ligase activity or a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • a plant comprising a polynucleotide having a sequence and the introduction of a polynucleotide or a recombinant vector comprising the polynucleotide, wherein the protein encoded by the nucleotide sequence has prenyltransferase activity.
  • the recombinant vector according to the present invention may contain, for example, any one or more of the polynucleotides described in the above (I) to (II), for example, [Sambrook, J. et al., “Molecular cloning. (Molecular cloning: a laboratory manual ”, (USA), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. According to a conventional method, it can be prepared by modifying it into an appropriate form according to the purpose and ligating it to a vector.
  • the recombinant vector used in the present invention can be appropriately selected from viruses, plasmids, fosmids, cosmid vectors, and the like.
  • At least one of the plasmids used preferably contains a selection marker for selecting a transformant, and a drug resistance gene and a gene complementary to auxotrophy can be used as the selection marker.
  • a selection marker for selecting a transformant preferably contains a drug resistance gene and a gene complementary to auxotrophy.
  • a drug resistance gene and a gene complementary to auxotrophy can be used as the selection marker.
  • Preferable specific examples thereof include a kanamycin resistance gene and a bialaphos resistance gene.
  • the DNA molecule as an expression vector used in the present invention is a DNA sequence necessary for the expression of each gene, for example, a transcription regulatory signal such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, It is preferable to have a translation adjustment signal.
  • a transcription regulatory signal such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, It is preferable to have a translation adjustment signal.
  • promoters that can be preferably used include CaMV 35S RNA promoter, CaMV 19S RNA promoter, nopaline synthase gene promoter, maize ubiquitin promoter, rice actin promoter, and the like.
  • the recombinant vector according to the present invention is preferably a recombinant vector selected from the group consisting of plasmids pIG6-CL, pIG6-PT, and pIG6-P450-2.
  • Fosmid pCC1-PP1 can be prepared using E. coli of deposit number: FERM BP-11133), plasmid pPP3 (deposit number: can be prepared using Aspergillus oryzae of FERM BP-11141), and nucleotide sequence contained therein as a template, A DNA fragment is amplified using the primer pairs shown below.
  • the plant into which the isolated polynucleotide according to the present invention is introduced may be appropriately selected according to the type of vector used.
  • Recombinant vectors can be introduced into plants by conjugation transfer, phage transduction, transformation of calcium ion method, lithium ion method, electroporation method, PEG method, Agrobacterium method, particle gun method, etc. What is necessary is just to use it according to the plant body to test from a method.
  • each gene when a plurality of genes are introduced into a plant body (plant cell), each gene may be contained in the same or different DNA molecules.
  • the plant according to the present invention is preferably a plant comprising one or more vectors selected from the group consisting of plasmids pIG6-CL, pIG6-PT, and pIG6-P450-2.
  • it comprises one or more vectors selected from the group consisting of plasmids pIG6-CL, pIG6-PT, and pIG6-P450-2 for the production of pyripyropene A ( And the use of transformed plants.
  • the plant growth method needs to determine conditions such as soil, fertilizer and temperature.
  • the method for producing a plant body of the present invention comprises one or more isolated polynucleotides selected from the group consisting of the following (I) and (II) or a recombinant vector comprising the same
  • a process comprising the step of introducing: (I) An isolated polynucleotide having a nucleotide sequence encoding at least one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 5, and 8 or an amino acid sequence substantially equivalent thereto (II) An isolated polynucleotide having at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in (iv): (I) Nucleotide sequences described in (a) to (c) below: (A) a nucleotide sequence from No.
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under a strict condition with a complementary sequence of the nucleotide sequence described in (i)
  • a nucleotide sequence encoding a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence (Iii) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (i), wherein one or more nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and the protein encoded by each nucleotide sequence;
  • a nucleotide sequence encoding a substantially equivalent protein (Iv) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (i), and encoding a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence Nucleotide sequence.
  • the polynucleotide and the recombinant vector used in the method for producing a plant of the present invention may be the same as the polynucleotide and the recombinant vector described in the plant of the present invention described above.
  • the introduction method may be the same as described above.
  • the step of introducing the recombinant vector of the present invention includes introducing an isolated polynucleotide encoding all polypeptides involved in the biosynthesis of pyripyropene A into one plant and introducing it into a plant body.
  • an isolated polynucleotide encoding a polypeptide involved in biosynthesis of pyripyropene A may be contained in separate vectors and introduced into a plant at the same time or at different times.
  • a plasmid having the following pyripyropene biosynthetic gene was prepared, introduced into tobacco and rice by the Agrobacterium method, and the resulting transformant was molecular biological and biochemical. Was analyzed.
  • PIG6 is a pUBA (plant physology 1992 volume 100, page 1503) maize ubiquitin promoter, followed by SpeI-SacI between EcoRI of pCAMBIA1390 (8860 bp, all base sequences are described in Genbank accession number: AF234307) and HindII.
  • MCS multiple cloning site
  • Agrobacterium into which pIG6-CL, pIG6-PT, and pIG6-P450-2 have been introduced.
  • Each plasmid was isolated by the tripartite conjugation method described in the Plant Molecular and Cell Engineering Manual (Yasuyuki Yamada Kodansha). It was introduced into Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) LBA4404 strain and EHA105 strain. Whether or not the introduction of the plasmid was successful was confirmed by colony PCR.
  • the primer pairs used for colony PCR are Adenylate F with Sac I (SEQ ID NO: 12) and Adenylate R with Kpn I (SEQ ID NO: 13) in CoA ligase, and Ubi PT F with Kpn I (SEQ ID NO: 14) in Prenyltransferase.
  • Ubi PT R with Sac I SEQ ID NO: 16
  • P450-2, F1 for cDNA P450-2 SEQ ID NO: 17
  • P450-2-2 R1 for cDNA R with Mlu I SEQ ID NO: 19
  • A. tumefaciens was introduced into tobacco (variety: SR1) (host) .
  • the presence or absence of gene introduction in the transformed tobacco and the comparative tobacco was confirmed using genomic PCR.
  • the primer pairs used in the genomic PCR method are Adenylate F with Sac I (SEQ ID NO: 12) and Adenylate R with Kpn I (SEQ ID NO: 13) in CoA ligase, and Ubi PT F with Kpn I (SEQ ID NO: 14) in Prenyltransferase.
  • Ubi PT R with Sac I SEQ ID NO: 16
  • P450-2 with F1 for cDNA P450-2 SEQ ID NO: 17
  • P450-2-2 R1 for cDNA R with Mlu I SEQ ID NO: 19
  • the primer pairs used in the genomic PCR method are Adenylate F with Sac I (SEQ ID NO: 12) and Adenylate R with Kpn I (SEQ ID NO: 13) in CoA ligase, and Ubi PT F with Kpn I (SEQ ID NO: 13) in Prenyltransferase. 14) and Ubi PT R with Sac I (SEQ ID NO: 16), and in P450-2, F1 for cDNA P450-2 (SEQ ID NO: 17) and P450-2-2 R1 for cDNA R with Mlu I (SEQ ID NO: 19) )Met.
  • an actin primer pair was also used (SEQ ID NOs: 24 and 25). It was found that the genes encoding Prenyltransferase and P450-2 were introduced in rice introduced with pIG6-PT and pIG6-P450-2 (Agarose electrophoresis confirmed a band at the expected position ( See FIGS. 5 and 6)). It was also found that a gene encoding CoA ligase was also introduced into rice (see FIG. 7).
  • the primer pairs used in rice RT-PCR were Adenylate F with Sac I (SEQ ID NO: 12) and Adenylate R with Kpn I (SEQ ID NO: 13) in CoA ligase, and 18F (SEQ ID NO: 15) in Prenyltransferase.
  • Ubi PT R with Sac I (SEQ ID NO: 16) and P450-2 were F1 for cDNA P450-2 (SEQ ID NO: 17) and R3 for cDNA P450-2 (SEQ ID NO: 18).
  • actin primer pairs were also used in all lines as in the genomic PCR method. The analysis was performed only by ethidium bromide staining by agarose electrophoresis. As a result, it was confirmed that an amplified band was observed in the transformant of both tobacco and rice, and expression was observed at the transcription level.
  • pIG6-CL-introduced rice In pIG6-CL-introduced rice, pIG6-PT-introduced tobacco and rice, and pIG6-P450-2-introduced tobacco and rice, the genes encoding Prenyltransferase, P450-2, and CoA ligase are transcribed. The level was confirmed to be expressed (a band was confirmed at the expected position) (see FIGS. 8 to 13). A band of expected molecular weight was confirmed for the tobacco into which pIG6-CL was introduced. On the other hand, it was confirmed that it was not expressed in tobacco and rice used as a comparative control into which no gene was introduced. In addition, it was confirmed that DNA was not amplified, that is, genomic DNA was not mixed when the total RNA sample was subjected to the direct PCR method without performing the reverse transcription reaction.

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Abstract

　ピリピロペンの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入することにより、ピリピロペンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された植物体の提供することができる。

Description

ピリピロペン生合成遺伝子発現植物体 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１１年１１月１７日に出願された米国仮出願６１／５６０,９６７号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、ピリピロペン生合成遺伝子発現植物体に関する。
　ピリピロペンＡは、Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12),4429-35（非特許文献１）、ＷＯ２００４／０６００６５号公報（特許文献１）に開示されているように、アメリカタバコガ幼虫に対し殺虫活性を有すること、ピリピロペンＡがコナガ幼虫およびチャイロコメノゴミムシダマシに対して殺虫活性を有することが記載されている。また、これまでに多くの耐害虫性の遺伝子導入植物が報告されているが、その多くは殺虫性のタンパク質、ペプチド等の遺伝子を導入して得られているものであり、複数の生合成工程を経て殺虫性の低分子を発現させた植物を開示しているものはほとんど無く、ましてピリピロペン生合成遺伝子発現植物体についてはこれまでに全く知られていない。
　一方、ピリピロペンＡの生産菌として、特開平４－３６０８９５号公報（特許文献２）には、アスペルギルス　フミガタスFO-1289株、Applied and Environmental Microbiology（1995），61（12），4429－35．（非特許文献１）には、ユーペニシリウム　レティキュロスポラムNRRL-3446株、ＷＯ２００４／０６００６５号公報（特許文献１）には、ペニシリウム　グリセオフルバムF1959株、および公開技報２００８－５００９９７号（特許文献３）には、ペニシリウム　コピロビウムPF1169株が開示されている。
　また、ピリピロペンＡの生合成ルートとして、Journal of Organic Chemistry(1996), 61,882-886. （非特許文献２）およびChemical Review(2005), 105, 4559-4580.（非特許文献３）には、アスペルギルス　フミガタスFO-1289株での推定生合成ルートが開示されており、アスペルギルス　フミガタスFO-1289株においてポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼのそれぞれによって合成された部分構造が結合され、環化酵素によりピリピロペンＡが合成されることが開示されている。
ＷＯ２００４／０６００６５号公報 特開平４－３６０８９５号公報 公開技報２００８－５００９９７号
Applied and Environmental Microbiology（1995），61（12），4429－35． Journal of Organic Chemistry(1996), 61,882-886. Chemical Review(2005), 105, 4559-4580.
　本発明者らは、今般、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体を見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
　従って、本発明の目的は、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体を提供することにある。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体。
（２）植物体がタバコまたはイネである、（１）に記載の植物体。
（３）ポリペプチドが、配列番号２、５、および８からなる群から選択される一または二以上のアミノ酸配列またはそれらと実質的に同等なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１）または（２）に記載の植物体。
（４）単離されたポリヌクレオチドが、下記（Ｉ）および（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、（１）または（２）に記載の植物体：
（Ｉ）下記の（ａ）～（ｄ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ＩＩ）下記の（ｉ）～（ｖｉ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）（ｉ）～（ｉｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
（５）（１）～（４）のいずれかに記載の植物体の製造方法であって、下記（ＩＩＩ）および（ＩＶ）からなる群から選択される一または二以上の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入する工程を含む、製造方法：
（ＩＩＩ）配列番号２、５、および８から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（ＩＶ）下記の（ｉ）～（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（ｉ）下記（ａ）～（ｃ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
　本発明によれば、ピリピロペンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された植物体を製造することができ、害虫抵抗性を有する植物体の産生に多大な貢献をなすものである。
図１は、ｐＩＧ６－ＣＬ、ｐＩＧ６－ＰＴ、およびｐＩＧ６－Ｐ４５０－２のプラスミドマップを表す。 図２は、Prenyltransferase遺伝子を導入し、形質転換したタバコのゲノムＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図３は、Ｐ４５０－２遺伝子を導入し、形質転換したタバコのゲノムＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図４は、ＣｏＡ　ｌｉｇａｓｅ遺伝子を導入し、形質転換したタバコのゲノムＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図５は、Prenyltransferase遺伝子を導入し、形質転換したイネのゲノムＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図６は、Ｐ４５０－２遺伝子を導入し、形質転換したイネのゲノムＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図７は、ＣｏＡ　ｌｉｇａｓｅ遺伝子を導入し、形質転換したイネのゲノムＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図８は、Prenyltransferase遺伝子を導入し、形質転換したタバコのＲＴ－ＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図９は、Ｐ４５０－２遺伝子を導入し、形質転換したタバコのＲＴ－ＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図１０は、ＣｏＡ　ｌｉｇａｓｅ遺伝子を導入し、形質転換したタバコのＲＴ－ＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図１１は、Ｐ４５０－２遺伝子を導入し、形質転換したイネのＲＴ－ＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図１２は、ＣｏＡ　ｌｉｇａｓｅ遺伝子を導入し、形質転換したイネのＲＴ－ＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。 図１３は、Prenyltransferase遺伝子を導入し、形質転換したイネのＲＴ－ＰＣＲ法によるアガロース電気泳動の結果を示す。
発明の具体的説明
微生物の寄託
　プラスミドｐＣＣ１－ＰＰ１で形質転換された大腸菌（Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ－Ｔ１Ｒ）は、２００８年１０月９日（原寄託日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３（国内寄託ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７０４より移管）（寄託者が付した識別のための表示：Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ－Ｔ１Ｒ／ｐＣＣ１－ＰＰ１）として寄託されている。
　プラスミドｐＰＰ３で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年７月３日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１４１（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP3-2）として寄託されている。
　プラスミドｐＰＰ６で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年１２月２１日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２１８（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP6）として寄託されている。
植物体
　本発明の植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体である。ピリピロペンＡの生合成経路は、ＷＯ２０１１／０９３１８５号公報のスキーム１に記載のとおりであるが、具体的には以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において、植物体とは、特に限定されるものではないが、米、麦類（コムギ、オオムギなど）、雑穀類（トウモロコシ、あわ、きび、ひえ、食用ソルガムなど）、果樹類（かんきつ、りんご、ぶどうなど）、野菜類（きゅうり、かぼちゃ、メロン、キャベツ、なす、トマト、いちごなど）、イモ類（ばれいしょ、かんしょ、さといもなど）、豆類（大豆、あずき、いんげんまめなど）、飼料作物（牧草、ソルガム、飼料用トウモロコシなど）、花き類、観葉植物、樹木類、茶、てんさい、さとうきび、ひまわり、ナタネ、ホップ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、芝、きのこ等が挙げられ、好ましくは米、麦類、雑穀類、野菜類、イモ類、豆類、花き類、ナタネ、ワタ、タバコが挙げられる。また、本発明の植物体は、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、または種子のいずれであってもよく、最終的に上述のような植物個体まで成長できることができる態様であれば、どのような態様であっても、本発明の植物体に含まれる。これらの植物体に、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入することにより、ピリピロペンＡを産生させることができる。本発明の好ましい態様によれば、害虫抵抗性を獲得した植物体が提供される。
　本発明の植物体が抵抗性を有する害虫としては、例えば、鱗翅目害虫（例えば、ハスモンヨトウ、ヨトウガ、アワヨトウ、アオムシ、コナガ、シロイチモジヨトウ、ニカメイガ、コブノメイガ、ハマキガ、シンクイガ、ハモグリガ、ドクガ、アグロティス属害虫（Agrotis spp）、ヘリコベルパ属害虫（Helicoverpa spp）、またはヘリオティス属害虫（Heliothis spp）など）、半翅目害虫（例えば、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、Aphis fabae、トウモロコシアブラムシ、エンドウヒゲナガアブラムシ、ジヤガイモヒゲナガアブラムシ、マメアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、Macrosiphum　avenae、Methopolophium dirhodum、ムギクビレアブラムシ、ムギミドリアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ニセダイコンアブラムシ、ユキヤナギアブラムシ、Rosy apple aphid、リンゴワタムシ、コミカンアブラムシ、またはミカンクロアブラムシなどのアブラムシ類（Aphididae、Adelgidae、またはPhy11oxeridae）、ツマグロヨコバイなどのヨコバイ類、チャノミドリヒメヨコバイなどのヒメヨコバイ類、ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、またはセジロウンカなどのウンカ類、シラホシカメムシ、ミナミアオカメムシ、またはアカヒゲホソミドリカスミカメなどのカメムシ類、タバココナジラミ、またはオンシツコナジラミなどのコナジラミ類（A1eyrodidae）、クワコナカイガラムシ、ミカンコナカイガラムシ、または、アカマルカイガラムシなどのカイガラムシ類（Diaspididae、Margarodidae、Ortheziidae、Ac1erdiae、Dacty1opiidae、Kerridae、Pseudococcidae、Coccidae、Eriococcidae、Asterolecaniidae、Beesonidae、Lecanodiaspididae、またはCerococcidea）など）、ミカンキジラミなどのキジラミ類、鞘翅目害虫（例えば、イネミズゾウムシ、アズキゾウムシ、チヤイロコメノゴミムシダマシ、ウェスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ドウガネブイブイ、ヒメコガネ、キスジノミハムシ、ウリハムシ、コロラドポテトハムシ、イネドロオイムシ、シンクイムシ類、またはカミキリムシ類など）、ダニ目（例えば、ナミハダニ、カンザワハダニ、またはミカンハダニなど）、膜翅目害虫（例えば、ハバチ類）、直翅目害虫（例えば、バッタ類）、双翅目害虫（例えば、イエバエまたはハモグリバエ類）、アザミウマ目害虫（例えば、ミナミキイロアザミウマまたはミカンキイロアザミウマなど）、植物寄生性線虫（例えば、ネコブセンチュウ、ネグサレセンチュウ、イネシンガレセンチュウ、またはマツノザイセンチュウなど）、が挙げられ、好ましい虫種としては、鱗翅目、半翅目、双翅目、アザミウマ目害虫が挙げられ、特に半翅目害虫に強い抵抗性を有する。
　本発明において、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドは、特に限定されないが、ポリケチド合成酵素活性、プレニルトランスフェラーゼ活性、水酸化酵素活性、アセチル化酵素活性、およびアデニル酸合成酵素活性からなる群から選択される一または二種以上の活性を有することが好ましく、より好ましくは、ポリペプチドがリガーゼ活性、水酸化酵素活性、およびプレニルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される一種または二種以上の活性を有し、さらに好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列からなるポリペプチドがリガーゼ活性を有し、配列番号５のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列からなるポリペプチドがオキシゲナーゼ活性（例えば、水酸化酵素活性）を有し、配列番号８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列からなるポリペプチドがプレニルトランスフェラーゼ活性を有する。
　本発明の好ましい態様によれば、植物体に、ＷＯ２０１１／０９３１８５号公報に記載のプラスミドｐＣＣ１－ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上のプラスミドが導入され、形質転換された植物体を提供することができる。
　本発明の好ましい別の態様によれば、下記の配列番号１に記載の断片である各ヌクレオチド配列、各ヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、各ヌクレオチド配列において１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列、各ヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列またはそれらを含んでなる組換えベクターが導入され、形質転換された植物体が提供される。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、リガーゼ活性、特にCoA ligase（CoA リガーゼ）活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、ポリケチド合成酵素活性、特にLovB-like polyketide synthase（LovB様ポリケチド合成酵素）(PKS)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、オキシゲナーゼ（例えば、水酸化酵素）活性、特にCytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（１）(P450-1)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、オキシゲナーゼ（例えば、水酸化酵素）活性、特にCytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（２）(P450-2)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、シクラーゼ活性、特にCyclase(IMP: Integral membrane protein)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、オキシゲナーゼ活性、特にFAD-dependent monooxygenase（FAD依存性モノオキシゲナーゼ）(FMO)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、プレニルトランスフェラーゼ活性、特にUbiA-like prenyltransferase（UbiA様プレニルトランスフェラーゼ）(UbiAPT)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase（アセチルトランスフェラーゼ）(AT)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、アセチルトランスフェラーゼ、特にAcetyltransferase-2(AT-2)活性を有することが好ましい。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２７７９８番から３１８５５番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、ＡＴＰ合成酵素活性、特にCation transporting ATPase活性を有することが好ましい。
　また、配列番号１のヌクレオチド３３４２番から５１５８番までは、CoA ligase（CoA リガーゼ）をコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号２に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド５３８２番から１２７７７番までは、LovB-like polyketide synthase（LovB様ポリケチド合成酵素）(PKS)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号３に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド１３２６６番から１５１４４番まで（以下、このポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（１）（P450-1）とする）および１６２２０番から１８０１８番まで（以下、このポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（２）（P450-2）とする）は、Cytochrome P450 monooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号４、５に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド１８５０６番から１９２９６番までは、Cyclase（シクラーゼ）をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号６に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド１９７７９番から２１３８９番までは、FAD-dependent monooxygenase（FAD依存性モノオキシゲナーゼ）(FMO)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号７に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド２１７９３番から２２８７７番までは、UbiA-like prenyltransferase（UbiA様プレニルトランスフェラーゼ）(UbiAPT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号８に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド２３２０５番から２４７７３番までは、Acetyltransferase（アセチルトランスフェラーゼ）(AT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号９に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド２５８２４番から２７１７８番までは、Acetyltransferase-2(AT-2)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号１０に記載したアミノ酸配列で示される。
　配列番号１のヌクレオチド２７７９８番から３１８５５番までは、Cation transporting ATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号１１に記載したアミノ酸配列で示される。
　また、本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、一つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸配列を意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列は、改変等される前のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに一層好ましくは９８％以上の配列同一性を有することが好ましい。また、改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1～40個、より好ましくは1～20個、さらに好ましくは1～10個、さらに一層好ましくは1～8個、最も好ましくは1～4個である。
　本発明の好ましい態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列から１～４０個（好ましくは、１～８個）のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該アミノ酸配列からなるポリペプチドがリガーゼ活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、タバコまたはイネ）が提供される。
　本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号５のアミノ酸配列から１～４０個（好ましくは、１～８個）のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該アミノ酸配列からなるポリペプチドがオキシゲナーゼ活性（好ましくは、水酸化酵素活性）を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、タバコまたはイネ）が提供される。
　本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号８のアミノ酸配列から１～４０個（好ましくは、１～８個）のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該アミノ酸配列からなるポリペプチドがプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、タバコまたはイネ）が提供される。
　本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列からアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列が、改変等される前の配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上（好ましくは、９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがリガーゼ活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、タバコまたはイネ）が提供される。
　本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号５のアミノ酸配列からアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列が、改変等される前の配列番号５のアミノ酸配列に対して、９０％以上（好ましくは、９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがオキシゲナーゼ活性（好ましくは、水酸化酵素活性）を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、タバコまたはイネ）が提供される。
　本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号８のアミノ酸配列からアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列が、改変等される前の配列番号８のアミノ酸配列に対して、９０％以上（好ましくは、９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、タバコまたはイネ）が提供される。
　そして、活性に影響を与えない改変の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、さらに一層好ましくは１～８個、最も好ましくは１～４個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
　本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、当業者であればその条件は適宜決定できるものであるが、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で、６０℃、２０分間の洗浄条件、０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件、または０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６５℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
　本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
　本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」は９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個のヌクレオチドの置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドの改変の個数は、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）である。
　「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列」とは、「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質」と同等な活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。
　本発明の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、１～４０個（好ましくは、１～８個）のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がリガーゼ活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
　本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、１～４０個（好ましくは、１～８個）のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がオキシゲナーゼ活性（好ましくは、水酸化酵素活性）を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
　本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、１～４０個（好ましくは、１～８個）のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がプレニルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
　本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの９０％以上（好ましくは、９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がリガーゼ活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
　本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの９０％以上好ましくは、９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がオキシゲナーゼ活性（例えば、水酸化酵素活性）を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
　本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの９０％以上好ましくは、９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がプレニルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
＜組換えベクター＞
　本発明による組換えベクターは、例えば、上記（I）～（II）に記載のポリヌクレオチドのいずれか一または二以上を、例えば、［サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第2版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年］に記載の遺伝子組換え技術の常法に従って目的に応じて適当な形態に修飾し、ベクターに連結することによって作製することができる。
　本発明において使用される組換えベクターは、ウイルス、プラスミド、フォスミド、またはコスミドベクター等から適宜選択することができる。
　使用されるプラスミドの内の少なくとも一つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
　また、本発明において利用される発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、各遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号を有しているのが好ましい。プロモーターとしては、CaMV 35S RNAプロモーター、CaMV 19S RNAプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、イネアクチンプロモーター等が好ましく用いることができるものとして挙げられる。
　本発明による組換えベクターは、好ましくは、プラスミドｐＩＧ６－ＣＬ、ｐＩＧ６－ＰＴ、およびｐＩＧ６－Ｐ４５０－２からなる群より選択される組換えベクターである。
　Fosmid pCC1-PP1（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３の大腸菌を用いて作成できる）、plasmid pPP3（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１４１のAspergillus oryzaeを用いて作成できる）およびに含まれるヌクレオチド配列を鋳型として、以下に示すプライマー対を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜形質転換された植物体＞
　本発明による単離されたポリヌクレオチドを導入する植物体は、用いるベクターの種類に応じて、適宜選択されて良い。
　組換えベクターの植物体への導入方法としては、接合伝達、ファージによる形質導入、さらにカルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった形質転換の方法の中から、供試する植物体に応じて用いれば良い。
　本発明において複数の遺伝子を植物体（植物細胞）に導入する場合には、各遺伝子は同一または別々のＤＮＡ分子に含まれていても良い。
　本発明による植物体は、好ましくは、プラスミドｐＩＧ６－ＣＬ、ｐＩＧ６－ＰＴ、およびｐＩＧ６－Ｐ４５０－２からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる植物体である。
　本発明の好ましい態様によれば、ピリピロペンＡの製造のための、プラスミドｐＩＧ６－ＣＬ、ｐＩＧ６－ＰＴ、およびｐＩＧ６－Ｐ４５０－２からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる（形質転換された）植物体の使用が挙げられる。
　植物の生育方法は、土壌、肥料、温度などの条件を決定する必要がある。
植物体の製造方法
　本発明の植物体の製造方法は、下記（Ｉ）および（ＩＩ）からなる群から選択される一または二以上の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入する工程を含む、製造方法である：
（Ｉ）配列番号２、５、および８から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド
（ＩＩ）下記の（ｉ）～（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（ｉ）下記（ａ）～（ｃ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、（ｉｉ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
　本発明の植物体の製造方法に用いられるポリヌクレオチドおよび組換えベクターは、上記の本発明の植物体に記載のポリヌクレオチドおよび組換えベクターと同じであってよく、また組換えベクターの植物体への導入方法についても上記と同様であってよい。
　また、本発明の組換えベクターを導入する工程は、ピリピロペンＡの生合成に関与する全てのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、一つのベクターに含ませて、植物体に導入してもよく、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを別々のベクターに含ませて、同時期に又は別々の時期に植物体に導入してもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　植物形質転換用ベクターpIG6を用いて、以下のピリピロペン生合成遺伝子を有するプラスミドを作製し、アグロバクテリウム法によりタバコおよびイネに導入し、得られた形質転換体を分子生物学的および生化学的に解析した。
　なお、pIG6は、pCAMBIA1390（8860 bp　全塩基配列はGenbank accession number: AF234307に記載）のEcoRIと、HindIIと間にpUBA（プラント フィジオロジー1992年100巻1503頁）のトウモロコシユビキチンプロモーター、次いでSpeI-SacI-PacI-MluI-PmeI-KpneI-PvuII-Sse8387I-BamHIからなるマルチプルクローニング部位（MCS）、およびノパリンシンターゼターミネーターが導入された植物形質転換用発現ベクターであり、その構造を図１に示す。
1）pIG6-CL(CoA ligase)の作製
　Fosmid pCC1-PP1（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３の大腸菌を用いて作成できる）を鋳型として、プライマー対Adenylate F with SacI（配列番号１２）と、Adenylate R with KpnI（配列番号１３）を用いたＰＣＲ法によりCoA ligase遺伝子を増幅し、精製したDNA断片を制限酵素KpnIおよびSacIを用いて二重切断し、pIG6の同部位にライゲーションし、大腸菌DH5αを形質転換することによって、図１に示すpIG6-CLを取得した。
2）pIG6-PT(Prenyltransgerase)の作製
　Fosmid pCC1-PP1を鋳型として、プライマー対Ubi PT F with KpnI（配列番号１４）と、Ubi PT R with SacI（配列番号１６）とを用いたＰＣＲ法によりPrenyltransgerase遺伝子を増幅し、精製したDNA断片を制限酵素SacIを用いて切断し、さらに制限酵素PvuIIおよびSacIを用いて切断したpIG6の同一部位にライゲーションし、大腸菌DH5αを形質転換することにより、図１に示すpIG6-PTを取得した。
3）pIG6-P450-2(Cytochrome P450 monooxygenase (2))の作製
　plasmid pPP3（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１４１のAspergillus oryzaeを用いて作成できる）を鋳型として、プライマー対F1 for cDNA P450-2 （配列番号１７）と、P450-2-2 R1 for cDNA R with MluI（配列番号１９）とを用いて、P450-2 cDNAを増幅し、精製した断片をMluIを用いて切断し、制限酵素PvuIIおよびMluIを用いて切断したpIG6の同一部位にライゲーションし、大腸菌DH5αを形質転換することにより、図１に示すpIG6-P450-2を取得した。
４）pIG6-CL、pIG6-PT、およびpIG6-P450-2を導入したアグロバクテリウムの作製
　植物分子・細胞工学マニュアル（山田康之著　講談社）に記載された三者接合法により、各々のプラスミドをAgrobacterium tumefaciens（A. tumefaciens）LBA4404株およびEHA105株に導入した。プラスミドの導入が成功したか否かを、コロニーＰＣＲ法により確認した。コロニーＰＣＲに用いたプライマー対は、CoA ligaseにおいては、Adenylate F with SacI（配列番号１２）およびAdenylate R with KpnI（配列番号１３）、Prenyltransferaseにおいては、Ubi PT F with KpnI（配列番号１４）およびUbi PT R with SacI（配列番号１６）、ならびにP450-2においては、F1 for cDNA P450-2（配列番号１７）およびP450-2-2 R1 for cDNA R with MluI（配列番号１９）であった。
５）アグロバクテリウム法によるタバコ形質転換
　植物分子・細胞工学マニュアル（山田康之著　講談社）に記載されたタバコのアグロバクテリウム感染法に準じ、タバコ（品種：ＳＲ１）（宿主）に、A. tumefaciens LBA4404株/pIG6-CL、A. tumefaciens LBA4404株/pIG6-PT、A. tumefaciens LBA4404株/pIG6-P450-2を各々感染させ、共存培養、ハイグロマイシン選抜を経て、目的とする形質転換体を取得した。この時、形質転換させたタバコと、比較対照としたタバコとをゲノムＰＣＲを用いて遺伝子の導入の有無を確認した。ゲノムＰＣＲ法に用いたプライマー対はCoA ligaseにおいては、Adenylate F with SacI（配列番号１２）およびAdenylate R with KpnI（配列番号１３）、Prenyltransferaseにおいては、Ubi PT F with KpnI（配列番号１４）およびUbi PT R with SacI（配列番号１６）、ならびにP450-2においてはF1 for cDNA P450-2（配列番号１７）およびP450-2-2 R1 for cDNA R with MluI（配列番号１９）であった。タバコのすべての系統において、導入遺伝子特異的プライマー対の他にアクチンプライマー対（配列番号２２および２３）も使用した。pIG6-PTおよびpIG6-P450-2を導入したタバコにおいて、PrenyltransferaseおよびP450-2をコードする遺伝子が導入されていることがわかった（アガロース電気泳動により、期待される位置にバンドが確認された（図２および３参照））。また、CoA ligaseをコードする遺伝子も、タバコに導入されていることがわかった（図４参照）。
６）アグロバクテリウム法によるイネ形質転換
　土岐の方法 (プラント モレキュラー バイオロジー 1997年15巻16頁から21頁)に従い、宿主としてイネを用いたアグロバクテリウム感染法を実施した。すなわち、イネ（品種：日本晴）（宿主）に、A. tumefaciens EHA105株/pIG6-CL、A. tumefaciens EHA105株/pIG6-PT、A. tumefaciens EHA105株/pIG6-P450-2を各々感染させ、共存培養、ハイグロマイシン選抜を経て、目的とする形質転換体を取得した。この時、形質転換させたイネと、対照としたイネとを、ゲノムＰＣＲ法を用いて遺伝子の導入の有無を確認した。ゲノムＰＣＲ法に用いたプライマー対は、CoA ligaseにおいては、Adenylate F with SacI（配列番号１２）およびAdenylate R with KpnI（配列番号１３）、Prenyltransferaseにおいては、Ubi PT F with KpnI（配列番号１４）およびUbi PT R with SacI（配列番号１６）、ならびにP450-2においては、F1 for cDNA P450-2（配列番号１７）およびP450-2-2 R1 for cDNA R with MluI（配列番号１９）であった。イネのすべての系統において、導入遺伝子特異的プライマー対の他にアクチンプライマー対も使用した（配列番号２４および２５）。pIG6-PTおよびpIG6-P450-2を導入したイネにおいて、PrenyltransferaseおよびP450-2をコードする遺伝子が導入されていることがわかった（アガロース電気泳動により、期待される位置にバンドが確認された（図５および６参照））。また、CoA ligaseをコードする遺伝子も、イネに導入されていることがわかった（図７参照）。
７）RT―PCRによる転写発現解析
　形質転換されたタバコおよび比較対照としたタバコ、ならびに形質転換されたイネおよび比較対照としたイネから、TRIzol（商標） Reagent試薬（インビトロジェン社製）を用いてメーカーマニュアルに従い、全RNAを抽出した。抽出したRNAをDeoxyribonucleaseI Amplification Grade(インビトロジェン社製)を用いて、DNase処理した。PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応に供した。得られた相補的なＤＮＡ配列（cDNA）を鋳型として、ピリピロペン生合成遺伝子CoA ligase、Prenyltransferaze、およびP450-2のオープンリーディングフレーム内部を増幅するプライマー対を用いて、MightyAmp（商標） DNA Polymerase(タカラバイオ社製)によりcDNA増幅を行い、ピリピロペン生合成遺伝子の転写レベルでの発現を調べた。タバコにおいて用いたプライマー対は、CoAligaseにおいては、Adenylate F with SacI（配列番号１２）と、Adenylate R with KpnI（配列番号１３）、Prenyltransferaseにおいては、Ubi PT F with KpnI（配列番号１４）およびUbi PT R with SacI（配列番号１６）、ならびにP450-2においては、F3 for cDNA P450-2（配列番号１８）およびR5 for cDNA P450-2（配列番号２１）であった。また、イネのＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマー対は、CoA ligaseにおいては、Adenylate F with SacI（配列番号１２）およびAdenylate R with KpnI（配列番号１３）、Prenyltransferaseにおいては、18F（配列番号１５）およびUbi PT R with SacI（配列番号１６）、そしてP450-2においては、F1 for cDNA P450-2（配列番号１７）およびR3 for cDNA P450-2（配列番号１８）であった。また、この際、ゲノムＰＣＲ法と同様に、すべての系統においてアクチンプライマー対も使用した。分析はアガロース電気泳動でのエチジウムブロマイド染色のみで行ったため、その結果、タバコ、イネ共に形質転換体では増幅したバンドが確認でき、転写レベルにおいて、発現していることが確認できた。pIG6-CLが導入されたイネ、pIG6-PTが導入されたタバコおよびイネ、pIG6-P450-2が導入されたタバコおよびイネにおいて、Prenyltransferase、P450-2、およびCoA ligaseをコードする遺伝子が、転写レベルにおいて、発現していることが確認された（期待される位置にバンドが確認された）（図８～１３参照）。pIG6-CLが導入されたタバコについて、期待される分子量のバンドが確認された。一方、遺伝子が導入されていない比較対照として用いたタバコおよびイネでは発現されていないことが確認された。なお、全ＲＮＡサンプルについて、逆転写反応を行わず、直接ＰＣＲ法を行った場合にはＤＮＡが増幅されない、すなわちゲノムＤＮＡが混在していないことが確認された。
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１４１
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２１８

Claims (5)

  1. 　ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体。
  2. 　植物体がタバコまたはイネである、請求項１に記載の植物体。
  3. 　ポリペプチドが、配列番号２、５、および８からなる群から選択される一または二種以上のアミノ酸配列またはそれらと実質的に同等なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１または２に記載の植物体。
  4. 　単離されたポリヌクレオチドが、下記（Ｉ）および（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の植物体：
    （Ｉ）下記の（ａ）～（ｄ）に記載されたヌクレオチド配列：
    （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ＩＩ）下記の（ｉ）～（ｖｉ）に記載されたヌクレオチド配列：
    （ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
    （ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｖｉ）（ｉ）～（ｉｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
  5. 　植物体の製造方法であって、下記（ＩＩＩ）および（ＩＶ）からなる群から選択される一または二以上の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入する工程を含む、製造方法：
    （ＩＩＩ）配列番号２、５、および８から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
    （（ＩＶ））下記の（ｉ）～（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
    （ｉ）下記（ａ）～（ｃ）に記載されたヌクレオチド配列：
    （ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｖ）（ｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
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