CN116445515B - 一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇及其应用，该基因簇共包括bkdA2，bkdB2，bkdC2三个结构基因以及一个bkdR转录调控基因。敲除毒三素链霉菌中所述基因簇任意一个或多个基因，可显著提高结构类似物RRT0.90的发酵水平。增强转录调控基因bkdR的表达，则可有效提高利普斯他汀的发酵效价。本发明为深入研究利普斯他汀及其结构类物的生物合成机理提供了直接依据，为开发更有效的奥利司他衍生物奠定了基础。本发明构建的利普斯他汀工程菌株能直接应用于奥利司他的发酵生产，可降低生产成本，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物基因资源挖掘与遗传育种领域，具体涉及毒三素链霉中与利普斯他汀及其结构类似物合成有关的支链α酮酸脱氢酶复合物编码基因簇及其应用。
背景技术
利普斯他汀是由毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)发酵产生的一种特异性肠胃道脂肪酶抑制剂，其分子结构中含有两个脂肪酸长链、一个反式中心β内酯环和一个氨基酸侧链。利普斯他汀的氢化还原产物奥利司他化学性质更加稳定，由罗氏公司开发成体重控制药物于1999年获批上市，至今已有超过20年的安全有效使用历史，是目前全球唯一的OTC减重药和非中枢神经作用减重药，也是唯一可用于12岁以上青少年肥胖症治疗的减重药。
利普斯他汀作为微生物次级代谢产物，在发酵过程中会产生一些与其结构和理化性质相近的结构类似物，现已报道的大多数利普斯他汀结构类似物均具有相同的天然β内酯骨架结构，仅在脂肪酸长链上有所不同，主要表现在其两条长链脂肪酸中含有一条末端单甲基化的异式或反异式脂肪酸，甲基位于脂肪酸分子碳链骨架倒数第2个或第3个碳原子上，形成脂肪酸支链。本发明的申请人在前期研究中发现并鉴定了一种结构新颖的利普斯他汀结构类似物RRT0.90(HPLC图谱中与利普斯他汀的相对保留时间为0.90)，与利普斯他汀具有相同的β内酯骨架和脂肪酸长链，唯一不同点为两种化合物骨架上酯键连接的氨基酸不同，其中利普斯他汀为甲酰化亮氨酸，RRT0.90则为甲酰化苯丙氨酸。
含有β内酯结构的天然产物比较少见且具有良好的生物活性，按来源不同可分为萜类β内酯、脂肪酸和聚酮类β内酯、α-氨基-β内酯三类。脂肪酸和聚酮类β内酯化合物具有良好的脂肪酶抑制活性，利普斯他汀作为其典型代表已被开发成药。但利普斯他汀结构类似物在毒三素链霉菌发酵液中的含量极低，难以提取和制备，大大限制了对其深入研究和开发应用。利普斯他汀的生物合成已有大量的研究，但其完整的生物合成途径仍未完全阐明，有关利普斯他汀结构类似物的形成机制研究报道很少，而有关其结构类似物RRT0.90的形成机制未见任何报道。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，以利普斯他汀发酵过程中产生的RRT0.90结构类似物为目标分子，对利普斯他汀产生菌进行了全基因组测序、基因组再分析和代谢网络重构，在染色体上发现了并鉴定了与利普斯他汀及其结构类似物RRT0.90形成有关的支链α酮酸脱氢酶编码基因簇bkdA2B2C2。所述基因簇包含bkdA2，bkdB2和bkdC2三个结构基因和一个Lrp/AsnC转录调控基因bkdR。所述基因簇的结构示意图如附图1所示。
其中，所述基因bkdA2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
所述基因bkdB2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
所述基因bkdC2，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
所述基因bkdR，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明的目的之一在于提供一种敲除毒三素链霉菌中所述基因簇任意一个或多个基因以显著提高利普斯他汀结构类似物RRT0.90发酵水平的方法。通过敲除所述基因簇中的bkdA2基因，bkdB2基因，bkdC2基因和bkdR基因中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因，可显著提高RRT0.90的发酵水平。
本发明的目的之二在于提供一种增强转录调控基因bkdR的表达以提高利普斯他汀发酵效价的方法。通过利用强启动子和增加基因拷贝数，在毒三素链霉菌中增强表达转录调控基因bkdR，可有效提高利普斯他汀的发酵效价。
本发明所述的毒三素链霉菌，包括但不限于本申请人公开发表的文献[李辉，方志锴，郭霞凌.利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA的全基因组测序与分析[J]，中国抗生素杂志，2022(1)：28-34]中记载的毒三素链霉菌AP617-N12CA。
本发明所述的提高结构类似物RRT0.90发酵水平的工程菌株构建方法，包括如下步骤：
1)目的基因敲除质粒的构建：以毒三素链霉菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得目的基因的同源重组左臂片段和右臂片段，将左臂片段和右臂片段插入到温敏型穿梭质粒pKC1139多克隆位点上，获得目的基因敲除质粒；
2)目的基因敲除质粒的接合转移：将目的基因敲除质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，通过属间接合转移导入毒三素链霉菌，通过安普霉素和萘啶酮酸抗性筛选发生第一次同源重组使敲除质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株。
3)目的基因敲除突变株的筛选与鉴定：将单交换菌株在不添加抗生素的斜面培养基上松弛传代后分离单菌落，同时影印到添加安普霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上，筛选在普通平板上生长而在抗性平板上不生长的安普霉素敏感型双交换突变株。然后通过同源重组模型设计特定引物，利用PCR方法对敏感菌株进行测序和筛选，最终得到基因缺失的双交换突变株。
4)目的基因敲除突变株的发酵与产物分析：将出发菌株和目的基因敲除图突变株分别进行发酵，分离纯化发酵液，同批次进行HPLC分析发酵产物变化情况。
所述目的基因为前述bkdA2基因，bkdB2基因，bkdC2基因和bkdR基因中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因。基因bkdA2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。基因bkdB2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。基因bkdC2，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。基因bkdR，其核苷酸序列如SEQID No.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明所述的提升利普斯他汀发酵效价的工程菌株构建方法，包括如下步骤：
1)整合型表达载体构建：以毒三素链霉菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到所述转录调控基因片段，通过酶切酶连的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/XbaI位点，得到整合型表达质粒pIB139-bkdR，pIB139-bkdR包含有红霉素抗性基因强启动子PermE*以及完整的bkdR基因，还含有质粒转移所需原件和及噬菌体的整合酶和整合位点。
2)接合转移与强化表达菌株筛选：将所述整合型表达质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，通过属间接合转移导入毒三素链霉菌，通过安普霉素抗性筛选整个pIB139-bkdR载体特异性整合进入毒三素链霉菌染色体的重组强化表达菌株。
所述的转录调控基因为前述的bkdR基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明所述基因簇的应用，是指通过对所述基因簇中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因进行敲除构建得到的工程菌，以及对所述基因簇中的转录调控基因进行强化表达构建的工程菌，在适用于利普斯他汀产生的条件下进行发酵培养，用于生产或制备利普斯他汀或其结构类似物RRT0.90。将工程菌依次经摇瓶种子培养、种子扩大培养和发酵培养基培养后生产或制备利普斯他汀或其结构类似物RRT0.90，发酵产物经分离纯化后可进一步合成奥利司他或其衍生物。包括含有SEQ ID No.1-4的任意核苷酸序列的基因和或含有选自SEQ IDNo.4-8的任意氨基酸序列的多肽均适用于生产或制备利普斯他汀或结构类似物RRT0.90。
有益效果：本发明在毒三素链霉菌染色体上鉴定了与利普斯他汀及其结构类似物RRT0.90合成有关的基因簇bkdA2B2C2。通过对基因簇bkdA2B2C2中的bkdA2，bkdB2，bkdC2和bkdR中的至少一个进行失活，可显著提升利普斯他汀结构类似物RRT0.90的发酵水平，为制备新的利普斯他汀衍生物的研究奠定基础。通过对基因簇bkdA2B2C2中的转录调控基因bkdR强化表达，可有效提高利普斯他汀的发酵效价，降低生产成本。
附图说明
图1为毒三素链霉菌中支链α酮酸脱氢酶复合物编码基因簇示意图；
图2为目的基因敲除的同源重组模型示意图；
图3为bkdR基因强化表达载体构建示意图；
图4为出发菌株AP617-N12CA的发酵产物分离纯化后的HPLC检测图；
图5为bkdR单基因敲除工程菌发酵产物分离纯化后的HPLC检测图；
图6为bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因敲除工程菌发酵产物分离纯化后的HPLC检测图；
图7为bkdR单基因敲除工程菌利普斯他汀加氢产物的质谱图；
图8为bkdR单基因敲除工程菌利普斯他汀结构类似物RR0.90加氢产物的质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式和实施例对本发明内容进行详细说明，但本发明的范围不限于此。以下具体实施例中，如无特别说明，使用的仪器是和试剂本领域常用的仪器和试剂，可以通过公开的市受渠道获得；所使用的方法为本领域技术人员熟知的常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实现所述方法。
以下实施例中所涉及的几种大肠杆菌和放线菌穿梭质粒均为本领域技术人员公知菌株和质粒，其中穿梭质粒pKC1139、链霉菌噬菌体的衍生质粒pIB139及大肠杆菌ET12567(pUZ8002)由申请人大邦(湖南)生物制药有限公司研发中心保藏，毒三素链霉AP617-N12CA为申请人大邦(湖南)生物制药有限公司的工业生产菌株，记载在本申请人公开发表的文献[李辉，方志锴，郭霞凌.利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA基因组测序分析[J]，中国抗生素杂志，2022(1)：10-18]中。
实施例1bkdA2B2C2基因簇的发现
对毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini AP617-N12CA进行全基因组测序，由北京百迈客生物科技有限公司采用llumina HiSeq 2500测序系统完成，采用Falcon套装进行序列组装。使用Glimmer v3.02预测编码序列，将编码序列翻译成氨基酸后，使用BlastP同源比对预测蛋白功能，依赖数据库GO，KEGG，Swiss-Prot，和COG对获得的每个预测的编码基因进行功能注释。采用在线软件AntiSMASH 5.0预测次级代谢产物合成基因簇，在基因组分析的基础上，发现了与以利普斯他汀及其结构类似物RRT0.90形成有关的支链α酮酸脱氢酶复合体编码基因簇bkdA2B2C2。其中bkdA2B2C2基因簇长3478bp，bkdA2基因长1149bp，编码具有脱氢酶活性的E1α2亚基(383aa)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。bkdB2基因长999bp，编码具有脱羧酶活性的E1β亚基(333aa)；其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。bkdC2基因长1347bp，编码具有二氢硫辛酰胺酰基转移酶活性的E2亚基(449aa)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。bkdA2B2C2基因簇示意图见说明书附图图1，在bkdA2B2C2基因簇上游还存在一个Lrp/AsnC转录调控基因bkdR，bkdR基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
实施例2bkdR单基因敲除工程菌的制备方法
1)bkdR单基因敲除质粒pKDR的构建
以毒三素链霉菌基因组DNA为模板，设计两对引物bkdR-L-P1/bkdR-L-P2和bkdR-R-P3/bkdR-R-P4分别对bkdR基因的同源重组左臂和右臂进行PCR扩增。扩增得到的左右同源臂经测序验证与目的基因序列相同后，将两同源臂分别用(EcoRI)-(XbaI)和(XbaI)-(Hind III)双酶切后依次连接于通用型克隆载体pUC19-Amp。然后将上述的构建载体用(EcoR I)-(Hind III)双酶切后插入大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pKC1139的多克隆位点内，获得bkdR基因敲除质粒pKDR。为确保同源臂的正确连接以及碱基序列未发生突变，对敲除质粒pKDR酶切电泳和测序验证，电泳条带与理论预测吻合，DNA测序结果未显示碱基突变，证明敲除质粒pKDR构建正确。
其中，本实施例所述两对引物序列如下：
同源重组左臂上游引物bkdR-L-P1：5’-CGGAATTCCATGAAGACGACCGGGTCGT-3’(SEQID No.9)，下划线处为EcoR I酶切位点；
同源重组左臂下游引物bkdR-L-P2：5’-GCTCTAGACCGCGGCCATTTGTTCATCC-3’(SEQID No.10)，下划线处为Xba I酶切位点；
同源重组右臂上游引物bkdR-R-P3：5’-GCTCTAGACCTGCTGGTCTTCGAGGAGAC-3’(SEQID No.11)，下划线处为Xba I酶切位点；
同源重组右臂下游引物bkdR-R-P4：5’-CCCAAGCTTAAATTGTGCGATCAAGGGGG-3’，(SEQ ID No.12)下划线处为Hind III酶切位点；
2)pKDR在大肠杆菌和毒三素链霉菌之间的接合转移
将敲除质粒pKDR转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞，转化后涂布到同时含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(25ug/ml)的LB抗性平板上，37℃静置培养至单菌落长出。挑取单菌落转接到含有三种抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取过夜培养的菌液0.3ml加入至30ml添加相应抗生素的LB培养基中，37℃震荡培养3h左右至OD600约0.4～0.6，取10ml离心收集菌体。收集的菌体用等体积新鲜LB液体培养基洗涤2次除去残留抗生素，用适量LB培养基重悬，得到含重组质粒的供体菌大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pKDR)悬浮液，备用。用2×YT培养基制备毒三素链霉菌AP617-N12CA孢子悬液，作为受体菌，50℃水浴热激10min，常温下备用。将制备好的大肠杆菌供体菌悬液和毒三素链霉菌菌AP617-N12CA孢子悬液等比例混合进行接合转移，离心后弃上清用剩余液体重悬。将重悬液均匀涂布于MS固体培养基平板，37℃培养20～24h，用1ml含安普霉素(终浓度50ug/ml)和萘啶酸(终浓度25ug/ml)的水溶液覆盖，继续培养3～5天，待接合子长出。敲除质粒pKDR是以pKC1139为骨架构建得到，其上的链霉菌复制子为温度敏感型复制子，当培养温度超过34℃时，含有游离敲除质粒的菌株不能生长，只有敲除质粒上携带的基因与链霉菌基因组上的同源区进行同源重组而整合到染色体上的菌株才能生长，所以MS平板上长出来的接合子即为单交换菌株。
3)bkdR基因单独敲除工程菌的筛选和鉴定
将单交换菌株在无抗平板上进行松弛培养，松弛三代后采用影印法将单菌落同时点种到添加安普霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上，筛选出在普通平板上生长而在抗性平板上不生长的安普霉素敏感菌株。这些安普霉素敏感菌株可能为双交换突变株，亦可能为回复突变株。为筛选到bkdR基因簇敲除突变株，提取安普霉素敏感株的染色体作为模板，根据同源重组模型(基因敲除的同源重组模型示意图见说明书附图图2)设计双交换验证引物bkdR-S-P5和bkdR-S-P6，利用PCR方法对敏感菌株进行测序和筛选，最终得到基因bkdR缺失的双交换突变株，此即为bkdR基因单独失活工程菌，命名为△bkdR。△bkdR工程菌利用筛选引物bkdR-S-P5/bkdR-S-P6扩增得到的条带长度为998bp。
其中，双交换验证引物序列为：
筛选引物bkdR-S-P5：5’-TAGCTCGGGAAGAGCCAGTCCTGCT-3’(SEQ IDNo.13)；
筛选引物bkdR-S-P6：5’-CAGCTCGGGCGCCTTCATGG-3’(SEQ ID No.14)；实施例3bkdC2单基因失活工程菌的制备方法
利用相同原理，参照实施例1所述的构建方法和流程，构建bkdA2B2C2基因簇中bkdC2基因单独失活的工程菌，命名为△bkdC2。△bkdC2工程菌利用筛选引物bkdC2-S-P11/bkdC2-S-P12扩增得到的条带长度为1064bp。
其中，引物序列如下：
同源重组左臂上游引物bkdC2-L-P7：5’-CGGAATTCACGTCCTGATCGACTACC-3’(SEQID No.15)，下划线处为EcoR I酶切位点；
同源重组左臂下游引物bkdC2-L-P8：5’-GCTCTAGAGCGCAGGTAATGGAGTTC-3’(SEQID No.16)，下划线处为Xba I酶切位点；
同源重组右臂上游引物bkdC2-R-P9：5’-GCTCTAGAGATCTCGGCCTCGGTCAGT-3’(SEQID No.17)，下划线处为Xba I酶切位点；
同源重组右臂下游引物bkdC2-R-P10：5’-CCCAAGCTTAGCAGGACTGGCTCTTCC-3’(SEQID No.18)，下划线处为Hind III酶切位点；
双交换筛选引物bkdC2-S-P11：5’-TGGTCGAACCTCTTCATGGTCG-3’(SEQ ID No.19)；
双交换筛选引物bkdC2-S-P12：5’-ACGCTGATCACATACGGGCC-3’(SEQ ID No.20)；
实施例4bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因失活工程菌的制备方法
利用相同原理，参照实施例1所述的构建方法和流程，构建敲除bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因失活的工程菌，命名为△(bkdC2-bkdB2-bkdA2)。△(bkdC2-bkdB2-bkdA2)工程菌利用筛选引物A2B2C2-S-P15/A2B2C2-S-P16扩增得到的条带长度为990bp。
其中，引物序列如下：
同源重组左臂上游引物bkdC2-L-P7：5’-CGGAATTCACGTCCTGATCGACTACC-3’(SEQID No.15)，下划线处为EcoR I酶切位点；
同源重组左臂下游引物bkdC2-L-P8：5’-GCTCTAGAGCGCAGGTAATGGAGTTC-3’(SEQID No.16)，下划线处为Xba I酶切位点；
同源重组右臂上游引物bkdA2-R-P13：5’-GCTCTAGAGCAGCTCTTGGACCGTCAT-3’，(SEQ ID No.21)，下划线处为Xba I酶切位点；
同源重组右臂下游引物bkdA2-R-P14：5’-CCCAAGCTTCACCTCGAACCTCAACTT-3’，(SEQ ID No.22)，下划线处为Hind III酶切位点。
双交换筛选引物A2B2C2-S-P15：5’-GAGAAGCTCGCCCGATGCAA-3’(SEQ ID No.23)；
双交换筛选引物A2B2C2-S-P16：5’-AACGGTCGATGGGGTCCAGT-3’(SEQ ID No.24)。
实施例5bkdR强化表达工程菌的制备方法
1)bkdR强化表达质粒构建
以毒三素链霉菌AP617-N12CA基因组DNA为模板，以bkdR-F/bkdR-R引物通过PCR扩增得到长度为664bp的两端含有NdeI/XbaI酶切位点的bkdR基因片段，连接到PDM19-T载体上，测序验证其基因序列正确性。然后将上述的构建载体经(NdeI)-(XbaI)双酶切，与相应酶切后的pIB139载体(Wilkinson，C.J.，A Hughes-Thomas，Martin，C.J.，Ines/>&Leadlay，P.F..(2002).Increasing the efficiency of heterologous promoters inactinomycetes.J Mol Microbiol Biotechnol，4(4)，417-426)连接，得到用于bkdR强化表达的质粒pIB139-bkdR。pIB139是一个含有红霉素抗性基因强启动子PermE*的链霉菌整合型表达载体，含有接合转移所需原件和及噬菌体/>的整合酶(int)和整合位点(attP)，可通过位点特异性重组整合进入链霉菌染色体上，随着染色体一起遗传和复制。bkdR基因强化表达载体构建示意图见说明书附图图3。
其中，引物序列如下：
bkdR扩增上游引物bkdR-F：5’-GGAATTCCATATGAGGCTGTGGACAAAGTGGCGCCG-3’，(SEQ ID No.25)，下划线处为NdeI酶切位点。
bkdR扩增下游引物bkdR-R：5’-CTAGTCTAGACTACTCCTCTGCGATGGCCC-3’，(SEQ IDNo.26)，下划线处为XbaI酶切位点。
2)bkdR强化表达质粒转入三素链霉菌AP617-N12CA
将已构建完成的表达质粒pIB139-bkdR转化含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞，涂布到含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(25ug/ml)的LB抗性平板上，37℃培养至单菌落长出。挑取单菌落转接到含有三种抗生素的LB液体培养基中培养过夜。取过夜培养的菌液0.3ml加入至30ml添加相应抗生素的LB培养基中，37℃培养3h左右至OD600约0.4～0.6，离心收集菌体。用等体积LB培养基洗涤2次除去残留抗生素，用适量LB培养基重悬，得到含表达质粒的供体菌大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pIB139-bkdR)悬浮液，备用。用2×YT培养基制备毒三素链霉菌AP617-N12CA孢子悬液，作为受体菌，50℃水浴热激10min，常温下备用。将制备好的大肠杆菌供体菌悬液和毒三素链霉菌菌AP617-N12CA孢子悬液等比例混合进行接合转移，离心后弃上清用剩余液体重悬。将重悬液均匀涂布于MS固体培养基平板，30℃培养20～24h，用1ml含安普霉素(终浓度50ug/ml)和萘啶酸(终浓度25ug/ml)的水溶液覆盖，30℃继续培养3～5天即可长出单菌落。从覆盖平板上挑选单菌落接种到安普霉素抗性平板上进一步确认抗性。pIB139-bkdR为整合型载体，不能在链霉菌中自主复制，只有pIB139-bkdR上的噬菌体位点与毒三素链霉菌AP617-N12CA内的attB位点在int整合酶介导下生位点特异性重组，整个pIB139-bkdR质粒整合进入毒三素链霉菌AP617-N12CA基因组中后，才能在安普霉素抗性筛选压力下生长，从而得到bkdR强化表达菌株。
实施例6bkdR单基因敲除工程菌的发酵与组分分析
以实施例2制备的工程菌△bkdR为例，对其进行菌种培养、生物发酵与分离纯化，通过对利普斯他汀及其结构类似物的组分分析反映出工程菌△bkdR发酵液中利普斯他汀及其结构类似物RRT0.90的比率变化。
将出发菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA与工程菌△bkdR同时分别进行发酵，发酵方法参照本申请人授权专利“一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基(ZL202110298030.5)”中公开的发酵工艺进行。发酵完成后，进行利普斯他汀的分离纯化、HPLC分析检测，发酵产物的分离纯化和分析检测方法参照本申请人授权专利“一种纯化利普斯他汀的方法(ZL201910318593.9)”、“一种奥利司他纯化工艺(ZL201610920367.4)”中公开的方法进行。
其中，出发菌株AP617-N12CA的发酵产物分离纯化后的HPLC检测图如附图4所示，峰结果如表1所示：
表1出发菌株AP617-N12CA的发酵产物分离纯化后的HPLC的峰结果
bkdR单基因敲除工程菌发酵产物分离纯化后的HPLC检测图如附图5所示，峰结果如表2所示：
表2bkdR单基因敲除工程菌发酵产物分离纯化后的HPLC的峰结果
检测结果经统计分析发现，工程菌△bkdR相对于出发菌株AP617-N12CA而言，利普斯他汀结构类似物RRT0.90的比率显著上升。HPLC图谱中RRT0.90物质的相对百分含量(峰面积比)从出发菌株的1.10％(参见表1)上升至11.34％(参见表2)，发酵水平提升10倍以上，为该物质的分离制备和深入研究奠定了基础。
实施例7bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因敲除工程菌的发酵与组分分析
利用相同原理，参照实施例6所述的方法和流程，对bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因敲除工程菌进行发酵验证、分离提取和组分分析。
bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因敲除工程菌的发酵产物分离纯化后的HPLC检测图如附图6所示，峰结果如表3所示：
表3bkdC2-bkdB2-bkdA2三基因敲除工程菌的发酵产物分离纯化后的HPLC峰结果
检测结果经统计分析发现，工程菌△bkdC2-bkdB2-bkdA2相对于出发菌株AP617-N12CA而言，利普斯他汀结构类似物RRT0.90的比率亦显著上升，HPLC图谱中RRT0.90物质的相对百分含量(峰面积比)从出发菌株的1.10％(参见表1)上升至8.61％(参见表3)。因此，通过将毒三素链霉菌中编码支链α酮酸脱氢酶的基因簇bkdA2B2C2中的bkdA2、bkdB2、bkdC2和bkdR四个基因中至少一个敲除后获得的工程菌，对于提高利普斯他汀结构类似物RRT0.90的发酵水平是一种行之有效的策略，可为该物质的分离制备和深入研究奠定基础。
实施例8bkdR强化表达工程菌的发酵与发酵效价及组分分析
利用相同原理，参照实施例6所述的方法和流程，对bkdR强化表达工程菌进行发酵验证、分离纯化和组分分析。检测结果经统计分析发现，bkdR强化表达工程菌相对于出发菌株AP617-N12CA而言，RRT0.90等利普斯他汀结构类物在HPLC图谱中的相对百分含量(峰面积比)未发生明显变化，但利普斯他汀发酵效价得到有效提升，平均效价从本申请人授权专利“一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基(ZL202110298030.5)”中公开的12g/L左右提升至13.8g/L，提升15％左右。因此，通过将毒三素链霉菌中编码支链α酮酸脱氢酶的基因簇bkdA2B2C2中bkdR基因进行强化表达所获得的工程菌，对于提高利普斯他汀发酵效价也是一种行之有效的策略，应用于利普斯他汀和奥利司他的发酵生产，可降低生产成本、提高生产效率。
实施例9bkdR单基因敲除工程菌发酵产物的氢化还原
将实施例6中bkdR基因敲除工程菌发酵产物经分离纯化后获得的利普斯他汀和RRT0.90样品参照本发明人公开发表的文献[郭远良，张吉松，彭滢.利普斯他汀的微填充床连续流动加氢[J].现代化工,2022,42(08):225-228]中记载的方法进行氢化还原，得到奥利司他和RRT0.90加氢产物。然后进行超高效液相色谱串联质谱检测，进一步鉴定bkdR基因敲除工程菌中利普斯他汀及结构类似物RRT0.90组成和结构。所述的利普斯他汀加氢产物奥利司他质谱峰如图7所示，对应分子量为495.39，所述的利普斯他汀结构类似物RRT0.90加氢产物质谱峰如图8所示，对应分子量为529.38，均与理论分子量相符。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种分离的参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇，其特征在于，所述基因簇来源于毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini，所述基因簇由bkdA2、bkdB2、bkdC2和bkdR四个基因组成；所述基因bkdA2的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述基因bkdB2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述基因bkdC2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述基因bkdR的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述利普斯他汀结构类似物的结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的基因簇，其特征进一步在于，所述基因bkdA2的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述基因bkdB2的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述基因bkdC2的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述基因bkdR的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
3.一种工程菌，其特征在于，以毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini为出发菌株，对如权利要求1所述的基因簇中的bkdA2、bkdB2、bkdC2三个基因敲除得到，或对bkdR单基因敲除得到；所述毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini为毒三素链霉菌AP617-N12CA。
4.一种工程菌，其特征在于，以毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini为出发菌株，对如权利要求1所述的基因簇中的bkdR基因进行过量表达得到；所述毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini为毒三素链霉菌AP617-N12CA。
5.一种权利要求3所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以毒三素链霉菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得目的基因的同源重组左臂片段和右臂片段，将左臂片段和右臂片段插入到质粒多克隆位点上，获得目的基因敲除质粒；所述目的基因是所述的基因簇中的bkdA2、bkdB2和bkdC2三个，或bkdR基因；
(2)将目的基因敲除质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，转入毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini，通过安普霉素和萘啶酮酸抗性筛选发生第一次同源重组使敲除质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株；
(3)将单交换菌株在不添加抗生素的斜面培养基上松弛传代后分离单菌落，同时影印到添加安普霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上，筛选在普通平板上生长而在抗性平板上不生长的安普霉素敏感型双交换突变株；通过同源重组模型设计引物，对敏感菌株进行测序和筛选，得到目的基因敲除的双交换突变株。
6.如权利要求5所述的方法，所述步骤(1)中使用的质粒为温敏性质粒pKC1139，所述步骤(2)中的质粒转入为接合转移转入。
7.一种权利要求4所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过PCR扩增得到转录调控基因的PCR片段，通过酶切连接的方法连入质粒的NdeI/XbalI位点，得到整合型表达质粒；所述转录调控基因为所述的基因簇中的bkdR基因；
(2)将所述整合型表达质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，转入毒三素链霉菌AP617-N12CA，通过安普霉素抗性筛选整个pIB139-bkdR载体特异性整合进入毒三素链霉菌染色体的重组强化表达菌株。
8.如权利要求7所述的方法，所述步骤(1)中使用的质粒为整合型质粒pIB139，所得整合型表达质粒为pIB139-bkdR，所述步骤(2)中的质粒转入为接合转移转入。
9.根据权利要求3-4任一项所述工程菌的应用，其特征在于，所述工程菌用于利普斯他汀或其结构类似物的发酵生产，所述利普斯他汀结构类似物的结构如下所示：
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