WO2011093186A1 - ピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を含む核酸構築物 - Google Patents

ピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を含む核酸構築物 Download PDF

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智 相原
奈緒美 隅田
弘一郎 村島
耕二 矢内
安西　弘行
憲太朗 山本
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明治製菓株式会社
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid construct comprising a pyripyropene biosynthetic gene group and a marker gene.
  • Non-patent Document 1 It has been clarified that 18 types of analogs of pyripyropene A to R exist naturally in the pyripyropene so far due to the difference in the structure of the side chain (Non-patent Document 1).
  • Pyripyropene is disclosed to have ACAT inhibitory activity (Patent Document 1), and is expected to be applied to the treatment of diseases caused by cholesterol accumulation.
  • moth pilipiropene has an insecticidal activity against giant moth larvae (Non-patent Document 2), long-tailed moth larvae (Patent Document 2), chyllium beetle (Patent Document 2), and aphids (Patent Document 3). Application to insecticide is expected.
  • Pyripyropene is known to be produced as a secondary metabolite by filamentous fungi. It is disclosed that -3446 strain (Non-patent document 2) and Penicillium griseofulbum F1959 strain (Patent document 2) each produce pyripyropene.
  • pyripyropene Industrial production of pyripyropene is carried out by culturing the above-mentioned producing bacteria and collecting pyripyropene.
  • the amount of secondary metabolites produced by microorganisms isolated from nature is very small, and in order to use them industrially, it is necessary to improve the productivity of these objects.
  • study the culture method of the target product-producing microorganism study the medium components, improve the fermentation conditions such as the addition of precursors, and mutate with UV irradiation or mutagen. Bacterial strains have been improved. Furthermore, in recent years, productivity has been improved using gene recombination in addition to these methods.
  • a general method for improving the productivity by gene recombination is enhancing the expression of biosynthetic genes.
  • a method for improving the productivity of the PF1022 substance produced by Agonomycetales by this method is disclosed. (Patent Document 6).
  • Patent Document 6 In order to adapt this technique, it is necessary that the target biosynthetic gene has been isolated and a transformation method has been established for the producing microorganism.
  • the present inventors have now found that the productivity of pyripyropene is remarkably improved by expressing a nucleic acid construct containing a pyripyropene biosynthetic gene group and a marker gene in a host.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid construct containing a pyripyropene biosynthetic gene group and a marker gene.
  • nucleic acid construct comprising a pyripyropene biosynthetic gene group and a marker gene.
  • a transformant obtained by introducing the nucleic acid construct into a host.
  • a transformant obtained by introducing a nucleic acid construct containing the pyripyropene biosynthetic gene group and a nucleic acid construct containing the marker gene into a host simultaneously or separately. Is provided.
  • a method for producing pyripyropene comprising culturing the transformant and collecting pyripyropene from the culture.
  • RB represents the right border
  • HYG r represents the hygromycin resistance coding region
  • PAngpdA represents the Aspergillus nidulans glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase promoter ( Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)
  • EGFP represents an enhanced green fluorescent protein coding region
  • TAngpdA is an Aspergillus nidulans glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase terminator ( Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase terminater)
  • LB represents the left border.
  • the left figure shows hygromycin-resistant colonies in the Agrobacterium-infected area, and the right figure shows the result of GFP fluorescence observation.
  • the left figure shows a colony of Penicillium copirobium PF1169 strain not infected with Agrobacterium in a medium not containing hygromycin, and the right figure shows the result of GFP fluorescence observation.
  • Escherichia coli EPI300 TM -T1 R transformed with the microbial deposit plasmid pCC1-PP1 has been approved by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on October 9, 2008 (original deposit date).
  • FERM BP-11133 (transferred from the domestic deposit FERM P-21704) to Tsukuba 1-1-1 Higashi 1-chome Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8856 Japan (indication for identification given by the depositor: Escherichia coli EPI300 TM -T1 R / pCC1-PP1).
  • the Escherichia coli transformed with the plasmid pPYRI02 was founded on December 14, 2009 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1-chome Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8565). 6), the deposit number is FERM BP-11203 (indication for identification given by the depositor: XL1-Blue MRA / pPYRI02).
  • the Escherichia coli transformed with cosmid pPYRI07 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (December 1, 2010, 1-chome, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8586) 6), the deposit number is FERM BP-11316 (indication for identification given by the depositor: XL1-Blue MRA / pPYRI07).
  • the pyripyropene biosynthetic gene group is arranged in a nucleic acid construct in a state that can be expressed in a marker gene and a host described later, and may be a gene group involved in the biosynthesis of pyripyropene.
  • a construct comprising the full length or a part of at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in (I) to (IV) below is provided: (I) a nucleotide sequence from No. 2911 to No. 27797 in SEQ ID No.
  • a nucleotide sequence encoding a protein substantially equivalent to the protein to be (III) a polynucleotide having a nucleotide sequence from No. 2911 to No.
  • the pyripyropene biosynthesis gene group in the present invention is a gene group comprising a target gene and an expression regulatory region.
  • the target gene has one or more genes encoding proteins involved in the biosynthesis of pyripyropene.
  • the expression regulatory region is not particularly limited as long as it has a nucleotide sequence necessary for regulating the expression of the target gene in the host. For example, a nucleotide that regulates the transcription amount of the target gene in the host. Sequence promoters and terminators are included.
  • the protein involved in the biosynthesis of pyripyropene is, for example, a protein involved in any of the biosynthetic pathways represented by the following scheme 1.
  • nucleic acid construct comprising a nucleotide sequence encoding at least one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 267 to 275 or an amino acid sequence substantially equivalent thereto.
  • nucleic acid construct comprising at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in the following (1) to (4): (1) Nucleotide sequences described in (a)-(i) below: (a) a nucleotide sequence from position 3342 to number 5158 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266; (b) a nucleotide sequence from 5382 to 12777 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266, (c) the nucleotide sequence from No. 13266 to No.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 15144 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266, (d) a nucleotide sequence from number 16220 to number 18018 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266; (e) a nucleotide sequence from number 18506 to number 19296 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266, (f) a nucleotide sequence from No. 19779 to No.
  • nucleotide sequence that is capable of hybridizing under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence described in (1) and that encodes a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence Array, (3) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1), wherein one or a plurality of nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and the protein encoded by each nucleotide sequence;
  • nucleic acid construct comprising at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in (1) to (4) below: (1) a nucleotide sequence comprising the entire length of the nucleotide sequence described in (a)-(i) or (a)-(h) above, (2) A nucleotide sequence that is capable of hybridizing under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence described in (1) and that encodes a protein that is substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence , (3) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1), wherein one or a plurality of nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and are substantially the same as the protein encoded by the nucleotide sequence.
  • nucleotide sequences encoding identically equivalent proteins (4) a nucleotide sequence which is a nucleotide sequence having at least 90% identity with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1) and which encodes a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence An array.
  • nucleic acid construct comprising at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in the following (1) to (4) is provided: (1) Full length or part of the nucleotide sequence described in (j)-(s) below: (j) Nucleotide sequence from 2911 to 3341 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 266 (k) Nucleotide sequence from 5159th to 5381 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 266 (l) Nucleotide sequence from positions 12778 to 13265 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 (m) Nucleotide sequence of nucleotide numbers 15145 to 16219 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 266 (n) the nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 from positions 18019 to 18505 (o
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence described in (1) and having a function substantially equivalent to each nucleotide sequence; (3) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1), wherein one or a plurality of nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and are substantially equivalent to each nucleotide sequence. Nucleotide sequence having various functions, (4) A nucleotide sequence having at least 90% identity with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1) and having a function substantially equivalent to each nucle
  • a nucleic acid construct comprising at least one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences described in the following (1) to (4) is provided: (1) a nucleotide sequence comprising all the full length of the nucleotide sequence described in (j)-(s) or (j)-(r), (2) a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence described in (1) and having a function substantially equivalent to each nucleotide sequence; (3) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1), wherein one or a plurality of nucleotides are deleted, substituted, inserted or added, and are substantially equivalent to each nucleotide sequence. Nucleotide sequence having various functions, (4) A nucleotide sequence having at least 90% identity with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in (1) and having a function substantially equivalent to each nucleotide sequence.
  • the full length or a part of the biosynthetic gene cluster derived from the pyripyropene-producing bacterium can be isolated and used, preferably, Penicillium copyrobium PF1169 represented by SEQ ID NO: 266.
  • the full length or part of the derived pyripyropene biosynthetic gene cluster can be used, and more preferably, the full length of the pyripyropene biosynthetic gene cluster derived from Penicillium copirobium PF1169 strain represented by SEQ ID NO: 266 can be used.
  • a “substantially equivalent amino acid sequence” means an amino acid sequence that has a modification by substitution, deletion, addition, or insertion of one or more amino acids, but does not affect the activity of the polypeptide.
  • the amino acid sequence modified by amino acid substitution, deletion, addition, or insertion is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably with respect to the amino acid sequence before the modification or the like. Preferably have a sequence identity of 95% or more, even more preferably 98% or more.
  • the number of amino acid residues to be modified is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 4. It is a piece.
  • modifications that do not affect activity include conservative substitutions.
  • the “conservative substitution” is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 1, so as not to substantially change the activity of the polypeptide. It means that 8 and most preferably 1 to 4 amino acid residues are replaced by another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic amino acid residue is substituted by another hydrophobic amino acid residue, a certain polar amino acid residue is substituted by another polar amino acid residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • nonpolar amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine and the like.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • “strict conditions” means that the membrane washing operation after hybridization is performed in a high-temperature, low-salt concentration solution, and those conditions can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • 2 ⁇ SSC concentration (1 ⁇ SSC: 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride), washing condition in 0.5% SDS solution at 60 ° C. for 20 minutes, or 0.2 ⁇ SSC concentration (1 ⁇ SSC: 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride), in a 0.1% SDS solution means washing conditions at 60 ° C. for 15 minutes.
  • Hybridization can be performed according to a known method. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • identity (sometimes referred to as homology) with respect to nucleotide sequences is used to mean the degree of coincidence of bases constituting each sequence among the sequences to be compared. At this time, the existence of gaps and the nature of amino acids are considered. Any numerical value of “identity” shown in the present specification may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, a default (initial setting) parameter in FASTA, BLAST, or the like. Can be easily calculated.
  • the “identity” with respect to the nucleotide sequence is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and further preferably 99% or more.
  • nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in a polynucleotide” may occur by a known method such as site-directed mutagenesis or naturally. It means that the modification was made by substitution of a plurality of nucleotides or the like.
  • the number of nucleotide modifications is one or more (for example, one to several, 1, 2, 3, or 4).
  • Nucleotide sequence encoding a protein substantially equivalent to the protein encoded by each nucleotide sequence means that the activity equivalent to “a protein encoded by each nucleotide sequence” has the same activity. It means a nucleotide sequence encoding a protein having the same.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from No. 3342 to No. 5158 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 has CoAligase activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 5382 to 12777 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 266 has LovB-like polyketide synthase (PKS) activity Is preferred.
  • PKS LovB-like polyketide synthase
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 13266 to 15144 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 has the activity of Cytochrome P450 monooxygenase (cytochrome P450 monooxygenase) (1) (P450-1) It is preferable to have.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 16220th to 18018th of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 has Cytochrome P450 monooxygenase (2) (P450-2) activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 18506 to 19296 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 preferably has Cyclase (IMP: Integral membrane protein) activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence of the nucleotide sequence 19779 to 21389 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 may have FAD-dependent monooxygenase (FMO-dependent monooxygenase) (FMO) activity preferable.
  • FMO-dependent monooxygenase FMO-dependent monooxygenase
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 21793 to 22877 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 preferably has UbiA-like prenyltransferase (UbiA-like prenyltransferase) (UbiAPT) activity. .
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 23205 to 24773 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 has Acetyltransferase (AT) activity.
  • a protein substantially equivalent to the protein encoded by the nucleotide sequence from 25824 to 27178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 266 has acetyltransferase-2 (AT-2) activity.
  • Nucleotide sequence having substantially the same function as each nucleotide sequence is not particularly limited as long as it has a function equivalent to “each nucleotide sequence”.
  • the function to regulate the expression of the target gene is equivalent. Specifically, it means that functions such as promoter activity and terminator activity are equivalent.
  • the target gene and expression control region are synthesized by a suitable primer based on the nucleotide sequence, and DNA amplification by PCR using a genomic DNA derived from a pyripyropene-producing bacterium or the like as a template or chemically It can be obtained by total synthesis.
  • pyripyropene is used in the meaning including from pyripyropene A to R, preferably pyripyropene A, E, and O, and more preferably pyripyropene A.
  • the pyripyropene biosynthetic gene group can be isolated, for example, by the following method. For example, genomic DNA of a pyripyropene-producing bacterium is extracted, cleaved with an appropriate restriction enzyme, and a library composed of genomic DNA is prepared using a cosmid vector. Subsequently, an appropriate primer was synthesized based on the nucleotide sequence contained in the pyripyropene biosynthesis gene group such as cytochrome P450 as described in Example 12, and PCR was performed using the genomic DNA derived from the pyripyropene-producing bacterium as a template.
  • the method is carried out to amplify a DNA fragment comprising a part of a biosynthetic gene group. Using this DNA fragment as a probe, a genomic library can be screened to isolate the full-length or part of the pyripyropene biosynthetic gene group.
  • the pyripyropene biosynthetic gene group expressed in the host in the present invention can be obtained by linking an expression regulatory region functioning in the host to the target gene, in addition to the above method.
  • the target gene and expression regulatory region may be linked by any method as long as the target gene is expressed in the host. For example, a method of operably linking a promoter upstream of the target gene and a terminator downstream. There is.
  • the target gene and the expression regulatory region according to the present invention can be linked according to a known method.
  • the marker gene according to the present invention is arranged in a nucleic acid construct in a state that can be expressed in the above-described pyripyropene biosynthetic gene group and host, and can be appropriately selected according to the selection method of the transformant.
  • Genes that encode drug resistance and genes that complement auxotrophy can be used.
  • drug resistance genes include genes for drugs such as destomycin, hygromycin, benomyl, oligomycin, G418, bleomycin, bialaphos, blasticidin S, phleomycin, phosphinothricin, ampicillin, kanamycin, and the like. Includes a destomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene.
  • genes that complement auxotrophy include genes such as amdS , pyrG , argB , trpC , niaD , TRP1 , LEU2 , and URA3 .
  • marker genes can be used after being isolated, amplified, or synthesized, for example, in the same manner as the pyripyropene biosynthetic genes.
  • nucleic acid construct of the present invention may be in any form as long as it can be introduced into a host gene, but preferably it can be used in a form incorporated into a vector upon introduction into the host. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a recombinant vector comprising the nucleic acid construct according to the present invention.
  • the recombinant vector according to the present invention can be prepared by introducing a pyripyropene biosynthetic gene group and a marker gene expressed in a host into an appropriate vector.
  • Any vector can be used in the present invention as long as it can be introduced into a host.
  • Examples thereof include cosmids, phage vectors, pUC plasmids, pBluescript plasmids, and pBR322 plasmids.
  • Hosts that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they can produce a pyripyropene by introducing the nucleic acid construct of the present invention, but microorganisms that can produce pyripyropene even without introducing the nucleic acid construct of the present invention are preferable, More preferred are filamentous fungi, still more preferred are microorganisms belonging to the genus Penicillium, Eupenicillium, or Aspergillus, and still more preferred are Penicillium copyrobium, Penicillium griseofulbum, Eupenicillium reticulosporum, or Aspergillus fumigatus Among these, Penicillium copirobium is preferable, and Penicillium copirobium PF1169 strain is most preferable.
  • the host by transforming with the nucleic acid construct, a transformant pyripyropene biosynthesis genes has been introduced, it is provided.
  • the method for introducing the nucleic acid construct into the host is not particularly limited as long as it is introduced into the host.
  • the nucleic acid construct can be introduced into the host by the following method using a recombinant vector.
  • Introduction of a nucleic acid construct using a recombinant vector into a host can be performed according to a conventional method.
  • the introduction method include an electroporation method, a polyethylene glycol method, an Agrobacterium method, a lithium method, and a calcium chloride method, and a method that is efficient for the host cell is selected.
  • the polyethylene glycol method is preferred.
  • plasmid pPYRI02 (Accession number of E. coli transformed with plasmid pPYRI02: FERM BP-11203) or cosmid pPYRI07 (Accession number of E. coli transformed with cosmid pPYRI07: FERM BP-11316)
  • a transformant obtained by introducing A into a host is provided.
  • a method for producing a pyripyropene comprising culturing the transformant produced as described above and collecting the pyripyropene from the culture, preferably A mass production method is provided.
  • the transformant can be cultured according to a conventional method by appropriately selecting a medium, culture conditions and the like.
  • a medium conventional components such as glucose, sucrose, cellulose, starch syrup, dextrin, starch, glycerol, molasses, animal / vegetable oil, etc. can be used as the carbon source.
  • the nitrogen source soybean flour, wheat germ, pharma media, corn steep liquor, cottonseed meal, bouillon, peptone, polypeptone, malto extract, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea and the like can be used.
  • inorganic salts capable of producing sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions as required, such as potassium chloride, calcium carbonate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, It is also effective to add 1 potassium phosphate, zinc sulfate, manganese sulfate, and copper sulfate.
  • various vitamins such as thiamine (thiamine hydrochloride, etc.), amino acids such as glutamic acid (sodium glutamate), asparagine (DL-asparagine, etc.), micronutrients such as nucleotides, and selective drugs such as antibiotics are added as necessary. You can also Furthermore, organic substances and inorganic substances that assist the growth of bacteria and promote the production of pyripyropene can be appropriately added.
  • the culture method can be carried out by a shaking culture method under aerobic conditions, an aeration stirring culture method or a deep aerobic culture method, and the aeration stirring culture method is most suitable.
  • the pH of the medium is, for example, about pH 6 to pH 8.
  • a suitable temperature for culturing is 15 ° C. to 40 ° C., but in many cases grows at around 26 ° C. to 37 ° C.
  • the production of pyripyropene varies depending on the medium and culture conditions, or the host used, but in any culture method, its accumulation usually reaches its maximum in 2 to 25 days.
  • Cultivation is stopped when the amount of pyropyropene during culture reaches the maximum, and pyropyropene is collected from the culture and isolated and purified as necessary.
  • pyropyropene is collected from the culture and isolated and purified as necessary.
  • multiple types of pyropyropene may be collected at the same time and isolated and purified as necessary, or multiple types of pyropyropene may be collected separately. If necessary, isolation and purification may be performed.
  • Example 1 Preparation of Penicillium copirobium PF1169 strain genomic DNA 500 ml of sterilized NB medium was placed in an Erlenmeyer flask (1 L) and penicillium copirobium PF1169 strain (previously cultured at 28 ° C. for 4 days in 1/2 CMMY agar medium ( Published technical report 2008-500997 (Patent Document 4) was added to the above medium, and liquid culture was performed at 28 ° C. for 4 days. Filtration with Miracloth gave 5 g of bacterial cells. From this bacterial cell, a genomic DNA purification kit Genomic-tip 100 / G (manufactured by Qiagen Co., Ltd.) was obtained according to the attached manual to obtain 30 ⁇ g of genomic DNA.
  • Genomic-tip 100 / G manufactured by Qiagen Co., Ltd.
  • Example 2 Degenerate primer for polyketide synthase (PKS) amplification and amplified fragments
  • PPS polyketide synthase
  • LC1 GAYCCIMGITTTYTYAYAYATG
  • Example 1 Using this degenerate primer, the genomic DNA prepared in Example 1 was reacted with ExTaq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached manual to detect an amplified fragment of about 700 bp (FIG. 1). . Then, the amplified fragment was analyzed, and an internal 500 bp sequence was identified (SEQ ID NO: 3).
  • Example 3 Genomic DNA Mass Sequence and Amino Acid Sequence Homology Search
  • the genomic DNA of Penicillium copirobium PF1169 obtained in Example 1 was subjected to mass sequencing and amino acid sequence homology search. Specifically, a portion of 50 ⁇ g of genomic DNA was pretreated and then subjected to a Roche 454 FLX DNA sequencer to obtain about 250 bp, 103,000 fragment sequences (total 49 Mb sequence).
  • polyketide synthase Aspergillus (A.) fumigatus PKS 2146a.a. And Penicillium (P.) griseofluvum 6-methylsalycilic ) are known as polyketide synthase and prenyltransferase .
  • prenyltransferase Aspergillus (A.) fumigatus Prenyltransferase, Aspergillus (A.) fumigatus Prenyltransferase (4-hydroxybezoate octaprenyltransferase), and Penicillium (P.) marneffei Prenyltransferase )
  • a search using the search software blastx was performed. 89, 86, 2, 1, and 3 homologous sequences were obtained, respectively (see Table 2). Furthermore, 19 and 23 contig sequences were obtained from the homologous sequences of A. fumigatus PKS 2146a.a. And P.
  • griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a. A. fumigatus PKS 2146a.a. Contig sequence: SEQ ID NO: 179 to 197, Contig sequence of P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a. (SEQ ID NO: 198 to 220) (see Table 2).
  • Example 4 PCR amplification from genomic DNA From the search results of blastx obtained in Example 3, 13 types of primer pairs shown in SEQ ID NOs: 227 to 252 were synthesized for polyketide synthase. Similarly, five kinds of primer pairs shown in SEQ ID NOs: 253 to 262 were synthesized for prenyltransferase. When PCR was performed on genomic DNA using these primers, amplified fragments of the expected size were recognized for all primer pairs (see FIGS. 1 and 2).
  • Example 5 Preparation of phage genomic library A ⁇ phage genomic library of Penicillium copirobium PF1169 strain was attached using ⁇ BlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit (Takara Bio Inc. Cat. No. 69242-3). Constructed according to the manual. That is, genomic DNA was partially decomposed using the restriction enzyme Sau3A1, and 0.5 ⁇ g of a DNA fragment of about 20 kb was ligated to 0.5 ⁇ g of ⁇ BlueSTAR DNA attached to the kit.
  • This ligation solution was subjected to in vitro packaging using a Lambda INN Packaging kit (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the manual attached to the kit to obtain 1 ml of the solution.
  • 10 ⁇ l of this packaged phage solution was infected with 100 ⁇ l of E. coli ER1647 strain, and after culturing overnight at 37 ° C. in a plaque forming medium, about 500 clone plaques were obtained.
  • a genomic library consisting of about 50,000 phages into which genomic DNA of 10-20 kb Penicillium copirobium PF1169 strain was introduced by infection was prepared.
  • Example 6 Screening from phage library Primary PCR hybridization using the PCR product amplified with the LC1-LC2c primer pair prepared above as a probe for the 10,000 phage library clone prepared in Example 5 Screening was performed. AlkPhos Direct Labeling and Detection System with CDP-Star (Cat. No. RPN3690, manufactured by GE Healthcare) was used for labeling and detection of the probe. The hybridization was performed according to the attached manual.
  • Example 7 Preparation of fosmid genomic library
  • a genomic library of Penicillium copirobium PF1169 strain was constructed by CopyControl Fosmid Library Production Kit (EPICENTRE, Cat. No. CCFOS110) according to the attached manual. That is, a DNA fragment of 0.25 ⁇ g of about 40 kb genomic DNA was blunt-ended and then incorporated into a fosmid vector pCCFOS (Epicentre).
  • This ligation solution was packaged in vitro using MaxPlax Lambda Packaging Extract attached to the kit based on the manual attached to the kit. When 10 ⁇ l of this packaged virus solution was infected with 100 ⁇ l of E. coli EPI300 TM -T1 R strain and cultured overnight at 37 ° C.
  • Example 8 Fosmid library screening According to the manual attached to the fosmid, each plasmid DNA was prepared from 96 pools of the library prepared in Example 7. Using the polyketide synthetase amplification degenerate primers synthesized in Example 2, PCR was performed on the 96 pool plasmid DNA samples. As a result, a DNA fragment of about 700 bp was amplified from 9 pools. Furthermore, a petri dish containing colonies of about 300 clones or more was prepared from this positive pool and rescreened by colony hybridization. As a result, nine fosmids were obtained from about 4800 clones using the LC1-LC2c primer pair.
  • Example 9 Mass sequence of genomic DNA and amino acid sequence homology search
  • the genomic DNA of Penicillium copirobium PF1169 strain obtained in Example 1 was subjected to mass sequence and amino acid sequence homology search. Specifically, 50 ⁇ g of genomic DNA was pretreated and then subjected to a Roche 454 FLX DNA sequencer to obtain an average contig length of 19.621 kb and a fragment sequence of 1405 fragments (total base length of 27.568160 Mb). The following five sequences (polyketide synthase: Penicillium (P.) Griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.
  • P22367 and Aspergillus ( P22367) and Aspergillus ( P22367) are known as polyketide synthase and prenyltransferase.
  • Example 10 Fosmid library screening and cluster gene sequence analysis According to the manual attached to the Fosmid kit (CopyControl Fosmid Library Production Kit manufactured by EPICENTRE), each plasmid from 96 pools of the library prepared in Example 7 DNA was prepared. Based on the nucleotide sequence determined by the Roche 454FLX DNA sequencer, a homology search of amino acid sequences was performed to search for a region where polyketide synthase and prenyltransferase are close to each other. A primer pair (No. 27) capable of amplifying a 400 bp DNA fragment was synthesized from the prenyltransferase base sequence in the obtained region. Using this primer, PCR was performed on the 48 pools of plasmid DNA samples.
  • an expected DNA fragment of about 400 bp (SEQ ID NO: 263) was amplified from 11 pools (see FIG. 3). Furthermore, a petri dish containing colonies of about 300 clones or more was prepared from 6 of the positive pools and rescreened by colony hybridization. As a result, 4 types of fosmids were obtained from about 4800 clones using 27F + 27R primer pairs (27F primer: SEQ ID NO: 264), 27R primer: SEQ ID NO: 265)). One of these was named pCC1-PP1 and the entire sequence of the insert was determined (SEQ ID NO: 266)).
  • Escherichia coli EPI300 TM -T1 R strain (attached to the fosmid kit) with the obtained pCC1-PP1, Escherichia coli EPI300 TM -T1 R strain / pCC1-PP1 (accession number FERM BP-11133) Got.
  • SEQ ID NO: 266 CoA ligase, LovB-like polyketide synthase (PKS), hydroxylase Cytochrome P450 monooxygenase, Cyclase, FAD-dependent monooxygenase (FMO), UbiA-like prenyltransferase (UbiAPT), acetylation
  • a homology search with the enzymes Acetyltransferase (AT), Acetyltransferase-2 (AT-2), and Cation transporting ATPase all of the above-mentioned enzymes are derived from Aspergillus fumigatus Af293 strain was performed. The above high homology was shown.
  • Nucleotides 3342-5158 of SEQ ID NO: 266 encode CoA ligase, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 267, and nucleotides 5382-12777 of SEQ ID NO: 266 are LovB-like polyketide synthase
  • the corresponding polypeptide encoding (PKS) is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 268 and is encoded by nucleotides 13266-15144 of SEQ ID NO: 266 (hereinafter, this polynucleotide sequence (P450-1)).
  • Cytochrome P450 monooxygenase (1)) and 16220-18018 (hereinafter, the protein encoded by this polynucleotide sequence (P450-2) is referred to as Cytochrome P450 monooxygenase (2)) encodes Cytochrome P450 monooxygenase,
  • the corresponding polypeptide is SEQ ID NO: 26, respectively.
  • nucleotide 18506-19296 of SEQ ID NO: 266 encodes Cyclase and the corresponding polypeptide is shown by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 271 and nucleotide 19779 of SEQ ID NO: 266.
  • -21389 encodes FAD-dependent monooxygenase (FMO), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 272, and nucleotide 21793-22877 of SEQ ID NO: 266 is a UbiA-like prenyltransferase (UbiAPT)
  • the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 273, nucleotides 23205-24773 of SEQ ID NO: 266 encodes acetyltransferase (AT), and the corresponding polypeptide is represented by SEQ ID NO: 274.
  • the amino acid sequence described is shown in SEQ ID NO: 266.
  • Leotide 25824-27178 encodes Acetyltransferase-2 (AT-2), and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 275, and nucleotides 27798-31855 of SEQ ID NO: 266 is a Cation transporting ATPase. The encoded and corresponding polypeptide was shown with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 276.
  • Example 11 Preparation of genomic DNA library A cosmid vector pMFCOS1 capable of transformation of fungi was constructed as follows. An approximately 3.0 kb Xba I fragment containing a destomycin resistance gene which is a marker gene for mold transformation was prepared from plasmid pMKD01 (Japanese Patent No. 3593134), and the ends were blunted using T4 polymerase. This fragment was ligated with a commercially available cosmid vector SuperCos1 (Stratagene) double digested with restriction enzymes Sma I and Stu I to construct cosmid vector pMFCOS1.
  • Penicillium copirobium PF1169 strain (open technical report No. 2008-500997 (Patent Document 4)), which is a pyripyropene A-producing bacterium, was added to a liquid medium (3% glycerin, 0.8% neutral broth, 0.3% malt extract, 0.2% yeast extract, 0.1% sodium glutamate, pH 7.0) and inoculated at 26 ° C. for 48 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and chromosomal DNA was prepared from these cells. Chromosomal DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI and then treated with alkaline phosphatase to dephosphorylate the DNA ends.
  • a liquid medium 3% glycerin, 0.8% neutral broth, 0.3% malt extract, 0.2% yeast extract, 0.1% sodium glutamate, pH 7.0
  • This DNA fragment was digested with restriction enzyme Xba I in advance and dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment, and further ligated to cosmid vector pMFCOS1 digested with restriction enzyme Bam HI to prepare a recombinant cosmid vector.
  • This recombinant cosmid vector was packaged in vitro using MAXPLAX lambda packaging extract manufactured by Epicenter, and infected with E. coli XLI-Blue MRA to prepare a genomic DNA library.
  • Example 12 Screening of genomic DNA library As a probe for screening the genomic DNA library prepared in Example 1, the cytochrome P450 gene, which is one of the pyripyropene A biosynthetic genes, was used and is shown below. As prepared by PCR.
  • PCR was carried out using the genomic DNA shown in Example 1 as a template and oligo DNAs of 5'-ATGATCGAGCTCAAAGATGC-3 '(SEQ ID NO: 277) and 5'-CTTCTTTCCAGTCAATACCT-3' (SEQ ID NO: 278) as primers.
  • PCR was performed using PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700 using Prime® STAR® HS® DNA® polymerase (Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase.
  • the primer was prepared by adjusting the genomic DNA to 0.5 ⁇ l (corresponding to 0.5 ⁇ g), the double-concentration reaction buffer attached to the enzyme to 25 ⁇ l, the 2.5 mM dNTP solution to 4 ⁇ l, and the concentration of 100 pmol / ⁇ l.
  • 0.5 ⁇ l each, 0.5 ⁇ l of enzyme and 19 ⁇ l of sterilized water were added to make 50 ⁇ l.
  • the reaction was conducted at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 25 cycles of incubation at 98 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes. After completion of the reaction, a part of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Example 13 Production of transformants Penicillium copirobium PF1169 strain, which is a pyripyropene-producing bacterium, was added to a liquid medium (3% glycerin, 0.8% nutritive broth, 0.3% malt extract, 0.2% yeast extract, 0.1% sodium glutamate, 2.0% Glycine, pH 7.0) was inoculated and cultured at 26 ° C. for 24 hours, and then the cells were collected by centrifugation.
  • a liquid medium 3% glycerin, 0.8% nutritive broth, 0.3% malt extract, 0.2% yeast extract, 0.1% sodium glutamate, 2.0% Glycine, pH 7.0
  • the obtained microbial cells were washed with 1.0 M KCl and filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and the protoplastizing enzyme solution (3 mg / mL ⁇ -glucuronidase, 1 mg / mL Chitinase, 3 mg / mL Lysing enzyme, 1.0 M KCl) Suspended in 10 mL. The hyphae were protoplasted by shaking at 30 ° C. for 60-90 minutes. The suspension was filtered and then centrifuged to collect protoplasts, which were then washed with a SUTC buffer (0.5 mol / L sucrose, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5]).
  • a SUTC buffer 0.5 mol / L sucrose, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5]
  • the prepared protoplast was suspended in 1 mL of SUTC buffer, 10 ⁇ g of pPYRI02 DNA solution (20 ⁇ L) was added to 100 ⁇ L of this, and the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes. Next, 400 ⁇ L of PEG solution (60% PEG 4000, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5]) was added and mixed, allowed to stand in ice for 20 minutes, 10 mL of SUTC buffer was added, and the mixture was centrifuged. Protoplast cells were collected. The obtained bacterial cells were suspended in 1 mL of SUTC buffer, centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes, and finally suspended in 100 ⁇ L of SUTC buffer.
  • PEG solution 50% PEG 4000, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5]
  • the cells subjected to the above treatment were layered on a 200 ⁇ g / mL hygromycin B, 1.0 M sucrose-containing potato dextrose agar together with a soft 1.0 M sucrose-containing potato dextrose agar medium, and cultured at 26 ° C. for 4 days. Thereafter, the formed colonies were used as transformants.
  • Example 14 Transformant culture and quantification of pyripyropene in culture medium
  • a medium (pH 7.0 before sterilization) having a composition of% polypeptone, 0.6% wheat germ, 0.3% yeast extract, 0.2% soybean meal and calcium carbonate 0.2% was used.
  • 10.0% glucose, 1.3% defatted soybean, 0.3% sodium glutamate, 0.8% wheat germ, 0.125% sodium chloride, 0.15% calcium carbonate 0.00%
  • a medium having a composition of 2% nicotinamide (pH 7.0 before sterilization) was used.
  • the 250 ml Erlenmeyer flask into which 40 ml of the seed medium was dispensed was sterilized at 122 ° C. for 20 minutes, and the transformant described in Example 13 was inoculated with 1 platinum loop of fungus and then shaken at 26 ° C. for 3 days. Cultured.
  • a 250 ml Erlenmeyer flask into which 20 ml of production medium had been dispensed was sterilized at 122 ° C. for 20 minutes, and 0.5 ml of the seed culture solution was aseptically transplanted thereto, and cultured with shaking at 26 ° C. for 8 days.
  • the obtained pattern was compared with a pyripyropene standard product, a peak derived from pyripyropene was identified, and pyripyropene was quantified from the area.
  • the pyripyropene analogs that were quantified were pyripyropene A, E, and O produced in this bacterium.
  • the penicillium copirobium 1 PF1169 strain which is the parent strain of the transformant, was similarly cultured and quantified for pyripyropene in the culture solution.
  • Example 15 Transformation of Penicillium copirobium using Agrobacterium tumefaciens
  • Penicillium copirobium PF1169 strain was cultured for 3 days at 28 ° C on 1 / 2CMMY agar medium, and conidia was scraped off and collected. Spores were obtained by filtration through sterile Miracloth (Carbiochem, Cat, No.
  • IM liquid medium (1.74 g / L K 2 HPO 4 , 1.36 g / L KH 2 PO 4 , 0.14 g / L NaCl, 0.49) g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.10 g / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 100 ⁇ L / L 9 mM FeSO 4 , 0.53 g / l (NH 4 ) 2 SO 2 , 1.8 g / L glucose, 8.53 g / L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid), 5 mL / L glycerin, pH 5.3) was diluted to 10 3 / ml, and this was made into a Penicillium copirobium spore suspension.
  • Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 introduced with pBI-AnGPD-EGFP (RIKEN) shown in Fig. 4 is inoculated into IM liquid medium containing 50 ppm kanamycin (Km) and cultured at 28 ° C overnight. did.
  • This is diluted with IM liquid medium containing 50 ppm of Km so that the absorption of transmitted light at 660 nm is 0.3 to 0.45, acetosyringone (AS) is added to a final concentration of 500 ⁇ M, and 28 Culturing was carried out at ° C for 6 hours, and this was used as an Agrobacterium culture solution.
  • Co-cultivation agar medium (1.74 g / L K 2 HPO 4 , 1.36 g / L KH 2 PO 4 , 0.14 g / L NaCl, 0.49 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O containing 50 ppm Km and 500 ⁇ M AS , 0.10 g / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 100 ⁇ L / L 9 mM FeSO 4 , 0.53 g / l (NH 4 ) 2 SO 2 , 0.9 g / L glucose, 8.53 g / L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) , 5 mL / L glycerin, 15 g / L Agar, pH 5.3) and hybond-N + (GE Health Science, diameter 82 mm, Cat.
  • Example 16 Screening of genomic DNA library 2
  • the base sequence at the end of the inserted fragment of pPYRI02 obtained in Example 12 is a sequence including 1-25000 of SEQ ID NO: 266 and its upstream region. Further, in order to obtain a full-length pyripyropene biosynthetic gene cluster to which the downstream part of the pyripyropene biosynthetic gene cluster is added, the downstream part of the biosynthetic gene cluster separately cloned and the inserted fragment of pPYRI02 described above are linked. We decided to construct a synthetic gene cluster.
  • the O-acetyltransferase gene which is a pyripyropene A biosynthetic gene not included in pPYRI02, was used as a probe from the genomic DNA library prepared in Example 11. The part was cloned.
  • pPYRI02 insert fragment obtained in Example 12 was constructed using the pPYRI02 insert fragment obtained in Example 12 and the pPYRI03 insert fragment.
  • Analysis of the base sequence of each cosmid reveals the restriction enzyme site on the cluster.
  • the Bsi WI fragment (approximately 20.2 kb) of pPYRI02 is the upstream region of the biosynthetic gene cluster, and the Bsi WI to Afl of pPYRI03 is the downstream region. It was revealed that a full-length biosynthetic gene class can be constructed by linking II fragments (about 4.9 kb). Therefore, first, plasmid pSET152 for actinomycete conjugation transmission [Bierman, M.
  • Hin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-1 5'-AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG-3 ') to change the multi-cloning site of pSET153 to Hin dIII- Not I- Bsi WIAflII- Not I- Eco RI after annealing (SEQ ID NO: 282) and Hin-Not-Bsi-Afl- Not-Eco-2 (5'-AATTCGCGGCCGCCTTAAGCGTACGCGGCCGCA-3 ') ( SEQ ID NO: 283), and pSET153 was double-digested with Hin dIII and Eco RI
  • the plasmid pSET201 was constructed by ligation.
  • the plasmid pPYRI05 was obtained by inserting an approximately 4.9 kb Bsi WI-Afl II fragment derived from pPYRI03 into the Bsi WI-Afl II site of pSET201.
  • a Bsi WI site of PPYRI05 insert the Bsi WI fragment of about 20.2kb from PPYRI02, it was selected clones Bsi WI fragment had been inserted in the biosynthesis gene cluster in the same direction of natural, to obtain a plasmid PPYRI06.
  • pPYRI06 is a plasmid containing the entire biosynthetic gene cluster, it does not have a fungal transformation marker. Therefore, the insert fragment was transferred to the cosmid vector pMFCOS1.
  • cosmid pPYRI07 is a cosmid that contains the entire biosynthetic gene cluster and also has a fungal transformation marker gene.
  • Example 17 Production of transformant using pPYRI07 A transformant was produced under the same conditions as in Example 13 except that pPYRI07 obtained in Example 16 was used.
  • Example 18 Transformant culture and quantification of pyripyropene in the culture solution
  • the transformant obtained in Example 17 and the method of quantification of pyripyropene in the culture solution were the same as those shown in Example 14. .
  • the pyripyropene analogs that were quantified were pyripyropene A, E, and O produced in this bacterium.
  • Penicillium copirobium PF1169 which is the parent strain of the transformant, was similarly cultured and quantified for pyripyropene in the culture broth.
  • Table 4 shows that the pyripyropene productivity of the transformant was improved 3.6 times that of the parent strain. From the above results, it was shown that the introduction of the full-length pyripyropene biosynthetic gene cluster improves the productivity of Penicillium copirobium PF1169 strain.
  • Example 19 Production of transformant using penicillium copyrobium Penicillium copyrobium
  • Penicillium copyrobium In order to confirm that the productivity of penicillium copyrobium other than PF1169 strain is improved by introducing a full-length pyripyropene biosynthetic gene cluster.
  • Copirobium ATCC58615 strain (see Studies in Mycology (2004), 49 p84-85) was transformed.
  • a transformant was produced in the same manner as the method shown in Example 13, except that pPYRI07 obtained in Example 16 was used.
  • Example 20 Cultivation of transformant and quantification of pyripyropene in culture medium
  • the culture of the transformant obtained in Example 19 and the method of quantification of pyripyropene in the culture liquid were carried out except that the culture time was 4 days. This was carried out by the method shown in Example 14.
  • the pyripyropene analogs that were quantified were pyripyropene A, E, and O produced in this bacterium.
  • Penicillium copirobium ATCC58615 which is the parent strain of the transformant, was similarly cultured and quantified for pyripyropene in the culture medium.
  • Table 5 the pyripyropene productivity of the transformant was improved 2.5 times that of the parent strain.

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Abstract

　ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物が提供される。本発明による核酸構築物によれば、安価で生産性の高いピリピロペンの製造法が提供される。

Description

ピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を含む核酸構築物 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１０年１月２６日に出願された日本出願特願２０１０－１４７００号および２０１０年１１月１１日に出願された日本出願特願２０１０－２５３１８３号に基づく優先権の主張を伴うものであり、この日本出願の全開示内容は、引用することにより本願の開示の一部とされる。
発明の背景
技術分野
　本発明は、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物に関する。
背景技術
　ピリピロペンは、これまで側鎖の構造の違いにより、ピリピロペンＡ～Ｒまでの１８種の類縁体が天然に存在することが明らかとされている（非特許文献１）。
　ピリピロペンは、ACAT阻害活性を有することが開示されており（特許文献１）、コレステロール蓄積に起因する疾患の治療等への応用が期待されている。また、 ピリピロペンが、オオタバコガ幼虫（非特許文献２）、コナガ幼虫（特許文献２）、チャイロコメムシダマシ（特許文献２）、アブラムシ（特許文献３）に対して殺虫活性を有することが開示されており、殺虫剤への応用が期待されている。
　ピリピロペンは糸状菌により二次代謝物として生産されることが知られており、例えば、ペニシリウム コピロビウムPF1169株（特許文献４）、アスペルギルス フミガタスIFO-1289株（特許文献５）、ユーペニシリウム レティキュロスポラムNRRL-3446株（非特許文献２）、ペニシリウム グリセオフルバムF1959株（特許文献２）が、それぞれピリピロペンを生産する事が開示されている。
　ピリピロペンの工業生産は、前記の生産菌を培養しピリピロペンを採取することにより実施される。一般に、天然から分離された微生物の生産する二次代謝産物の量は微量であり、これを産業的に利用するためには、これら目的物の生産性を向上させる必要がある。
　目的物の生産性を向上させるためには、目的物生産微生物の培養方法の検討、培地成分の検討、および前駆体の添加などの発酵条件の改良、並びに紫外線照射または突然変異誘発剤による突然変異を利用した菌株の改良が行われている。さらに近年では、これらの方法に加えて遺伝子組換えを利用した生産性の向上も行われるようになってきた。
　遺伝子組換えによる生産性向上における一般的な手法は、生合成遺伝子の発現増強であり、例えば、本手法によりアゴノマイセタレスの生産するPF1022物質の生産性を向上させる方法が開示されている（特許文献６）。この手法を適応するためには、目的物の生合成遺伝子が単離されており、かつその生産微生物において形質転換法が確立されていることが必要である。
　ピリピロペンについては生合成遺伝子群を単離した報告はこれまでなく、また、ピリピロペン生産菌を宿主とした形質転換法も確立されていなかった。従って、これまでピリピロペンの生合成遺伝子群をその生産微生物に導入することが困難であり、遺伝子組換えによる生産性向上が実現できない状況であった。
特開平6-184158号公報 W02004/060065号公報 W02006/129714号公報 公開技報2008-500997号 特開平4-360895号公報 特許3961289号
Journal of Antibiotics (1996)、49(3)、292‐298 Applied and Environmental Microbiology (1995)、61 (12)、 4429-4435
　本発明者らは、今般、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物を宿主で発現させることにより、ピリピロペンの生産性が顕著に向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
　従って、本発明の目的は、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物を提供することにある。
　そして、本発明の一つの態様によれば、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物が提供される。
　また、本発明の別の態様によれば、前記核酸構築物を、宿主に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
　さらに、本発明の別の態様によれば、前記ピリピロペン生合成遺伝子群を含む核酸構築物と、前記マーカー遺伝子を含む核酸構築物とを、同時にまたは別々に、宿主に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
　また、本発明の別の態様によれば、前記形質転換体を培養し、培養物からピリピロペンを採取することを含んでなるピリピロペンの製造法が提供される。
は、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動は、以下のプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物を用いた。Ｍ：分子量マーカー(100bp ラダー)、レーン１：配列番号１および２のプライマー、レーン２：配列番号２３９および２４０のプライマー、レーン３：配列番号２３７および２３８のプライマー、レーン４：配列番号２４１および２４２のプライマー、レーン５：配列番号２４７および２４８のプライマー、レーン６：配列番号２５１および２５２のプライマー、レーン７：配列番号２４５および２４６のプライマー、レーン８：配列番号２４３および２４４のプライマー、レーン９：配列番号２４９および２５０のプライマー、レーン１０：配列番号２３５および２３６のプライマー、レーン１１：配列番号２３３および２３４のプライマー、レーン１２：配列番号２２７および２２８のプライマー、レーン１３：配列番号２２９および２３０のプライマー、レーン１４：配列番号２３１および２３２のプライマー。 は、図１と同様、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動は、以下のプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物を用いた。Ｍ：分子量マーカー(100bp ラダー)、レーン１：配列番号２５３および２５４のプライマー、レーン２：配列番号２５７および２５８のプライマー、レーン３：配列番号２５９および２６０のプライマー、レーン４：配列番号２５５および２５６のプライマー、レーン５：配列番号２６１および２６２のプライマー。 は、図１と同様、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動は、以下のプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物を用いた。レーン１：分子量マーカー(100bp ラダー)、レーン２：配列番号２６４および２６５のプライマー(400bp増幅断片)。 は、用いた糸状菌用プラスミドベクターpBI-AnGPD-EGFPのマップを表す。図中、RBは右側の境界(right border)を表し、HYGｒはハイグロマイシン耐性をコードする領域(Hygromycin resistance coding region)を表し、PAngpdAはアスペルギルス・ニドランス　グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素プロモーター(Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)を表し、EGFPは強化緑色蛍光タンパク質をコードする領域(enhanced green fluorescent protein coding region)を表し、TAngpdAはアスペルギルス・ニドランス　グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素ターミネーター(Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase terminater)を表し、LBは左側の境界(left border)を表す。 左図は、アグロバクテリウム感染区のハイグロマイシン耐性コロニーを表し、右図はそのGFP蛍光観察の結果を表す。 左図は、ハイグロマイシンを含まない培地におけるアグロバクテリウムを感染させていないペニシリウム　コピロビウムPF1169株のコロニーを表し、右図はそのGFP蛍光観察の結果を表す。
発明の具体的説明
微生物の寄託
　プラスミドｐＣＣ１－ＰＰ１で形質転換された大腸菌（Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ－Ｔ１Ｒ）は、２００８年１０月９日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３（国内寄託ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７０４より移管）（寄託者が付した識別のための表示：Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ－Ｔ１Ｒ／ｐＣＣ１－ＰＰ１）として寄託されている。
　プラスミドｐＰＹＲＩ０２で形質転換された大腸菌は、平成２１（２００９）年１２月１４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ－１１２０３（寄託者が付した識別のための表示：XL1-Blue MRA/pPYRI02）として寄託されている。
　コスミドｐＰＹＲＩ０７で形質転換された大腸菌は、平成２２（２０１０）年１２月１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ－１１３１６（寄託者が付した識別のための表示：XL1-Blue MRA/pPYRI07）として寄託されている。
ピリピロペン生合成遺伝子群
　本発明におけるピリピロペン生合成遺伝子群とは、後述するマーカー遺伝子と宿主において発現可能な状態で核酸構築物中に配置されるものであり、ピリピロペンの生合成に関与する遺伝子群であれば特に限定されないが、好ましくは、下記の(I)～(IV)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列の全長もしくはその一部を含んでなる構築物が提供される：
(I)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列、
(II)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(III) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
(IV) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
　本発明におけるピリピロペン生合成遺伝子群のさらに好ましい態様によれば、目的遺伝子と、発現調節領域とを含んでなる遺伝子群である。ここで、目的遺伝子とは、ピリピロペンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を一またはそれ以上有するものである。また、発現調節領域とは、宿主で前記目的遺伝子の発現を調節するために必要なヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、目的遺伝子の宿主内での転写量を調節するヌクレオチド配列であるプロモーターやターミネーターなどが含まれる。また、ピリピロペンの生合成に関与するタンパク質とは、例えば、下記スキーム１で表される生合成経路のいずれかに関与するタンパク質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　　　　　　　　　　　　　　　　スキーム１
　本発明の目的遺伝子の好ましい態様によれば、配列番号２６７～２７５から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される。
　本発明の目的遺伝子のさらに好ましい態様によれば、下記の(１)～(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 下記(a)-(i)に記載されたヌクレオチド配列:
(a)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の3342番から5158番までのヌクレオチド配列、
(b)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5382番から12777番までのヌクレオチド配列、
(c)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の13266番から15144番までのヌクレオチド配列、
(d)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の16220番から18018番までのヌクレオチド配列、
(e)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18506番から19296番までのヌクレオチド配列、
(f)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19779番から21389番までのヌクレオチド配列、
(g)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21793番から22877番までのヌクレオチド配列、
(h)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の23205番から24773番までのヌクレオチド配列、および
(i)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の25824番から27178番までのヌクレオチド配列、
(２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
　本発明の目的遺伝子のさらに一層好ましい態様によれば、下記の(１)～(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 上記(a)-(i)または(a)-(h)に記載されたヌクレオチド配列の全長を全て含むヌクレオチド配列、
(２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
　本発明の発現調節領域の好ましい態様によれば、下記の(１)～（４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個ヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 下記(j)-(s)に記載されたヌクレオチド配列の全長もしくは一部:
(j)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の2911番から3341番までのヌクレオチド配列
(k)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5159番から5381番までのヌクレオチド配列
(l)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の12778番から13265番までのヌクレオチド配列
(m)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の15145番から16219番までのヌクレオチド配列
(n)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18019番から18505番までのヌクレオチド配列
(o)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19297番から19778番までのヌクレオチド配列
(p)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21390番から21792番までのヌクレオチド配列
(q)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の22878番から23204番までのヌクレオチド配列
(r)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の24774番から25823番までのヌクレオチド配列
(s)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の27179番から27797番までのヌクレオチド配列
(２）（１）において記載されたヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
　本発明の発現調節領域のより好ましい態様によれば、下記の(１)～（４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個ヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 前記(j)-(s)または(j)-(r)に記載されたヌクレオチド配列の全長を全て含むヌクレオチド配列、
(２）（１）において記載されたヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
　本発明においてピリピロペン生合成遺伝子群としては、ピリピロペン生産菌に由来する生合成遺伝子クラスターの全長もしくは一部を単離して使用することができ、好ましくは、配列番号２６６で示されるペニシリウム　コピロビウムＰＦ1169株に由来するピリピロペン生合成遺伝子クラスターの全長または一部を用いることができ、さらに好ましくは、配列番号２６６で示されるペニシリウム　コピロビウムＰＦ1169株に由来するピリピロペン生合成遺伝子クラスターの全長を用いることができる。
　本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、一つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸配列を意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列は、改変等される前のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに一層好ましくは９８％以上の配列同一性を有することが好ましい。また、改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1～40個、より好ましくは1～20個、さらに好ましくは1～10個、さらに一層好ましくは1～8個、最も好ましくは1～4個である。
　そして、活性に影響を与えない改変の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように、好ましくは1～40個、より好ましくは1～20個、さらに好ましくは1～10個、さらに一層好ましくは1～8個、最も好ましくは1～4個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
　本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、当業者であればその条件は適宜決定できるものであるが、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件、または０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
　本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
　本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」は９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個のヌクレオチドの置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドの改変の個数は、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）である。
　「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列」とは、「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質」と同等な活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、CoA ligase（CoAリガーゼ）活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、LovB-like polyketide synthase（LovB様ポリケチド合成酵素）(PKS)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（１）(P450-1)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cytochrome P450 monooxygenase（２）(P450-2)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cyclase（シクラーゼ）(IMP: Integral membrane protein)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、FAD-dependent monooxygenase（FAD依存性モノオキシゲナーゼ）(FMO)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、UbiA-like prenyltransferase（UbiA様プレニルトランスフェラーゼ）(UbiAPT)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase（アセチルトランスフェラーゼ）(AT)活性を有することが好ましい。
　配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase-2(AT-2)活性を有することが好ましい。
　「それぞれヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列」とは、「それぞれヌクレオチド配列」と同等の機能を有する限り特に限定されないが、例えば目的遺伝子の発現を調節する機能が同等であることを意味し、詳細には、例えば、プロモーター活性やターミネーター活性などの機能が同等であることを意味する。
　前記の目的遺伝子、発現調節領域は、前記のヌクレオチド配列を基に適当なプライマーを合成し、それを用いてピリピロペン生産菌等に由来するゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅または化学的に全合成することにより取得することができる。
ピリピロペン
　本発明において、ピリピロペンとは、ピリピロペンＡからＲまでを含む意味で用いられるものとし、好ましくは、ピリピロペンＡ、Ｅ、およびＯであり、さらに好ましくはピリピロペンＡである。
ピリピロペン生合成遺伝子群の単離方法
　ピリピロペン生合成遺伝子群は、例えば、以下の方法で単離することができる。例えば、ピリピロペン生産菌のゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、コスミドベクターを用いて、ゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。続いて、実施例１２の記載に従ってcytochrome P450等のピリピロペン生合成遺伝子群に含まれるヌクレオチド配列を基に、適当なプライマーを合成し、それを用いてピリピロペン生産菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を実施し、生合成遺伝子群の一部からなるＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、ピリピロペン生合成遺伝子群の全長もしくは一部を単離することができる。
　本発明における、宿主で発現されるピリピロペン生合成遺伝子群は、前記の方法以外に、目的遺伝子に、宿主で機能する発現調節領域を連結させることにより得ることができる。目的遺伝子と発現調節領域の連結様式は、目的遺伝子が宿主で発現すればどの様な方法でも構わないが、例えば、目的遺伝子の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結する方法がある。本発明による目的遺伝子と発現調節領域の連結は、公知の方法に従って行うことができる。
マーカー遺伝子
　本発明によるマーカー遺伝子は、上述したピリピロペン生合成遺伝子群と宿主において発現可能な状態で核酸構築物中に配置されるものであり、形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、デストマイシン、ハイグロマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラホス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられ、好ましくはデストマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、例えば、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
　これらのマーカー遺伝子は、例えば、ピリピロペン生合成遺伝子群と同様な方法で単離、増幅、もしくは合成し、使用することができる。
核酸構築物
　本発明における核酸構築物は、宿主の遺伝子に導入できればどのような形態のものでもよいが、好ましくは、宿主への導入の際に、ベクター中に組み込まれた形態で用いることができる。従って、本発明好ましい態様によれば、本発明による核酸構築物を含んでなる組換えベクターが提供される。
　本発明による組換えベクターは、適当なベクターに宿主で発現されるピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を導入することで調製できる。
　組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
　本発明において使用できるベクターとしては、宿主に導入できればいずれも使用できるが、例えば、コスミド、ファージベクター、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系プラスミド、およびｐＢＲ３２２プラスミドなどが挙げられる。
宿主
　本発明において使用できる宿主としては、本発明の核酸構築物を導入してピリピロペンを生産できる宿主であれば特に限定されないが、本発明の核酸構築物を導入しない状態でもピリピロペンを生産できる微生物が好ましく、より好ましくは糸状菌が挙げられ、さらに好ましくはペニシリウム属、ユーペニシリウム属、またはアスペルギルス属に属する微生物が挙げられ、さらに一層好ましくはペニシリウム　コピロビウム、ペニシリウム グリセオフルバム、ユーペニシリウム レティキュロスポラム、またはアスペルギルス フミガタスが挙げられ、その中でもペニシリウム　コピロビウムが好ましく、最も好ましくはペニシリウム　コピロビウムＰＦ１１６９株が挙げられる。
形質転換体の造出
　本発明によれば、前記宿主を、前記核酸構築物を用いて形質転換することにより、ピリピロペン生合成遺伝子群が導入された形質転換体が提供される。核酸構築物の宿主への導入方法は、宿主へ導入されれば特に限定されないが、例えば組換えベクターを用いた以下の方法により核酸構築物を宿主へ導入することができる。
　宿主への組換えベクターを用いた核酸構築物の導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ペニシリウム　コピロビウムを宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
　本発明の好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＹＲＩ０２（プラスミドｐＰＹＲＩ０２で形質転換された大腸菌の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２０３）またはコスミドｐＰＹＲＩ０７（コスミドｐＰＹＲＩ０７で形質転換された大腸菌の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１３１６）を宿主に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
形質転換体の培養とピリピロペンの製造
　本発明によれば、前記で造出された形質転換体を培養し、その培養物からピリピロペンを採取することを含んでなるピリピロペンの製造法、好ましくはピリピロペンの大量製造法が提供される。
　形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ－アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、ピリピロペンの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
　培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、特に通気撹拌培養法が最も適している。培地のｐＨは、例えばｐＨ６～ｐＨ８程度である。培養に適当な温度は、１５℃～４０℃であるが、多くの場合２６℃～３７℃付近で生育する。ピリピロペンの生産は、培地および培養条件、または使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常２日～２５日間でその蓄積が最高に達する。
　培養中のピロピロペンの量が最高になった時に培養を停止し、培養物からピロピロペンを採取し、必要に応じて単離、精製を行う。複数の種類のピロピロペンが製造された場合には、複数種のピロピロペンを同時に採取して必要に応じて単離、精製を行ってもよいし、複数種のピロピロペンを別々に採取して、必要に応じて単離、精製を行ってもよい。
　以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ペニシリウム　コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡの調製
　三角フラスコ（１L）に滅菌したNB培地　500mlを入れ、1/2CMMY寒天培地において、28℃で、4日間前培養していたペニシリウム　コピロビウムPF1169株（公開技報2008-500997号（特許文献4））を上記の培地に加え、28℃で、4日間液体培養した。ミラクロスで濾過により、菌体５ｇを得た。この菌体よりゲノムＤＮＡ精製キット Genomic-tip 100/G（キアゲン株式会社製）を、添付のマニュアルに従い、30μgのゲノムＤＮＡを取得した。
実施例２：ポリケチド合成酵素(PKS)増幅用縮重プライマーとその増幅断片
　種々の糸状菌ポリケチド合成酵素に保存されているアミノ酸配列より増幅用縮重プライマーとして　下記プライマーをデザインし、合成した：
　ＬＣ１　： ＧＡＹＣＣＩＭＧＩＴＴＹＴＴＹＡＡＹＡＴＧ（配列番号１）
　ＬＣ２ｃ： ＧＴＩＣＣＩＧＴＩＣＣＲＴＧＣＡＴＹＴＣ（配列番号２）
　（ただし、R=A/G、Y=C/T、M=A/C、I=イノシン）。
　この縮重プライマーを使用して、実施例１において調製したゲノムＤＮＡと、ExTaqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）とを、添付のマニュアルに従い反応させ、約700bpの増幅断片を検出した（図１）。そして、前記増幅断片を解析し、その内部500bpの配列を特定した（配列番号３）。
実施例３：ゲノムＤＮＡの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索
　実施例１において得られたペニシリウム　コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ　50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX　ＤＮＡシークエンサーに供し、約250bp、10.3万本のフラグメント配列（総計49Mbの配列）を取得した。
　この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素：Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.およびPenicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.、プレニルトランスフェラーゼ：Aspergillus (A.) fumigatus Prenyltransferase、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）、およびPenicillium(P.) marneffei Prenyltransferase由来の配列）を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ８９本、８６本、２本、１本、および３本の相同配列を取得した（表２参照）。さらに、A. fumigatus PKS 2146a.a.およびP. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.の相同配列から、それぞれ１９本、２３本のコンティグ配列を取得した（A. fumigatus PKS 2146a.a.のコンティグ配列：配列番号１７９～１９７、P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.のコンティグ配列：配列番号１９８～２２０）（表２参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例４：ゲノムＤＮＡからのPCR増幅
　実施例３において取得したblastxの検索結果より、ポリケチド合成酵素に対して、配列番号２２７～２５２に示す１３種のプライマー対を合成した。同様に、プレニルトランスフェラーゼに対して、配列番号２５３～２６２に示す５種のプライマー対を合成した。これらのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対するPCRを行ったところ、全プライマー対について期待される大きさの増幅断片を認めた（図１および図２参照）。
実施例５：ファージゲノムライブラリーの作製
　ペニシリウム　コピロビウムPF1169株のλファージゲノムライブラリーを、λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit ( タカラバイオ株式会社製 Cat. No. 69242-3)を用いて、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、ゲノムＤＮＡを、制限酵素Sau3A1を用いて部分分解し、約20kbのＤＮＡ断片0.5μgをキットに添付されたλBlueSTAR　ＤＮＡ0.5μgに連結した。このライゲーション溶液をLambda INN Packaging kit(株式会社ニッポンジーン製)を用い、キットに添付のマニュアルに基づいてin vitroパッケージングを行い、1mlの溶液を取得した。このパッケージングされたファージ溶液１０μlを大腸菌ER1647株100μlに感染させ、プラーク形成培地において、37℃で、一晩培養後、約500クローンのプラークを得た。このように感染により10～20kbのペニシリウム　コピロビウムPF1169株のゲノム ＤＮＡ が導入されたファージ約50000クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。
実施例６：ファージライブラリーからのスクリーニング
　実施例５において調製したファージライブラリー10000クローンに対して、上記で調製したLC1－LC2cプライマー対により増幅させたPCR産物をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによる１次スクリーニングを行った。プローブの標識と検出にはAlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star（GEヘルスケア株式会社製 Cat. No. RPN3690）を用いた。前記ハイブリダイゼーションは、添付のマニュアルに従い、実施した。
　１次スクリーニングにより、６クローンが候補として残った。さらに、プラークハイブリダイゼーションによる２次スクリーニングの結果、４クローンを取得した。これらの陽性クローンは大腸菌BM25.8株に感染させ、添付のマニュアルに従いファージをプラスミドに変換させ、目的領域を含む４種のプラスミドを取得した。
実施例７：フォスミドゲノムライブラリーの作製
　ペニシリウム　コピロビウムPF1169株のゲノムライブラリーは、CopyControl Fosmid Library Production Kit（EPICENTRE社製、Cat. No.CCFOS110）を、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、約40 kbのゲノムＤＮＡ0.25μgのＤＮＡ断片を末端の平滑化を行った後、フォスミドベクターpCCFOS（Epicentre社製）に組み込んだ。このライゲーション溶液を同キット添付のMaxPlaxLambda Packaging Extractを用い、キットに添付のマニュアルに基づいて、in vitroパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液10μlを大腸菌EPI300TM-T1R株100μlに感染させ、クロラムフェニコール含有培地において、37℃で、一晩培養し選抜したところ、300クローンのコロニーを得た。このように感染により40kbのペニシリウム　コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡ が導入されたフォスミド約30000クローンを取得した。1wellあたり約50クローンとなるように96wellプレートに分注し、つまり、９６のプール、約4800クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。 
実施例８：フォスミドライブラリースクリーニング
　フォスミド添付のマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドＤＮＡを調製した。実施例２で合成したポリケチド合成酵素増幅用縮重プライマーを用いて、この９６プールのプラスミドＤＮＡサンプルに対して、PCRを行った。その結果、約700bpのＤＮＡ断片が、９プールより増幅した。さらにこのポジティブプールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、LC1-LC2cプライマー対を用いて、約4800クローンより９種のフォスミドを取得した。
実施例９：ゲノムＤＮＡの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索
　実施例１において得られたペニシリウム　コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ　50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX　ＤＮＡシークエンサーに供し、平均コンティグ長19.621kb、1405本のフラグメント配列（総塩基長27.568160Mbの配列）を取得した。
　この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素： Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.(P22367) およびAspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.(Q4WZA8)、プレニルトランスフェラーゼ：Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase(Q0MRO8)、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(Q4WBI5)、およびAspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）(Q4WLD0)由来の配列)を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ２２本(P22367)、２１本(Q4WZA8)、２本(Q0MRO8)、３本(Q4WBI5)、および３本(Q4WLD0)の相同配列を取得した。
実施例１０：フォスミドライブラリースクリーニングおよびクラスター遺伝子の配列解析　フォスミドキット（EPICENTRE社製 CopyControl Fosmid Library Production Kit）に添付されているマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドDNAを調製した。Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーにより決定された塩基配列に基づいてアミノ酸配列の相同性検索を行い、ポリケチド合成酵素とプレニルトランスフェラーゼが近接する領域を検索した。得られた領域のプレニルトランスフェラーゼ塩基配列より400bpのDNA断片を増幅しうるプライマー対（No.27）を合成した。このプライマーを用いて、この４８プールのプラスミドDNAサンプルに対して、PCRを行った。その結果期待される約400bpのDNA断片（配列番号２６３）が、１１プールより増幅した（図３参照）。さらに、このポジティブプールのうち６プールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、27F + 27Rのプライマー対（27Fプライマー：配列番号２６４）、27Rプライマー：配列番号２６５））を用いて、約4800クローンより４種のフォスミドを取得した。この内の一つをpCC1-PP1と命名し、挿入断片の全配列を決定した（配列番号２６６））。
　得られたpCC1-PP1により大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株（フォスミドキットに付属）を形質転換することにより大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株／pCC1-PP1（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３）を得た。
　なお、前記配列番号２６６の配列とCoA ligase、LovB-like polyketide synthase(PKS)、水酸化酵素であるCytochrome P450 monooxygenase、Cyclase、FAD-dependent monooxygenase(FMO)、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)、アセチル化酵素であるAcetyltransferase(AT)、Acetyltransferase-2(AT-2)、およびCation transporting ATPase（上記酵素は、いずれもAspergillus fumigatus Af293株由来）との、相同性検索をそれぞれ行ったところ、いずれも７０％以上の高い相同性を示した。
　配列番号２６６のヌクレオチド３３４２－５１５８は、CoA ligaseをコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号２６７に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド５３８２－１２７７７は、LovB-like polyketide synthase(PKS)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２６８に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１３２６６－１５１４４（以下、このポリヌクレオチド配列（P450-1）によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（１）とする）および１６２２０－１８０１８（以下、このポリヌクレオチド配列（P450-2）によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（２）とする）は、Cytochrome P450 monooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号２６９、２７０に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１８５０６－１９２９６は、Cyclaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７１に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１９７７９－２１３８９は、FAD-dependent monooxygenase(FMO)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７２に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２１７９３－２２８７７は、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７３に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２３２０５－２４７７３は、Acetyltransferase(AT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７４に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２５８２４－２７１７８は、Acetyltransferase-2(AT-2)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７５に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２７７９８－３１８５５は、Cation transporting ATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７６に記載したアミノ酸配列で示された。
実施例１１：ゲノムＤＮＡライブラリーの作成
　カビの形質転換が可能なコスミドベクターpMFCOS1を以下のようにして構築した。プラスミドpMKD01（特許第3593134号公報）よりカビの形質転換用マーカー遺伝子であるデストマイシン耐性遺伝子を含む約3.0kbのXbaI断片を調製し、T4ポリメラーゼを使用して末端を平滑化した。この断片を制限酵素SmaIおよびStuIで二重消化した市販のコスミドベクターSuperCos1（ストラタジーン社）と連結してコスミドベクターpMFCOS1を構築した。
　次に、ピリピロペンＡ生産菌であるペニシリウム　コピロビウム PF1169株（公開技報2008-500997号（特許文献４））を液体培地（３％グリセリン、０．８％ニュートリエントブロス、０．３％麦芽エキス、０．２％酵母エキス、０．１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に植菌し、２６℃、４８時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集め、これらの菌体より染色体ＤＮＡを調製した。染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片を、予め制限酵素XbaIで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素BamHIで消化したコスミドベクターpMFCOS1に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、エピセンター社製のMAXPLAXラムダパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌ＸＬＩ－Ｂｌｕｅ　ＭＲＡに感染させることによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
実施例１２：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
　実施例１で作製したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ピリピロペンＡ生合成遺伝子の一つであるcytochrome P450遺伝子を使用することとし、以下に示すようにＰＣＲによって調製した。
　実施例１に示したゲノムＤＮＡを鋳型とし、5’-ATGATCGAGCTCAAAGATGC-3’ （配列番号２７７）と5’-CTTCTTTCCAGTCAATACCT-3’（配列番号２７８）のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてPrime STAR HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ　ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００を用いて行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを０．５μｌ（０．５μｇ相当量）、酵素に添付の２倍濃度反応用緩衝液を２５μｌ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ溶液を４μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．５μｌずつ、酵素を０．５μｌ、滅菌水を１９μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で２分間のインキュベーションを２５サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿物を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１．８ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。
　上記ＤＮＡ断片をプローブにし、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約５０００個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの１クローンよりプラスミドｐＰＹＲＩ０２を単離した。また、このプラスミドｐＰＹＲＩ０２の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号２６６の１～２５０００およびその上流域を含むことが確認された。
実施例１３：形質転換体の造出 
　ピリピロペン生産菌であるペニシリウム　コピロビウム PF1169株を液体培地（３％グリセリン、０．８％ニュートリエントブロス、０．３％麦芽エキス、０．２％酵母エキス、０．１％グルタミン酸ナトリウム、２．０％グリシン、ｐＨ７．０）に植菌し、２６℃、２４時間培養した後、遠心により菌体を集めた。得られた菌体を１．０Ｍ　ＫＣｌで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、３ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、１．０Ｍ　ＫＣｌ）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０～９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍＭ　塩化カルシウム、１０ｍＭ　トリス塩酸［ｐＨ７．５］）で洗浄した。
　調製したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのｐＰＹＲＩ０２ＤＮＡ溶液（２０μＬ）を加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ　塩化カルシウム、１０ｍＭ　トリス塩酸[ｐＨ７．５]）を加え混合し、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、遠心しプロトプラスト化した菌体を回収した。得られた菌体を１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
　以上の処理を加えた菌体を、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、１．０Ｍ　シュークロース含ポテトデキストロースアガー上に、軟１．０Ｍ　シュークロース含ポテトデキストロースアガー培地とともに重層し、２６℃、４日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
実施例１４：形質転換体の培養、および培養液中のピリピロペンの定量
　形質転換体の培養には、種培地として２．０％でんぷん（スターチ）、１．０％ぶどう糖（グルコース）、０．５％ポリペプトン、０．６％小麦胚芽、０．３％酵母エキス、０．２％大豆粕および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地(殺菌前ｐＨ７．０)を用いた。また、生産培地としては、１０．０％グルコース、１．３％脱脂大豆、０．３％グルタミン酸ナトリウム、０．８％小麦胚芽、０．１２５％塩化ナトリウム、０．１５％炭酸カルシウム、０．２％ニコチンアミドの組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。
　前記の種培地４０ｍｌを分注した２５０ｍｌ容三角フラスコを１２２℃で２０分間殺菌し、これに実施例１３に記載した形質転換体を1白金耳の菌を植菌後、２６℃で３日間振盪培養した。次いで、生産培地２０ｍｌを分注した２５０ｍｌ容三角フラスコを１２２℃で２０分間殺菌し、これに上記種培養液０．５ｍｌを無菌的に移植し、２６℃で８日間振盪培養した。得られた培養液０．５ｍｌにメタノール９.５ｍｌを添加しピリピロペンを抽出、濾過すると抽出液が得られた。このうち１０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣシステムＬＣ－２０１０Ｃ（島津製作所）を用いて分析した。分析条件は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ ４．６ Ｘ ２５０ｍｍ、移動相：アセトニトリル：水＝６０：４０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、ＵＶ波長：３２０ｎｍとした。得られたパターンをピリピロペン標準品と比較し、ピリピロペンに由来するピークを特定し、その面積からピリピロペンの定量を行った。尚、定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。
　同時に形質転換体の親株であるペニシリウム　コピロビウム PF1169株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。
　その結果、下表３に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の約２．６倍に向上し、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含まないｐＰＹＲＩ０２により形質転換させた形質転換体であっても、ピリピロペン生産性が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例１５：アグロバクテリウム　ツメファシエンスを用いたペニシリウム　コピロビウムの形質転換
　1/2CMMY寒天培地でペニシリウム　コピロビウムPF1169株を28℃で3日間培養し、分生糸をかきとり回収した。滅菌ミラクロス（Carbiochem社製、Cat, No. 475855）で濾過して胞子を取得し、IM液体培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、1.8 g/L グルコース、8.53 g/L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L グリセリン、pH 5.3)で103 /mlに希釈し、これをペニシリウム　コピロビウム胞子懸濁液とした。
　図４に示すpBI-AnGPD-EGFP (独立行政法人理化学研究所)を導入したアグロバクテリウム　ツメファシエンスEHA105株を50 ppmのカナマイシン(Km)を含むIM液体培地に植菌し、28℃で１晩培養した。これを660nmの透過光の吸収が0.3 ～ 0.45になるように50 ppmのKmを含むIM液体培地で希釈し、終濃度が500 μMとなるようにアセトシリンゴン(AS)を添加し、さらに28°Cで6時間培養し、これをアグロバクテリウム培養液とした。50 ppmのKmおよび500 μMのASを含むco-cultivation寒天培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、0.9 g/L グルコース、8.53 g/L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L グリセリン、15 g/L Agar、pH 5.3)にhybond-N+ (GEヘルスサイエンス社製、直径82 mm、Cat. No. RPN82B)を敷き、上記の方法で得られた100 μLのペニシリウム　コピロビウム胞子懸濁液と、100 μLのアグロバクテリウム培養液とを混合し、hybond-N+上に均一に広げた。これを、25℃で2日間共存培養した後、50 ppmのハイグロマイシンおよび25 ppmのメロペネム(住友製薬社製)を含むMM寒天培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、1.8 g/L グルコース、15 g/L Agar)に移し4日間選択培養した。得られたコロニーを25 ppmのハイグロマイシンおよび25 ppmのメロペネムを含む1/2CMMY寒天培地に移し、生育した形質転換体を取得した。取得したハイグロマイシン耐性コロニーとGFP蛍光観察結果を図５Ａに示したとおり、得られたハイグロマイシン耐性コロニーのほとんどから蛍光を検出した。一方、図５Ｂに示したとおり、対照としたアグロバクテリウムを感染させていないペニシリウム　コピロビウムPF1169株からは蛍光を検出しなかった。また、ハイグロマイシン耐性コロニーのゲノムPCR実験により、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびGFP遺伝子の導入も確認した(データ省略)。
実施例１６：ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング２
　実施例１２で得たｐＰＹＲＩ０２の挿入断片末端の塩基配列は、配列番号２６６の１～２５０００およびその上流域を含む配列である。さらにピリピロペン生合成遺伝子クラスターの下流部分を加えた全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを得るために、別途クローニングした生合成遺伝子クラスターの下流部分と、上記ｐＰＹＲＩ０２の挿入断片と連結させることにより、全長の生合成遺伝子クラスターを構築することとした。
　全長の生合成遺伝子クラスターの構築方法としては、実施例１１で作製したゲノムDNA ライブラリーより、ｐＰＹＲＩ０２には含まれていないピリピロペンＡ生合成遺伝子であるO-acetyltransferase遺伝子をプローブとして、本クラスターの下流部分をクローニングした。
　実施例１１に示したゲノムDNAを鋳型とし、プローブとして使用するDNA 断片を増幅する際のプライマーとして5'-ATGGATTCCCTATTGACGAG-3’（配列番号２７９）及び5’-TTAAATCTCCCCACCAACCG-3’（配列番号２８０）を用いた以外は、実施例１２の場合と同様の条件で実施した。
　本DNA 断片をプローブとして、ECL ダイレクトDNA／RNA ラベリング・検出システムを使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約5000 個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの１クローンよりプラスミドｐＰＹＲＩ０３を単離した。本クローンに対するPCR解析の結果、生合成遺伝子クラスターの下流域は充分有しており、上流部については、Cytochrome P450 monooxygenaseまでは有していること、またAdenylate forming enzyme(CoA ligase)は含まれていないことを確認した。
　実施例１２で得たｐＰＹＲＩ０２の挿入断片と、前記ｐＰＹＲＩ０３の挿入断片を用い、生合成遺伝子クラスター全長を有するコスミドを構築することとした。それぞれのコスミドの塩基配列の解析よりクラスター上に有する制限酵素部位が明らかにでき、生合成遺伝子クラスターの上流領域としてpPYRI02のBsiWI断片（約20.2kb）を、下流領域としてpPYRI03のBsiWI～AflII断片（約4.9kb）を連結することにより、全長の生合成遺伝子クラスーが構築できることが明らかとなった。
　そこでまず、放線菌の接合伝達用プラスミドpSET152［ビアマン（Bierman，M．）ら著，「ジーン（Gene）」，（蘭国），1992年，第116巻，p．43－49］をSphI 消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑化した後、HindIII リンカー（5’-CCCAAGCTTGGG-3’（配列番号２８１）、宝酒造株式会社製）を連結してプラスミドpSET153 を構築した。pSET153のマルチクローニングサイトをHindIII－NotI－BsiWIAflII－NotI－EcoRI に変更するため、合成オリゴヌクレオチドHin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-1（5’-AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG-3’）（配列番号２８２）およびHin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-2（5’-AATTCGCGGCCGCCTTAAGCGTACGCGGCCGCA-3’）（配列番号２８３）をアニールした後、HindIII 及びEcoRI で二重消化したpSET153 と連結してプラスミドpSET201 を構築した。pSET201 のBsiWI－AflII 部位に、pPYRI03 由来の約4.9kb のBsiWI－AflII 断片を挿入してプラスミドpPYRI05 を得た。pPYRI05 のBsiWI 部位に、pPYRI02由来の約20.2kb のBsiWI 断片を挿入し、BsiWI 断片が天然の生合成遺伝子クラスターと同向きに挿入されたクローンを選抜し、プラスミドpPYRI06 を得た。pPYRI06 は生合成遺伝子クラスター全長を含むプラスミドであるが、カビの形質転換マーカーを有していないことから、挿入断片のコスミドベクターpMFCOS1 への繋ぎ換えを行った。即ち、pPYRI02由来の約8.5kb のコスミドベクター部分のNotI 断片と、pPYRI06 由来の約25.1kb のNotI断片を連結してコスミドpPYRI07（翻訳領域：配列番号２８４、非翻訳領域：配列番号２８５）を得た。pPYRI07 は生合成遺伝子クラスター全長を含むとともにカビの形質転換マーカー遺伝子も有するコスミドである。
　pPYRI07 の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号２６６の２４４６～２７５０５およびその上流にベクター部分の塩基配列を含んでおり、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含むことが確認された。
実施例１７：pPYRI07を用いた形質転換体の造出 
　実施例１６で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例１３の場合と同様の条件で形質転換体の造出を行った。
実施例１８：形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量
　実施例１７で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、実施例１４で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウム　コピロビウム PF1169株についても、同様に培養及び培養液中のピリピロペンの定量を行った。
　その結果、下表４に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の３．６倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、ペニシリウム　コピロビウム PF1169株の生産性が向上することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例１９：ペニシリウム　コピロビウムを用いた形質転換体の造出
　ペニシリウム　コピロビウム PF1169株以外のペニシリウム　コピロビウムにおいても全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを導入により、その生産性が向上することを確認するために、ペニシリウム　コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株（Studies in Mycology(2004), 49 p84-85参照）について形質転換を行った。
　方法は、実施例１６で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例１３に示した方法と同様の方法にて形質転換体の造出を行った。
実施例２０：形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量
　実施例１９で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、培養時間が４日間であることを除き、実施例１４で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウム　コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。
　その結果、下表５に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の２．５倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、PF1169株以外のペニシリウム　コピロビウムについても、その生産性が向上することが示された。また、ペニシリウム　コピロビウムPF1169株の方が、ペニシリウム　コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株に比べ、生産性がより向上するが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３３
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０３
　ＦＥＲＭ 　ＢＰ－１１３１６

Claims (17)

  1. 　ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む、核酸構築物。
  2. 　前記ピリピロペン生合成遺伝子群が、下記の(I)～(IV)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列の全長もしくはその一部を含んでなる、請求項１に記載の核酸構築物：
    (I)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列、
    (II)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    (III) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
    (IV) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
  3. 　前記ピリピロペン生合成遺伝子群が、目的遺伝子と、発現調節領域とを含んでなる、請求項１または２に記載の核酸構築物。
  4. 　前記目的遺伝子が、配列番号２６７～２７５から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸構築物。
  5. 　前記目的遺伝子が、下記の(１)～(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸構築物：
    （１）下記(a)-(i)に記載されたヌクレオチド配列:
    (a)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の3342番から5158番までのヌクレオチド配列、
    (b)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5382番から12777番までのヌクレオチド配列、
    (c)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の13266番から15144番までのヌクレオチド配列、
    (d)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の16220番から18018番までのヌクレオチド配列、
    (e)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18506番から19296番までのヌクレオチド配列、
    (f)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19779番から21389番までのヌクレオチド配列、
    (g)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21793番から22877番までのヌクレオチド配列、
    (h)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の23205番から24773番までのヌクレオチド配列、および
    (i)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の25824番から27178番までのヌクレオチド配列、
    (２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
  6. 　前記発現調節領域が、下記の(１)～(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個ヌクレオチド配列を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の核酸構築物：
    （１）下記(j)-(s)に記載されたヌクレオチド配列の全長もしくはその一部:
    (j)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の2911番から3341番までのヌクレオチド配列、
    (k)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5159番から5381番までのヌクレオチド配列、
    (l)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の12778番から13265番までのヌクレオチド配列、
    (m)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の15145番から16219番までのヌクレオチド配列、
    (n)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18019番から18505番までのヌクレオチド配列、
    (o)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19297番から19778番までのヌクレオチド配列、
    (p)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21390番から21792番までのヌクレオチド配列、
    (q)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の22878番から23204番までのヌクレオチド配列、
    (r)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の24774番から25823番までのヌクレオチド配列、および
    (s)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の27179番から27797番までのヌクレオチド配列、
    (２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
    （３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
    （４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
  7. 　前記マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子である、請求項１～６に記載の核酸構築物。
  8. 　前記マーカー遺伝子が、デストマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項１～６に記載の核酸構築物。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物を、宿主に導入することにより得られる、形質転換体。
  10. 　ピリピロペン生合成遺伝子群を含む核酸構築物と、マーカー遺伝子を含む核酸構築物とを、同時にまたは別々に、宿主に導入することにより得られる、形質転換体。
  11. 　プラスミドｐＰＹＲＩ０２またはコスミドｐＰＹＲＩ０７を宿主に導入することにより得られる、請求項９に記載の形質転換体。
  12. 　前記宿主がピロピロペンを生産する糸状菌である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の形質転換体。
  13. 　前記ピリピロペンを生産する糸状菌が、ペニシリウム属、ユーペニシリウム属、またはアスペルギルス属である、請求項１２に記載の形質転換体。
  14. 　前記ピリピロペンを生産する糸状菌が、ペニシリウム　コピロビウム、ペニシリウム グリセオフルバム、ユーペニシリウム レティキュロスポラム、アスペルギルス フミガタスである、請求項１２に記載の形質転換体。
  15. 　前記ピリピロペンを生産する糸状菌がペニシリウム　コピロビウムである、請求項１２に記載の形質転換体。
  16. 　前記ピリピロペンを生産する糸状菌がペニシリウム　コピロビウムＰＦ１１６９ 株またはペニシリウム　コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株である、請求項１２に記載の形質転換体。
  17. 　請求項９～１６のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養物からピリピロペンを採取することを含んでなる、ピリピロペンの製造法。
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