CN113846041B - 增强转运蛋白基因的表达以提高盐霉素发酵水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强转运蛋白基因的表达以提高盐霉素发酵水平的方法；包括在白色链霉菌BK 3‑25中，分别过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652，得到高产盐霉素的突变株。本发明通过增强转运蛋白基因的转录水平，提高盐霉素的外排效率、降低其胞内毒性、解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高盐霉素产量。

Description

增强转运蛋白基因的表达以提高盐霉素发酵水平的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种增强转运蛋白基因的表达以提高盐霉素发酵水平的方法；尤其涉及一种通过增强转运蛋白基因的转录水平，提高盐霉素的外排效率，进而提高盐霉素产量的方法；通过在白色链霉菌BK 3-25中过量表达内源的转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316、SLNHY_6652，可以提高盐霉素的外排效率、降低其胞内毒性、解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高盐霉素产量。
背景技术
盐霉素是由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的一种聚醚类抗生素，它能够与金属阳离子和质子螯合，形成中性的配合物，穿过细胞膜，改变细胞内外的离子梯度和渗透压，从而导致细胞的死亡。盐霉素在畜牧业中被广泛地用于治疗鸡球虫病和提高饲料的利用率，在临床上用来杀死疟疾的致病原疟原虫。2009年美国的一项研究表明，盐霉素能够特异性地杀死上皮肿瘤干细胞，且效果是临床在用的药物紫杉醇的100倍。此外还有证据显示盐霉素对人白血病干细胞有一定的抑制作用。虽然盐霉素作用于肿瘤干细胞的机理以及是否能开发成抗肿瘤药物尚未清楚，但是暗示了盐霉素具有巨大的潜力。
在盐霉素的发酵过程中，胞内过量积累的盐霉素会对细胞的生长和生理活动造成负面影响，此时，细胞的保护机制将会中断盐霉素的进一步合成。前期研究中，通过对不同豆油添加条件下发酵液转录组数据的比较，我们找到了六个与盐霉素外排有关的基因：SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652。增强转运蛋白基因的表达可以提高盐霉素外排的效率，减少其在胞内的积累，进而降低对宿主的负面影响，解除对盐霉素合成的抑制，最终提高盐霉素的产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强转运蛋白基因的表达以提高盐霉素发酵水平的方法；本发明在白色链霉菌BK 3-25中，分别过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652，获得高产盐霉素的菌株LX-09、LX-10、LX-11、LX-12、LX-13、LX-14、LX-15和LX-16；该突变株基于过量表达内源转运蛋白基因，提高盐霉素外排的效率，进而降低对宿主的负面影响，最终提高盐霉素的产量。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种盐霉素高产菌株，所述菌株的盐霉素生物合成基因簇外的转运蛋白基因过量表达。
作为本发明的一个实施方案，所述菌株由白色链霉菌过量表达序列依次如SEQ IDNO.1-8所示的内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316、SLNHY_6652中的一种或几种构建而得。
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_0929的序列如下(SEQ ID NO.1)：
ATGCAGACCAACTCCCCCTGGCGGATACCCGACTTCCGCACGCTGTTCACCGCGACCACCCTCAGCCAGCTCGCCACCAACATCGGCTATGTCGCGGTACCGCTGATCGCGGTCACCGAACTCGACGCCAGCCCCGGCGAGGTGGGCGCGCTCGCCACCCTCAGCACCGTCGCCTTCCTGCTCATCGGGCTGCCCGCGGGCGCCTGGGTGGACCGGATGCGGCACCGCAGGGTGCTGATCGCGGCCGACCTGACCAGGGCGGCCCTGTTCGTCTCGCTGCCGATCGCCTGGTGGCTGGACTCGCTCACCCTCGGACAGCTCTACGCCGTGGTGCTCTTCAACGGCTGCGCCACCGTCTTCTTCGACGTCGGCTCGCAGAGCGTGCTGCCCCAACTGGTCGGCAAGGAAGGCCTGGTGCAGGCCAACGCCGCCGTCATGACGCTCATCGCGGCGGGCAACGTCGCGGGCCGCGGCGCGGGCGGCGGCTTCGTCCAGCTGCTCACCGCGCCGGTCGCGGTCGCCTTCACCGCGGGCAGCTACCTCGCCTCCGGGCTGCGGCTGACCGGCATCCGCCACACTCCCCCGCCGCCTCCGCCGCCGTCCGGCGCGGCCGTCACGCTACGCGCGCAGATCGCCGAGGGCGTACGGCACGTCTTCCGCAACGCGGAGCTGCGGGCCCTGGCGCTGACCGCCGCCTTCACCAACCTCGGCTCGCAGATCATCAACACCATGCTGCCGGTGCTCTTCGTCCGCGAACTCGACCTGCCCGCAGGCGCCTTGGGCCTGTTCTGGGCGGCGGGCGGCGCCGGGCTCCTCGCCGGAGCGCGCTGTGCGCGGCCCATCGCGGGACGGCTCGGCTACGGCCGCACGCTCGGTCTCGCCGGGCTCTGCATGGCCCCGGCCGGGCTGCTCATCCCGCTGGTCGACCGCGGAGGATGGCTGTATCTCGCCGGTGCGGGCTACCTGCTCGCGATGTTCAAGACCGGAATGGACAACGTTCTCGGAGTCAGCCTGCGCCAGCGCATGACGGCGAGTTCCCTGCTCGGGCGGATGAACGCCACCTTCCGCTTCATGCTGACCGGCGCCCTCGCGGTCGGCTCGGCCGTGGCCGGCGCCATCGGTGAACTCACCAGCGTGCACACCACCTTGTGGGTGGGCGGCGTGATCCTCTCGCTCGCCTTCCTGCCGGTCTTCCTGTCCCCCGTGCGGGGGCGCCGCGAACTTCCCGAACAACAGGAGGAGGTCGTGCGCAAATCCGCACCCGCCGATTCCTGA
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_1893的序列如下(SEQ ID NO.2)：
ATGATCGAGCTCGAAGGGCTGACCAAGCGCTACGGCGAGAAGATGGCCGTCGACAATCTGACCTTCACGGTGCGGCCGGGCATCGTGACCGGGTTCCTCGGCCCGAACGGCGCGGGCAAGTCGACCACCATGCGGATGATGCTGGGCCTGGACCGGCCGACCTCCGGTGACGTCCGCATCGACGGCACCCACTACGACCGCCTCAAGGAACCCCTCAAGGACATCGGGGCGCTCCTGGACGCCAAGGCGATGCACGGCGGGCGCAGCGCCTACCACCATCTGCTGTGCCTGGCGCAGTCCAACGGCATCCCCAGCAGCCGGGTGCACGAGGTGCTGGACACGGTCGGGTTGACGGCGGTGGCGAAGAAGAAGGCCAAGGGCTTCTCGCTCGGCATGGGCCAGCGGCTGGGGATCGCGGGCGCGCTGCTCGGCGATCCGCGGATCCTGATGTTCGACGAGCCGGTCAACGGCCTGGATCCCGAGGGCATCCACTGGATCCGCAATCTGATGAAGTCCCTTGCCGCGCAGGGCCGTACGGTCTTCGTCTCCTCGCATCTGATGAGCGAGATGGCGCTGACCGCCGACCACCTGGTCGTGATCGGGCAGGGCCGCCTGCTGGCGGACACCTCGATGGCGGACTTCATCCGGGAGAACTCCCGCTCCTACGTACGGCTGCGCAGCCCGCAGCGCGAGCAGCTCCTCGATGTGCTGCACCGGGAGAACATCGCGGTCCTCACCAAGGACGACGGGGCGCTGGAAGTGGACGGCACCGGAGCCGACCGGCTCGGCGAGCTGGCCGCCGCCCACCGCCTGGTCCTGCACGAACTCAGCCCGCAGCAGGCCTCGTTGGAAGAGGCGTTCATGCAACTCACCGCCGAATCGGTCGAATACCACGCCCACACCGGACCCGGCGGCATCGGAAGCCCACCCCCCGGCGGCCTCCCGCCCGGCGGCCCGCCGCAGCAGCCGTATCCTGTCGGCGCCCCGGGGGCACCCGGCGACGGGAGCCAGGGCCTGCCGACCGCTCCCCCGCCCGGCGGCGCGCAGGCGCCGCCACCGGCGAGCGGTCCGGGAAGCCCCGGCTGGGGCCAAGGCTGGCAGCGACCCGGGAAGGGGGCCTGA
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_3363的序列如下(SEQ ID NO.3)：
CTACTTGATGGCGGTCAGCAGCGGCAGGATCTCGTCGATCGCGTACGGGATCGACAGGACGGTGTTGAAGGAGAAGGCCGCGCCGATGTCGGGGCCCTGGTAGGGCACGAACAGGTCGCGCTTTTCCTGGTGGACCTTCAGCTTCTTGTAGAGCGCCTCGCCCTGGATGCGCTCGTCGGCCTCGGTGCTGGAGGTGACCCAGACCAGCCGGTCGGTGTCCAGGACGCTCAGCTTCTCGGCGCTCAACTCGGCGGCGTTCATGCCGGGTTGGGCGAGCTTGTCGACCTCGGGCTTGAGCTTGAAGCCGAACTCCTCGAAGAAGATCGCCTTCGGGTCGGTCTTGGTGAAGGCGCTGTACTTGCCCGCCTCGAAGCTGTCCGCGACGGCCAGCGTCATCTTGGCGAACTCGGGGTGCTCGGTGCGCACCTTCTTGAACCGCGCGTCGATGCCCTTGATCAGCTTCTCGGTCTCGGCGTCCTTGCCGAGCGACTTGCCGATCTGACGGGTCATCACCTTCCAGGGGGCGGCGTAGTCCGGGTGCCCCTTGGGCTGCGCGACGACCTTGGTGAACTTGGAGAGCGTCTCGTACTGCTCCTTCTTCATGCCGGAGTACTGGGCGATGACCAGGTCCGGCTTGAGGGAGGCGATCTTCTCCATGTTGAACTCGTCGCGCTCGCCGACGATCTGCGGTGTCTCGGAGCCCCACTTCGCCTTGGTCCAGGGCCACTTGCCGTACGGGCGCTCCTTGAACCAGTCCACCGAGCCGACCGGCTTGATGCCGAGCGCGAGCACGGTGTCCTGGTCCGAGAGGCCGAGGGTGACGACCTTCTCCGGCGCCTTGTCGATCTTCGTGGAGCCGTACTTGTGCTCCACGGTGACCGGGAAGGCCCCCGAACTGGAGCCGCCCTTGGGGTCCTTGGACCCCTCGGAGCCGGAGTCGTCGGAGCCGCCCCCGCAGGCGGTCAGCGCGAGCGCGGCGGTCACGGCCAC
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_4037的序列如下(SEQ ID NO.4)：
TCAGCGACCGGACTGCGGGGCCTTCCAGCGGGCGATGCCGCGGGCCACCAGGTTGAGGATCATGACGAAGGCGATGAGCGCGAGCGAGGCGGCCCAGGCCCGGTCGTAGGCGGCGCCGCTGCCGGAGCTGTTCGCGTACTGCTGGTAGATGTACAGCGGCAGCGAGGCCTGCTCCCCCTCGAAGGGGTTGGTGTTGATGAAGCTGTTGCCCCACACCAGGAGCAGGACCGGCGCGGTCTCGCCGGTGATGCGCGCGACCGCCAGCATGACGCCCGTGGTGATGCCGCCGATCGAGGTCGGGACGACCACCTTGAGGATGGTGCGCCACTTGGGCACGCCGAGCGCGAGGCTGGCCTCCCGCAGCTCGTTCGGGACGAGCTTGAGCATCTCCTCGGTGGAGCGCACGATCACCGGGATCATCAGGATCGACAGGGCGAGCGAGCCGGCGAAGCCGGAGAAGTCGAAGCCGAGGATCAGGATCCAGAAGCTGAGGACGAACAGGCCCGCGACGATCGAGGGCACGCCCGTCATCACGTCGACGAAGAAGGTGACGGCCTTGGCGAGCCTGCCGCGCCCGTACTCCACCAGGTAGATGGCGGTGAACAGGCCGAGCGGCACGGACATCACGGTGGCGAGGCCGACCTGCTCCAGGGTGCCGATGATGGCGTGGTAGATGCCGCCGCCGGGCTCGGTGTCGGCGACCACGCCCATCGAGTGGCCGAGGAAGTAGCCGTCGAAGACCTTGGCGCCGCGCTTGACCGTCTCGTAGAGGAGGGAGGCGAGCGGGATCACGGCGAGGACGAAGGTGACCCAGACGACGCTGGTGGCGACCCGGTCCTTGGCCTGGCGGCGGCCCTCGACGGCGGCGGCCGCGGTGTAGGTGATCACCACGAAGAGCAGGGCGGCGATCAGTCCCCACTGGACCGTGTTGCCGAGACCGGCGAGCAGGCCGATGCCGGAGCCGAGCAGGACCGAGAGCAGGGCGATGCCCCAGGCGGAGCCGCGCGGCAGGCGGGCGGTCTTCAGGGTCCCCGGGCGCGGGGTGGTGGCTGCGTGGCTCAT
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_0199的序列如下(SEQ ID NO.5)：
TCACAGGGACACCTCCTTGCGGCGGCGGACCATCGCGATGAACACCGGGGCTCCGATCAGCGCGGTCACCGCACCGACCTCCAACTCCCCCTCCGGCAGCACCAGCCGCCCCACGATGTCCGCGCCCAGCAGCAGCACCGGCGCGAGCAGCATGCAGTACGGCAGGCTCCATCGCAGATCAGGCCCGGCCAGCCAACGCGCCACCAGCGGAATCACCAGGCCCACGAAGCCGATCGGGCCCGCCGCCGCGGTCGCCGCCCCGCACAGCAGCGTCACCGCGACGACCGTCCCCAGCCGCGTCCGCCCCACATGCACCCCGAGCCCTCTCCCCAACTCCTCCCCCAGCGCAAGGGAGTTCAGCGACCGCGCCAGCAGCAGGGCCAACACCAGTCCCACTCCGACAAAGGGCGCCAACTCGCCCACCAGCTCGGGCCGCCGCCCCGCCAACGACCCCACCATCCAGAACCGCAGATAGTCGTAGGTCGCCGCGTCGAAGACCGTCAGCCCCGCGATCAGCCCGCCCAGGGACGCGCTCACCGCCGCCCCCGCCAGGGCCAACCGCACCGGAGTCGGCCCCCCGCGCCCCGAGGCCCCGAGCACATACACGACCACACTCGCCAACGCCGCCCCCGCGAACGAGAACCACACCAGCGACAGAAAGCTCCCCACACCCAGGAAACCGATGGCGAAAACCAC
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_0818的序列如下(SEQ ID NO.6)：
TCAGGCGCGTCCCGCGGTCTTCTGCGTGCGGCGGGAGACCGAGTCGATGACGACGGCGGCGAGCAGCACCGCGCCGGTGATCATGTACTGGATCTCGCTCGCCATGCCGAGCAGGTTCAGGCCCTGCTGGATGGACTGCAGCACGAGCATGCCGAGCAGGGCCGACCAGACCTTGCCCCGGCCGCCGAAGAGGCTGGTGCCGCCGATCACGGCCGCCGCGATGACCAGCATCAGGGTGTTGCCGGAGCCGAGGTTCTTGGTGGCGCCGCCGGCGGTGCTGGCGATGAACAGGCCGCCGAAGGCGGCGAGCATCCCGGAGATGCCGAAGACGGCGATCCGGATCATGTCGACGTTGATACCGGCGCGGCGGGCCGCCTCGGCGTTGCCGCCGACCGCGAAGACCTTGCGGCCGAAGGTGGTGCGCCGGGCGACGAAGTCGGCGATCACCAGGACCGCGAGGAAGAGCACCAGGGCGAGCGGCAGGCCGCGGGCGCCCTCCGGCTCGTTCAGCTCGTAGGCGACGACGAAGGAGATCACCGCGACGACGGCGGTGCGCAGCACGATCTCGCTGACCGGGCGGGAGGGCAGGTCGGCGGCGCGGCGGCGGCGGGTCTCCCACAGCAGCGAGGCCGCGTAGGCGAGGACGGCGACGAGGGCGACCCCGTAGCCGACGGCCTTGTCGGCGAAGTAGTGGCTGGTGAGGTTCTCGACGATGCTGCCCTCGGGCGTGTTGATGCTGCCCTCGGAGCCCATCAGCCAGATCTGCAGTCCGCTCCAGCCGAGGAAGCCCGCGAGGGTGACCACGAAGGCGGGCACGCCGACCTTGGCGAAGAAGACGCCGTGCAGGGCGCCGATGACCAGTCCGCAGACGACCGCGAAGAGCACCGCGGTCCAGTCGCTCCAGCCGTGGTTGACGCTGAGCACCGCCCAGATCGCGGCGCCGAGTCCGGCCACCGAGCCGACCGAGAGGTCGATCTCGCCGAGCAGCAGGACGAAGACGATGCCGACGGCCATGATGCCGAGGCCGGAGGTGAAGACGGCGATGTTGGCGAGGCTGCTCGCCGACAGGAAGCTGTCGTTCTTCGCCTGGAAGATGATCGCGATGACGATCAGGCCCACCACCACGGGCAGCGAGCCGAGTTCACCGCCGCGGATCTTGCGGACGAACTCGGTCCCGTAGCCCTTGAGGCCCTGCTCGCGCACGAGCAGGCGCGGGTCCACGGCGGGGATGGGCGCCGCCGATCCCCCGGCGGCCGGGTCGGCCGGGTCCTTCACCGCGGTGGCGGTCTCCTGCGGCTGCGCGGAGTTCTTGGCGAGGTCGCTCAT
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_6316的序列如下(SEQ ID NO.7)：
GTGAGCGCGCCGACCGAGGAGTTGACCGGGGAGCCGACCGGCCGGGACCCGCTGGTCGAGGTCCGCGGGCTCACCGCGCGCGCCGGGGACCGACTCCTCCTCGACGGGGTCGACCTGCGGCTGGCGGCCGGCCGTGTCACCGCGCTGGTCGGGCCCTCCGGCAGCGGCAAGACCACCACCGCGCTCGCCCTGCTCGGCGAGTACGAACCGGGAGTGCGCCTGAGCGGTGAGATCACCGTCGCGGGCGTCCCCGTGCTCGGCCCCGGCGGCGTCACGGACCGCGCCGCCGAGGTGCGCGGCGGCACCCTCGCGTATATGCCGCAGCACCCCGGCAGCGCGCTCAACCCGGCCCGGCGCACCGGCGCCGTGCTCACCGAACTCGCCCGGCTGCACCGCCCGGAGCCGGGACGCACCCCCGCCGAGTCGGCCGCCGCCGCGCTCGCCGGGGCCCAACTCCCGTACGACCGGGGCGTCTTGCGCCGCTTCCCGCACCAGTTCTCCGGCGGGCAGCGGCAGCGGGTCGCGCTGGCGCAGGTCCTGGCCTGCGGGCCGCGGGTCCTCGTCCTCGACGAACCGGGCACCGGTCTCGACGCGGTAACCCGGCTCGACCTGACCCGCGAACTCACCGCCCTCGCCGGTCAGGGCCTCGCCCTCCTCCTGCTCAGCCACGACCACGGCCTGGTCCGCGCGCTGGCCGACCGCGCCGTGCGCCTCGAAGCGGGCAGGGTGGCCGCCGAGGGCAGCCCCGCCGAGGTGCTGCCCCGCACCGCCCTGCCCGCGCCGCGCCCGCGCCCGCAGTCCGCACCGCCGGTGGCCGCCGCCGAAGGCCTGGAGGTCAGCGGGCTGCACGCCTGGCTGCGCCCCGGGGGCCGCGGCCGGGTGCTGCACGACATCGGCCTGCGGCTCGCCCCGGGCGGCTGCCTGGCGATCGCCGGGCGCTCCGGCAGCGGCAAGACCACCCTGGCCCGCTGCCTGGCCGGACTCCACGAGCGCCACAACGGCCAAGTCCACCTGGACGGCGTGAAGTTGGACGTCCTGCGCCGCCGGGGCACGGCACAGATCCGCCGGCTCCAGTACGTCTGGCAGGAGGCGAAGGGCTCCTTCGACCCGCGCCGCCCGGTGCTCGACCAGGTGGCCCGCACCGCCGTACGGCTGCGGGCGCTGAGCCCCGCCGCCGCCCGCGCGGAGGCCGCCGCCCTGCTCGACGAGCTGGGCGTGCCCGAGGAGACGGCCCGGCGCGGCCCCGGCGGGCTCTCCGGCGGCGAACTCCAGCGGGCCGCCTTCGCGCGCGCCGCACTGGCCCGGCCCCGGGTGCTGATCTGCGACGAGGTGACCAGCGCCCTGGACCCGGTGGCCGCCGCCCGGCTGCTCGCGGTGGCCGACCGGCTGCGCTCCGAGGGCACCGCCCTGCTCTGGATCAGCCACGAGCTGGGCCTCGTACGGCAGTTGGCCGAGCATCTGGTGATCCTCGACGCGGGCCGGGTGGCCGAGGCGGGGGAGTGCGCGGCGCTGCTCGCGGCACCCCGCTCGGCGGCGGGCCGGGAGCTGGTCGAGGCGGCGCTGAGCGGACAGGAACCGGCGGAAGAACCGGGTCCGGAGGCGGCGACGGTCCCCGGACCGGGCCCGCGACCGCTGGAGCAGGGATCAGGACGGGGACCAGCACAGGGATCAAGACAGGGATCAAAGCAGGGATCAGGAAAGGCCGTCCCGCGCTGA
所述转运蛋白的编码基因SLNHY_6652的序列如下(SEQ ID NO.8)：
TCATGCGGGTTCCTCCAGTTCTTCGCGGGCCGCCTCGCCCGGCGCGGTCACGGTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCCGTTGCCGTTGCCGTTGCCGTTGCCGTTGCCGTTGCCGGTGCCGGTGCGCGGGGCGGGCGGGGTGCCGGGTGCCCGTGTGCCGTCGTCGGGGCCGGTGGGGTCCTCGGGGCTGCGCGTGACCACGGCGCGGTACCGGGGGTCCTCGTGCAGGAGGGCGCGGTGGCTGCCCGTGGCGGTCACCTTGCCCTCGTGCACCAGGACGACCTCGTCCGCGCGGTCGAGGAGCAGCGGCGAGGAGGTGAGCACCACCGTGGTCCGGCCGGACCTGAGCGCGCGCAGCCCCTCGGCGATCCTGGCCTCGGTGTGCGAGTCGACCGCGGAGGTCGGCTCGTCCAGGACGAGCACCTCGGGATCGGTGAACAGCGAGCGGGCCAGGGCGAGCCGCTGGCGCTGGCCGCCGGAGAGGGACCGGCCGCGCTCGGTGAGGTGCGCCGCCATCGGCTCCGCGCCGTCGGCGGACTGCTGGGCCAGGGCGTCGAGTACGTCCGCGCACTCCGCCGCCGCCAGCGCCTCGGCCGTACCGACCGTCCCGGAGGCGGGCACCGCGAGGACCTCGCGCAGCGTCCCCGACAGGAGGACCGGGTCCTTGTCCTGGACGAGCACCAGGGTGCGGGCGGCCTCCAGCGAGAGATCGTCCAGCGGTACGGAGCCGAGCAGGACGGAGGGAGCGCTCCCGGCGTCCTGGGCCGCGTGGCCGCCGAGCCGGTCCGCCAGTCTCCCGGCGGCGTCCGGATCCCCGCAGACCACGGCGGTCAGCCGGCCCTGCCGGGCGAGGAGACCGCTCACGGGGTCGTACAGATCGCCGCGGGGGAGGGAGTCGGGGCGGAGCCCGCCCGGGTCCGTGTCGCGGGTGAGCGCCAGTACCCGGGCGGCCCGCTTGGCGGAGGGCCGGGAGAAGGAGTACGCCATGGCGATCTCCTCGAAGTGGCGCAGCGGGAAGTTGAGTAGCGTCACCGCGCTGTACACGCCGACCAGTTCGCCGACCGAGATCCGCCCCTGCCGGGCCAGGTGGACGCCCTGCCAGACCACGGCGATCAGCAGCAGCCCCGGCAGGAGCACCTGGACGGCGGCGATCAGCGACCACATCCGCGCGCTGCGCACGGCGGCTCCGCGCACCTCCTGGGAGGCGCCGCGGTACCGGTCGAGGAAGAGTTCCTCGCCGCCGATGCCGCGGAGGACCCGGAGTCCGGCGACGGTGTCGGAGGCCAGCTCGGTGGCGTATCCGGCCTTCTCCCGCTGGACGTCGGCGCGTTGGGTGGCCCTGGGGAGGAGGGGGAGCACGGCGAGCGCGACCACCGGGATGCCCAGGGCGACGATCCAGCCGAGGGAGGGCACCCAGACCACCAGGGCCACGCAGACGGTGAGGACCGTGAGGGCGGCGGCGCTGAAGCGGGAGAGCGCTTCGACGAACCAGCCGATCTTCTCGACGTCCCCGGTGGAGACCGCGACCACCTCCCCGGCGGCGACCCGCCGGGTCAGCGCGGAGCCGAGCAGCGCCGTCTTGCGGGCGAGGAGCTGCTGGACGCGGGCGGCGGTGGTGATCCAGTTGGTGACGGCCCTGCGGTGCAGCATCGTGTCGCCGAGCGCGATGGCCCCGCCGAAGAGGAAGAGCAGGCACCCGGCGAGGGCGAGCCGGGCGCCGGATCCGTCGAGCACCGCCTCGACCGCGTAGCCGGTCCCGTAGGACAGGGCCGCGATGGAGAGGAAGTGCAGCAGTCCCCAGCCCAGGGCCGCGAACTGGCCGCCGAGTTGCTGCCGTCCGAGCCACAGCAGGAAGCGCGGCCCCGAGCGTGCGTCCGGAGTACCGGGGTCGGCGAAGGGCAGGTCCTGGATGTTCATGAGGTCCCATGACTCGGAGAAGGGGGGAAGCGGGAGCCGGGGCGCGACCGGGTGGTCGGCGGACGGCGGACAGGGCGCGGGCGGCAC
作为本发明的一个实施方案，出发菌株为白色链霉菌BK 3-25。
第二方面，本发明提供了一种用于过量表达转运蛋白基因的整合型质粒载体，所述载体包含序列依次如SEQ ID NO.1-8所示的内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316、SLNHY_6652中的一种或几种。
第三方面，本发明提供一种用于过量表达转运蛋白基因的整合型质粒载体的构建方法，通过PCR扩增得到所述内源转运蛋白基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
具体构建步骤如下：
第一步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0929的整合型质粒载体I；
第二步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_1893的整合型质粒载体II；
第三步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_3363的整合型质粒载体III；
第四步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_4037的整合型质粒载体IV；
第五步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0199的整合型质粒载体V；
第六步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0818的整合型质粒载体VI；
第七步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_6316的整合型质粒载体VII；
第八步：设计并构建用于过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_6652的整合型质粒载体VIII；
第九步：将前八步构建得到的整合型质粒载体I-VIII通过接合转移导入受体菌BK3-25中进行位点特异性重组，并通过抗性和PCR验证筛选分别得到基因过量表达的重组突变株；如实施例中重组突变株LX-09、LX-10、LX-11、LX-12、LX-13、LX-14、LX-15和LX-16。
更具体的，通过PCR扩增得到1275bp的SLNHY_0929基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到1122bp的SLNHY_1893基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到990bp的SLNHY_3363基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到1062bp的SLNHY_4037基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到696bp的SLNHY_0199基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到1326bp的SLNHY_0818基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到1716bp的SLNHY_6316基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
通过PCR扩增得到2058bp的SLNHY_6652基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
第四方面，本发明提供一种盐霉素高产的白色链霉菌菌株，将前述的整合型质粒载体，或前述的方法构建得到的整合型质粒载体接合转移导入受体菌白色链霉菌中进行重组获得所述菌株。
第五方面，本发明还涉及一种增强转运蛋白基因的转录水平以提高盐霉素发酵水平的方法，通过增强内源转运蛋白基因的转录水平以提高白色链霉菌发酵生产盐霉素的产量。
作为本发明的一个实施方案，所述方法通过在白色链霉菌BK 3-25中过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652中的一种或几种，获得过量表达突变株；发酵，获得盐霉素。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵，其技术要点是，包括以下步骤：将活化后的转运蛋白基因过量表达突变株菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养48h；按10％接种量转接至二级种子培养基中，33℃、220rpm的转速下培养16h；按10％的接种量转接至发酵培养基中，33℃、220rpm的转速下发酵9d后收集发酵液并进行萃取。
作为本发明的一个实施方案，所述一级种子培养基包括TSB 3w/v％，酵母提取物0.5w/v％，蔗糖10.3w/v％。
作为本发明的一个实施方案，所述二级种子培养基包括黄豆饼粉3w/v％，酵母提取物1w/v％，CaCO3 0.2w/v％。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基包括胚芽粉0.8w/v％，黄豆饼粉0.5w/v％，KCl 0.22w/v％，NaCl 0.1w/v％，脲0.16w/v％，酒石酸0.2w/v％，MgSO4 0.01w/v％，K2HPO4 0.01w/v％，CaCO3 0.5w/v％，大豆油15w/v％。
本发明具有如下有益效果：
1)在白色链霉菌BK 3-25中，利用整合型载体pIB139，在BK 3-25染色体上分别插入一个拷贝、来源于白色链霉菌BK 3-25的转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316、SLNHY_6652，较对照菌株(空白载体整合菌株)分别提高57.66％、11.35％、69.75％、35.84％、10.94％、29.21％、7.20％和35.84％，实验室摇瓶水平分别达到22.85g/L、16.14g/L、24.60g/L、19.69g/L、16.08g/L、18.72g/L、15.54g/L和19.69g/L；可见通过本发明可显著提高盐霉素的发酵产量；
2)现有技术主要聚焦盐霉素生物合成基因簇内的转运蛋白基因(如slnTI和slnTII)，通过过表达两个基因的融合基因slnT，实现了盐霉素产量提升，但并不非常明显；而本发明聚焦盐霉素生物合成基因簇外的转运蛋白基因，分别单独过表达之后产量最高提升幅度达到69.75％，摇瓶发酵水平达到24.60g/L(BK3-25::SLNHY_3363即LX-11)。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为SLNHY_0929基因过量表达质粒构建示意图；
图2为SLNHY_1893基因过量表达质粒构建示意图；
图3为SLNHY_3363基因过量表达质粒构建示意图；
图4为SLNHY_4037基因过量表达质粒构建示意图；
图5为SLNHY_0199基因过量表达质粒构建示意图；
图6为SLNHY_0818基因过量表达质粒构建示意图；
图7为SLNHY_6316基因过量表达质粒构建示意图；
图8为SLNHY_6652基因过量表达质粒构建示意图；
图9为转运蛋白基因增强表达突变株与对照菌株盐霉素发酵产量示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
本发明所涉及的质粒pIB139已经在SCI数据库文献《Zhang XiaoJie,LuChenYang,BAI LinQuan*:Conversion of the high-yield salinomycin producerStreptomyces albus BK3-25 into a surrogate host for polyketideproduction.Science China Life Sciences 2017(9)：1000-1009》中记载。
本发明所涉及的菌株BK 3-25已在文献《Xiaojie Zhang,Chenyang Lu,LinquanBai*:Mechanism of salinomycin overproduction in Streptomyces albus asrevealed by comparative functional genomics.Appl Microbiol Biotechnol(2017)101:4635–4644》中记载。
实施例1
本实施例为制备转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652过量表达的突变株LX-09、LX-10、LX-11、LX-12、LX-13、LX-14、LX-15和LX-16的具体过程。具体包括以下步骤：
第一步：构建质粒pK-0929：如图1，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_0929-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_0929基因片段(1275bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-0929。
第二步：构建质粒pK-1893：如图2，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_1893-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_1893基因片段(1122bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-1893。
第三步：构建质粒pK-3363：如图3，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_3363-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_3363基因片段(990bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-3363。
第四步：构建质粒pK-4037：如图4，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_4037-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_4037基因片段(1062bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-4037。
第五步：构建质粒pK-0199：如图5，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_0199-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_0199基因片段(696bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-0199。
第六步：构建质粒pK-0818：如图6，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_0818-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_0818基因片段(1326bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-0818。
第七步：构建质粒pK-6316：如图7，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_6316-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_6316基因片段(1716bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-6316。
第八步：构建质粒pK-6652：如图8，以白色链霉菌BK 3-25基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物slnhy_6652-F/R，通过PCR扩增得到SLNHY_6652基因片段(2058bp)。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pK-6652。
上述第一至八步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下表1：
表1
Figure BDA0003335861490000131
第一至八步所用到的引物序列为：
表2
引物名称 碱基序列
slnhy_0929-F TATA CATATG ATGCAGACCAACTCCCCCTG SEQ ID NO.9
slnhy_0929-R TATA GAATTC TCAGGAATCGGCGGGTGCGG SEQ ID NO.10
slnhy_1893-F TATA CATATG ATGATCGAGCTCGAAGGGCT SEQ ID NO.11
slnhy_1893-R TATA GAATTC TCAGGCCCCCTTCCCGGGTC SEQ ID NO.12
slnhy_3363-F TATA CATATG ATGAGCCACGCAGCCACCAC SEQ ID NO.13
slnhy_3363-R TATA GAATTC TCAGCGACCGGACTGCGGGG SEQ ID NO.14
slnhy_4037-F TATA CATATG GTGGCCGTGACCGCCGCGCT SEQ ID NO.15
slnhy_4037-R TATA GAATTC CTACTTGATGGCGGTCAGCA SEQ ID NO.16
slnhy_0199-F TATA CATATG TCACAGGGACACCTCCTTGC SEQ ID NO.17
slnhy_0199-R TATA GAATTC GTGGTTTTCGCCATCGGTTT SEQ ID NO.18
slnhy_0818-F TATA CATATG TCAGGCGCGTCCCGCGGTCT SEQ ID NO.19
slnhy_0818-R TATA GAATTC GCGATGAGCGACCTCGCCAASEQ ID NO.20
slnhy_6316-F TATA CATATG GTGAGCGCGCCGACCGAGGA SEQ ID NO.21
slnhy_6316-R TATA GAATTC TCAGCGCGGGACGGCCTTTC SEQ ID NO.22
slnhy_6652-F TATA CATATG TCATGCGGGTTCCTCCAGTT SEQ ID NO.23
slnhy_6652-R TATA GAATTC CCCCTTCCGTGCCGCCCGCG SEQ ID NO.24
第一至八步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：
PCR反应体系：DNA模板50ng，引物50pmol，50％DMSO 5μL，dNTP 1μL，缓冲液25μL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至50μL；
PCR条件：95℃ 5min；95℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 1-2min；循环30次；72℃ 10min。
第九步：将第一至八步构建得到的过量表达的质粒载体pK-0929、pK-1893、pK-3363、pK-4037、pK-0199、pK-0818、pK-6316和pK-6652通过接合转移导入受体菌BK 3-25中进行位点特异性重组，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652基因过量表达的突变株。具体包括以下步骤：
将基因过量表达的质粒pK-0929、pK-1893、pK-3363、pK-4037、pK-0199、pK-0818、pK-6316和pK-6652分别转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中。将对应ET12567(pUZ8002)接种于含有1‰浓度Apr、Kan和Chl三种抗生素的LB中，37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养2.5h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时刮取BK 3-25新鲜平板的孢子，用TES漂洗一遍，重悬后在50℃热激10min，加入相同体积的2*YT和终浓度为5mmol/L的CaCl2，在37℃条件下预萌发2.5h，用LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的ISP4固体培养基上，于30℃培养箱倒置培养。16h后取出平板，分别将阿泊拉霉素(终浓度100μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度100μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在ISP4固体培养基上，将固体培养基晾干后在30℃培养箱中倒置培养。一般3～5d后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有100μg/mL阿泊拉霉素和100μg/mL甲氧苄啶两种抗生素的ISP4固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652基因加倍的突变株。
上述第九步中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：
PCR体系：DNA模板10～100ng，引物(表2)20pmol，50％DMSO 2μL，2*Mix10μL，加纯水补齐至20μL；
PCR条件：95℃ 5min；95℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 1-2min；循环30次；72℃ 10min。
实施例2
本实施例为利用转运蛋白基因过量表达的突变株LX-09、LX-10、LX-11、LX-12、LX-13、LX-14、LX-15和LX-16发酵产生盐霉素的过程。具体步骤如下：将转运蛋白基因过量表达的菌株LX-09、LX-10、LX-11、LX-12、LX-13、LX-14、LX-15和LX-16分别涂布于固体ISP4培养基上活化，30℃培养2d后，分别挑取1cm2菌块接种至一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养48h；按10％接种量转接至二级种子培养基中，33℃、220rpm条件下培养16h；按10％的接种量转接至发酵培养基，33℃、220rpm条件下发酵，发酵9d后收集发酵液进行萃取和化合物检测。
表3种子培养基及发酵培养基的成分构成
Figure BDA0003335861490000151
实施例3
本实施例为利用HPLC检测盐霉素的发酵产量的方法。具体为：采用安捷伦公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，并采用DAD紫外吸收检测器测定210nm下的色谱吸收峰。
其中，HPLC参数如下：
色谱柱：Agilent TC-18,2.1×150mm,5μm；
流动相流速：1mL/min；
流动相：2％乙酸水溶液和HPLC级乙腈梯度洗脱。
柱温：室温。
图9为转运蛋白基因增强表达突变株与对照菌株盐霉素发酵产量示意图。结果表明突变株的产量对比野生型菌株分别提高57.66％、11.35％、69.75％、35.84％、10.94％、29.21％、7.20％和35.84％，实验室摇瓶水平分别达到22.85g/L、16.14g/L、24.60g/L、19.69g/L、16.08g/L、18.72g/L、15.54g/L和19.69g/L。
综上所述，本发明通过在白色链霉菌BK 3-25中，分别过量表达内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652，得到高产盐霉素的突变株LX-09、LX-10、LX-11、LX-12、LX-13、LX-14、LX-15和LX-16。增强转运蛋白基因的转录水平可以提高盐霉素的外排效率、降低其胞内毒性、解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高盐霉素产量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 增强转运蛋白基因的表达以提高盐霉素发酵水平的方法
<130> KAG48112
<141> 2021-11-02
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1275
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 1
atgcagacca actccccctg gcggataccc gacttccgca cgctgttcac cgcgaccacc 60
ctcagccagc tcgccaccaa catcggctat gtcgcggtac cgctgatcgc ggtcaccgaa 120
ctcgacgcca gccccggcga ggtgggcgcg ctcgccaccc tcagcaccgt cgccttcctg 180
ctcatcgggc tgcccgcggg cgcctgggtg gaccggatgc ggcaccgcag ggtgctgatc 240
gcggccgacc tgaccagggc ggccctgttc gtctcgctgc cgatcgcctg gtggctggac 300
tcgctcaccc tcggacagct ctacgccgtg gtgctcttca acggctgcgc caccgtcttc 360
ttcgacgtcg gctcgcagag cgtgctgccc caactggtcg gcaaggaagg cctggtgcag 420
gccaacgccg ccgtcatgac gctcatcgcg gcgggcaacg tcgcgggccg cggcgcgggc 480
ggcggcttcg tccagctgct caccgcgccg gtcgcggtcg ccttcaccgc gggcagctac 540
ctcgcctccg ggctgcggct gaccggcatc cgccacactc ccccgccgcc tccgccgccg 600
tccggcgcgg ccgtcacgct acgcgcgcag atcgccgagg gcgtacggca cgtcttccgc 660
aacgcggagc tgcgggccct ggcgctgacc gccgccttca ccaacctcgg ctcgcagatc 720
atcaacacca tgctgccggt gctcttcgtc cgcgaactcg acctgcccgc aggcgccttg 780
ggcctgttct gggcggcggg cggcgccggg ctcctcgccg gagcgcgctg tgcgcggccc 840
atcgcgggac ggctcggcta cggccgcacg ctcggtctcg ccgggctctg catggccccg 900
gccgggctgc tcatcccgct ggtcgaccgc ggaggatggc tgtatctcgc cggtgcgggc 960
tacctgctcg cgatgttcaa gaccggaatg gacaacgttc tcggagtcag cctgcgccag 1020
cgcatgacgg cgagttccct gctcgggcgg atgaacgcca ccttccgctt catgctgacc 1080
ggcgccctcg cggtcggctc ggccgtggcc ggcgccatcg gtgaactcac cagcgtgcac 1140
accaccttgt gggtgggcgg cgtgatcctc tcgctcgcct tcctgccggt cttcctgtcc 1200
cccgtgcggg ggcgccgcga acttcccgaa caacaggagg aggtcgtgcg caaatccgca 1260
cccgccgatt cctga 1275
<210> 2
<211> 1122
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 2
atgatcgagc tcgaagggct gaccaagcgc tacggcgaga agatggccgt cgacaatctg 60
accttcacgg tgcggccggg catcgtgacc gggttcctcg gcccgaacgg cgcgggcaag 120
tcgaccacca tgcggatgat gctgggcctg gaccggccga cctccggtga cgtccgcatc 180
gacggcaccc actacgaccg cctcaaggaa cccctcaagg acatcggggc gctcctggac 240
gccaaggcga tgcacggcgg gcgcagcgcc taccaccatc tgctgtgcct ggcgcagtcc 300
aacggcatcc ccagcagccg ggtgcacgag gtgctggaca cggtcgggtt gacggcggtg 360
gcgaagaaga aggccaaggg cttctcgctc ggcatgggcc agcggctggg gatcgcgggc 420
gcgctgctcg gcgatccgcg gatcctgatg ttcgacgagc cggtcaacgg cctggatccc 480
gagggcatcc actggatccg caatctgatg aagtcccttg ccgcgcaggg ccgtacggtc 540
ttcgtctcct cgcatctgat gagcgagatg gcgctgaccg ccgaccacct ggtcgtgatc 600
gggcagggcc gcctgctggc ggacacctcg atggcggact tcatccggga gaactcccgc 660
tcctacgtac ggctgcgcag cccgcagcgc gagcagctcc tcgatgtgct gcaccgggag 720
aacatcgcgg tcctcaccaa ggacgacggg gcgctggaag tggacggcac cggagccgac 780
cggctcggcg agctggccgc cgcccaccgc ctggtcctgc acgaactcag cccgcagcag 840
gcctcgttgg aagaggcgtt catgcaactc accgccgaat cggtcgaata ccacgcccac 900
accggacccg gcggcatcgg aagcccaccc cccggcggcc tcccgcccgg cggcccgccg 960
cagcagccgt atcctgtcgg cgccccgggg gcacccggcg acgggagcca gggcctgccg 1020
accgctcccc cgcccggcgg cgcgcaggcg ccgccaccgg cgagcggtcc gggaagcccc 1080
ggctggggcc aaggctggca gcgacccggg aagggggcct ga 1122
<210> 3
<211> 990
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 3
ctacttgatg gcggtcagca gcggcaggat ctcgtcgatc gcgtacggga tcgacaggac 60
ggtgttgaag gagaaggccg cgccgatgtc ggggccctgg tagggcacga acaggtcgcg 120
cttttcctgg tggaccttca gcttcttgta gagcgcctcg ccctggatgc gctcgtcggc 180
ctcggtgctg gaggtgaccc agaccagccg gtcggtgtcc aggacgctca gcttctcggc 240
gctcaactcg gcggcgttca tgccgggttg ggcgagcttg tcgacctcgg gcttgagctt 300
gaagccgaac tcctcgaaga agatcgcctt cgggtcggtc ttggtgaagg cgctgtactt 360
gcccgcctcg aagctgtccg cgacggccag cgtcatcttg gcgaactcgg ggtgctcggt 420
gcgcaccttc ttgaaccgcg cgtcgatgcc cttgatcagc ttctcggtct cggcgtcctt 480
gccgagcgac ttgccgatct gacgggtcat caccttccag ggggcggcgt agtccgggtg 540
ccccttgggc tgcgcgacga ccttggtgaa cttggagagc gtctcgtact gctccttctt 600
catgccggag tactgggcga tgaccaggtc cggcttgagg gaggcgatct tctccatgtt 660
gaactcgtcg cgctcgccga cgatctgcgg tgtctcggag ccccacttcg ccttggtcca 720
gggccacttg ccgtacgggc gctccttgaa ccagtccacc gagccgaccg gcttgatgcc 780
gagcgcgagc acggtgtcct ggtccgagag gccgagggtg acgaccttct ccggcgcctt 840
gtcgatcttc gtggagccgt acttgtgctc cacggtgacc gggaaggccc ccgaactgga 900
gccgcccttg gggtccttgg acccctcgga gccggagtcg tcggagccgc ccccgcaggc 960
ggtcagcgcg agcgcggcgg tcacggccac 990
<210> 4
<211> 1062
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 4
tcagcgaccg gactgcgggg ccttccagcg ggcgatgccg cgggccacca ggttgaggat 60
catgacgaag gcgatgagcg cgagcgaggc ggcccaggcc cggtcgtagg cggcgccgct 120
gccggagctg ttcgcgtact gctggtagat gtacagcggc agcgaggcct gctccccctc 180
gaaggggttg gtgttgatga agctgttgcc ccacaccagg agcaggaccg gcgcggtctc 240
gccggtgatg cgcgcgaccg ccagcatgac gcccgtggtg atgccgccga tcgaggtcgg 300
gacgaccacc ttgaggatgg tgcgccactt gggcacgccg agcgcgaggc tggcctcccg 360
cagctcgttc gggacgagct tgagcatctc ctcggtggag cgcacgatca ccgggatcat 420
caggatcgac agggcgagcg agccggcgaa gccggagaag tcgaagccga ggatcaggat 480
ccagaagctg aggacgaaca ggcccgcgac gatcgagggc acgcccgtca tcacgtcgac 540
gaagaaggtg acggccttgg cgagcctgcc gcgcccgtac tccaccaggt agatggcggt 600
gaacaggccg agcggcacgg acatcacggt ggcgaggccg acctgctcca gggtgccgat 660
gatggcgtgg tagatgccgc cgccgggctc ggtgtcggcg accacgccca tcgagtggcc 720
gaggaagtag ccgtcgaaga ccttggcgcc gcgcttgacc gtctcgtaga ggagggaggc 780
gagcgggatc acggcgagga cgaaggtgac ccagacgacg ctggtggcga cccggtcctt 840
ggcctggcgg cggccctcga cggcggcggc cgcggtgtag gtgatcacca cgaagagcag 900
ggcggcgatc agtccccact ggaccgtgtt gccgagaccg gcgagcaggc cgatgccgga 960
gccgagcagg accgagagca gggcgatgcc ccaggcggag ccgcgcggca ggcgggcggt 1020
cttcagggtc cccgggcgcg gggtggtggc tgcgtggctc at 1062
<210> 5
<211> 1062
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 5
tcagcgaccg gactgcgggg ccttccagcg ggcgatgccg cgggccacca ggttgaggat 60
catgacgaag gcgatgagcg cgagcgaggc ggcccaggcc cggtcgtagg cggcgccgct 120
gccggagctg ttcgcgtact gctggtagat gtacagcggc agcgaggcct gctccccctc 180
gaaggggttg gtgttgatga agctgttgcc ccacaccagg agcaggaccg gcgcggtctc 240
gccggtgatg cgcgcgaccg ccagcatgac gcccgtggtg atgccgccga tcgaggtcgg 300
gacgaccacc ttgaggatgg tgcgccactt gggcacgccg agcgcgaggc tggcctcccg 360
cagctcgttc gggacgagct tgagcatctc ctcggtggag cgcacgatca ccgggatcat 420
caggatcgac agggcgagcg agccggcgaa gccggagaag tcgaagccga ggatcaggat 480
ccagaagctg aggacgaaca ggcccgcgac gatcgagggc acgcccgtca tcacgtcgac 540
gaagaaggtg acggccttgg cgagcctgcc gcgcccgtac tccaccaggt agatggcggt 600
gaacaggccg agcggcacgg acatcacggt ggcgaggccg acctgctcca gggtgccgat 660
gatggcgtgg tagatgccgc cgccgggctc ggtgtcggcg accacgccca tcgagtggcc 720
gaggaagtag ccgtcgaaga ccttggcgcc gcgcttgacc gtctcgtaga ggagggaggc 780
gagcgggatc acggcgagga cgaaggtgac ccagacgacg ctggtggcga cccggtcctt 840
ggcctggcgg cggccctcga cggcggcggc cgcggtgtag gtgatcacca cgaagagcag 900
ggcggcgatc agtccccact ggaccgtgtt gccgagaccg gcgagcaggc cgatgccgga 960
gccgagcagg accgagagca gggcgatgcc ccaggcggag ccgcgcggca ggcgggcggt 1020
cttcagggtc cccgggcgcg gggtggtggc tgcgtggctc at 1062
<210> 6
<211> 1326
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 6
tcaggcgcgt cccgcggtct tctgcgtgcg gcgggagacc gagtcgatga cgacggcggc 60
gagcagcacc gcgccggtga tcatgtactg gatctcgctc gccatgccga gcaggttcag 120
gccctgctgg atggactgca gcacgagcat gccgagcagg gccgaccaga ccttgccccg 180
gccgccgaag aggctggtgc cgccgatcac ggccgccgcg atgaccagca tcagggtgtt 240
gccggagccg aggttcttgg tggcgccgcc ggcggtgctg gcgatgaaca ggccgccgaa 300
ggcggcgagc atcccggaga tgccgaagac ggcgatccgg atcatgtcga cgttgatacc 360
ggcgcggcgg gccgcctcgg cgttgccgcc gaccgcgaag accttgcggc cgaaggtggt 420
gcgccgggcg acgaagtcgg cgatcaccag gaccgcgagg aagagcacca gggcgagcgg 480
caggccgcgg gcgccctccg gctcgttcag ctcgtaggcg acgacgaagg agatcaccgc 540
gacgacggcg gtgcgcagca cgatctcgct gaccgggcgg gagggcaggt cggcggcgcg 600
gcggcggcgg gtctcccaca gcagcgaggc cgcgtaggcg aggacggcga cgagggcgac 660
cccgtagccg acggccttgt cggcgaagta gtggctggtg aggttctcga cgatgctgcc 720
ctcgggcgtg ttgatgctgc cctcggagcc catcagccag atctgcagtc cgctccagcc 780
gaggaagccc gcgagggtga ccacgaaggc gggcacgccg accttggcga agaagacgcc 840
gtgcagggcg ccgatgacca gtccgcagac gaccgcgaag agcaccgcgg tccagtcgct 900
ccagccgtgg ttgacgctga gcaccgccca gatcgcggcg ccgagtccgg ccaccgagcc 960
gaccgagagg tcgatctcgc cgagcagcag gacgaagacg atgccgacgg ccatgatgcc 1020
gaggccggag gtgaagacgg cgatgttggc gaggctgctc gccgacagga agctgtcgtt 1080
cttcgcctgg aagatgatcg cgatgacgat caggcccacc accacgggca gcgagccgag 1140
ttcaccgccg cggatcttgc ggacgaactc ggtcccgtag cccttgaggc cctgctcgcg 1200
cacgagcagg cgcgggtcca cggcggggat gggcgccgcc gatcccccgg cggccgggtc 1260
ggccgggtcc ttcaccgcgg tggcggtctc ctgcggctgc gcggagttct tggcgaggtc 1320
gctcat 1326
<210> 7
<211> 1716
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 7
gtgagcgcgc cgaccgagga gttgaccggg gagccgaccg gccgggaccc gctggtcgag 60
gtccgcgggc tcaccgcgcg cgccggggac cgactcctcc tcgacggggt cgacctgcgg 120
ctggcggccg gccgtgtcac cgcgctggtc gggccctccg gcagcggcaa gaccaccacc 180
gcgctcgccc tgctcggcga gtacgaaccg ggagtgcgcc tgagcggtga gatcaccgtc 240
gcgggcgtcc ccgtgctcgg ccccggcggc gtcacggacc gcgccgccga ggtgcgcggc 300
ggcaccctcg cgtatatgcc gcagcacccc ggcagcgcgc tcaacccggc ccggcgcacc 360
ggcgccgtgc tcaccgaact cgcccggctg caccgcccgg agccgggacg cacccccgcc 420
gagtcggccg ccgccgcgct cgccggggcc caactcccgt acgaccgggg cgtcttgcgc 480
cgcttcccgc accagttctc cggcgggcag cggcagcggg tcgcgctggc gcaggtcctg 540
gcctgcgggc cgcgggtcct cgtcctcgac gaaccgggca ccggtctcga cgcggtaacc 600
cggctcgacc tgacccgcga actcaccgcc ctcgccggtc agggcctcgc cctcctcctg 660
ctcagccacg accacggcct ggtccgcgcg ctggccgacc gcgccgtgcg cctcgaagcg 720
ggcagggtgg ccgccgaggg cagccccgcc gaggtgctgc cccgcaccgc cctgcccgcg 780
ccgcgcccgc gcccgcagtc cgcaccgccg gtggccgccg ccgaaggcct ggaggtcagc 840
gggctgcacg cctggctgcg ccccgggggc cgcggccggg tgctgcacga catcggcctg 900
cggctcgccc cgggcggctg cctggcgatc gccgggcgct ccggcagcgg caagaccacc 960
ctggcccgct gcctggccgg actccacgag cgccacaacg gccaagtcca cctggacggc 1020
gtgaagttgg acgtcctgcg ccgccggggc acggcacaga tccgccggct ccagtacgtc 1080
tggcaggagg cgaagggctc cttcgacccg cgccgcccgg tgctcgacca ggtggcccgc 1140
accgccgtac ggctgcgggc gctgagcccc gccgccgccc gcgcggaggc cgccgccctg 1200
ctcgacgagc tgggcgtgcc cgaggagacg gcccggcgcg gccccggcgg gctctccggc 1260
ggcgaactcc agcgggccgc cttcgcgcgc gccgcactgg cccggccccg ggtgctgatc 1320
tgcgacgagg tgaccagcgc cctggacccg gtggccgccg cccggctgct cgcggtggcc 1380
gaccggctgc gctccgaggg caccgccctg ctctggatca gccacgagct gggcctcgta 1440
cggcagttgg ccgagcatct ggtgatcctc gacgcgggcc gggtggccga ggcgggggag 1500
tgcgcggcgc tgctcgcggc accccgctcg gcggcgggcc gggagctggt cgaggcggcg 1560
ctgagcggac aggaaccggc ggaagaaccg ggtccggagg cggcgacggt ccccggaccg 1620
ggcccgcgac cgctggagca gggatcagga cggggaccag cacagggatc aagacaggga 1680
tcaaagcagg gatcaggaaa ggccgtcccg cgctga 1716
<210> 8
<211> 2058
<212> DNA
<213> Streptomyces albus BK3-25
<400> 8
tcatgcgggt tcctccagtt cttcgcgggc cgcctcgccc ggcgcggtca cggtggtgct 60
ggtgctggtg ctggtgctgg tgctggtgct ggtgctggtg ctggtgctgg tgctggtgct 120
ggtgctggtg ccgttgccgt tgccgttgcc gttgccgttg ccgttgccgg tgccggtgcg 180
cggggcgggc ggggtgccgg gtgcccgtgt gccgtcgtcg gggccggtgg ggtcctcggg 240
gctgcgcgtg accacggcgc ggtaccgggg gtcctcgtgc aggagggcgc ggtggctgcc 300
cgtggcggtc accttgccct cgtgcaccag gacgacctcg tccgcgcggt cgaggagcag 360
cggcgaggag gtgagcacca ccgtggtccg gccggacctg agcgcgcgca gcccctcggc 420
gatcctggcc tcggtgtgcg agtcgaccgc ggaggtcggc tcgtccagga cgagcacctc 480
gggatcggtg aacagcgagc gggccagggc gagccgctgg cgctggccgc cggagaggga 540
ccggccgcgc tcggtgaggt gcgccgccat cggctccgcg ccgtcggcgg actgctgggc 600
cagggcgtcg agtacgtccg cgcactccgc cgccgccagc gcctcggccg taccgaccgt 660
cccggaggcg ggcaccgcga ggacctcgcg cagcgtcccc gacaggagga ccgggtcctt 720
gtcctggacg agcaccaggg tgcgggcggc ctccagcgag agatcgtcca gcggtacgga 780
gccgagcagg acggagggag cgctcccggc gtcctgggcc gcgtggccgc cgagccggtc 840
cgccagtctc ccggcggcgt ccggatcccc gcagaccacg gcggtcagcc ggccctgccg 900
ggcgaggaga ccgctcacgg ggtcgtacag atcgccgcgg gggagggagt cggggcggag 960
cccgcccggg tccgtgtcgc gggtgagcgc cagtacccgg gcggcccgct tggcggaggg 1020
ccgggagaag gagtacgcca tggcgatctc ctcgaagtgg cgcagcggga agttgagtag 1080
cgtcaccgcg ctgtacacgc cgaccagttc gccgaccgag atccgcccct gccgggccag 1140
gtggacgccc tgccagacca cggcgatcag cagcagcccc ggcaggagca cctggacggc 1200
ggcgatcagc gaccacatcc gcgcgctgcg cacggcggct ccgcgcacct cctgggaggc 1260
gccgcggtac cggtcgagga agagttcctc gccgccgatg ccgcggagga cccggagtcc 1320
ggcgacggtg tcggaggcca gctcggtggc gtatccggcc ttctcccgct ggacgtcggc 1380
gcgttgggtg gccctgggga ggagggggag cacggcgagc gcgaccaccg ggatgcccag 1440
ggcgacgatc cagccgaggg agggcaccca gaccaccagg gccacgcaga cggtgaggac 1500
cgtgagggcg gcggcgctga agcgggagag cgcttcgacg aaccagccga tcttctcgac 1560
gtccccggtg gagaccgcga ccacctcccc ggcggcgacc cgccgggtca gcgcggagcc 1620
gagcagcgcc gtcttgcggg cgaggagctg ctggacgcgg gcggcggtgg tgatccagtt 1680
ggtgacggcc ctgcggtgca gcatcgtgtc gccgagcgcg atggccccgc cgaagaggaa 1740
gagcaggcac ccggcgaggg cgagccgggc gccggatccg tcgagcaccg cctcgaccgc 1800
gtagccggtc ccgtaggaca gggccgcgat ggagaggaag tgcagcagtc cccagcccag 1860
ggccgcgaac tggccgccga gttgctgccg tccgagccac agcaggaagc gcggccccga 1920
gcgtgcgtcc ggagtaccgg ggtcggcgaa gggcaggtcc tggatgttca tgaggtccca 1980
tgactcggag aaggggggaa gcgggagccg gggcgcgacc gggtggtcgg cggacggcgg 2040
acagggcgcg ggcggcac 2058
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tatacatatg atgcagacca actccccctg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tatagaattc tcaggaatcg gcgggtgcgg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tatacatatg atgatcgagc tcgaagggct 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tatacatatg atgatcgagc tcgaagggct 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tatacatatg atgagccacg cagccaccac 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tatagaattc tcagcgaccg gactgcgggg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tatacatatg gtggccgtga ccgccgcgct 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 16
tatagaattc ctacttgatg gcggtcagca 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 17
tatacatatg tcacagggac acctccttgc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 18
tatagaattc gtggttttcg ccatcggttt 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 19
tatacatatg tcaggcgcgt cccgcggtct 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 20
tatagaattc gcgatgagcg acctcgccaa 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 21
tatacatatg gtgagcgcgc cgaccgagga 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 22
tatagaattc tcagcgcggg acggcctttc 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 23
tatacatatg tcatgcgggt tcctccagtt 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artioposthia triangulata
<400> 24
tatagaattc ccccttccgt gccgcccgcg 30

Claims (6)

1.一种盐霉素高产菌株，其特征在于，所述菌株的盐霉素生物合成基因簇外的转运蛋白基因过量表达；所述菌株由白色链霉菌BK 3-25过量表达序列依次如SEQ ID NO.1-8所示的内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316、SLNHY_6652中的一种或几种构建而得。
2.一种盐霉素高产的白色链霉菌菌株，其特征在于，将用于过量表达转运蛋白基因的整合型质粒载体接合转移导入受体菌白色链霉菌BK 3-25中进行重组获得所述菌株；所述载体包含序列依次如SEQ ID NO.1-8所示的内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316、SLNHY_6652中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的盐霉素高产的白色链霉菌菌株，其特征在于，所述整合型质粒载体的构建方法是通过PCR扩增得到所述内源转运蛋白基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点。
4.一种增强转运蛋白基因的转录水平以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于，通过增强内源转运蛋白基因的转录水平以提高白色链霉菌发酵生产盐霉素的产量；具体是通过在白色链霉菌BK 3-25中过量表达序列依次如SEQ ID NO.1-8所示的内源转运蛋白基因SLNHY_0929、SLNHY_1893、SLNHY_3363、SLNHY_4037、SLNHY_0199、SLNHY_0818、SLNHY_6316和SLNHY_6652中的一种或几种，获得过量表达突变株；发酵，获得盐霉素。
5.如权利要求4所述的增强转运蛋白基因的转录水平以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述发酵包括以下步骤：将活化后的转运蛋白基因过量表达突变株菌丝体接种于一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养48h；按10％接种量转接至二级种子培养基中，33℃、220rpm的转速下培养16h；按10％的接种量转接至发酵培养基中，33℃、220rpm的转速下发酵9d后收集发酵液并进行萃取。
6.如权利要求5所述的增强转运蛋白基因的转录水平以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于，
所述一级种子培养基包括TSB 3w/v％，酵母提取物0.5w/v％和蔗糖10.3w/v％；
所述二级种子培养基包括黄豆饼粉3w/v％，酵母提取物1w/v％和CaCO3 0.2w/v％；
所述发酵培养基包括胚芽粉0.8w/v％，黄豆饼粉0.5w/v％，KCl 0.22w/v％，NaCl0.1w/v％，脲0.16w/v％，酒石酸0.2w/v％，MgSO4 0.01w/v％，K2HPO4 0.01w/v％，CaCO30.5w/v％和大豆油15w/v％。
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