CN114921431B - 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用 - Google Patents

糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114921431B
CN114921431B CN202210490385.9A CN202210490385A CN114921431B CN 114921431 B CN114921431 B CN 114921431B CN 202210490385 A CN202210490385 A CN 202210490385A CN 114921431 B CN114921431 B CN 114921431B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glu
mutant
ala
leu
aromatic alcohol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210490385.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114921431A (zh
Inventor
陈守文
李智
占杨杨
赵晶
蔡冬波
王冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Yinchuang Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Hubei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University filed Critical Hubei University
Priority to CN202210490385.9A priority Critical patent/CN114921431B/zh
Publication of CN114921431A publication Critical patent/CN114921431A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114921431B publication Critical patent/CN114921431B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用，所述突变体的氨基酸为SEQ ID NO.1所示。相比野生型，突变体T9(A13W/I67F/A80W)或者表达其的微生物可催化酪醇，对羟基苯甲醇通过糖基转移反应来制备高纯度的芳香醇糖苷，区域选择性大于90％，因此本发明提供的突变体在芳香醇糖苷的合成方面具有应用价值，可减少分离纯化目标产物的成本。

Description

糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用。
背景技术
芳香醇糖苷是一类植物源天然产物，具有免疫调节、抗疲劳、抗衰老、保护心血管、杀伤癌细胞，保护神经系统等多种药理活性，具有广泛的应用前景。酪醇糖苷是一类植物源天然产物，是以酪醇(对羟基苯乙醇，Tyrosol)为苷元，葡萄糖为糖配基合成的糖苷类化合物。分别对酪醇的醇羟基和对位的乙羟基糖基化，会得到两个互为同分异构体的糖苷化合物淫羊藿次苷D2(Icariside D2)和红景天苷(对羟基苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Salidroside)，分子式为C14H20O7，分子量为300。文献报道，酪醇糖苷具有免疫调节、抗疲劳、抗衰老、保护心血管、杀伤癌细胞，保护神经系统等多种药理活性，具有广泛的应用前景。芳香醇糖苷是一类药用植物的活性成分，具有抗疲劳、缓解神经衰弱、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和消炎等多种生物学活性，在医药、保健、化妆品和功能食品领域具有广泛应用，如淫羊藿中的淫羊藿次苷D2、红景天中的红景天苷和天麻中的天麻素。目前芳香醇糖苷主要通过植物提取和化学合成法合成。从天然植物中提取糖苷类化合物的工艺复杂，而且天然植物中糖苷类化合物的含量低，提取成本较高。化学合成的方法在生产过程中所使用的试剂及产生的副产物大多对环境有污染，无法实现环境可持续性，因此近年来酶法或微生物发酵法合成糖苷类化合物受到了越来越多的关注。
目前黄酮苷的来源有三种途径，一是从植物中提取分离，但是许多具有良好活性的黄酮苷在植物中的含量较低；二是化学合成方法，化学合成法又分为全合成和半合成，但通常黄酮苷产率低，选择性差，需要官能团的多步保护和去保护作用，因此难以实现多种黄酮类化合物的合成应用；三是酶催化生物合成方法，酶催化生物合成法因操作简单、条件温和、副产物少、收率高和高效绿色环保等特点而广受关注。目前酶催化生物合成黄酮苷最常用的酶有两种：糖基转移酶和糖苷合成酶。黄酮苷通常是通过植物和微生物中的糖基转移酶将活性糖供体上的糖分子转移到黄酮类受体来催化合成的，并且黄酮类化合物的骨架上的任一羟基都可糖基化，不同位置上的糖基化对其生物活性及对人体健康的潜在益处具有重大影响。
以芳香醇为前体，在糖基转移酶的作用下进行糖基化反应，生成芳香醇糖苷。对于含多个羟基的芳香醇化合物(例如酪醇、对羟基苯甲醇、羟基酪醇和白藜芦醇)，目前筛选到的糖基转移酶主要来源于植物，在微生物中表达活性不高，合成效率较低，另一方面糖基转移酶催化常获得不同比例的混合糖苷，如何控制糖基转移酶的区域选择性，获得单一芳香醇糖苷产物是本领域研究中的关键问题。采用糖基转移酶可直接利用活性供体上的糖分子催化合成黄酮苷。由于许多糖基转移酶区域选择性专一和底物特异性，使用单一的糖基转移酶很难实现底物的不同位点的糖基化，这在一定程度上限制了结构多样的黄酮苷的合成。
本发明旨在通过蛋白质工程手段改造地衣芽胞杆菌来源的糖基转移酶YjiC，提高区域选择性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶YjiC突变体T9(A13W/I67F/A80W)，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶YjiC突变体T9的基因。
本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达上述的糖基转移酶Y jiC突变体T9。
本发明最后一个目的在于提供了上述的糖基转移酶YjiC突变体T9在发酵生产芳香醇糖苷中的应用。
为了到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种糖基转移酶YjiC突变体T9，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
编码上述糖基转移酶YjiC突变体T9的基因也属于本发明的保护范围，所述的基因优选的为SEQ ID NO.2所示。
表达SEQ ID NO.1所示蛋白的基因工程菌也属于本发明的保护范围，所述的基因工程菌优选的，为地衣芽胞杆菌。
糖基转移酶YjiC突变体T9在发酵生产芳香醇糖苷中的应用，包括将编码SEQ IDNO. 1所示氨基酸的基因转入地衣芽胞杆菌中，在发酵培养基中添加含多个羟基的芳香醇化合物作为底物进行发酵，即可获得芳香醇糖苷。
以上所述的地衣芽胞杆菌，优选的，包括地衣芽胞杆菌WX-02(CCTCC NO：M208065，CN101875950A)，或地衣芽胞杆菌DW2(或称为地衣芽孢杆菌DW2，CN112226437 A)。
以上所述的应用中，所述的含多个羟基的芳香醇化合物包括但不限于：酪醇、对羟基苯甲醇、羟基酪醇，白藜芦醇等。
以上所述的应用中，添加了芳香醇化合物的发酵培养基为：葡萄糖20-100g/L，芳香醇化合物0.1-10g/L，Na2HPO4·12H2O 5-20g/L，KH2PO41-10g/L，NH4Cl1-10g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，NaCl 0.1-5g/L，柠檬酸钠0.1-5g/L，FeCl3·6H2O 1-100mg/L，ZnCl21-100 mg/L，MnCl2·4H2O 1-100mg/L，NaMoO4·7H2O 1-100mg/L，CoCl2·6H2O 1-100mg/L，C uSO4·5H2O 1-100mg/L，pH6-8，所述的芳香醇化合物为酪醇、对羟基苯甲醇、羟基酪醇，或白藜芦醇。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明是使用具有广底物谱，区域选择性差的来源于地衣芽胞杆菌的糖基转移酶YjiC进行蛋白质工程改造，获得的突变T9(A13W/I67F/A80W)，以表达糖基转移酶T9的重组地衣芽胞杆菌作为生物催化剂，与表达野生YjiC相比，以酪醇作为底物，得到产物淫羊藿次苷 D2，产率从近65％提高到90.4％。
(2)该酶经过改造后，其突变体T9对于底物对羟基苯甲醇，苄醇，羟基酪醇和白藜芦醇与野生型的区域选择性不同，具有较高的区域选择性与转化率，具有重要的应用价值。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例里采用的培养基配方如下：
固体培养基配方(1L)：酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉15g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。
LB培养基配方(1L)：酵母提取粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。
基本盐培养基配方：葡萄糖80g/L，芳香醇底物2g/L，Na2HPO4·12H2O 15.1g/L，KH2PO45g/L，NH4Cl3g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，柠檬酸钠1g/L，FeCl3·6 H2O13.5mg/L，ZnCl217mg/L，MnCl2·4H2O 10mg/L，NaMoO4·7H2O 6mg/L，CoCl2·6 H2O 6mg/L，CuSO4·5H2O 4.3mg/L，pH 7.0，115℃灭菌20min。
产物芳香醇糖苷分析方法：
样品制备：将发酵得到的上清液用超纯水按一定比例稀释后，使用0.22μm的水系滤膜过滤。
芳香醇糖苷液相检测方法：使用高效液相色谱仪(HPLC，岛津Nexera XR系列)和岛津PAD检测器(224nm)，色谱柱为大连依利特Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250 mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸和甲醇(体积比为8:2)，流速0.6mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL，检测波长为224nm。以芳香醇糖苷的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，即得芳香醇糖苷的标准曲线，根据标准曲线计算不同芳香醇糖苷产量。
实施例1：
糖基转移酶YjiC野生型表达菌株构建
(1)以地衣芽胞杆菌WX-02(CCTCC NO：M208065，CN101875950A)基因组中yjiC基因序列，如SEQ ID NO.4所示，编码SEQ ID NO.3所示蛋白，设计引物。以WX-02基因组 DNA为模板进行PCR扩增，获得yjiC片段，与pHY300PLK质粒通过Gibison连接，转化大肠杆菌DH5α，转化产物涂布于含四环素抗性LB固体培养基，于37℃培养18h，在LB 固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃过夜培养后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒pHY-yjiC；将测序正确的重组质粒pHY-yjiC转化地衣芽胞杆菌WX-02中，即获得地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-yjiC。
扩增yjiC引物如下：
yjiC-F:gacatttccccgaaaagtatgggccaaaaacatatc
yjiC-R:ctgtcagaccaagtttacgagtcatttttagcaccg
扩增pHY300PLK骨架引物如下：
T5-pHY-F:tttttaacctcccgttatttttcgc
T5-pHY-R:aagagcagagaggacggatttcctg
实施例2：
糖基转移酶YjiC突变型表达菌株构建
(1)突变体的设计
利用反向PCR技术，以获得的重组质粒pHY-yjiC为模板进行定点突变，设计突变引物。
表1突变引物表
(2)突变体的构建：
以重组质粒pHY-yjiC为模板，PCR扩增A13W突变体自连骨架(引物为A13W-F和A13W-R)，反应体系如下表所示：
表2 PCR扩增A13W单突变体片段
组份 体积(μL)
Mix 47.5
F 1
R 1
模板pHY-yjiC重组质粒 0.5
总体系 50 
PCR反应程序：变性98℃，20秒；退火58℃，20秒；延伸72℃，2min。
Gibison自连反应
表3 Gibison自连反应体系
自连骨架 3μL
5×CE Ⅱ buffer 2μL
Exnase Ⅱ 1μL
<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> 加水至10μL 
反应程序：37℃，30min；4℃，5min。
转化大肠杆菌DH5α，转化产物涂布于含四环素抗性LB固体培养基，于37℃培养18h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃过夜培养后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确A13W单突变体重组质粒pHY-yjiCA13W；
再以上述获得的A13W单突变体质粒pHY-yjiCA13W作为模板，以S10-F和S10-R为引物PCR扩增突变体片段A13W/I67F，载体自连，转化大肠杆菌，验证，获得阳性转化子，经过测序得到A13W/I67F重组载体pHY-yjiCA13W/I67F。在此基础上，以pHY-yjiCA13W/I67F为模板，以T9-F/T9-R为引物，PCR扩增突变体片段A13W/I67F/A80W，载体自连，转化大肠杆菌，验证，获得阳性转化子，经过测序得到A13W/I67F/A80W重组载体pHY-yjiCA13W/I67F/A80W,简称为pHY-T9。将重组质粒pHY-T9转化地衣芽胞杆菌WX-02中，即获得重组地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-T9。
实施例3：
糖基转移酶YjiC及其突变体T9催化芳香醇合成芳香醇糖苷：
将-80℃保存的重组地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-T9或地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-yjiC于含有20μg/mL四环素抗性的LB固体培养基上划线活化，37℃过夜培养。单菌落转接至添加有10μg/mL四环素抗性的LB液体培养基(30mL，15μL抗生素)，37℃摇床培养12 h，得到种子液(OD600＝3-5)。将种子液以2％(v/v)的接种量(初始生物量OD600＝0.1) 转接至50mL的基本盐培养基中：葡萄糖80g/L，芳香醇底物2g/L，Na2HPO4·12H2O 15. 1g/L，KH2PO45g/L，NH4Cl3g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，柠檬酸钠1g/L，Fe Cl3·6H2O 13.5mg/L，ZnCl217 mg/L，MnCl2·4H2O 10mg/L，NaMoO4·7H2O 6mg/L，CoCl 2·6H2O 6mg/L，CuSO4·5H2O 4.3mg/L，pH 7.0，37℃，230rpm培养72h，即得发酵液，通过高效液相色谱分析产物。
所述的芳香醇底物为酪醇或对羟基苯甲醇。
由表4可以看出，突变体对苯环羟基的糖基化的产物特异性高较野生型有了明显的提高，突变体T9催化酪醇可以得到高比例的淫羊藿次苷D2，比例90％以上，而野生酶能得到产物淫羊藿次苷D2，比例只有65％，提高了39％。利用突变体T9以酪醇作为糖基受体生产淫羊藿次苷D2的产量较利用野生型提高了28％，产量达到3.59g/L(表4)；
利用突变体T9以对羟基苯甲醇作为糖基受体生产天麻素的比例较利用野生型提高了31. 2％，达到90％，同时天麻素产量提高了80％(表4)。
表4突变体T9与野生型以不同芳香醇为底物得到不同产物含比例(％)和芳香醇糖苷含量(g /L)比较
底物浓度为2g/L
对比例1：
对位点13位丙氨酸进行突变为苯丙氨酸(A13F)，第13位的丙氨酸和15位甘氨酸分别突变为色氨酸和丝氨酸(A13W和G15S)或者第13位的丙氨酸、67位的异亮氨酸和80 位丙氨酸分别突变为色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺(A13W和I67F和A80N)。按照实施例1～ 2制备得到酶突变体菌体，按照实施例3的方法进行发酵，基本盐培养基为葡萄糖80g/L，酪醇2g/L，Na2HPO4·12H2O 15.1g/L，KH2PO45g/L，NH4Cl3g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/ L，NaCl 0.5g/L，柠檬酸钠1g/L，FeCl3·6H2O 13.5mg/L，ZnCl217mg/L，MnCl2·4H2O 10mg/L，NaMoO4·7H2O6mg/L，CoCl2·6H2O 6mg/L，CuSO4·5H2O 4.3mg/L，pH 7.0， 37℃，230rpm培养72h。
结果显示如表5所示，突变体A13F和A13W/I67F/A80N产物淫羊藿次苷D2的比率只有71％，淫羊藿次苷D2的产量反而明显下降。突变体A13W/G15S丧失了催化酪醇的活性，没有产物合成。因此，相比之下，突变体T9(A13W/I67F/A80W)具有高区域选择性和高催化活性。
表5不同突变体与野生型以酪醇为底物得到不同产物含比例(％)和芳香醇糖苷含量(g/L) 比较
ND:not detected
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Gln Lys His Ile Ala Ile Phe Asn Ile Pro Trp His Gly His
1               5                   10                  15
Ile Asn Pro Thr Leu Ala Leu Thr Ala Ser Leu Val Lys Arg Gly Tyr
            20                  25                  30
Arg Val Thr Tyr Pro Val Thr Asp Glu Phe Val Lys Ala Val Glu Glu
        35                  40                  45
Thr Gly Ala Glu Pro Leu Asn Tyr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Asp Pro
    50                  55                  60
Gln Gln Phe Arg Glu Leu Met Lys Asn Lys Lys Asp Met Thr Gln Trp
65                  70                  75                  80
Pro Met Met Phe Met Lys Glu Met Glu Glu Val Leu Pro Gln Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Leu Tyr Glu Asn Asp Lys Pro Asp Leu Ile Leu Phe Asp Phe Met
            100                 105                 110
Ala Met Ala Gly Lys Met Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val
        115                 120                 125
Arg Leu Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Asn Glu His Phe Ser Phe Lys Ser
    130                 135                 140
Met Ser Glu Glu Phe Lys Ile Glu Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Lys Asn Ala Asn Leu Pro Ser Phe Asn Phe Glu Glu Met Phe Glu
                165                 170                 175
Pro Ala Lys Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Arg Ala Phe Gln Pro Tyr
            180                 185                 190
Gly Glu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Ser Phe Val Gly Pro Ser Leu Ala
        195                 200                 205
Lys Arg Lys Phe Gln Glu Lys Asp Thr Pro Val Ile Ser Asp Ser Gly
    210                 215                 220
Arg Pro Val Met Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro
225                 230                 235                 240
Glu Phe Tyr His Met Cys Ile Glu Ala Phe Arg Asp Thr Lys Trp Gln
                245                 250                 255
Val Ile Met Ala Val Gly Thr Thr Ile Asp Pro Glu Ser Phe Asp Asp
            260                 265                 270
Ile Pro Asp Asn Phe Ser Ile His Gln Arg Val Pro Gln Leu Glu Ile
        275                 280                 285
Leu Lys Lys Ala Glu Leu Phe Ile Thr His Gly Gly Met Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Met Glu Gly Leu Asn Ala Gly Val Pro Leu Val Ala Val Pro Gln Met
305                 310                 315                 320
Pro Glu Gln Glu Ile Thr Ala Arg Arg Val Glu Glu Leu Gly Leu Gly
                325                 330                 335
Lys His Leu Gln Pro Glu Asp Thr Thr Val Ala Ser Leu Arg Glu Ala
            340                 345                 350
Val Ser Gln Thr Asp Gly Asn Leu Asp Val Leu Lys Arg Val Lys Asp
        355                 360                 365
Met Gln Glu His Ile Lys Gln Ala Gly Gly Ala Glu Lys Ala Ala Asp
    370                 375                 380
Glu Ile Glu Ser Phe Leu Ala Pro Ala Gly Val Lys
385                 390                 395
<210> 2
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggccaaa aacatatcgc gatttttaat attccctggc acgggcatat taatccgacg 60
cttgctttaa cggcaagcct tgtcaaacgc ggttatcggg taacatatcc ggtaacggat 120
gagtttgtga aagctgttga ggaaactggg gcagagccgc tcaactaccg ctcaacttta 180
aatatcgatc cgcagcaatt tcgggagctg atgaaaaata aaaaagatat gacgcagtgg 240
ccgatgatgt ttatgaaaga aatggaggag gttcttcctc agcttgaagc gctttatgag 300
aatgacaagc ctgacctcat cctttttgac tttatggcca tggcgggaaa aatgctggct 360
gagaagtttg gaatagaggc ggttcgcctt tgttctacat atgcacagaa cgaacatttt 420
tcattcaaat caatgtctga agagtttaag atcgagctca cgcctgagca agaagccgct 480
ttgaaaaatg cgaatcttcc gtcatttaat tttgaagaga tgttcgaacc ggcaaaattg 540
aacattgtct ttatgcctcg tgcttttcag ccttacggcg aaacgtttga tgaacggttc 600
tcttttgtcg gtccttctct agccaaacgc aagtttcagg aaaaagacac gccggttatt 660
tcggacagcg gccgtcctgt catgctgatt tctttaggga cggcgttcaa tgcctggccg 720
gaattttatc atatgtgcat cgaagcattc agggacacga agtggcaggt gatcatggct 780
gtcggcacga caatcgatcc tgaaagcttt gacgacatac ctgataactt ttcgattcat 840
cagcgcgttc cccagctgga aatcctgaag aaagcagagc ttttcatcac ccatgggggt 900
atgaacagta cgatggaagg attgaatgcc ggtgtaccgc ttgttgccgt cccgcaaatg 960
cctgaacagg aaatcactgc ccgccgcgtc gaagaactcg ggcttggcaa gcatttgcag 1020
ccggaggaca caacagttgc ttcattgcgg gaagccgtct cccagacaga cggtaacctg 1080
gatgtcctga aacgcgtaaa ggacatgcaa gagcacatta aacaagcagg aggagccgag 1140
aaagccgcag atgaaattga gtcattttta gcaccggcag gagtgaaata a 1191
<210> 3
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Gln Lys His Ile Ala Ile Phe Asn Ile Pro Ala His Gly His
1               5                   10                  15
Ile Asn Pro Thr Leu Ala Leu Thr Ala Ser Leu Val Lys Arg Gly Tyr
            20                  25                  30
Arg Val Thr Tyr Pro Val Thr Asp Glu Phe Val Lys Ala Val Glu Glu
        35                  40                  45
Thr Gly Ala Glu Pro Leu Asn Tyr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Asp Pro
    50                  55                  60
Gln Gln Ile Arg Glu Leu Met Lys Asn Lys Lys Asp Met Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Pro Met Met Phe Met Lys Glu Met Glu Glu Val Leu Pro Gln Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Leu Tyr Glu Asn Asp Lys Pro Asp Leu Ile Leu Phe Asp Phe Met
            100                 105                 110
Ala Met Ala Gly Lys Met Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val
        115                 120                 125
Arg Leu Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Asn Glu His Phe Ser Phe Lys Ser
    130                 135                 140
Met Ser Glu Glu Phe Lys Ile Glu Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Lys Asn Ala Asn Leu Pro Ser Phe Asn Phe Glu Glu Met Phe Glu
                165                 170                 175
Pro Ala Lys Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Arg Ala Phe Gln Pro Tyr
            180                 185                 190
Gly Glu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Ser Phe Val Gly Pro Ser Leu Ala
        195                 200                 205
Lys Arg Lys Phe Gln Glu Lys Asp Thr Pro Val Ile Ser Asp Ser Gly
    210                 215                 220
Arg Pro Val Met Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro
225                 230                 235                 240
Glu Phe Tyr His Met Cys Ile Glu Ala Phe Arg Asp Thr Lys Trp Gln
                245                 250                 255
Val Ile Met Ala Val Gly Thr Thr Ile Asp Pro Glu Ser Phe Asp Asp
            260                 265                 270
Ile Pro Asp Asn Phe Ser Ile His Gln Arg Val Pro Gln Leu Glu Ile
        275                 280                 285
Leu Lys Lys Ala Glu Leu Phe Ile Thr His Gly Gly Met Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Met Glu Gly Leu Asn Ala Gly Val Pro Leu Val Ala Val Pro Gln Met
305                 310                 315                 320
Pro Glu Gln Glu Ile Thr Ala Arg Arg Val Glu Glu Leu Gly Leu Gly
                325                 330                 335
Lys His Leu Gln Pro Glu Asp Thr Thr Val Ala Ser Leu Arg Glu Ala
            340                 345                 350
Val Ser Gln Thr Asp Gly Asn Leu Asp Val Leu Lys Arg Val Lys Asp
        355                 360                 365
Met Gln Glu His Ile Lys Gln Ala Gly Gly Ala Glu Lys Ala Ala Asp
    370                 375                 380
Glu Ile Glu Ser Phe Leu Ala Pro Ala Gly Val Lys
385                 390                 395
<210> 4
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgggccaaa aacatatcgc gatttttaat attcccgctc acgggcatat taatccgacg 60
cttgctttaa cggcaagcct tgtcaaacgc ggttatcggg taacatatcc ggtaacggat 120
gagtttgtga aagctgttga ggaaactggg gcagagccgc tcaactaccg ctcaacttta 180
aatatcgatc cgcagcaaat tcgggagctg atgaaaaata aaaaagatat gacgcaggct 240
ccgatgatgt ttatgaaaga aatggaggag gttcttcctc agcttgaagc gctttatgag 300
aatgacaagc ctgacctcat cctttttgac tttatggcca tggcgggaaa aatgctggct 360
gagaagtttg gaatagaggc ggttcgcctt tgttctacat atgcacagaa cgaacatttt 420
tcattcaaat caatgtctga agagtttaag atcgagctca cgcctgagca agaagccgct 480
ttgaaaaatg cgaatcttcc gtcatttaat tttgaagaga tgttcgaacc ggcaaaattg 540
aacattgtct ttatgcctcg tgcttttcag ccttacggcg aaacgtttga tgaacggttc 600
tcttttgtcg gtccttctct agccaaacgc aagtttcagg aaaaagacac gccggttatt 660
tcggacagcg gccgtcctgt catgctgatt tctttaggga cggcgttcaa tgcctggccg 720
gaattttatc atatgtgcat cgaagcattc agggacacga agtggcaggt gatcatggct 780
gtcggcacga caatcgatcc tgaaagcttt gacgacatac ctgataactt ttcgattcat 840
cagcgcgttc cccagctgga aatcctgaag aaagcagagc ttttcatcac ccatgggggt 900
atgaacagta cgatggaagg attgaatgcc ggtgtaccgc ttgttgccgt cccgcaaatg 960
cctgaacagg aaatcactgc ccgccgcgtc gaagaactcg ggcttggcaa gcatttgcag 1020
ccggaggaca caacagttgc ttcattgcgg gaagccgtct cccagacaga cggtaacctg 1080
gatgtcctga aacgcgtaaa ggacatgcaa gagcacatta aacaagcagg aggagccgag 1140
aaagccgcag atgaaattga gtcattttta gcaccggcag gagtgaaata a 1191
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacatttccc cgaaaagtat gggccaaaaa catatc 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtcagacc aagtttacga gtcattttta gcaccg 36
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttttaacct cccgttattt ttcgc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagagcagag aggacggatt tcctg 25
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggaatatta aaaatcgcga tatgtttttg gccca 35
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atttttaata ttccctggca cgggcatatt aatccgacg 39
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tatcgatccg cagcaatttc gggagctgat gaaaaataaa 40
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgctgcgga tcgatattta aagttgagcg gtag 34
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaaaagata tgacgcagtg gccgatgatg tttatgaaag aa 42
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgcgtcata tcttttttat ttttcatcag ctcccgaa 38

Claims (8)

1.一种糖基转移酶突变体，所述突变体为SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的糖基转移酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，所述的基因为SEQ ID NO.2所示。
4.表达SEQ ID NO.1所示蛋白的基因工程菌。
5.权利要求1所述的糖基转移酶突变体在地衣芽胞杆菌发酵生产芳香醇糖苷中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02或地衣芽胞杆菌DW2。
7.根据权利要求5所述的应用，应用过程中的发酵培养基中含有芳香醇化合物，所述的芳香醇化合物为酪醇、对羟基苯甲醇、羟基酪醇，或白藜芦醇。
8.根据权利要求7所述的应用，应用过程中的发酵培养基为：葡萄糖20-100 g/L，芳香醇化合物0.1-10 g/L，Na2HPO4·12H2O 5-20 g/L，KH2PO41-10 g/L，NH4Cl1-10 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，NaCl 0.1-5 g/L，柠檬酸钠0.1-5 g/L，FeCl3·6H2O 1-100 mg/L，ZnCl21-100 mg/L，MnCl2·4H2O 1-100 mg/L，NaMoO4·7H2O 1-100 mg/L，CoCl2·6H2O 1-100 mg/L，CuSO4·5H2O 1-100mg/L，pH6-8。
CN202210490385.9A 2022-05-05 2022-05-05 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用 Active CN114921431B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210490385.9A CN114921431B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210490385.9A CN114921431B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114921431A CN114921431A (zh) 2022-08-19
CN114921431B true CN114921431B (zh) 2023-04-25

Family

ID=82807633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210490385.9A Active CN114921431B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114921431B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101875950A (zh) * 2009-11-17 2010-11-03 华中农业大学 利用环境压力提高芽胞杆菌发酵聚-γ-谷氨酸产量的方法
EP2960330A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Technische Universität München Glycosyl transferases and their uses
WO2017181152A2 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110331173A (zh) * 2019-07-29 2019-10-15 湖北大学 苯丙酮酸脱羧酶突变体m538a在生物发酵生产苯乙醇中的应用
CN111019918A (zh) * 2019-11-20 2020-04-17 广东广业清怡食品科技有限公司 一种糖基转移酶突变体及其应用
CN111093390A (zh) * 2017-05-15 2020-05-01 谱赛科美国股份有限公司 高纯度甜菊醇糖苷
WO2020249138A1 (zh) * 2019-06-14 2020-12-17 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 糖基转移酶突变体及其应用
CN112553175A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 糖基转移酶ugt76g1突变体的制备及其应用
CN112626154A (zh) * 2013-05-28 2021-04-09 谱赛科有限责任公司 高纯度的甜菊醇糖苷

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3564369A4 (en) * 2016-12-27 2020-07-29 Suntory Holdings Limited STEVIOL GLYCOSIDE HEXOSE TRANSFERASE AND CODING GENE FOR THIS

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101875950A (zh) * 2009-11-17 2010-11-03 华中农业大学 利用环境压力提高芽胞杆菌发酵聚-γ-谷氨酸产量的方法
CN112626154A (zh) * 2013-05-28 2021-04-09 谱赛科有限责任公司 高纯度的甜菊醇糖苷
EP2960330A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Technische Universität München Glycosyl transferases and their uses
WO2017181152A2 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN111093390A (zh) * 2017-05-15 2020-05-01 谱赛科美国股份有限公司 高纯度甜菊醇糖苷
WO2020249138A1 (zh) * 2019-06-14 2020-12-17 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 糖基转移酶突变体及其应用
CN110331173A (zh) * 2019-07-29 2019-10-15 湖北大学 苯丙酮酸脱羧酶突变体m538a在生物发酵生产苯乙醇中的应用
CN112553175A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 糖基转移酶ugt76g1突变体的制备及其应用
CN111019918A (zh) * 2019-11-20 2020-04-17 广东广业清怡食品科技有限公司 一种糖基转移酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genbank.NCBI Reference Sequence: WP_020451485.1.Genbank.2021,第1-2页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114921431A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111712570B (zh) 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
Liu et al. Production, characterization and antioxidant activities in vitro of exopolysaccharides from endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3
KR101076042B1 (ko) 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를이용한 에탄올과 부탄올의 제조방법
CN110066760B (zh) 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用
CN107723307A (zh) 一种高效制备d‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法及其应用
CN109750071A (zh) 一种生物催化合成莱鲍迪苷m的方法
CN110791493B (zh) 一种天冬氨酸氨裂合酶突变体及其应用
CN103131721B (zh) 瘤胃菌d-塔格糖3-差向异构酶的核苷酸序列及其应用
CN106434483B (zh) 一种布氏乳杆菌及其应用
CN105734092B (zh) 一种酶法制备d-塔格糖的方法
CN109796516B (zh) 一组天然与非天然的原人参三醇型人参皂苷的合成方法
CN113122488B (zh) 克雷伯氏菌工程菌及其生产甘油和二羟基丙酮的应用
CN113215121B (zh) 一种高效异源合成罗汉果甜苷v前体的方法
CN109576239A (zh) 耐热磷酸化酶及其应用
CN114921431B (zh) 糖基转移酶突变体及其在发酵生产芳香醇糖苷中的应用
KR20130105174A (ko) 고온성 베타-글루코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드 컴파운드 엠씨, 컴파운드 와이 및 아글리콘 프로토파낙사디올 생산
CN114736918B (zh) 一种整合表达生产红景天苷的重组大肠杆菌及其应用
CN116731886A (zh) 产糖基化虾青素的工程菌及其构建方法与应用
CN102146123A (zh) 氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白系统及其编码的基因簇
KR102466825B1 (ko) 사포닌에 대해 생물전환능을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 bla-9 균주, 이를 이용한 화합물 k의 함량이 증대된 발효 홍삼 추출물의 제조 방법, 이에 따른 발효 홍삼 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물
CN115058400B (zh) 来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用
CN110004099A (zh) 一种红景天苷的发酵生产方法
CN103695364A (zh) 通过弱化5-氨基乙酰丙酸脱水酶活性获得5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其应用
CN108102964B (zh) 一种反式-4-羟基-l-脯氨酸合成菌株及其l-脯氨酸羟化酶基因和应用
CN112779235B (zh) 一种生物催化合成多种黄酮苷的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240808

Address after: 312432 Yousen Zhejiang East E-commerce Industrial Park, No. 1977 Xinnong Road, Lushan Street, Shengzhou City, Shaoxing City, Zhejiang Province 311-1 (Address Application)

Patentee after: Zhejiang Yinchuang Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 430000 No.368 Youyi Avenue, Wuchang District, Wuhan City, Hubei Province

Patentee before: Hubei University

Country or region before: China