CN113755354A

CN113755354A - 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途

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Publication number: CN113755354A
Application number: CN202010684910.1A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 殷华; 庄以彬; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN113755354B

Abstract

本发明公开了利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途。本发明工程菌株的构建方法包括使受体菌表达来源于蛇根木的UDP‑葡萄糖基转移酶的步骤。本发明的重组酿酒酵母不表达ARO7基因，含有并能够表达天麻素合成途径基因AsUGT^syn、CAR^syn、PPTcg‑1^syn、ubiC^syn，和表达天麻素前体合成增强的基因ppsA、tktA、ARO1、ARO2和ARO4突变体ARO4^K229L基因。本发明通过引入新的糖基转移酶，在食品级酿酒酵母中构建了从葡萄糖合成天麻素代谢通路，通过基因组整合技术及提高前体合成代谢流，实现天麻素在250mL摇瓶发酵产量达2.1g/L，为大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

Description

利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途。

背景技术

天然产物因其对人体健康的多重益处而被广泛地用作营养补充剂、膳食制品和药物。天麻(Gastrodia elata Blume)属兰科多年生草本共生植物，以地下块茎入药，是传统名贵中药材，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效，用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癫痫抽搐等症。天麻素(Gastrodin)，又名4-羟甲基苯基-beta-D-吡喃葡萄糖甙，为天麻的特征组分，具有较好的镇静和安眠作用，对神经衰弱、失眠、头痛症状有明显的缓解作用。除此之外，天麻素还被证实有提高记忆力、抗炎、抗氧化等功效。

天麻素市场需求量巨大，自20世纪八十年代以来，一直在被多家制药公司或企业生产。迄今，天麻素的工业生产主要是通过化学合成和对天麻植株进行萃取。化学合成法从前体开始需要多步反应，且副产物多、反应专一性差，过程中需要使用毒性较强的溴素、红磷等物质，造成严重的三废问题。天麻素在不同品种的天麻中含量都低，平均在0.2-0.4％，致使植物萃取法存在成本高，环境污染及资源浪费等问题。微生物培养一般在封闭的发酵容器中进行，不受外界环境因素的影响，能提供一致的产品组成和产量。随着合成生物学的发展，通过改造微生物来合成植物源天然产物成为解决市场供应问题的突破口。

天麻素具有以下特征：化学名称为4-(hydroxymethyl)phenyl beta-D-glucopyranoside，分子式为C₁₃H₁₈O₇，分子量为286.2778，CAS号为62499-27-8，结构式为：

天麻素是在糖基转移酶的催化作用下，转移UDP-Glucose的葡萄糖基至对羟基苯甲醇的酚羟基而合成。糖基转移酶的活性高低对天麻素的合成效率有至关重要的影响。作为用于治疗和改善人体健康的药物，选择安全的天麻素微生物生产底盘细胞尤为重要。酿酒酵母遗传操作技术成熟，菌体生长迅速，被食品药品监督管理局(FDA)认定的安全的、可食用级别的微生物，适合用作生产食品、医用药物等底盘细胞。属于真核生物，不受噬菌体感染，在工业发酵生产中可规避常见的噬菌体感染引起的倒罐等问题，且后期产品纯化处理简单，不存在一些细菌底盘如大肠杆菌带来的可导致人体热原反应的内毒素污染。目前用于天麻素合成的糖基转移酶稀少，且尚无在酵母中合成天麻素的报道。

发明内容

本发明的目的是提供利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途。本发明在鉴定了一个新的高效的糖基转移酶基础上，通过基因工程改造酿酒酵母，实现天麻素的从头合成。

第一方面，本发明要求保护一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，记为方法I。

所述方法I可包括如下步骤(A1)：

(A1)使受体菌表达糖基转移酶AsUGT，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产天麻素的工程菌株。

其中，所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木(Rauvolfia serpentina)的UDP-葡萄糖基转移酶。

第二方面，本发明要求保护一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，记为方法II。

所述方法II可包括如下步骤(A2)：

(A2)使受体菌表达糖基转移酶AsUGT、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够生产天麻素的工程菌株。

其中，所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木(Rauvolfia serpentina)的UDP-葡萄糖基转移酶；所述羧酸还原酶CAR来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC来源于大肠杆菌；所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L是将来源于酿酒酵母的抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4的第229位赖氨酸突变为亮氨酸后得到的突变体蛋白。

第三方面，本发明要求保护一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，记为方法III。

所述方法III可包括如下步骤(A3)：

(A3)使受体菌不表达分支酸变位酶ARO7，表达糖基转移酶AsUGT、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够生产天麻素的工程菌株。

第四方面，本发明要求保护一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，记为方法IV。

所述方法IV可包括如下步骤(A4)：

(A4)使受体菌不表达分支酸变位酶ARO7，表达糖基转移酶AsUGT、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA、转酮酶tktA、EPSP合酶ARO1、分支酸合酶ARO2和抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够生产天麻素的工程菌株。

其中，所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木(Rauvolfia serpentina)的UDP-葡萄糖基转移酶；所述羧酸还原酶CAR来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA和所述转酮酶tktA来源于大肠杆菌；所述EPSP合酶ARO1和所述分支酸合酶ARO2来源于酿酒酵母；所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L是将来源于酿酒酵母的抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4的第229位赖氨酸突变为亮氨酸后得到的突变体蛋白。

在前文第一方面中，所述步骤(A1)可为：向所述受体菌中导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因，所得菌株即为所述工程菌1。

在前文第二方面中，所述步骤(A2)可为：向所述受体菌中导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，所得菌株即为所述工程菌2。

在前文第三方面中，所述步骤(A3)可为：敲除所述受体菌基因组中所述分支酸变位酶ARO7的编码基因，并导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，所得菌株即为所述工程菌3。

在前文第四方面中，所述步骤(A4)可为：敲除所述受体菌基因组中所述分支酸变位酶ARO7的编码基因，并导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因、所述转酮酶tktA的编码基因、所述EPSP合酶ARO1的编码基因、所述分支酸合酶ARO2的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，所得菌株即为所述工程菌4。

进一步地，在所述工程菌1中，启动所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌1中上述各基因是通过质粒形式表达的。具体是通过将转化质粒pCf301-AsUGT^syn导入所述受体菌后得到的。所述转化质粒pCf301-AsUGT^syn中含有由P_ScTEF1启动子、所述糖基转移酶AsUGT的编码基因和T_CYC1终止子顺次连接而成的表达盒。

进一步地，在所述工程菌2和所述工程菌3中，启动所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子；启动所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子；启动所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的启动子可为P_TDH3启动子，终止所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的终止子可为T_TEF终止子；启动所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的启动子可为P_TDH3启动子，终止所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的终止子可为T_TEF终止子；启动所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的启动子可为P_PGK1启动子，终止所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的终止子可为T_ADH1终止子。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌2中上述各基因是通过质粒形式表达的。具体是通过将转化质粒pCf302-CP和转化质粒pCf301-AUA导入所述受体菌后得到的。所述转化质粒pCf302-CP中含有表达盒C和表达盒P；所述表达盒C由P_ScTEF1启动子、所述羧酸还原酶CAR的编码基因和T_CYC1终止子顺次连接而成，所述表达盒P由P_TDH3启动子、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因和T_TEF终止子顺次连接而成。所述转化质粒pCf301-AUA中含有表达盒A1、表达盒U和表达盒A2；所述表达盒A1由P_PGK1启动子、所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因和T_ADH1终止子顺次连接而成，所述表达盒U由P_TDH3启动子、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和T_TEF终止子顺次连接而成，所述表达盒A2由P_ScTEF1启动子、所述糖基转移酶AsUGT的编码基因和T_CYC1终止子顺次连接而成。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌3有为两种：一种记作工程菌31；另一种记作工程菌32。

所述工程菌31中上述待表达的各基因是通过质粒形式表达。具体可通过将所述受体菌中的所述分支酸变位酶ARO7的编码基因敲除后，再导入前文所述转化质粒pCf302-CP和所述转化质粒pCf301-AUA后得到。

在所述工程菌32中，上述待表达的各基因是整合到基因组中的。基因组的rDNA位置整合有所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因。

所述工程菌32通过如下方式得到：将所述受体菌中的所述分支酸歧化酶ARO7的编码基因敲除后，导入上游同源臂rDNA-up、DNA片段A、DNA片段B和下游同源臂rDNA-down四个片段，所述DNA片段A中顺次含有P_TDH3启动子、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述T_TEF终止子、所述P_ScTEF1启动子、所述羧酸还原酶CAR的编码基因和所述T_CYC1终止子，所述DNA片段B中顺次含有标记基因(如URA3基因)、T_ADH1启动子、所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因、P_PGK1启动子、P_TDH3启动子、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因、T_TEF终止子、P_ScTEF1启动子、所述糖基转移酶AsUGT的编码基因和T_CYC1终止子，所述四个片段按照所述上游同源臂rDNA-up、所述DNA片段A、所述DNA片段B和所述下游同源臂rDNA-down的顺序相邻两者间存在同源区(如40bp同源区)，通过同源重组整合到基因组rDNA位置。

在本发明的具体实施方式中，敲除所述受体菌中的所述分支酸变位酶ARO7的编码基因是通过基于pUG6和pSH65质粒的常规酵母同源重组基因敲除技术实现的。更加具体的，可按照包括如下步骤的方法实现：步骤1、以ARO7-UP-P1(见表1)和ARO7-DN-P2(见表1)为引物，以NotI酶切pUG6质粒后所回收1.6kb的片段为模板，进行PCR扩增，获得敲除大片段；然后将所述敲除大片段转化至所述受体菌，得到所述分支酸变位酶ARO7的编码基因被KanMX替换敲除的克隆，记为克隆K；步骤2、通过将质粒pSH65转化所述克隆K，获得KanMX被切除的克隆；丢失pSH65质粒后获得无抗敲除所述受体菌中的所述分支酸变位酶ARO7的编码基因的克隆。

进一步地，在所述工程菌4中，启动所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子；启动所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子；启动所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的启动子可为P_TDH3启动子，终止所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的终止子可为T_TEF终止子；启动所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的启动子可为P_TDH3启动子，终止所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的终止子可为T_TEF终止子；启动所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因转录的启动子可为P_TDH3启动子，终止所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因转录的终止子可为T_TEF终止子；启动所述转酮酶tktA的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述转酮酶tktA的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子；启动所述EPSP合酶ARO1的编码基因转录的启动子可为P_ScTEF1启动子，终止所述EPSP合酶ARO1的编码基因转录的终止子可为T_CYC1终止子；启动所述分支酸合酶ARO2的编码基因转录的启动子可为P_TDH3启动子，终止所述分支酸合酶ARO2的编码基因转录的终止子可为T_TEF终止子；启动所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的启动子可为P_PGK1启动子，终止所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的终止子可为T_ADH1终止子。

在所述工程菌4中，上述待表达的各基因是整合到基因组中的。基因组的rDNA位置整合有所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，且基因组的δDNA位置整合有所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因、所述转酮酶tktA的编码基因、所述EPSP合酶ARO1的编码基因和所述分支酸合酶ARO2的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌4通过如下方式得到：以前文所述工程菌32为出发菌株，导入上游同源臂δDNA-up、DNA片段C、DNA片段D、DNA片段E和下游同源臂δDNA-down五个片段，所述DNA片段C中顺次含有P_TDH3启动子、所述分支酸合酶ARO2的编码基因、T_TEF终止子、P_ScTEF1启动子、所述EPSP合酶ARO1的编码基因和T_CYC1终止子，所述DNA片段D中顺次含有标记基因(如LEU2基因)、T_ADH1终止子、所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因、P_PGK1启动子、P_TDH3启动子、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和T_TEF终止子，所述DNA片段E中顺次含有P_TDH3启动子、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因、T_TEF终止子、P_ScTEF1启动子、所述转酮酶tktA的编码基因和T_CYC1终止子，所述五个片段按照所述上游同源臂δDNA-up、所述DNA片段C、所述DNA片段D、所述DNA片段E和所述下游同源臂δDNA-down的顺序相邻两者间存在同源区(如40bp同源区)，通过同源重组整合到基因组δDNA位置。

在前文各方面中，所述受体菌可为酵母菌。

进一步地，所述酵母菌可为酿酒酵母。

在本发明的具体实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4272。

在前文各方面中，所述糖基转移酶AsUGT可为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质，或为SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述羧酸还原酶CAR可为氨基酸序列如NCBI中序列号Q6RKB1所示的蛋白质，或为NCBI中序列号Q6RKB1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号Q6RKB1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号Q6RKB1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1可为氨基酸序列如NCBI中序列号WP_003857486所示的蛋白质，或为NCBI中序列号WP_003857486经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号WP_003857486具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号WP_003857486所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC可为氨基酸序列如NCBI中序列号AAY88959所示的蛋白质，或为NCBI中序列号AAY88959经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号AAY88959具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号AAY88959所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA可为氨基酸序列如NCBI中序列号NP_416217所示的蛋白质，或为NCBI中序列号NP_416217经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号NP_416217具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号NP_416217所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述转酮酶tktA可为氨基酸序列如NCBI中序列号YP_026188所示的蛋白质，或为NCBI中序列号YP_026188经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号YP_026188具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号YP_026188所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述EPSP合酶ARO1可为氨基酸序列如NCBI中序列号NP_010412所示的蛋白质，或为NCBI中序列号NP_010412经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号NP_010412具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号NP_010412所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述分支酸合酶ARO2可为氨基酸序列如NCBI中序列号NP_011367所示的蛋白质，或为NCBI中序列号NP_011367经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号NP_011367具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号NP_011367所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在前文各方面中，所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L可为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质，或为SEQ ID No.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

其中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在前文各方面中，所述糖基转移酶AsUGT的编码基因(简称AsUGT^syn基因)可为核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.3所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.3所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述羧酸还原酶CAR的编码基因(简称CAR^syn基因)可为核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.4所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为Q6RKB1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.4所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为Q6RKB1所示的蛋白质的DNA分子；或

在前文各方面中，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因(简称PPTcg-1^syn基因)可为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ IDNo.5所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为WP_003857486所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.5所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为WP_003857486所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因(简称ubiC^syn基因)可为核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.6所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为AAY88959所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.6所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为AAY88959所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因可为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:946209所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:946209所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为NP 416217所示的蛋白质的DNA分子，或与Gene ID:946209所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为NP_416217所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述转酮酶tktA的编码基因可为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:947420所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:947420所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为YP_026188所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ Gene ID:947420所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为YP_026188所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述EPSP合酶ARO1的编码基因可为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:851705所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:851705所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为NP_010412所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ Gene ID:851705所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为NP_010412所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述分支酸合酶ARO2的编码基因可为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:852729所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:852729所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号为NP_011367所示的蛋白质的DNA分子，或与Gene ID:852729所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号为NP_011367所示的蛋白质的DNA分子。

在前文各方面中，所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因可为核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.7所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.7所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子。

上述标注“syn”的基因在合成时进行了酿酒酵母密码子优化。本领域技术人员应该理解的是，酿酒酵母与大肠杆菌、植物等不同生物在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将不同来源的目标蛋白基因在酿酒酵母中进行密码子优化，可以使其在表达系统中更有效地表达。

上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述编码基因中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述编码基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

第五方面，本发明要求保护利用前文所述方法构建得到的工程菌株。

第六方面，本发明要求保护如下任一应用：

(B1)前文所述的糖基转移酶AsUGT或其相关生物材料在以对羟基苄醇为底物合成天麻素中的应用。

(B2)前文所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在合成天麻素中的应用。

(B3)前文所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA、所述转酮酶tktA、所述EPSP合酶ARO1、所述分支酸合酶ARO2和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在合成天麻素中的应用。

(B4)前文所述的工程菌株在生产天麻素中的应用。

其中，所述工程菌1需要外源加入作为底物的对羟基苄醇；所述工程菌2、所述工程菌3和所述工程菌4由于可以自身合成作为底物的对羟基苄醇，因而不需额外加入对羟基苄醇。

(B5)前文所述的糖基转移酶AsUGT或其相关生物材料在构建前文所述的工程菌株中的应用。

(B6)前文所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在构建前文所述的工程菌株中的应用。

(B7)前文所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA、所述转酮酶tktA、所述EPSP合酶ARO1、所述分支酸合酶ARO2和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在构建前文所述的工程菌株中的应用。

所述相关生物材料可为编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

第六方面，本发明要求保护一种生产天麻素的方法。

本发明所要求保护的生产天麻素的方法，可为如下任一：

(C1)包括如下步骤：利用前文所述的糖基转移酶AsUGT催化对羟基苄醇的酚羟基糖基化，进而生成天麻素。

(C2)包括如下步骤：将前文所述工程菌1在含有葡萄糖和对羟基苄醇的体系中进行发酵培养，从发酵产物中获得天麻素。

其中，葡萄糖在体系中的终浓度可控制在1-40g/L(如20g/L)，对羟基苄醇在体系中的终浓度可控制在1-20mM(如2mM)，25-32℃(如30℃)摇床(如220rpm)培养24-48h。对羟基苄醇可在培养18h时加入。

(C3)包括如下步骤：将前文所述工程菌2、所述工程菌3或所述工程菌4在含有葡萄糖的体系中进行发酵培养，从发酵产物中获得天麻素。由于所述工程菌2、所述工程菌3或所述工程菌4可以自身合成作为底物的对羟基苄醇，因而发酵体系中不需额外加入对羟基苄醇。

其中，进行所述发酵培养时的温度可为30-32℃(如30℃)，时间可为72-216h(如96-144h)。进行所述发酵培养时培养基中葡萄糖的终浓度可为5-40g/L(如20g/L)。进行所述发酵培养时的培养基为筛选培养基；所述筛选培养基具体为SC液体培养基。进行所述发酵培养可为摇床培养(如220rpm)。进行所述发酵培养时接种量为1％-2％(体积百分比)。

本发明首次发现了来源于蛇根木的糖基转移酶AsUGT能在酿酒酵母中表达，能够催化对羟基苄醇的酚羟基糖基化进而生成天麻素，且表现出较高的催化天麻素合成活性。本发明通过引入新的糖基转移酶AsUGT，在酿酒酵母中构建了天麻素合成途径，并调控了从葡萄糖到对羟基苄醇的代谢流，得到高产天麻素的重组酿酒酵母。该重组酿酒酵母菌株不表达ARO7基因，含有并能够表达天麻素合成途径基因AsUGT^syn、CAR^syn、PPTcg-1^syn、ubiC^syn，和表达天麻素前体合成增强的基因ppsA、tktA、ARO1、ARO2和ARO4突变体ARO4^K229L基因。酿酒酵母作为安全的、可食用级别的模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；而且本发明通过引入新的糖基转移酶，在食品级酿酒酵母中构建了从葡萄糖合成天麻素代谢通路，通过基因组整合技术及提高前体合成代谢流，实现天麻素在250mL摇瓶发酵产量达2.1g/L，为大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为对羟基卞醇的饲喂实验，验证AsUGT催化天麻素合成的功能。(A)为4742-AsUGT^syn和对照株4742-301发酵液上清及天麻素标品的HPLC检测。其中峰II为饲喂底物对羟基卞醇的峰。(B)为4742-AsUGT^syn发酵液上清中出现的峰I进行的质谱验证结果。(C)为表达糖基转移酶AsUGT^syn和UGT73B6^FSy对底物对羟基苄醇转化率。

图2为天麻素从头合成线路。

图3为酿酒酵母天麻素合成菌株4742-pGS发酵及天麻素鉴定。(A)为天麻素标品、对羟基卞醇标品，及重组菌4742-pGS和对照菌4742-pCf发酵液上清的HPLC分析；(B)为菌株4742-pGS发酵液上清，峰I的MS图谱；(C)为菌株4742-pGS发酵液上清峰II的MS图谱。

图4为菌株Δ7-pGS和rGS3发酵产量及生长比较。(A)为产量曲线；(B)为生长曲线；(C)为发酵液检测的HPLC结果。

图5为菌株4742-pGS、Δ7-pGS、rGS3及rGS-HBA天麻素产量比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的各关键基因蛋白序列如下：

糖基转移酶AsUGT来源于蛇根木(Rauvolfia serpentina)，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。经酿酒酵母密码子优化后的编码基因(简称AsUGT^syn基因)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

羧酸还原酶CAR来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)，其氨基酸序列如NCBI中序列号Q6RKB1所示。经酿酒酵母密码子优化后的编码基因(简称CAR^syn基因)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，其氨基酸序列如NCBI中序列号WP_003857486所示。经酿酒酵母密码子优化后的编码基因(简称PPTcg-1^syn基因)的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA和转酮酶tktA均来源于大肠杆菌。分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的氨基酸序列如NCBI中序列号AAY88959所示，磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的氨基酸序列如NCBI中序列号NP_416217所示，转酮酶tktA氨基酸序列如NCBI中序列号YP_026188所示。经酿酒酵母密码子优化后的分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因(简称ubiC^syn基因)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因的核苷酸序列如Gene ID:946209所示，转酮酶tktA的编码基因的核苷酸序列如Gene ID:947420所示。

EPSP合酶ARO1和分支酸合酶ARO2来源于酿酒酵母。EPSP合酶ARO1的氨基酸序列如NCBI中序列号NP_010412所示，分支酸合酶ARO2的氨基酸序列如NCBI中序列号NP_011367所示。EPSP合酶ARO1的编码基因的核苷酸序列如Gene ID:851705所示，分支酸合酶ARO2的编码基因的核苷酸序列如GeneID:852729所示。

抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L是来源于酿酒酵母的抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4的第229位赖氨酸突变为亮氨酸后得到的突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

下述实施例中所涉及的酿酒酵母感受态制备方法：单克隆被接种至3mL液体培养基，30℃，200rpm培养过夜，转接其中的3mL过夜培养物接种至50mL培养基，起始OD600在0.2，接着30℃，200rpm培养至OD600在0.8。培养物2,000g离心3min，重悬在25mL无菌水，2,000g离心3min，重悬在1.0mL 0.1M醋酸锂，转移至1.5mL离心管，2,000g离心15s，弃上清，重悬在320μL 0.1M醋酸锂，作为感受态细胞。

下述实施例中所用到的多个大片段同时转化酿酒酵母的技术方法流程，是基于Jolanda van Leeuwen的方法进行改进的(van Leeuwen,J.,et al.(2015).Rapid andEfficient Plasmid Construction by Homologous Recombination in Yeast.ColdSpring Harb Protoc 2015(9):pdb prot085100.)，具体操作如下：在1.5mL无菌离心管中加入10μL DNA片段混合物(每个片段大约100-200ng)和2μL鲑鱼精ssDNA溶液(10mg/mL)，然后加入12μL酿酒酵母感受态细胞，轻轻混匀后加入100μL转化缓冲液(配方：800μL的50％PEG3350、100μL的1M LiAc、100μL的10×TE和50μL的DMSO混合而成)，轻轻涡旋10s。放置此转化混合物在42℃、15min后，冰浴5min。转化混合物800g离心1min重悬在1mL的YPD培养基中，30℃放置2h后2000g离心1min，重悬在0.5mL无菌水中涂布SC筛选培养基的平板。

下述实施例中所涉及的引物见表1，质粒和菌株见表2。

表1本发明所用的PCR引物

引物	序列(5′→3′)
		ARO7-UP-P1	actgttttaaatctacaaaatattagagatgaattagttagaatggaggat cagctgaagcttcgtacgctg
ARO7-DN-P2	agtattccacctcaacttccttagtgataggtataacaatttccttata gcataggccactagtggatctg
		r D-F	CTCCAAAGAGTATCAC
r D-R	TGATAAACTCGAACTGGAATTCCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAG
		r U-F	TGCGCTCGGTCGTTCGGCTCTGCATTCCCAAACAACTCGAC
r U-R	AACTTGAAATTGCTGGCCTTTTC
		r 5.8-F	AATGCCCAAAGAAAAAGTTGGAATTCCAGTTCGAGTTTATC
r 5.8-R	AGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGATTCATTAATGCAGCTGGA
		r 7.4-F	CTAAGAAACCATTATTATC
r 7.4-R	TCGAGTTGTTTGGGAATGCAGAGCCGAACGACCGAGCGCAG
		δU-F	TGTTGGAATAAAAATCAAC
δU-R	TAAGGAAAGAGTGAGGAACTAGATACTGGTGAATTTTGAG
		δD-F	AGAATCAGGGGATAACGCATAAAGAGAATGTGGATTTTG
δD-R	TATCATCTACTAACTAGTATTTAC
		δ7.7-F	TCTCAAAATTCACCAGTATCTAGTTCCTCACTCTTTCCTTAC
δ7.7-R	AGAGGTTTTCACCGTCATCAAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
		δ6.8-F	FTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTTGATGACGGTGAAAACCTCTG
δ6.8-R	AGATATTATAACATCTGCAAGTATGCTGTGCTTGGGTGTTTTG
		δ6.2-F	ACACCCAAGCACAGCATACTTGCAGATGTTATAATATCTG
δ6.2-R	TCAAAATCCACATTCTCTTTATGCGTTATCCCCTGATTCTG

表2本发明所涉及的质粒和菌株

下述实施例中所涉及培养基如下：

SC-ura为SC尿嘧啶缺陷的酵母培养基，其中葡萄糖浓度为20g/L；

SC-leu为为SC亮氨酸营养缺陷型酵母培养基，其中葡萄糖浓度为20g/L；

SC-ura/leu为SC尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型酵母培养基，其中葡萄糖浓度为20g/L；

实施例1、糖基转移酶AsUGT催化天麻素合成功能验证

pCf301，pCf302质粒是自行构建载体，为2μm ori的pESC来源质粒。这两个质粒记载在文献“Jiang,J.J.,et al.(2018).Metabolic Engineering of Saccharomycescerevisiae for High-Level Production of Salidroside from Glucose.Journal ofAgricultural and Food Chemistry 66(17):4431-4438”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。

将SEQ ID No.3所示的AsUGT^syn基因克隆到pCf301载体的NheI/和AatII两个酶切位点之间，得到的经测序验证正确的重组质粒命名为pCf301-AsUGT^syn。

转化质粒pCf301-AsUGT^syn至酿酒酵母BY4742(保存于本实验室，此菌株为领域公知酵母菌模式菌株，可从很多公司买到)，采用常规的醋酸锂转化方法，为本领域常用的方法，在此不再赘述。挑选并验证获得正确的转化菌株，命名为4742-AsUGT。4742-AsUGT接种至3mLSC-ura，30℃220rpm摇床培养24h，转接2mL培养物至装有50mLSC-ura的250mL的三角瓶，30℃、220rpm摇床培养18h时添加终浓度为2mM的对羟基苄醇，然后30℃、220rpm摇床培养，在底物添加后24h和48h取样，进行HPLC分析，并对出现的特征峰进行质谱LC-MS分析(具体方法见实施例6)。

UGT73B6^FS同样被在酿酒酵母中进行密码子优化后(优化后基因命名为UGT73B6^FSy，具体序列见SEQ ID No.8)克隆至pCf301质粒，和AsUGT^syn克隆位点相同，得质粒pCf301-UGT73B6^FSy。相同方法转化至酿酒酵母BY4742，得菌株4742-UGT73B6^FSy。空质粒pCf301相同方法被转化至酿酒酵母BY4742，得菌株4742-301。菌株4742-UGT73B6^FSy和4742-301以与4742-AsUGT同样的发酵方式进行发酵和底物饲喂。

HPLC实验，结果表明，相对于对照株4742-301，AsUGT表达株4742-AsUGT发酵液在6.3min出现一个特征峰，HPLC-MS结果表明特征峰I的分子离子峰m/z为304.14([M+NH4]⁺)，与天麻素分子量一致，峰II为所添加的底物对羟基苄醇峰，参考图1。在24小时，有0.5mM的天麻素被转化合成，底物转化率(被转化的底物量除以所添加的总底物量)为25％，在48h，1.1mM的天麻素被转化合成，底物转化率为55％。相对于UGT73B6^FSy表达株4742-UGT73B6^FSy，饲喂底物24h后，4742-AsUGT底物转化率是UGT73B6^FSy的33倍，表明AsUGT在酿酒酵母中的酶催化效率远高于UGT73B6^FSy，参考图1。

实施例2、酿酒酵母天麻素合成菌株4742-pGS、Δ7-pGS构建

基因CAR^syn和PPTcg-1-1^syn被分别克隆至pCf302质粒的NheI/AatII和HindIII/BamHI酶切位点间，获得质粒pCf302-CP。

基因ARO4^K229L、AsUGT^syn和ubiC^syn被分别克隆至pCf301的SpeI/BglII，NheI/AatII和HindIII/BamHI酶切位点间，获得质粒pCf301-AUA。

酿酒酵母BY4742基因ARO7敲除株Δaro7，是通过基于pUG6和pSH65质粒的常规酵母同源重组基因敲除技术，敲除酿酒酵母BY4742中基因组上的分支酸变位酶ARO7基因后得到菌株。Δaro7的具体构建方法如下：首先，以ARO7-UP-P1和ARO7-DN-P2为引物，以NotI酶切pUG6质粒后所回收1.6kb的片段为模板，进行PCR扩增，获得敲除大片段；然后转化敲除大片段至酿酒酵母BY4742菌株，以抗生素G418的YPD模板筛选获得克隆K，即ARO7被KanMX替换敲除的克隆；质粒pSH65转化克隆K，以抗生素Zeocin的YPD模板筛选获得克隆K-pSH65，然后进行半乳糖诱导，稀释涂平板筛选在YPD加G418不生长的克隆，不生长的对应克隆为KanMX切除克隆，克隆进行验证后，进行连续传代培养，筛选Zeocin的YPD不生长的克隆，实现pSH65丢失，即获得无抗敲除ARO7的克隆，命名为Δaro7。

常规醋酸锂转化法，转化质粒pCf302-CP和pCf301-AUA至酿酒酵母BY4742，筛选培养基为SC-ura/leu，并通过克隆PCR验证，获得正确的转化子，命名为4742-pGS。

常规醋酸锂转化法，转化质粒pCf302-CP和pCf301-AUA至所构建的酿酒酵母BY4742基因ARO7敲除株Δaro7，筛选培养基为SC-ura/leu，并通过克隆PCR验证，获得正确的转化子，命名为Δ7-pGS。

常规醋酸锂转化法，转化对照空质粒pCf302和pCf301至所构建的酿酒酵母BY4742，筛选培养基SC-ura/leu并通过克隆PCR验证，获得正确的转化子，命名为4742-pCf。

实施例3、酿酒酵母天麻素合成菌株rGS3构建

ARO4^K229L和天麻素合成途径基因包括CAR^syn，PPTcg-1^syn，AsUGT^syn和ubiC^syn与URA3标签，一共14kb的核酸序列整合在酿酒酵母Δaro7基因组rDNA位置。

技术方法如下：以PCR引物对rU-F&R和rD-F&R分别从酿酒酵母BY4742基因组扩增获得rDNA-up(476bp)和rDNA-down(326bp)。以r5.8-F&R引物，以质粒pCf302-CP为模板扩增获得包含CAR^syn,PPTcg-1^syn的大片段约5.8kb。以r7.4-F&R.为引物，质粒pCf301-AUA为模板扩增获得包含AsUGT^syn,ubiC^syn,ARO4^K229L和URA3的大片段约7.4kb。片段rDNA-up、5.8kb片段、7.4kb片段和片段rDNA-down间顺序相邻，且相邻片段两端有40bp同源区。获得的这四个片段用前面提到的多个大片段同时转化酿酒酵母的技术方法转化至酿酒酵母Δaro7，筛选培养基为SC-ura，PCR及PCR片段测序验证后，选取阳性克隆进行发酵，阳性克隆命名为rGS3。rGS3中，在rDNA位点整合的各基因排布如图2所示。

实施例4酿酒酵母天麻素合成菌株rGS-HBA构建

通过实验把基因ARO1、ARO2、ppsA、tktA、ubiC^syn和ARO4^K229L整合至酿酒酵母rGS3基因组δDNA位置。具体操作如下：

基因ARO4^K229L和ubiC^sy同时被分别克隆至pCf302质粒的SpeI/BglII和HindIII/BamHI酶切位点间，获得质粒pCf302-AU。

基因ppsA和tktA被分别克隆至pCf301质粒的NheI/AatII和HindIII/BamHI酶切位点间，获得质粒pCf301-pt。

基因ARO1和ARO2被分别克隆至pCf301质粒的NheI/AatII和HindIII/BamHI酶切位点间获得质粒pCf301-ARO1/2。

技术方法如下：以PCR引物对δU-F&R和δD-F&R分别从酿酒酵母BY4742基因组扩增获得片段δDNA-up(329bp)和δDNA-down(316bp)。以δ7.7-F&R为引物对，以质粒pCf301-ARO1/2为模板PCR扩增获得包含基因ARO1和ARO2基因约7.7kb的片段。以δ6.8-F&R为引物，以质粒pCf302-AU为模板PCR扩增获得包含LEU2筛选标签，基因ubiC^syn和ARO4^K229L约6.8kb片段。以δ6.2-F&R为引物，以pCf301-pt为模板PCR扩增获得包含ppsA和tktA基因的约6.2kb片段。五个片段δDNA-up、7.7kb的片段、6.8kb片段、6.2kb片段和δDNA-down顺序相邻，且相邻片段两端有40bp同源区。这五个片段以前面提到的多个大片段同时转化酿酒酵母的技术方法进行转化至酿酒酵母rGS3，筛选培养基为SC-ura/leu，PCR及PCR片段测序验证后，选取阳性克隆进行发酵，阳性克隆命名为rGS-HBA。rGS-HBA中，在δDNA位点整合的各基因排布如图2所示。

实施例5、酿酒酵母天麻素合成菌株4742-pGS发酵及天麻素鉴定

将菌株4742-pGS及对照菌株4742-pCf单克隆各接种在3mL的SC-ura/leu，30℃220rpm，摇床培养18h，得到种子液。然后各将2mL种子液分别转接入装有50mL SC-ura/leu液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、220rpm培养，取发酵液进行HPLC或LC-MS检测；实验各设三个平行处理。

HPLC检测结果见图3中(A)。菌株4742-pGS相对于对照菌株4742-pCf在6.3min和12.6min出现明显的新峰，峰I和峰II。参考天麻素和对羟基苄醇的标品HPLC峰，初步推测峰I为天麻素，峰II为对羟基苄醇。实验通过LC-MS对这两个峰进行质谱测定，结果见图3中(B)和(C)。峰I的分子离子峰m/z为304.14([M+NH4]⁺)，与天麻素分子量一致；峰II的分子离子峰m/z为107.05([M–H₂O+H]⁺)，与对羟基卞醇的分子量一致；表明天麻素合成途径基因在酿酒酵母中实现了功能性表达，以葡萄糖为碳源，从头合成了目标产物天麻素。所构建的天麻素从头合成途径如图2所示。

实施例6、菌株Δ7-pGS和rGS3发酵产量及生长比较

将菌株Δ7-pGS及rGS3单克隆分别接种在3mL的SC-ura/leu和SC-ura中，含20g/L葡萄糖中，30℃220rpm，摇床培养20h，得到种子液。然后各将2mL种子液分别转接入装有50mL相应液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、220rpm培养。自发酵起始取发酵液进行OD600和HPLC检测；实验各设三个平行处理。

产量曲线如图4中(A)所示，自发酵4天起，Δ7-pGS的天麻素产量趋于稳定，最高为125mg/L；发酵6天时菌株rGS3的天麻素产量达到420mg/L，然后产量趋于稳定。生长曲线见图4中(B)，Δ7-pG在发酵两天后出现下降趋势，至发酵终止，rGS的OD600相对于Δ7-pG高30％；实验结果表明基因在基因组rDNA位点的整合提高了天麻素产量，并且相对于质粒基础的天麻素产生菌Δ7-pG，更利于菌体生长。图4中(C)为发酵液检测的HPLC结果，峰I为天麻素，峰II为对羟基苄醇。

实施例7、菌株4742-pGS、Δ7-pGS、rGS3及rGS-HBA发酵天麻素产量比较

为了进一步同时比较获得的菌株产量，把所构建的四个菌株进行了同批次发酵。将菌株4742-pGS、Δ7-pGS及rGS-HBA单克隆分别在3mL的SC-ura/leu，rGS3的单克隆接种在SC-ura，30℃220rpm，摇床培养18h，得到种子液。然后各将2mL种子液分别转接入50mL的相应的液体培养基中，30℃、240rpm培养。发酵时间为144h。取发酵液进行HPLC检测；实验各设三个平行处理。

对比例为酿酒酵母BY4742和Δaro7，培养基为无营养缺陷的SC液体培养基。

各菌株发酵液进行HPLC测定，产量测定结果如图5所示，发酵培养6天含质粒的天麻素合成菌株4742-pGS天麻素产量为12mg/L，Δaro7基因敲除株Δ7-pGS天麻素产量为116mg/L，相对于4742-pGS天麻素产量提高近10倍；天麻素合成途径基因整合株rGS3天麻素产量为441mg/L，天麻素产量相对于质粒表达形式的菌株Δ7-pGS产量提高4倍；通过前体合成途径基因进一步整合的菌株rGS-HBA产量高达2100mg/L，相对于初始菌株4742-pGS提高了175倍。

在获得高效的糖基转移酶AsUGT的基础上，我们在酿酒酵母中首次构建了从头合成天麻素的人工合成途径。通过基因组整合技术和天麻素前体合成的增强，获得摇瓶发酵产量高达2.1g/L获得的工程菌株rGS-HBA，是目前为止所报道的微生物合成天麻素的最高产量，此菌株有用于工业发酵生产天麻素的潜力，或可作为进一步改造成更高产量工业株的出发株。

实施例8、天麻素检测方法及天麻素标准曲线制作

(1)产物的HPLC检测：发酵液取1mL 12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。仪器为安捷伦液相色谱仪，UV检测器；Agela Innoval C18柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；洗脱条件为10％B20min，10％到100％B 1min，100％B 10min，100％到10％B 1min，10％B 10min(％表示体积百分含量)；进样量为20μL。

(2)产物的LC-MS分析：Agilent 1260系统，Bruker micro Q-TOF II massspectrometer；其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；洗脱条件为10％B 20min，10％到100％B 1min，100％B 10min，100％到10％B 1min，10％B 10min；进样量20μl；ESI正离子源，分子量扫描范围50-800。

(3)取天麻素标品，从100mg/L起始至2000mg/L配制系列浓度，取20μl进行HPLC，以不同浓度的天麻素标品峰面积和浓度数值进行标准曲线及方程拟合；得到标准曲线方程为y＝4E-05x-39.45；R2＝0.9994，其中x为峰面积，y为浓度mg/L。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途

<130> GNCLN201409

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> Rauvolfia serpentina

<400> 1

Met Glu His Thr Pro His Ile Ala Met Val Pro Thr Pro Gly Met Gly

1 5 10 15

His Leu Ile Pro Leu Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Val Leu Arg His

20 25 30

Asn Phe Gly Val Thr Phe Ile Ile Pro Thr Asp Gly Pro Leu Pro Lys

35 40 45

Ala Gln Lys Ser Phe Leu Asp Ala Leu Pro Ala Gly Val Asn Tyr Val

50 55 60

Leu Leu Pro Pro Val Ser Phe Asp Asp Leu Pro Ala Asp Val Arg Ile

65 70 75 80

Glu Thr Arg Ile Cys Leu Thr Ile Thr Arg Ser Leu Pro Phe Val Arg

85 90 95

Asp Ala Val Lys Thr Leu Leu Ala Thr Thr Lys Leu Ala Ala Leu Val

100 105 110

Val Asp Leu Phe Gly Thr Asp Ala Phe Asp Val Ala Ile Glu Phe Lys

115 120 125

Val Ser Pro Tyr Ile Phe Tyr Pro Thr Thr Ala Met Cys Leu Ser Leu

130 135 140

Phe Phe His Leu Pro Lys Leu Asp Gln Met Val Ser Cys Glu Tyr Arg

145 150 155 160

Asp Val Pro Glu Pro Leu Gln Ile Pro Gly Cys Ile Pro Ile His Gly

165 170 175

Lys Asp Phe Leu Asp Pro Ala Gln Asp Arg Lys Asn Asp Ala Tyr Lys

180 185 190

Cys Leu Leu His Gln Ala Lys Arg Tyr Arg Leu Ala Glu Gly Ile Met

195 200 205

Val Asn Thr Phe Asn Asp Leu Glu Pro Gly Pro Leu Lys Ala Leu Gln

210 215 220

Glu Glu Asp Gln Gly Lys Pro Pro Val Tyr Pro Ile Gly Pro Leu Ile

225 230 235 240

Arg Ala Asp Ser Ser Ser Lys Val Asp Asp Cys Glu Cys Leu Lys Trp

245 250 255

Leu Asp Asp Gln Pro Arg Gly Ser Val Leu Phe Ile Ser Phe Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Ala Val Ser His Asn Gln Phe Ile Glu Leu Ala Leu Gly Leu

275 280 285

Glu Met Ser Glu Gln Arg Phe Leu Trp Val Val Arg Ser Pro Asn Asp

290 295 300

Lys Ile Ala Asn Ala Thr Tyr Phe Ser Ile Gln Asn Gln Asn Asp Ala

305 310 315 320

Leu Ala Tyr Leu Pro Glu Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys Gly Arg Cys

325 330 335

Leu Leu Val Pro Ser Trp Ala Pro Gln Thr Glu Ile Leu Ser His Gly

340 345 350

Ser Thr Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu

355 360 365

Ser Val Val Asn Gly Val Pro Leu Ile Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu

370 375 380

Gln Lys Met Asn Ala Val Met Leu Thr Glu Gly Leu Lys Val Ala Leu

385 390 395 400

Arg Pro Lys Ala Gly Glu Asn Gly Leu Ile Gly Arg Val Glu Ile Ala

405 410 415

Asn Ala Val Lys Gly Leu Met Glu Gly Glu Glu Gly Lys Lys Phe Arg

420 425 430

Ser Thr Met Lys Asp Leu Lys Asp Ala Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp

435 440 445

Asp Gly Ser Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Leu Ala Cys Lys Trp Glu

450 455 460

Asn Lys Ile Ser Ser Thr

465 470

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ser Glu Ser Pro Met Phe Ala Ala Asn Gly Met Pro Lys Val Asn

1 5 10 15

Gln Gly Ala Glu Glu Asp Val Arg Ile Leu Gly Tyr Asp Pro Leu Ala

20 25 30

Ser Pro Ala Leu Leu Gln Val Gln Ile Pro Ala Thr Pro Thr Ser Leu

35 40 45

Glu Thr Ala Lys Arg Gly Arg Arg Glu Ala Ile Asp Ile Ile Thr Gly

50 55 60

Lys Asp Asp Arg Val Leu Val Ile Val Gly Pro Cys Ser Ile His Asp

65 70 75 80

Leu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Lys Lys Leu Ser Asp

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Glu Leu Lys Gly Asp Leu Ser Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys

100 105 110

Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Val

115 120 125

Asn Asn Thr Phe Asn Ile Asn Lys Gly Leu Gln Ser Ala Arg Gln Leu

130 135 140

Phe Val Asn Leu Thr Asn Ile Gly Leu Pro Ile Gly Ser Glu Met Leu

145 150 155 160

Asp Thr Ile Ser Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Val Ser Phe Gly Ala

165 170 175

Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser

180 185 190

Gly Leu Ser Phe Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr Leu

195 200 205

Asn Val Ala Val Asp Ala Cys Gln Ala Ala Ala His Ser His His Phe

210 215 220

Met Gly Val Thr Leu His Gly Val Ala Ala Ile Thr Thr Thr Lys Gly

225 230 235 240

Asn Glu His Cys Phe Val Ile Leu Arg Gly Gly Lys Lys Gly Thr Asn

245 250 255

Tyr Asp Ala Lys Ser Val Ala Glu Ala Lys Ala Gln Leu Pro Ala Gly

260 265 270

Ser Asn Gly Leu Met Ile Asp Tyr Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp

275 280 285

Phe Arg Asn Gln Pro Lys Val Asn Asp Val Val Cys Glu Gln Ile Ala

290 295 300

Asn Gly Glu Asn Ala Ile Thr Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn

305 310 315 320

Glu Gly Asn Gln Gly Ile Pro Ala Glu Gly Lys Ala Gly Leu Lys Tyr

325 330 335

Gly Val Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Thr Thr Glu Asp

340 345 350

Val Leu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Val Arg Gln Arg Arg Glu Val Asn

355 360 365

Lys Lys

370

<210> 3

<211> 1413

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggaacata ccccacatat tgcaatggtt ccaaccccag gtatgggtca tttaattcca 60

ttagttgaat ttgcaaaacg tttagtgtta cgtcataatt ttggcgtgac ctttattatt 120

ccaaccgatg gcccattacc aaaagcacag aaaagttttt tagatgcatt accagcaggc 180

gtgaattatg ttttattacc accagttagt tttgatgatt taccagcaga tgtgcgtatt 240

gaaacccgta tttgtttaac cattacccgt agtttaccat ttgtgcgtga tgcagttaaa 300

accttattag caaccaccaa attagcagca ttagtggttg atttatttgg caccgatgca 360

tttgatgttg caattgagtt taaagtgagt ccatatattt tctatccaac caccgcaatg 420

tgtttaagtt tatttttcca tttaccaaaa ttagatcaga tggttagttg tgaatatcgt 480

gatgttccag aaccattaca gattccaggt tgtattccaa ttcatggtaa agatttttta 540

gacccagcac aggatcgtaa aaatgatgca tataaatgtt tattacatca ggcaaaacgt 600

tatcgtttag cagaaggtat tatggttaat acctttaatg acttagaacc aggtccatta 660

aaagcattac aggaagaaga tcagggcaaa ccaccagtgt atccaattgg cccattaatt 720

cgtgcagata gtagtagtaa agttgatgat tgtgaatgtt taaaatggtt agatgatcag 780

ccacgtggca gtgttttatt tattagtttt ggtagtggcg gcgcagttag tcataatcag 840

tttattgaat tagcattagg cttagaaatg agtgaacagc gttttttatg ggtggtgcgt 900

agtccaaatg ataaaattgc aaatgcaacc tatttcagta ttcagaatca gaatgatgca 960

ttagcatatt taccagaagg ctttttagaa cgtaccaaag gtcgttgttt attagttcca 1020

agttgggcac cacagaccga aattttaagt catggcagta ccggcggctt tttaacccat 1080

tgtggctgga atagtatttt agaaagtgtg gttaatggcg tgccattaat tgcatggcca 1140

ttatatgcag aacagaaaat gaatgcagtg atgttaaccg aaggcttaaa agttgcatta 1200

cgtccaaaag caggtgaaaa tggcttaatt ggccgtgttg aaattgcaaa tgcagttaaa 1260

ggtttaatgg aaggtgaaga aggcaaaaaa tttcgtagta ccatgaaaga tttaaaagat 1320

gcagcaagtc gtgcattaag tgatgatggt agtagtacca aagcattagc agaattagca 1380

tgtaaatggg aaaataagat tagtagtacc taa 1413

<210> 4

<211> 3525

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atggctgttg attctccaga tgaaagattg caaagaagaa ttgctcaatt gtttgctgaa 60

gatgaacaag ttaaagctgc tagaccattg gaagctgttt ctgctgctgt ttctgcacca 120

ggtatgagat tggctcaaat tgctgctaca gttatggctg gttatgctga tagaccagct 180

gctggtcaaa gagcttttga attgaatact gatgatgcta ctggtagaac atctttgaga 240

ttgttgccaa gatttgaaac tattacatac agagaactgt ggcaaagagt tggtgaagtt 300

gctgctgctt ggcatcatga tccagaaaat ccattaagag ctggtgactt tgttgcttta 360

ttgggtttta cttctatcga ttatgctaca ttagacttag ctgatattca tttgggtgct 420

gttactgttc cattacaagc tagtgctgct gtttcacaat tgattgctat tttgacagaa 480

acatctccaa gattgttggc ttctactcca gaacatttgg atgctgctgt tgaatgttta 540

ttggctggta caacaccaga aagattggtt gtttttgatt atcatccaga agatgatgat 600

caaagagctg cttttgaatc tgctagaaga agattggctg atgctggttc tttagttatt 660

gttgaaacat tggatgctgt tagagctaga ggtagagatt tgccagctgc tccattgttt 720

gttccagata ctgatgatga tccattagct ttgttaatat atacctctgg ttctactggt 780

acaccaaaag gtgctatgta tacaaataga ttggctgcta ctatgtggca aggtaattct 840

atgttacaag gtaattcaca aagggttggt attaatttga actatatgcc aatgtctcac 900

attgctggta gaatttcttt gtttggtgtt ttagctagag gtggtacagc ttattttgct 960

gctaaatctg atatgtctac attgtttgaa gacattggtt tagttagacc aactgaaatt 1020

ttctttgtcc caagagtttg tgatatggtt tttcaaagat accaatctga attggataga 1080

agatcagttg ctggtgctga tttggatact ttggatagag aagttaaagc tgatttgaga 1140

caaaattact tgggtggtag atttttggtt gctgttgttg gttctgctcc attagctgct 1200

gaaatgaaaa cttttatgga atctgttctg gatttgccat tacatgatgg ttatggttct 1260

actgaagctg gtgcttctgt tttattagat aatcaaatcc agaggccacc agttttggat 1320

tataaattag ttgatgtccc agaattgggt tattttagaa ctgatagacc acatccaaga 1380

ggtgaattat tgttgaaggc tgaaacaact attccaggtt attataaaag gccagaagtt 1440

actgctgaaa tttttgatga agatggtttt tacaagaccg gtgacattgt tgctgaatta 1500

gaacatgata gattggttta tgtcgataga agaaataacg ttttgaagtt gtctcaaggt 1560

gaatttgtta cagttgctca tttggaagct gtctttgctt cttctccatt gattagacaa 1620

atttttatct acggttcctc tgaaagatca tatttgttgg ctgttattgt tccaacagat 1680

gatgctttaa gaggtagaga cacagctaca ttgaaatctg ctttagctga atctattcaa 1740

agaattgcta aggatgctaa tttgcaacca tacgaaattc caagagattt tctaattgag 1800

acagaaccat tcactattgc taatggtttg ttatctggta ttgctaaatt gttaaggcca 1860

aatttgaagg aaagatatgg tgctcaatta gaacaaatgt atacagattt ggctactggt 1920

caagctgatg aattgttggc tttaagaaga gaagctgctg atttgccagt tttagaaact 1980

gtttctaggg ctgctaaagc tatgttgggt gttgcttctg ctgatatgag accagatgct 2040

cattttacag atttgggtgg tgactctttg tctgctttat ctttttctaa tctgttgcat 2100

gaaatcttcg gtgttgaagt tccagttggt gttgttgttt ctccagctaa tgaattaaga 2160

gatttggcta attacatcga agctgaaaga aattctggtg ctaaaagacc aacttttaca 2220

tctgttcatg gtggtggttc tgaaattaga gctgctgatc taactttgga taaattcatt 2280

gatgctagaa cattggctgc tgctgattct attccacatg ctccagttcc agctcaaaca 2340

gttttattaa caggtgctaa tggttatttg ggtagatttt tatgtctgga atggttagaa 2400

agattggata aaactggtgg tacattaatt tgtgttgtta gaggttctga tgctgctgct 2460

gctagaaaaa gattagattc tgcttttgat tccggtgacc caggtttgtt agaacattat 2520

caacaattgg ctgctagaac tttagaagtt ttagctggtg acattggtga cccaaatttg 2580

ggtttagatg atgctacatg gcaaagattg gctgaaactg ttgatttgat tgttcatcca 2640

gctgctttag ttaatcatgt tttgccatat actcagttgt ttggtccaaa tgttgttggt 2700

actgctgaaa tagttagatt ggctattact gctagaagaa aaccagttac atatttgtct 2760

acagttggtg ttgctgatca agttgatcca gctgaatatc aagaagattc tgatgttaga 2820

gaaatgtctg ctgttagagt tgttagagaa tcttatgcta atggttacgg taattctaaa 2880

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tttagatcag atatgatttt ggctcattct aggtatgctg gtcaattgaa tgttcaagat 3000

gtttttacaa ggttgatctt gtctttggtt gctactggta ttgctccata ttctttttat 3060

agaacagacg ctgatggtaa tagacaaaga gctcattatg atggtttgcc agctgatttt 3120

actgctgctg ctattacagc tttgggtatt caagctacag aaggttttag aacttatgat 3180

gttttgaacc catacgatga tggtatttct ttggatgaat ttgttgattg gttggttgaa 3240

tctggtcatc caattcaaag aataacagat tattccgatt ggtttcatag atttgaaaca 3300

gctattagag ctttgccaga aaaacaaaga caagctagtg ttttgccatt gttagatgct 3360

tatagaaatc catgtccagc tgttagaggt gctattttgc cagctaaaga atttcaagct 3420

gctgttcaaa ctgctaaaat tggtccagaa caagatattc cacatttgtc tgctccattg 3480

attgataaat atgtttctga tctggagttg ttgcaattat tataa 3525

<210> 5

<211> 654

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgttggatg aatctttatt tcctaattct gctaaatttt cttttattaa aactggagac 60

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<212> DNA

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<400> 6

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ttggaccctc aattgttaga ttggttgttg ttggaagatt ctatgactaa aagattcgaa 120

caacaaggta aaacagtttc tgttacaatg attagagagg gttttgttga acaaaatgaa 180

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<212> DNA

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<400> 7

atgagtgaat ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa 60

gaagatgtca gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa 120

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gataccattt ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga 540

accaccgaat ctcaactgca cagagaattg gcctccggtt tgtctttccc agttggtttc 600

aagaacggta ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat 660

tctcaccatt tcatgggtgt tactttgcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt 720

aacgaacact gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag 780

tccgttgcag aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac 840

tctcacggta actccaataa ggatttcaga aaccaaccaa aggtcaatga cgttgtttgt 900

gagcaaatcg ctaacggtga aaacgccatt accggtgtca tgattgaatc aaacatcaac 960

gaaggtaacc aaggcatccc agccgaaggt aaagccggct tgaaatatgg tgtttccatc 1020

actgatgctt gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct 1080

gtcagacaaa gaagagaagt taacaagaaa taa 1113

<210> 8

<211> 1443

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

atgggttcag aaactaggcc tttatctata ttctttttcc cttttatggc acatggtcac 60

atgattccta tggttgatat ggctagatta tttgcatctc aaggtgttag gtgtactatt 120

gttactactc caggtaatca acctttaatt gcaaggtcta ttggtaaagt tcaattattg 180

ggttttgaaa ttggtgttac tactattcca ttcagaggta cagaatttgg tttacctgat 240

ggttgtgaaa atttggattc tgttccttct cctcaacatg tttttcattt ctttgaagca 300

gcgggttctt taagggaacc atttgaacaa ttattagaag aacataaacc agattgtgtt 360

gttggagata tgttctttcc ttggtctaca gattctgctg ctaaatttgg tattcctaga 420

ttagtttttc atggtacatc atattttgca ttgtgtgcag gtgaagcagt taggattcat 480

aaaccatatt tgtcagtttc ttctgatgat gaaccatttg ttattccagg tttgccagat 540

gaaattaaat taactaaatc tcaattgcct atgcaccttt tggaaggcaa aaaagattca 600

gttttagcac aattattaga tgaagttaaa gaaactgaag tttcatctta tggtgttatt 660

gttaattcta tatacgaatt ggaacctgct tatgctgatt attttaggaa tgttttgaaa 720

agaagagctt gggaaattgg tcctttgtct ttgtgtaata gggatgttga agaaaaagca 780

atgaggggta tgcaagctgc tattgatcaa catgaatgtt taaaatggtt ggattctaaa 840

gaaccagatt ctgttgttta tgtttgtttt ggttctacat gtaaatttcc tgatgatcaa 900

ttagcagaaa ttgcttcagg tttagaagca tcaggtcaac agttcatttg ggttattaga 960

cgtatgtctg atgattctaa agaagattac cttcctaaag gttttgaaga aagagttaaa 1020

gatagagctt tgttgattag gggttgggct ccacaagttt tgattttaga tcatcaatca 1080

gttggtggtt ttgtttcaca ttgtggttgg aactctactt tagaaggtat ttcagcaggt 1140

ttacctatgg ttacttggcc agttgcagct gaacaatttt ataatgagaa attgttaact 1200

gaagttttaa aaattggtgt tgcagttggt gctaggaagt ggagacaatt agttggagat 1260

tttgttcata aagatgctat tcaaagggca gttagggaaa ttatggaagg tgaagaagca 1320

gaagaaagaa gaattattgc taggcaaatg ggaaaaatgg caaaaagggc tgttgaaaaa 1380

gatggttcat cttggactaa tttgaataac ttgttacaag aattaaaatt gaaaaaagtt 1440

taa 1443

Claims

1.一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，包括如下步骤(A1)：

(A1)使受体菌表达糖基转移酶AsUGT，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产天麻素的工程菌株；

所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木的UDP-葡萄糖基转移酶。

2.一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，包括如下步骤(A2)：

(A2)使受体菌表达糖基转移酶AsUGT、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够生产天麻素的工程菌株；

所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木的UDP-葡萄糖基转移酶；所述羧酸还原酶CAR来源于诺卡氏菌；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1来源于谷氨酸棒杆菌；所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC来源于大肠杆菌；所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L是将来源于酿酒酵母的抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4的第229位赖氨酸突变为亮氨酸后得到的突变体蛋白。

3.一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，包括如下步骤(A3)：

(A3)使受体菌不表达分支酸变位酶ARO7，表达糖基转移酶AsUGT、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够生产天麻素的工程菌株；

4.一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，包括如下步骤(A4)：

(A4)使受体菌不表达分支酸变位酶ARO7，表达糖基转移酶AsUGT、羧酸还原酶CAR、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA、转酮酶tktA、EPSP合酶ARO1、分支酸合酶ARO2和抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够生产天麻素的工程菌株；

所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木的UDP-葡萄糖基转移酶；所述羧酸还原酶CAR来源于诺卡氏菌；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1来源于谷氨酸棒杆菌；所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA和所述转酮酶tktA来源于大肠杆菌；所述EPSP合酶ARO1和所述分支酸合酶ARO2来源于酿酒酵母；所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L是将来源于酿酒酵母的抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4的第229位赖氨酸突变为亮氨酸后得到的突变体蛋白。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(A1)为：向所述受体菌中导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因，所得菌株即为所述工程菌1；和/或

所述步骤(A2)为：向所述受体菌中导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，所得菌株即为所述工程菌2；和/或

所述步骤(A3)为：敲除所述受体菌基因组中所述分支酸变位酶ARO7的编码基因，并导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，所得菌株即为所述工程菌3；和/或

所述步骤(A4)为：敲除所述受体菌基因组中所述分支酸变位酶ARO7的编码基因，并导入所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因、所述转酮酶tktA的编码基因、所述EPSP合酶ARO1的编码基因、所述分支酸合酶ARO2的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，所得菌株即为所述工程菌4。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述工程菌1中，启动所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；和/或

在所述工程菌2和所述工程菌3中，启动所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；启动所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；启动所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的启动子为P_TDH3启动子，终止所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的终止子为T_TEF终止子；启动所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的启动子为P_TDH3启动子，终止所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的终止子为T_TEF终止子；启动所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的启动子为P_PGK1启动子，终止所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的终止子为T_ADH1终止子；和/或

在所述工程菌4中，启动所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述糖基转移酶AsUGT的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；启动所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述羧酸还原酶CAR的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；启动所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的启动子为P_TDH3启动子，终止所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因转录的终止子为T_TEF终止子；启动所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的启动子为P_TDH3启动子，终止所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因转录的终止子为T_TEF终止子；启动所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因转录的启动子为P_TDH3启动子，终止所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因转录的终止子为T_TEF终止子；启动所述转酮酶tktA的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述转酮酶tktA的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；启动所述EPSP合酶ARO1的编码基因转录的启动子为P_ScTEF1启动子，终止所述EPSP合酶ARO1的编码基因转录的终止子为T_CYC1终止子；启动所述分支酸合酶ARO2的编码基因转录的启动子为P_TDH3启动子，终止所述分支酸合酶ARO2的编码基因转录的终止子为T_TEF终止子；启动所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的启动子为P_PGK1启动子，终止所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因转录的终止子为T_ADH1终止子；和/或

在所述工程菌3中，基因组的rDNA位置整合有所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因；和/或

在所述工程菌4中，基因组的rDNA位置整合有所述糖基转移酶AsUGT的编码基因、所述羧酸还原酶CAR的编码基因、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因，且基因组的δDNA位置整合有所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因、所述转酮酶tktA的编码基因、所述EPSP合酶ARO1的编码基因和所述分支酸合酶ARO2的编码基因和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述受体菌为酵母菌；

进一步地，所述酵母菌为酿酒酵母；

更进一步地，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4272；

和/或

所述糖基转移酶AsUGT为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质，或为SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述羧酸还原酶CAR为氨基酸序列如NCBI中序列号Q6RKB1所示的蛋白质，或为NCBI中序列号Q6RKB1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号Q6RKB1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号Q6RKB1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1为氨基酸序列如NCBI中序列号WP_003857486所示的蛋白质，或为NCBI中序列号WP_003857486经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号WP_003857486具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号WP_003857486所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC为氨基酸序列如NCBI中序列号AAY88959所示的蛋白质，或为NCBI中序列号AAY88959经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号AAY88959具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号AAY88959所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA为氨基酸序列如NCBI中序列号NP_416217所示的蛋白质，或为NCBI中序列号NP_416217经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号NP_416217具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号NP_416217所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述转酮酶tktA为氨基酸序列如NCBI中序列号YP_026188所示的蛋白质，或为NCBI中序列号YP_026188经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号YP_026188具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号YP_026188所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述EPSP合酶ARO1为氨基酸序列如NCBI中序列号NP_010412所示的蛋白质，或为NCBI中序列号NP_010412经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号NP_010412具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号NP_010412所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述分支酸合酶ARO2为氨基酸序列如NCBI中序列号NP_011367所示的蛋白质，或为NCBI中序列号NP_011367经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与NCBI中序列号NP_011367具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在NCBI中序列号NP_011367所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或

所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质，或为SEQ ID No.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

和/或

所述糖基转移酶AsUGT的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.3所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.3所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子；或

所述羧酸还原酶CAR的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.4所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号Q6RKB1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.4所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号Q6RKB1所示的蛋白质的DNA分子；或

所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.5所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号WP_003857486所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.5所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号WP_003857486所示的蛋白质的DNA分子；或

所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.6所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号AAY88959所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.6所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号AAY88959所示的蛋白质的DNA分子；或

所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA的编码基因为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:946209所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:946209所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号NP_416217所示的蛋白质的DNA分子，或与Gene ID:946209所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号NP_416217所示的蛋白质的DNA分子；或

所述转酮酶tktA的编码基因为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:947420所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:947420所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号YP_026188所示的蛋白质的DNA分子，或与Gene ID:947420所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号YP_026188所示的蛋白质的DNA分子；或

所述EPSP合酶ARO1的编码基因为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:851705所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:851705所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号NP_010412所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ Gene ID:851705所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号NP_010412所示的蛋白质的DNA分子；或

所述分支酸合酶ARO2的编码基因为核苷酸序列如Gene Bank中Gene ID:852729所示的DNA分子，或在严格条件下与Gene ID:852729所示的DNA分子杂交且编码NCBI中序列号NP_011367所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ Gene ID:852729所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码NCBI中序列号NP_011367所示的蛋白质的DNA分子；或

所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的编码基因为核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.7所示的DNA分子杂交且编码SEQ IDNo.2所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.7所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子。

8.利用权利要求1-7中任一所述方法构建得到的工程菌株。

9.如下任一应用：

(B1)权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT或其相关生物材料在以对羟基苄醇为底物合成天麻素中的应用；

(B2)权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在合成天麻素中的应用；

(B3)权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA、所述转酮酶tktA、所述EPSP合酶ARO1、所述分支酸合酶ARO2和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在合成天麻素中的应用；

(B4)权利要求8所述的工程菌株在生产天麻素中的应用；

(B5)权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT或其相关生物材料在构建权利要求8所述的工程菌株中的应用；

(B6)权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在构建权利要求8所述的工程菌株中的应用；

(B7)权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT、所述羧酸还原酶CAR、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PPTcg-1、所述分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC、所述磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA、所述转酮酶tktA、所述EPSP合酶ARO1、所述分支酸合酶ARO2和所述抗反馈抑制DAHP合成酶ARO4突变体ARO4^K229L的组合或其相关生物材料在构建权利要求8所述的工程菌株中的应用；

所述相关生物材料为编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

10.一种生产天麻素的方法，为如下任一：

(C1)包括如下步骤：利用权利要求1-7任一中所述的糖基转移酶AsUGT催化对羟基苄醇的酚羟基糖基化，进而生成天麻素；

(C2)包括如下步骤：将权利要求1-7任一中所述工程菌1在含有葡萄糖和对羟基苄醇的体系中进行发酵培养，从发酵产物中获得天麻素；

(C3)包括如下步骤：将权利要求1-7任一中所述工程菌2、所述工程菌3或所述工程菌4在含有葡萄糖的体系中进行发酵培养，从发酵产物中获得天麻素。