CN115058400A

CN115058400A - 来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用

Info

Publication number: CN115058400A
Application number: CN202210409803.7A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 占杨杨; 李乐怡; 李智; 许海霞; 蔡冬波
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2042-04-19
Also published as: CN115058400B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用，所述的糖基转移酶RrUGT3的序列为SEQ ID NO.2所示。将编码SEQ ID NO.2的基因转入地衣芽胞杆菌中，在发酵培养基中添加对羟基苯甲醇进行发酵，即可获得生物发酵的天麻素，能高效且专一性转化对羟基苯甲醇合成天麻素，为微生物转化法工业化生产天麻素奠定基础。

Description

来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用。

背景技术

糖基化反应是指在糖基转移酶(Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y)的催化下将活化的糖分子连接到受体分子上，改变受体分子的活性、增加受体分子的水溶性及分泌性等。糖基化是植物次生代谢中的关键反应之一，是影响植物天然产物生物活性的重要因素。植物源中药中有很多重要活性成分都是糖基化的产物，比如天麻活性成分天麻素，红景天的活性成分红景天苷，柳树皮中活性成分水杨苷等。由于糖基转移酶在植物天然产物糖基化和生理功能中发挥的关键作用及其在生物技术中潜在的应用价值，越来越受到人们的关注。

糖基转移酶(GTs)根据序列相似性、特征结构域、糖苷键立体构型以及底物特异性等可以分成92个家族。尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGTs)属于家族1，其广泛存在于植物、动物、真菌、细菌以及病毒中，催化供体糖基基团转移至小分子受体上，这些小分子受体如次级代谢物、生物或非生物毒素、植物激素等。天麻素(Gastrodin)，化学名为 4-(hydroxymethyl)phenyl beta-D-glucopyranoside，分子式为C13H18O7，分子量为286.1053， CAS号为62499-27-8。天麻素具有镇静、抗惊厥、抗炎、镇痛、扩张血管、抗氧化、增强机体免疫功能和抗老年痴呆等作用，在临床上广泛应用于神经衰弱及神经衰弱综合症、眩晕、头痛及癫痈的辅助治疗。目前，天麻素的生产主要是从天麻块茎中提取或者通过化学合成或，然而，植物提取存在资源限制，占用耕地等问题，化学合成存在高副产物、污染严重等问题。

通过微生物细胞直接转化及组织培养生产天麻素等仅处于实验室研究阶段，存在周期长、产量低等问题。Bai等研究人员从红景天植物中克隆得到UGT73B6及其突变体体UGT73B6^F389A等3个天麻素合成相关的葡萄糖基转移酶。在大肠杆菌中过表达这三个酶，发现只有UGT73B6能催化合成红景天苷，而且催化效率较低，添加2mM酪醇时UGT73B6 底物转化率只有6％。Fan等研究芽胞杆菌糖基转移酶YjiC可以催化对羟基苯甲醇同时合成天麻素和4-hydroxyphenylmethyl-β-D-glucopyranoside，比例为0.88:1。因此，目前报道的合成天麻素的糖基转移酶存在专一性不高或者活性不强的问题。

RrUGT3来源于玫瑰植物中的一种糖基转移酶，是家族1中的一员。Liu等研究表明RrUGT可以催化酪醇发生糖基化，生成淫羊藿次苷D2，尚未报道关于该酶对其他底物的催化作用，特别是没有关于其催化对羟基苯甲醇的酚羟基发生糖基化生成天麻素的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用，所述的糖基转移酶RrUGT3的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。以克服现有技术中天麻素催化效率较低，专一性差的问题。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用，所述的糖基转移酶RrUGT3的序列为SEQ ID NO.2所示，应用过程包括将编码SEQ ID NO.2的基因转入地衣芽胞杆菌中，在发酵培养基中添加对羟基苯甲醇进行发酵，即可获得生物发酵的天麻素；

以上所述的应用中，优选的，所述的基因为SEQ ID NO.1所示；

以上所述的应用中，所述的地衣芽胞杆菌为现有技术报道过的任意地衣芽胞杆菌；

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02(CCTCCNO： M208065，CN101875950A)。

以上所述的应用中，优选的，所述的发酵培养基为，1L：葡萄糖20-100g，Na₂HPO₄·12H₂O 5-20g，KH₂PO₄1-10g，NH₄Cl1-10g，MgSO₄·7H₂O 0.1-5g，NaCl 0.1-5g，柠檬酸钠0.1-5g， FeCl₃·6H₂O 1-100mg，ZnCl₂1-100mg，MnCl₂·4H₂O 1-100mg，NaMoO₄·7H₂O 1-100mg，CoCl₂·6H₂O 1-100mg，CuSO₄·5H₂O 1-100mg，pH6-8；

以上所述的应用中，优选的，添加的对羟基苯甲醇在发酵培养基中的浓度为1-10g/L。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的糖基转移酶RrUGT3能高效且专一性转化对羟基苯甲醇合成天麻素，为微生物转化法工业化生产天麻素奠定基础。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在地衣芽胞杆菌或其他宿主中表达RrUGT3的本领域常用的各种表达载体，例如pHY300PLK和pET系列质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，在此不再赘述。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，大肠杆菌DH5α可市售获得，使用到的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌 WX-02(CCTCC NO：M208065，CN101875950A)。地衣芽胞杆菌WX-02用于本发明中糖基转移酶RrUGT3基因的表达，大肠杆菌DH5α用于基因RrUGT3克隆。大肠杆菌-芽胞杆菌穿梭表达载体pHY300PLK购自Novagen，所述质粒携带来自于玫瑰并根据地衣芽胞杆菌进行密码子优化的糖基转移酶RrUGT3蛋白的编码基因(SEQ ID NO.1所示)。

实施例里采用的培养基配方如下：

固体培养基配方(1L)：酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g。，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。

LB培养基配方(1L)：酵母提取粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。

基本盐培养基配方(1L)：葡萄糖80g，Na₂HPO₄·12H₂O 15.1g，KH₂PO₄5g，NH₄Cl3g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，NaCl 0.5g，柠檬酸钠1g，FeCl₃·6H₂O 13.5mg，ZnCl₂17mg，MnCl₂·4H₂O10mg，NaMoO₄·7H₂O 6mg，CoCl₂·6H₂O 6mg，CuSO₄·5H₂O 4.3mg，pH 7.0，115℃灭菌20 min。

产物天麻素分析方法：

样品制备：将发酵得到的上清液用超纯水按一定比例稀释后，使用0.22μm的水系滤膜过滤。

天麻素液相检测方法：使用岛津PAD检测器(224nm)，依利特Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)通过高效液相色谱仪(HPLC，岛津Nexera XR系列)测量上清液中的天麻素浓度。流动相为0.1％甲酸和甲醇(体积比为8:2)，流速0.6mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL，检测波长为224nm。以天麻素的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，即得天麻素的标准曲线，根据标准曲线计算天麻素产量。

实施例1：

pHY-RrUGT3表达质粒构建

根据Genbank提供RrUGT3(MF674528.1)蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示，进行地衣芽胞杆菌中密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的基因由南京金斯瑞科技有限公司合成。合成后的基因利用引物RrUGT3-F/R经PCR扩增回收，以载体pHY-kivD模板，该载体来源于文献ZhanY,et al.Efficient synthesis of 2-phenylethanol from L-phenylalanine by engineered Bacillus licheniformis usingmolasses as carbon source.Appl Microbiol Biotechnol.2020.104(17):7507-7520，利用引物T5-PbacA-F/R扩增载体骨架，骨架进行切胶回收。将回收的基因片段和载体骨架参照试剂盒的说明书进行连接，转化大肠杆菌 DH5α，提取质粒，测序验证获得正确质粒pHY-RrUGT3。

RrUGT3-F：aaaaaggagaatttttatatgagcggcacaccgcat

RrUGT3-R：tccgtcctctctgctcttttaatgtttcattgagct

T5-PbacA-F：ataaaaattctcctttttgataaa

T5-PbacA-R：aagagcagagaggacggatttcctg

实施例2：

RrUGT3生物转化底物对羟基苯甲醇合成天麻素

将不含基因的空质粒pHY300PLK及表达质粒pHY-RrUGT3至分别转入地衣芽胞杆菌WX-02中，得菌株WX-02/pHY300、WX-02/pHY-RrUGT3。WX-02/pHY300和 WX-02/pHY-RrUGT3菌株分别接种至含20mg/L四环素的液体LB培养基中37℃培养过夜， 0.5mL过夜培养物接种50mL的基本盐培养基(每升基本盐培养基含有：葡萄糖80g， Na₂HPO₄·12H₂O 15.1g，KH₂PO₄5g，NH₄Cl3g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，NaCl 0.5g，柠檬酸钠1g， FeCl₃·6H₂O 13.5mg，ZnCl₂17mg，MnCl₂·4H₂O 10mg，NaMoO₄·7H₂O 6mg，CoCl₂·6H₂O 6mg， CuSO₄·5H₂O 4.3mg，pH 7.0)，并添加终浓度为1-10g/L(具体见表1)的底物对羟基苯甲醇，然后置37℃培养60小时。发酵液上清进行HPLC分析产物天麻素含量。实验设三个重复。

HPLC图谱显示，WX-02/pHY-RrUGT3菌株发酵液检测到天麻素保留时间Rt为10min，确定WX-02/pHY-RrUGT3催化酪醇的醇羟基发生糖基化生成天麻素，色谱图中只有天麻素一种产物，并没有4-hydroxyphenylmethyl-β-D-glucopyranoside的产生，专一性合成天麻素。发酵中添加7g/L以下的对羟基苯甲醇，天麻素的转化率均大于92％，当对羟基苯甲醇添加到7g/L时，天麻素产量最高达到14.15g/L(表1)，是目前报道的最高水平，且远高于目前文献及专利所报道的转化效率。

表1 添加不同底物浓度天麻素合成水平

实施例3：

不同来源的糖基转移酶的天麻素合成能力：

对比例1：糖基转移酶YjiC来源于地衣芽胞杆菌WX-02

参照实施例1的内容，以pHY-kivD为质粒模板，利用引物T5-PbacA-F/R扩增载体骨架；以地衣芽胞杆菌WX-02基因组为模板，利用引物yjiC-F和yjiC-R扩增地衣芽胞杆菌WX-02 的糖基转移酶基因yjiC，将其克隆至表达载体pHY300中，构建重组载体pHY-yjiC，转入地衣芽胞杆菌WX-02中，构建重组菌株WX-02/pHY-yjiC。WX-02/pHY-yjiC菌株分别接种至含20mg/L四环素的液体LB培养基中37℃培养过夜，0.5mL过夜培养物接种50mL的基本盐培养基(每升基本盐培养基含有：葡萄糖80g，Na₂HPO₄·12H₂O 15.1g，KH₂PO₄5g，NH₄Cl3g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，NaCl 0.5g，柠檬酸钠1g，FeCl₃·6H₂O 13.5mg，ZnCl₂17mg，MnCl₂·4H₂O10mg，NaMoO₄·7H₂O 6mg，CoCl₂·6H₂O 6mg，CuSO₄·5H₂O 4.3mg，pH 7.0)，并添加终浓度为3g/L的底物对羟基苯甲醇，然后置37℃培养60小时。

发酵液上清进行HPLC分析产物天麻素含量。实验设三个重复。产生了2.09±0.48g/L 的天麻素和2.45±0.29g/L4-hydroxyphenylmethyl-β-D-glucopyranoside(表2)。

糖基转移酶基因yjiC的扩增引物为：

yjiC-F：aaaaaggagaatttttatatgggccaaaaacatatc

yjiC-R：tccgtcctctctgctcttttatttcactcctgccggtg

对比例2：糖基转移酶RrUGT33来源于玫瑰、糖基转移酶AtUGT85A1来源于拟南芥、糖基转移酶OsSGT1来源于水稻

参照实施例1的内容，以pHY-kivD为质粒模板，利用引物T5-PbacA-F/R扩增载体骨架；分别以玫瑰，拟南芥和水稻的基因组DNA为模板，扩增糖基转移酶RrUGT33基因(引物为RrUGT33-F和RrUGT33-R)，糖基转移酶AtUGT85A1基因(引物为Atugt85a1-F和Atugt85a1-R)和糖基转移酶OsSGT1基因(引物为OsSGT1-F和OsSGT1-R)，以此分别构建pHY-RrUGT33、pHY-AtUGT85A1和pHY-OsSGT1。将其转化至WX-02中，获得 WX-02/pHY-yjiC、WX-02/pHY-RrUGT33、WX-02/pHY-AtUGT85A1和WX-02/pHY-OsSGT1。上述重组菌株分别接种至含20mg/L四环素的液体LB培养基中37℃培养过夜，0.5mL过夜培养物接种50mL的基本盐培养基(每升基本盐培养基含有：葡萄糖80g，Na₂HPO₄·12H₂O 15.1g，KH₂PO₄5g，NH₄Cl3g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，NaCl 0.5g，柠檬酸钠1g，FeCl₃·6H₂O 13.5mg， ZnCl₂17mg，MnCl₂·4H₂O10mg，NaMoO₄·7H₂O 6mg，CoCl₂·6H₂O 6mg，CuSO₄·5H₂O 4.3 mg，pH 7.0)，并添加终浓度为3g/L的底物对羟基苯甲醇，然后置37℃培养60小时。

发酵液上清进行HPLC分析产物天麻素含量。实验设三个重复。表达RrUGT33的菌株只产生0.5g/L天麻素和0.6g/L4-hydroxyphenylmethyl-β-D-glucopyranoside，然而表达AtUGT85A1和OsSGT1的菌株不能催化对羟基苯甲醇合成天麻素，只能产生 4-hydroxyphenylmethyl-β-D-glucopyranoside(表2)。

RrUGT33-F：aaaaaggagaatttttat atgagcctgatcgaaaaac

RrUGT33-R：tccgtcctctctgctcttttatctgatatgtttcgtt

Atugt85a1-F：aaaaaggagaatttttatatgggcagccagatcatt

Atugt85a1-R：tccgtcctctctgctcttttaatcttgtgatttctg

OsSGT1-F：aaaaaggagaatttttat atggcgagcagcgaaaga

OsSGT1-R：tccgtcctctctgctcttttatttaaattttctatcc

表2 不同来源糖基转移酶催化3g/L对羟基苯甲醇合成天麻素的情况

a:ND＝not detected

序列表

<110> 湖北大学

<120> 来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcggca caccgcatat cgccattctt ccgtcaccgg gcatgggaca tctgattccg 60

atggcagaat ttgcgaaaag actggtccat catcataact ttagcatcac gtttgtcatt 120

ccgacagatg gaccgccgag ctcagcgtat cagcaagtcc ttacgtcact gccgagctca 180

atcgaccata tttttcttcc gcaggtcgat ctgacagacg tcgtcagcca atcaccggcc 240

catccgcgga tcgaaacgct tattagcctg acagtcgcac gctcacttag ctcactgaga 300

acgacactta gctcactgca gagctcaaaa aatcttgtca gcctggtcgt cgatcttttt 360

ggcacggatg cgtttgaccc ggccatcgaa ctgggaattt caccgtatat ctttttcccg 420

agcacggcca tgacactgtc actttttctg tatatgccgc agcttgataa aagcgtcacg 480

tgcgaattta gacatatgac agacctggtt agaatcccgg gatgcgtccc ggtcagagga 540

agcgatcttt ttgacccggt ccaagataga acagacgaag cgtataaatg ggtcattcat 600

catagcaacc gctatccgat ggccgaaggc gtcatcgaaa attcatttat ggaactggaa 660

catggagcac ttaaatatct gcagacggtc caaagcggca aacctccggt ctatgcggtc 720

ggaccgctta ttaaaatgga ttatgacgtc gatgacagcg gctcaaaaat cattgaatgg 780

cttgatgacc agccggtcgg cagcgtcctg tttgtcagct ttggatcagg cggaacgctg 840

tcatatgaac aaatgacaga acttgcccat ggactggaaa gctcacagca acggtttctt 900

tgggtcgtcc gcagcccgaa ccaaatcccg aattcaacgt attttagcgt ccagtcacaa 960

aaagatccgc ttgcatatct gccggaaggc tttcttaacc ggacagaagg ccgcggactg 1020

gtcgtcagca attgggcccc gcaggcacaa attctgagcc atggctcaac gggcggattt 1080

atgtcacatt gcggatggaa cagcatcctg gaatcagtcg tccatggagt cccgatcatt 1140

gcgtggccgc tttatgccga acagaaaatg aatagcatca ttgtcgtcga agatgtcaaa 1200

gtcgcactta gaccggcggg cgtcggagaa agagtcgtcg aacggagcga aatcacagcc 1260

gtcgtcaaag cactgatgga aggcgaagaa ggcaagaaag tccgcaacag aatgaaagaa 1320

cttaaagaag cggcggcaag agcagtcagc gatgatggag cgtcaacgat cgcgattgcc 1380

gacctggcgc aaaaatggcg cagctcaatg aaacattaa 1419

<210> 2

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Gly Thr Pro His Ile Ala Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Gly

1 5 10 15

His Leu Ile Pro Met Ala Glu Phe Ala Lys Arg Leu Val His His His

20 25 30

Asn Phe Ser Ile Thr Phe Val Ile Pro Thr Asp Gly Pro Pro Ser Ser

35 40 45

Ala Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Ile Asp His Ile

50 55 60

Phe Leu Pro Gln Val Asp Leu Thr Asp Val Val Ser Gln Ser Pro Ala

65 70 75 80

His Pro Arg Ile Glu Thr Leu Ile Ser Leu Thr Val Ala Arg Ser Leu

85 90 95

Ser Ser Leu Arg Thr Thr Leu Ser Ser Leu Gln Ser Ser Lys Asn Leu

100 105 110

Val Ser Leu Val Val Asp Leu Phe Gly Thr Asp Ala Phe Asp Pro Ala

115 120 125

Ile Glu Leu Gly Ile Ser Pro Tyr Ile Phe Phe Pro Ser Thr Ala Met

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Phe Leu Tyr Met Pro Gln Leu Asp Lys Ser Val Thr

145 150 155 160

Cys Glu Phe Arg His Met Thr Asp Leu Val Arg Ile Pro Gly Cys Val

165 170 175

Pro Val Arg Gly Ser Asp Leu Phe Asp Pro Val Gln Asp Arg Thr Asp

180 185 190

Glu Ala Tyr Lys Trp Val Ile His His Ser Asn Arg Tyr Pro Met Ala

195 200 205

Glu Gly Val Ile Glu Asn Ser Phe Met Glu Leu Glu His Gly Ala Leu

210 215 220

Lys Tyr Leu Gln Thr Val Gln Ser Gly Lys Pro Pro Val Tyr Ala Val

225 230 235 240

Gly Pro Leu Ile Lys Met Asp Tyr Asp Val Asp Asp Ser Gly Ser Lys

245 250 255

Ile Ile Glu Trp Leu Asp Asp Gln Pro Val Gly Ser Val Leu Phe Val

260 265 270

Ser Phe Gly Ser Gly Gly Thr Leu Ser Tyr Glu Gln Met Thr Glu Leu

275 280 285

Ala His Gly Leu Glu Ser Ser Gln Gln Arg Phe Leu Trp Val Val Arg

290 295 300

Ser Pro Asn Gln Ile Pro Asn Ser Thr Tyr Phe Ser Val Gln Ser Gln

305 310 315 320

Lys Asp Pro Leu Ala Tyr Leu Pro Glu Gly Phe Leu Asn Arg Thr Glu

325 330 335

Gly Arg Gly Leu Val Val Ser Asn Trp Ala Pro Gln Ala Gln Ile Leu

340 345 350

Ser His Gly Ser Thr Gly Gly Phe Met Ser His Cys Gly Trp Asn Ser

355 360 365

Ile Leu Glu Ser Val Val His Gly Val Pro Ile Ile Ala Trp Pro Leu

370 375 380

Tyr Ala Glu Gln Lys Met Asn Ser Ile Ile Val Val Glu Asp Val Lys

385 390 395 400

Val Ala Leu Arg Pro Ala Gly Val Gly Glu Arg Val Val Glu Arg Ser

405 410 415

Glu Ile Thr Ala Val Val Lys Ala Leu Met Glu Gly Glu Glu Gly Lys

420 425 430

Lys Val Arg Asn Arg Met Lys Glu Leu Lys Glu Ala Ala Ala Arg Ala

435 440 445

Val Ser Asp Asp Gly Ala Ser Thr Ile Ala Ile Ala Asp Leu Ala Gln

450 455 460

Lys Trp Arg Ser Ser Met Lys His

465 470

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaggaga atttttatat gagcggcaca ccgcat 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgtcctct ctgctctttt aatgtttcat tgagct 36

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ataaaaattc tcctttttga taaa 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagagcagag aggacggatt tcctg 25

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaggaga atttttatat gggccaaaaa catatc 36

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccgtcctct ctgctctttt atttcactcc tgccggtg 38

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaaaggaga atttttatat gagcctgatc gaaaaac 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccgtcctct ctgctctttt atctgatatg tttcgtt 37

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaaaggaga atttttatat gggcagccag atcatt 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccgtcctct ctgctctttt aatcttgtga tttctg 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaaaggaga atttttatat ggcgagcagc gaaaga 36

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccgtcctct ctgctctttt atttaaattt tctatcc 37

Claims

1.SEQ ID NO.2所示蛋白，或编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因在生物合成天麻素中的应用，应用过程包括将编码SEQ ID NO.2的基因转入地衣芽胞杆菌中，在发酵培养基中添加对羟基苯甲醇进行发酵，即可获得生物发酵的天麻素。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的基因为SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02。

4.根据权利要求1所述的应用，所述的发酵培养基为，1L：葡萄糖20-100 g，Na₂HPO₄·12H₂O 5-20 g，KH₂PO₄1-10 g，NH₄Cl1-10 g，MgSO₄·7H₂O 0.1-5g，NaCl 0.1-5 g，柠檬酸钠0.1-5 g，FeCl₃·6H₂O 1-100 mg，ZnCl₂1-100 mg，MnCl₂·4H₂O 1-100 mg，NaMoO₄·7H₂O 1-100 mg，CoCl₂·6H₂O 1-100 mg，CuSO₄·5H₂O 1-100mg，pH6-8。

5.根据权利要求1所述的应用，添加的对羟基苯甲醇在发酵培养基中的浓度为1-10g/L。