KR101076042B1

KR101076042B1 - 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를이용한 에탄올과 부탄올의 제조방법

Info

Publication number: KR101076042B1
Application number: KR1020070134701A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 장유신; 이진영; 정광섭; 김재현
Original assignee: 한국과학기술원; 지에스칼텍스 주식회사; 바이오퓨얼켐 주식회사
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2011-10-21
Also published as: AU2008341277A1; US20110027845A1; CN101952430A; JP2011507504A; WO2009082148A3; CN101952430B; WO2009082148A2; KR20090066951A; EP2222845A4; EP2222845A2

Abstract

본 발명은 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 에탄올 및 부탄올 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 및 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 에탄올 및 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 미생물의 대사흐름 조작에 의해 수득된 본 발명에 따른 재조합 미생물은 다른 부산물 없이 부탄올과 에탄올만을 고효율로 생성할 수 있어, 산업 용제 및 수송 연료 생성 미생물로 유용하다.

부탄올, 에탄올, 코에이 트랜스퍼라제, 알코올/알데하이드 디하이드로제나제

Description

에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 에탄올과 부탄올의 제조방법{Enhanced Ethanol and Butanol Producing Microorganisms and Method for Preparing Ethanol and Butanol Using the Same}

본 발명은 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 에탄올 및 부탄올 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 및 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 에탄올 및 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

에탄올과 부탄올은 현재 산업 용매로써 거대한 시장을 형성하고 있으며, 앞으로 자동차 등의 수송 연료로 사용 가능성이 현실화되고 있어 계속적인 수요 증가가 예상되고 있다.

에탄올(C₂H₅OH)은 예로부터 녹말이나 당류를 발효시키는 방법으로 제조되었 으며, 오늘날 주류(酒類)의 대부분은 이 방법으로 제조하고 있다. 그러나, 오늘날 주류 제조를 제외하고는 석유로부터 얻은 에틸렌(에텐)을 원료로 하는 합성법으로 에틸렌을 황산에 흡수시켜 에탄올의 황산에스테르를 만든 후, 이것을 다시 가수분해하여 디에틸에테르와 함께 얻는 방법(황산가수법)과 기상(氣相)에서 에틸렌을 고체 인산 촉매를 사용하여 접촉적으로 수증기와 반응시킴으로써 직접 에탄올을 합성하는 방법(직접수화법)으로 제조하고 있다. 이러한 방법은 근본적으로 석유를 원료로 하고 있다는 점과 황산가수법의 경우 대량의 황산을 농축하여 순환시키므로 대규모의 설비를 필요로 한다는 점이 문제가 되고 있다.

한편, 부탄올(C₄H₉OH)의 전세계 생산량은 약 백십만 톤/년으로 추정된다. 현재 시판되는 부탄올은 모두 화학적 합성으로 생산된 것이다. 부탄올의 화학합성법 또한 에탄올과 마찬가지로 원료를 석유로 하고 있으며, 이로부터 얻어진 프로필렌으로부터 합성되는 옥소법(oxo process)이 사용된다. 이러한 석유를 원료로 하여 고온 고압을 사용하는 방법은 에탄올과 마찬가지로 비용과 에너지 면에서 비효율적이다 (Tsuchida et al ., Ind . Eng . Chem . Res ., 45:8634, 2006). 즉, 석유화학을 이용한 에탄올과 부탄올의 생산은 제조시에 다량의 유해성 폐기물, 폐용액 및 폐가스(일산화탄소 포함)를 배출한다는 문제점을 가지고 있으며, 특히 화석 원료를 기초 물질로 사용한다는 한계를 가지고 있다.

상술한 바와 같이 지금까지 생산되는 부탄올의 경우 화학합성법에 의해 대부분 생산되고 있으며, 유가 상승과 환경 문제 야기 등으로 세계 각국에서는 바이오 에탄올 및 부탄올 연구에 대한 관심이 급속하게 증가되고 있는 상황이나, 아직까지 바이오 에탄올 및 부탄올만을 효율적으로 생산한 예는 없었다.

부탄올 및 에탄올의 경우 지금까지 발효를 통하여 생산한 예는 대부분 클로스트리듐을 이용하여 생산한 것으로, 벡터에 adc(아세토아세트산 탈탄산 효소), ctfA(CoA 전달 효소 A) 및 ctfB(CoA 전달 효소 B)의 3가지 유전자를 넣고 adc의 프로모터를 사용하여 인위적 오페론을 제작하고, 이 플라스미드(pFNK6)를 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주에 도입한 결과, 야생형에 비해 아세톤, 부탄올 및 에탄올의 생산성을 각각 95%, 37% 및 90% 증가시킨 예가 있다 (Mermelstein et al., Biotechnol . Bioeng ., 42:1053, 1993). 또 aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 클로닝한 후 과발현시켜 야생형과 비교한 결과, 아세톤의 생성량에 비해 부탄올 및 에탄올의 생성량이 높게 나타낸 예(Nair et al ., J. Bacteriol ., 176:871, 1994)가 있다. 이 외에 유전자의 기능을 불활성화시키는 방법으로 buk(부티르산 인산화 효소)와 pta(인산화아세트산 전달 효소)를 불활성화시킨 예가 있는데, buk 유전자를 불활성화한 균주(PJC4BK)를 pH 5.0 이상으로 발효한 결과, 부탄올 생산량이 16.7 g/ℓ까지 상당히 증가하는 것으로 보고되었다 (Harris et al ., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000). 그러나, pta 불활성화의 경우는 야생형과 비교하였을 때 용매 생산에서 유의한 차이를 보이지 못한 것으로 보고되어 있다 (Harris et al ., Biotechnol. Bioeng ., 67:1, 2000).

또한, 무작위 돌연변이로 유발된 돌연변이주 Clostridium beijerinckii BA101 균주를 이용하여 탄소원으로 maltodextrins을 사용하여 발효한 결과, 18.6 g/ℓ의 부탄올이 생산된다는 것을 보고한 예도 있다 (Ezeji et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 63:653, 2004). 하지만, 상기의 이러한 결과들은 모두 부탄올 및 에탄올이 부산물인 아세톤과 함께 생성되는 예로 아세톤의 특성 때문에 아세톤을 제거하지 않고 연료로 바로 사용할 수 없다는 아주 큰 단점이 있다.

아세톤 생성 없이 에탄올과 부탄올을 생성한 예로써, adc(아세토아세트산 탈탄산 효소의 유전자), ctfA(CoA 전달 효소 A의 유전자), ctfB(CoA 전달 효소 B의 유전자), 및 aad(알코올/알데히드 탈수소 효소의 유전자) 활성에 모두 결함이 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 돌연변이주에 aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 도입한 재조합 변이 미생물을 이용한 경우가 있으나, 부탄올과 에탄올의 최종 농도가 각각 84 mM과 8 mM(Nair et al ., J. Bacteriol ., 176:5843, 1994)로 생산성이 낮은 단점이 있다. 또한, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 부탄올을 생성한 예(Shota et al ., Metab . Eng ., In Press, 2007))가 있으나, 최대 부탄올 생성 농도가 552 mg/ℓ로 매우 낮아 산업적 이용이 불가능하다.

따라서, 당업계에서는 아세톤과 같은 부산물의 생성 없이 연료로 바로 이용 가능한 부탄올 또는 에탄올/부탄올 혼합물을 고효율로 생산할 수 있는 미생물 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 에탄올 및 부탄올 합성경로(도 1)를 토대로 높은 수율로 에탄올과 부탄올을 다른 부산물 없이 제조할 수 있는 미생물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824 유래의 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(ctfAB)와, 아세틸코에이 및 부티릴코에이를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhE1)를 클로닝하고, 유기 용제를 생산하지 못하는 숙주 미생물에 도입시켜 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물이 에탄올과 부탄올은 고농도로 생산하는 반면, 부산물인 아세톤은 거의 생산되지 않는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 다른 부산물의 생산 없이 부탄올 또는 에탄올/부탄올을 고효율로 생산하는 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 에탄올 및 부탄올의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 숙주 미생물에 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입하는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 숙주 미생물에 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 아세틸코에이 (acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 에탄올 및/또는 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올 및/또는 부탄올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 특정 유전자의 도입 또는 증폭을 통하여 에탄올 및 부탄올의 고생산 능력을 가지는 재조합 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 대사흐름 조작에 의해 아세톤 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐 아니라, 에탄올과 부탄올의 시간당 생산성을 향상시킬 수 있어 에탄올/부탄올의 산업적 생산에 유용하다.

본 발명에서는 에탄올 및 부탄올 합성경로(도 1)를 토대로 아세톤 등 다른 부산물의 생성없이 높은 수율로 에탄올/부탄올을 제조할 수 있는 미생물을 개발하기 위하여, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824 유래의 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(ctfAB)와, 아세틸코에이 및 부티릴코에이를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 알코올/알데하이 드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhE1)를 클로닝하고, 상기 유전자를 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지고 있고, 아세톤과 같은 유기 용제를 생성하지 못하는 숙주 미생물에 도입시켜 재조합 미생물을 제작하였다.

따라서, 본 발명은 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 숙주 미생물에 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입하는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법, 및 상기 방법에 의해 제조된, 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 숙주 미생물에 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념 이다.

본 발명에 있어서, 상기 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로는 [acetyl CoA --> acetoacetyl CoA --> 3-hydroxybutyryl CoA --> crotonyl CoA --> butyryl CoA]인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 아세톤 생합성 경로가 차단되어 아세톤 생성량이 전체 유기용제 생산량의 10% 미만인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 아세톤 생합성 경로는 adc(아세토아세트산 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자)를 결실시킬 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐 속 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로를 가지고 있는 한 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소는 코에이 트랜스퍼라제이고, 상기 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 ctfAB인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소는 알코올/알데하이드 디하이드로제나제인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자는 adhE1인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 상기 ctfAB 및 adhE1 로 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 유래인 것만을 예시하였으나, 다른 미생물 유래의 유전자라 할지라도, 도입된 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 megaplasmid(아세토아세트산 탈탄산 효소, CoA 트랜스퍼라제, 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 포함한 127 유전자가 존재함)가 결실되어 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 M5를 숙주 미생물로 이용하였다. 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 M5는 아세톤 생합성 경로가 차단되어 있는 미생물이다 (도 1). 본 발명에서는 아세톤 생합성 경로가 차단되어 있는 클로스트리듐 속 숙주 미생물로 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5만을 예시하였으나, 이외에도 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 1NYG, 4NYG, 5NYG 및 DG1(Stim-Herndon, K.P. et al ., Biotechnol ./ Food Microbiol ., 2:11, 1996)과 C. acetobutylicum ATCC 824 Type IV, M3, M5, 2-BB R, 2-BB D, Rif B12, Rif D10, Rif F7, 및 C. butyricum ATCC 860(Clark, S.W. et al ., Appl . Environ . Microbiol., 55:970, 1989)을 사용할 수도 있다.

상기 숙주 미생물에 상기 ctfAB 및 adhE1을 함유하는 재조합벡터(pIMP1::adhE1.ctfAB)를 도입하여 재조합 미생물 M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)를 제조한 다음, 이를 배양한 결과, 아세톤은 거의 생성되지 않으면서 부탄올/에탄올이 고농도로 생성되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 에탄올 및/또는 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올 및/또는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양 및 에탄올 및 부탄올의 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 에탄올/부탄올의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 부탄올 및 에탄올의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높기기 위하여 gas-stripping 방법(Thaddeus et al ., Bioprocess Biosyst . Eng ., 27:207, 2005)등을 이용하여 배양 도중에 에탄올 및 부탄올을 회수할 수도 있다. 즉, 배양 중에 생성된 에탄올 및 부탄올을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.

한편, 본 발명에서는 부탄올 생합성 경로가 차단된 경우만을 예시하였으나, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주에서 butyrate 생합성 경로를 차단하여 부탄올 생성량을 증가시킨 보고(Harris et al ., Biotechnol . Bioeng ., 67:1, 2000)가 있고, 도 1의 대사경로에서 acetyl CoA로부터 acetate로의 생합성 경로 및/또는 butyryl CoA로부터 butyrate로의 생합성 경로를 차단할 경우 에탄올과 부탄올의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 추정할 수 있다. 다른 방편으로 acetate를 이용할 수 있는 유전자(acs, atoDA)등을 도입할 경우에도 에탄올과 부탄올의 생성을 증가시킬 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자 에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 유기 용제를 생산하지 못하는 숙주 균주로 특정 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 M5만을 예시하였으나, 다른 클로스트리듐 속이나 다른 속의 미생물을 사용하더라도, 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로를 가지고 있고, 아세톤 등의 유기용제 생합성 경로가 차단되어 있는 숙주 균주에 동일 유전자를 도입하고 이를 이용하여 에탄올 및 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 알콜/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhE1) 및 코에이 트랜스퍼라제 유전자(ctfAB) 함유 재조합 벡터의 제작

서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열을 가지는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 adhE1, ctfA 및 ctfB 유전자를 프로모터와 전사종료 서열을 포함하여 클로닝하였다.

먼저, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 사용한 PCR(표 1)을 수행한 다음, 수득된 adhE1, ctfA 및 ctfB 유전자를 제한효소 SalI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단된 클로스트리듐/대장균 셔틀벡터 pIMP1(Mermelstein, L.D. et al ., Bio/Technol., 10:190, 1992)에 삽입하여 재조합 벡터 pIMP1::adhE1.ctfAB를 제작하였다 (도 2). 이로써 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 유래의 알콜/알데 하이드 디하이드로제나제와 코에이 트랜스퍼라제 유전자를 코딩하는 유전자(adhE1, ctfAB)가 클로닝되었다.

PCR 조건

유전자	프라이머	프라이머에 포함된 제한효소 자리	반응조건 (중합효소: Pfu-x)
adhE1 및 ctfAB	P1(서열번호 1) P2(서열번호 2)	SalI	Cycle I: 95℃, 5 min Cycle II: (30 cycles) 95℃, 40 sec 61℃, 30 sec 72℃, 2.5 min Cycle III: 72℃, 5 min Cycle IV: 4℃, forever

상기 클로닝된 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 유래의 adhE1 및 ctfAB 유전자의 염기서열을 분석하고, 알콜/알데하이드 디하이드로제나제와 코에이 트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 추정하였다. 그 결과, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 adhE1, ctfA 및 ctfB 유전자 서열(서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5) 및 아미노산 서열(서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8)을 확인하였다.

실시예 2: 재조합 미생물의 제조

실시예 1에서 제작된 재조합 벡터 pIMP1::adhE1.ctfAB를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5 균주에 도입하여 M5(pIMP1::adhE1.ctfAB) 균주를 제작하였다.

먼저, 바실러스 서브틸리스 파지(Bacillus subtilis Phage) Φ3T I 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 발현 벡터, pAN1(Mermelstein et al ., Appl . Environ. Microbiol ., 59:1077, 1993)을 함유하는 대장균 TOP10에 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 벡터를 도입하여, 상기 벡터를 클로스트리듐으로의 형질전환에 적합하도록 메틸레이션을 유도하였다. 이렇게 메틸레이션된 벡터를 대장균으로부터 분리 및 정제하고, 이 벡터를 megaplasmid(아세토아세트산 탈탄산 효소의 유전자, CoA 트랜스퍼라제의 유전자, 알코올/알데하이드 디하이드로제나제의 유전자를 포함하는 176 유전자가 존재)가 결실되어 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 M5 (Cornillot et al., J. Bacteriol., 179:5442, 1997)에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였다. 또한, 클로닝용 벡터로 사용한 pIMP1을 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5 균주에 도입하여 M5(pIMP1) 균주를 제조하였다.

형질전환을 위한 M5 competant cell은 다음과 같이 준비하였다. 먼저 10 ml CGM(표 2)에 M5 균주를 접종한 후, OD 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이를 이용하여 2X YTG 배지(bacto tryptone 16 g, yeast extract 10 g, NaCl 4 g, glucose 5 g, 1 리터 당) 60 ml에 10% 접종하여 4-5 시간 동안 배양하였다. 형질전환버퍼(EPB, 270 mM sucrose 15 ml, 686 mM NaH₂PO₄ 110 ul, pH 7.4)로 2번 washing한 후, 2.4 ml의 동일 버퍼로 미생물 세포를 현탁시켰다. 이렇게 만들어진 M5 competent cell 600 ul와 재조합 플라스미드 DNA 25 ul를 섞어서 4 mm 전극을 가진 cuvette에 충진한 후 2.5 kV, 25 uF의 조건으로 전기 충격을 가하였다. 즉시, 1 ml의 2X YTG 배지로 현탁하여 3시간 동안 37℃에서 배양한 후, 40 ug/ml의 에리트로마이신이 포함된 2X YTG 고체배지에 도말하여 형질전환체를 선발하였다.

CGM 배지의 조성

성분	함량 (g/ℓ)
glucose	80
K₂HPO₄ 3H₂O	0.982
KH₂PO₄	0.75
MgSO₄	0.348
MnSO₄ H₂O	0.01
FeSO₄ 7H₂O	0.01
(NH₄)₂SO₄	2
NaCl	1
asparagine	2
PABA (paraaminobenzoic acid)	0.004
yeast extract	5

실시예 3: 재조합 미생물 M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)를 이용한 에탄올/부탄올의 생산

실시예 2에서 제조된 재조합 미생물 M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)을 배양하여 그 성능을 평가하였다. CGM 배지 10㎖을 함유한 30㎖ 시험관을 멸균한 후, 80℃ 이상에서 꺼내어 질소가스를 채운 다음, 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/㎖를 첨가하고, 상기 재조합 미생물을 접종하여 37℃에서 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 혐기 조건에서 전배양을 수행하였다.

상기 성분으로 구성된 배지 100 ㎖을 함유한 250 ㎖ 플라스크를 멸균한 후, 동일한 처리를 한 다음, 상기 전배양액 6 ㎖을 접종하여 흡광도(600nm)가 1.0이 될 때까지 37℃, 혐기 조건에서 2차 전배양하였다. 그 후, 상기 성분으로 구성된 배지 2.0 ℓ를 함유한 5.0 ℓ 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea)를 멸균 다음, 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5 vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮춘 후, 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/ml을 첨가하고 상기 2차 전배양액 100 ㎖을 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 60시간 배양하였다. pH는 5 N NaOH의 automatic feeding에 의해 5.5로 유지되었고, 배양 중에는 질소를 0.2 vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.

상기 배지 중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하였으며, 시간별로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 아세톤 및 에탄올과 부탄올 농도를 packed column(Supelco Carbopack^TM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 대조균 M5(pIMP1)에서는 에탄올 및 부탄올이 생성되지 않은 반면, 재조합균주 M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)의 경우, 고농도의 에탄올 및 부탄올이 생성되고, 아세톤은 거의 생성되지 않는 것(0.5 g/ℓ 이하)을 확인할 수 있었다. 아울러 에탄올과 부탄올의 최종 생산 농도 뿐만 아니라, 생산성도 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주의 경우, 아세톤 생성량이 전체 유기용제의 약 28%로 알려져 있으나(Harris et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 27:322, 2001), 본 발명에 따른 재조합 균주의 경우, 약 5% 미만으로 그 생성량이 미미하다는 것을 확인할 수 있었다.

재조합 균주의 유기 용제 생산량

유기 용제	균주 및 생성량 (g/ℓ)		비고
유기 용제	M5(pIMP1)	M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)	비고
아세톤	0.0	0.5	ATCC 824 균주의 acetone 생산량 4.9 g/ℓ
에탄올	0.0	1.8
부탄올	0.0	8.0
(에탄올+부탄올)/ (에탄올+부탄올+아세톤)	0%	95% 이상	72%

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 에탄올 및 부탄올 생산 능력이 없는 퇴화(degeneration)된 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주의 대사회로(A)와 상기 퇴화된 균주에 ctfAB와 adhE1를 도입하여 제조된 재조합 균주의 에탄올과 부탄올 합성 대사경로(B)를 나타내는 모식도이다.

도 2는 ctfAB와 adhE1을 포함하는 재조합 벡터 pIMP1::adhE1.ctfAB의 유전자 지도이다.

<110> KAIST Biofuelchem Co. GS caltex Co. <120> ENHANCED ETHANOL AND BUTANOL PRODUCING MICROORGANISMS AND METHOD FOR PREPARING ETHANOL AND BUTANOL USING THE SAME <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tacgcgtcga cgcttctttt atgtagtatt atttcagaag 40 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tacgcgtcga cgccagtaaa agagattgtt tctagc 36 <210> 3 <211> 2589 <212> DNA <213> adhE1 <400> 3 atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60 aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120 gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180 ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 300 gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360 atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420 agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac 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acaggtttag gaactttgat tgaaaaagga aagaaaaaaa tatctataaa tggaacggaa 420 tatttgttag agctacctct tacagccgat gtagcattaa ttaaaggtag tattgtagat 480 gaggccggaa acaccttcta taaaggtact actaaaaact ttaatcccta tatggcaatg 540 gcagctaaaa ccgtaatagt tgaagctgaa aatttagtta gctgtgaaaa actagaaaag 600 gaaaaagcaa tgacccccgg agttcttata aattatatag taaaggagcc tgcataa 657 <210> 5 <211> 666 <212> DNA <213> ctfB <400> 5 atgattaatg ataaaaacct agcgaaagaa ataatagcca aaagagttgc aagagaatta 60 aaaaatggtc aacttgtaaa cttaggtgta ggtcttccta ccatggttgc agattatata 120 ccaaaaaatt tcaaaattac tttccaatca gaaaacggaa tagttggaat gggcgctagt 180 cctaaaataa atgaggcaga taaagatgta gtaaatgcag gaggagacta tacaacagta 240 cttcctgacg gcacattttt cgatagctca gtttcgtttt cactaatccg tggtggtcac 300 gtagatgtta ctgttttagg ggctctccag gtagatgaaa agggtaatat agccaattgg 360 attgttcctg gaaaaatgct ctctggtatg ggtggagcta tggatttagt aaatggagct 420 aagaaagtaa taattgcaat gagacataca aataaaggtc aacctaaaat tttaaaaaaa 480 tgtacacttc ccctcacggc aaagtctcaa gcaaatctaa ttgtaacaga acttggagta 540 attgaggtta ttaatgatgg tttacttctc actgaaatta ataaaaacac aaccattgat 600 gaaataaggt ctttaactgc tgcagattta ctcatatcca atgaacttag acccatggct 660 gtttag 666 <210> 6 <211> 862 <212> PRT <213> adhE1 <400> 6 Met Lys Val Thr Thr Val Lys Glu Leu Asp Glu Lys Leu Lys Val Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Glu Met Val Asp 20 25 30 Glu Ile Phe Arg Asn Ala Ala Met Ala Ala Ile Asp Ala Arg Ile Glu 35 40 45 Leu Ala Lys Ala Ala Val Leu Glu Thr Gly Met Gly Leu Val Glu Asp 50 55 60 Lys Val Ile Lys Asn His Phe Ala Gly Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Asp Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Glu Arg Asn Glu Pro Tyr Gly 85 90 95 Ile Thr Lys Ile Ala Glu Pro Ile Gly Val Val Ala Ala Ile Ile Pro 100 105 110 Val Thr Asn Pro Thr Ser Thr Thr Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125 Lys Thr Arg Asn Gly Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys 130 135 140 Ser Thr Ile Leu Ala Ala Lys Thr Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ser 145 150 155 160 Gly Ala Pro Glu Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu 165 170 175 Leu Thr Gln Tyr Leu Met Gln Lys Ala Asp Ile Thr Leu Ala Thr Gly 180 185 190 Gly Pro Ser Leu Val Lys Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile 195 200 205 Gly Val Gly Pro Gly Asn Thr Pro Val Ile Ile Asp Glu Ser Ala His 210 215 220 Ile Lys Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn 225 230 235 240 Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Ile Val Leu Lys Ser Ile 245 250 255 Tyr Asn Lys Val Lys Asp Glu Phe Gln Glu Arg Gly Ala Tyr Ile Ile 260 265 270 Lys Lys Asn Glu Leu Asp Lys Val Arg Glu Val Ile Phe Lys Asp Gly 275 280 285 Ser Val Asn Pro Lys Ile Val Gly Gln Ser Ala Tyr Thr Ile Ala Ala 290 295 300 Met Ala Gly Ile Lys Val Pro Lys Thr Thr Arg Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320 Val Thr Ser Leu Gly Glu Glu Glu Pro Phe Ala His Glu Lys Leu Ser 325 330 335 Pro Val Leu Ala Met Tyr Glu Ala Asp Asn Phe Asp Asp Ala Leu Lys 340 345 350 Lys Ala Val Thr Leu Ile Asn Leu Gly Gly Leu Gly His Thr Ser Gly 355 360 365 Ile Tyr Ala Asp Glu Ile Lys Ala Arg Asp Lys Ile Asp Arg Phe Ser 370 375 380 Ser Ala Met Lys Thr Val Arg Thr Phe Val Asn Ile Pro Thr Ser Gln 385 390 395 400 Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Arg Ile Pro Pro Ser Phe Thr 405 410 415 Leu Gly Cys Gly Phe Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Glu Asn Val Gly 420 425 430 Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Thr Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 435 440 445 Met Leu Trp Phe Arg Val Pro His Lys Val Tyr Phe Lys Phe Gly Cys 450 455 460 Leu Gln Phe Ala Leu Lys Asp Leu Lys Asp Leu Lys Lys Lys Arg Ala 465 470 475 480 Phe Ile Val Thr Asp Ser Asp Pro Tyr Asn Leu Asn Tyr Val Asp Ser 485 490 495 Ile Ile Lys Ile Leu Glu His Leu Asp Ile Asp Phe Lys Val Phe Asn 500 505 510 Lys Val Gly Arg Glu Ala Asp Leu Lys Thr Ile Lys Lys Ala Thr Glu 515 520 525 Glu Met Ser Ser Phe Met Pro Asp Thr Ile Ile Ala Leu Gly Gly Thr 530 535 540 Pro Glu Met Ser Ser Ala Lys Leu Met Trp Val Leu Tyr Glu His Pro 545 550 555 560 Glu Val Lys Phe Glu Asp Leu Ala Ile Lys Phe Met Asp Ile Arg Lys 565 570 575 Arg Ile Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Gly Lys Lys Ala Met Leu Val Ala 580 585 590 Ile Thr Thr Ser Ala Gly Ser Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe Ala Leu 595 600 605 Val Thr Asp Asn Asn Thr Gly Asn Lys Tyr Met Leu Ala Asp Tyr Glu 610 615 620 Met Thr Pro Asn Met Ala Ile Val Asp Ala Glu Leu Met Met Lys Met 625 630 635 640 Pro Lys Gly Leu Thr Ala Tyr Ser Gly Ile Asp Ala Leu Val Asn Ser 645 650 655 Ile Glu Ala Tyr Thr Ser Val Tyr Ala Ser Glu Tyr Thr Asn Gly Leu 660 665 670 Ala Leu Glu Ala Ile Arg Leu Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr 675 680 685 Lys Asn Gly Arg Thr Asn Glu Lys Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala 690 695 700 Ser Thr Met Ala Gly Met Ala Ser Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Cys 705 710 715 720 His Ser Met Ala Ile Lys Leu Ser Ser Glu His Asn Ile Pro Ser Gly 725 730 735 Ile Ala Asn Ala Leu Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Phe Asn Ala Val 740 745 750 Asp Asn Pro Val Lys Gln Ala Pro Cys Pro Gln Tyr Lys Tyr Pro Asn 755 760 765 Thr Ile Phe Arg Tyr Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Ile Lys Leu Gly Gly 770 775 780 Asn Thr Asp Glu Glu Lys Val Asp Leu Leu Ile Asn Lys Ile His Glu 785 790 795 800 Leu Lys Lys Ala Leu Asn Ile Pro Thr Ser Ile Lys Asp Ala Gly Val 805 810 815 Leu Glu Glu Asn Phe Tyr Ser Ser Leu Asp Arg Ile Ser Glu Leu Ala 820 825 830 Leu Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Phe Pro Leu Thr Ser 835 840 845 Glu Ile Lys Glu Met Tyr Ile Asn Cys Phe Lys Lys Gln Pro 850 855 860 <210> 7 <211> 218 <212> PRT <213> ctfA <400> 7 Met Asn Ser Lys Ile Ile Arg Phe Glu Asn Leu Arg Ser Phe Phe Lys 1 5 10 15 Asp Gly Met Thr Ile Met Ile Gly Gly Phe Leu Asn Cys Gly Thr Pro 20 25 30 Thr Lys Leu Ile Asp Phe Leu Val Asn Leu Asn Ile Lys Asn Leu Thr 35 40 45 Ile Ile Ser Asn Asp Thr Cys Tyr Pro Asn Thr Gly Ile Gly Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Asn Asn Gln Val Lys Lys Leu Ile Ala Ser Tyr Ile Gly Ser 65 70 75 80 Asn Pro Asp Thr Gly Lys Lys Leu Phe Asn Asn Glu Leu Glu Val Glu 85 90 95 Leu Ser Pro Gln Gly Thr Leu Val Glu Arg Ile Arg Ala Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Leu Gly Gly Val Leu Thr Lys Thr Gly Leu Gly Thr Leu Ile Glu 115 120 125 Lys Gly Lys Lys Lys Ile Ser Ile Asn Gly Thr Glu Tyr Leu Leu Glu 130 135 140 Leu Pro Leu Thr Ala Asp Val Ala Leu Ile Lys Gly Ser Ile Val Asp 145 150 155 160 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Tyr Lys Gly Thr Thr Lys Asn Phe Asn Pro 165 170 175 Tyr Met Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Ile Val Glu Ala Glu Asn Leu 180 185 190 Val Ser Cys Glu Lys Leu Glu Lys Glu Lys Ala Met Thr Pro Gly Val 195 200 205 Leu Ile Asn Tyr Ile Val Lys Glu Pro Ala 210 215 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> ctfB <400> 8 Met Ile Asn Asp Lys Asn Leu Ala Lys Glu Ile Ile Ala Lys Arg Val 1 5 10 15 Ala Arg Glu Leu Lys Asn Gly Gln Leu Val Asn Leu Gly Val Gly Leu 20 25 30 Pro Thr Met Val Ala Asp Tyr Ile Pro Lys Asn Phe Lys Ile Thr Phe 35 40 45 Gln Ser Glu Asn Gly Ile Val Gly Met Gly Ala Ser Pro Lys Ile Asn 50 55 60 Glu Ala Asp Lys Asp Val Val Asn Ala Gly Gly Asp Tyr Thr Thr Val 65 70 75 80 Leu Pro Asp Gly Thr Phe Phe Asp Ser Ser Val Ser Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Arg Gly Gly His Val Asp Val Thr Val Leu Gly Ala Leu Gln Val Asp 100 105 110 Glu Lys Gly Asn Ile Ala Asn Trp Ile Val Pro Gly Lys Met Leu Ser 115 120 125 Gly Met Gly Gly Ala Met Asp Leu Val Asn Gly Ala Lys Lys Val Ile 130 135 140 Ile Ala Met Arg His Thr Asn Lys Gly Gln Pro Lys Ile Leu Lys Lys 145 150 155 160 Cys Thr Leu Pro Leu Thr Ala Lys Ser Gln Ala Asn Leu Ile Val Thr 165 170 175 Glu Leu Gly Val Ile Glu Val Ile Asn Asp Gly Leu Leu Leu Thr Glu 180 185 190 Ile Asn Lys Asn Thr Thr Ile Asp Glu Ile Arg Ser Leu Thr Ala Ala 195 200 205 Asp Leu Leu Ile Ser Asn Glu Leu Arg Pro Met Ala Val 210 215 220

Claims

아세틸코에이(acetyl CoA)에서 아세토아세틸코에이(acetoacetyl CoA), 3-하이드록시부티릴코에이(3-hydroxybutyryl CoA) 및 크로토닐코에이(crotonyl CoA)를 거쳐서 부티릴코에이(butyryl CoA)를 생합성하는 경로를 가지고, 아세톤 생합성 경로가 차단되어 있는 클로스트리듐 속 미생물에 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자와 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소인 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhE1)를 도입하는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 아세톤 생합성 경로가 차단된 숙주 미생물은 아세토아세트산 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자(adc)가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물의 제조방법.
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제1항에 있어서, 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소는 코에이 트랜스퍼라제인 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 ctfAB 인 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물의 제조방법.
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아세틸코에이(acetyl CoA)에서 아세토아세틸코에이(acetoacetyl CoA), 3-하이드록시부티릴코에이(3-hydroxybutyryl CoA) 및 크로토닐코에이(crotonyl CoA)를 거쳐서 부티릴코에이(butyryl CoA)를 생합성하는 경로를 가지고, 아세톤 생합성 경로가 차단되어 있는 클로스트리듐 속 미생물에 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자와 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 각각 에탄올 및 부탄올로 전환하는 효소인 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhE1)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물.
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제10항에 있어서, 상기 아세톤 생합성 경로가 차단된 숙주 미생물은 아세토아세트산 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자(adc)가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물.
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제10항에 있어서, 아세트산 및 부틸산을 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butylyl CoA)로 전환하는 효소는 코에이 트랜스퍼라제인 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물.
제15항에 있어서, 상기 코에이 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 ctfAB 인 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능이 증가된 재조합 클로스트리듐 속 미생물.
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클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5에 pIMP1::adhE1.ctfAB 벡터가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 및 부탄올 생성능을 가지는 재조합 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5.
제10항, 제13항, 제15항 또는 제16항의 재조합 클로스트리듐 속 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 에탄올, 부탄올 또는 상기 에탄올과 부탄올의 혼합액을 회수하는 단계를 포함하는 알코올의 제조방법.
제20항의 에탄올 및 부탄올 생성능을 가지는 재조합 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5를 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 에탄올 및 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올 및 부탄올의 제조방법.