KR101346615B1 - 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법 - Google Patents

부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사회로의 조작 및 돌연변이를 이용한 evolution을 통하여 제작된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법에 관한 것이다. 상기 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물은 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물로부터 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 대사흐름 조작에 의해 아세톤 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐 아니라 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 생산성을 향상시킬 수 있어 상기 알코올의 산업적 생산에 유용하다.

Description

부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법{Enhanced Butanol, Ethanol and Isopropanol Producing Recombinant Mutant Microorganisms and Method for Preparing It Using the Same}
본 발명은 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대사회로의 조작 및 돌연변이를 이용한 evolution을 통하여 제작된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법에 관한 것이다.
부탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올은 현재 산업 용매로써 거대한 시장을 형성하고 있다. 바이오 에탄올은 미국 및 브라질에서는 이미 자동차 등의 수송 연료로 사용되고 있으며, 부탄올 및 이소프로판올 또한 앞으로 자동차 등의 수송연료로 사용 가능성이 현실화되고 있어 계속적인 수요 증가가 예상되고 있다. 수송연료로써 부탄올은 가솔린과 비슷한 에너지 밀도를 가지며, 에탄올 및 이소프로판올은 부탄올에 비하여 상대적으로 높은 모터 옥탄가를 가진다. 에탄올 및 이소프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹에서 2가지 이상 포함한 혼합 알코올은 순수 부탄올에 비하여 상대적으로 더 높은 옥탄가의 장점을 가지고, 에탄올에 비하여는 상대적으로 더 높은 에너지 밀도의 장점을 가진다. 또한, 이들 혼합 알코올을 동시에 적정 비율로 생산하게 될 경우, 각각을 별도로 생산한 후, 다시 섞는 공정보다 비용적 측면에서 더욱 유리하다.
부탄올(C4H9OH)의 전세계 생산량은 약 백십만 톤/년으로 추정된다. 현재 시판되는 부탄올은 모두 화학적 합성으로 생산된 것이다. 부탄올의 화학합성법은 원료를 석유로 하고 있으며 이로부터 얻어진 프로필렌으로부터 합성되는 옥소법(oxo process)이 사용된다. 에탄올(C2H5OH)은 예로부터 녹말이나 당류를 발효시키는 방법으로 제조되었으며, 오늘날 주류(酒類)의 대부분은 이 방법으로 제조하고 있다. 공업용 에탄올은 석유로부터 얻은 에틸렌(에텐)을 황산에 흡수시켜 에탄올의 황산에스테르를 만든 후, 이것을 다시 가수분해하여 디에틸에테르와 함께 얻는 방법(황산가수법)과 기상(氣相)에서 에틸렌을 고체인산촉매에 접촉적하여 수증기와 반응시킴으로써 직접 에탄올을 합성하는 방법(직접수화법)으로 제조하고 있다. 이소프로판올 역시 대부분 석유로부터 얻은 프로필렌(propylene)으로부터 직접 수화 또는 황산을 이용한 산화반응을 통해 생산된다.
상술한 바와 같이 지금까지 생산되는 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올의 경우 화학합성법에 의해 대부분 생산되고 있으며, 유가 상승과 환경 문제 야기 등으로 세계 각국에서는 이들 바이오 알코올 연구에 대한 관심이 급속하게 증가되고 있는 상황이나, 아직까지 바이오 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올만을 효율적으로 동시에 생산한 예는 없었다.
발효를 통한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 생산은 Clostridium beijerinkii NRRL B592, C. beijerinkii NRRL B593, C. beijerinkii IAM 19015, C. beijerinkii ATCC 14823, C. beijerinkii NCIMB 9581 등 일부 클로스트리듐 균주에서 가능하다 (Shaheen et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2: 115, 2000). 하지만, 상기의 균주들이 생산하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 포함한 전체 유기용제 생산 농도는 11.3 g/l (C. beijerinkii NRRL B592), 11.5 g/l (C. beijerinkii NRRL B593), 12.0 g/l (C. beijerinkii IAM 19015), 4.4 g/l (C. beijerinkii ATCC 14823), 3.3 g/l (C. beijerinkii NCIMB 9581)로 매우 낮아 산업적 이용이 불가능하다.
한편, 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 생산하는 C. acetobutylicum ATCC 824 등은 혼합 알코올 생산에 있어서 부산물로 취급되는 아세톤을 동시에 생산하고 있어, 혼합 알코올 생산 산업에 있어서 분리 정제 비용을 상승시키고 carbon yield를 감소시키는 요인으로 작용하고 있다. 아세톤 생산을 감소시키기 위한 선행 연구들에 의하면, 1) aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 과발현시켜 야생형과의 비교에서 상대적으로 부탄올 및 에탄올 생성량 대비 아세톤 생성 비율이 감소한 보고 (Nair et al., J. Bacteriol., 176:871, 1994); 2) buk 유전자를 불활성화함으로써 상대적으로 부탄올 생산량이 16.7 g/l까지 증가함으로써 아세톤 생산 비율이 감소한 보고(Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000); 3) 무작위 돌연변이로 유발된 돌연변이주 C. beijerinckii BA101 균주를 이용하여 18.6 g/l까지 부탄올 생산량을 증가시킴으로써 아세톤 생산 비율이 감소한 보고 (Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004) 등이 있다. 하지만, 상기의 3가지 예들은 모두 부산물인 아세톤의 농도가 실제로 감소되지 않은 단점이 있다. 아세톤 생성이 감소되거나 차단된 채로 에탄올 및 부탄올을 생성한 예로써, adc(아세토아세트산 탈탄산 효소의 유전자) 제거 (Jiang et al., Metab. Eng. doi:10.1016/j.ymben.2009.06.002, 2009), ctfA(CoA 전달 효소 A의 유전자), ctfB(CoA 전달 효소 B의 유전자) 제거 (WO2008052596, WO2008052973), aad(알코올/알데히드 탈수소 효소의 유전자) 및 ctfAB(CoA 전달 효소 AB의 유전자) 활성에 모두 결함이 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 돌연변이주에 aad(Nair et al., J. Bacteriol., 176:5843, 1994) 또는 aad-ctfAB를 도입(PCT/KR2008/007577)한 재조합 변이 미생물을 이용한 경우가 있으나, 부탄올 및 에탄올 혼합물의 최종 농도가 6~16.3 g/l로 낮은 단점이 있어 산업적 이용이 불가능하다.
따라서 당업계에서는 아세톤과 같은 부산물의 생성 없이 연료로 바로 이용 가능한 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 혼합 알코올을 고효율로 생산하는 미생물의 개발이 절실하게 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 아세톤과 같은 부산물의 생성 없이 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 고효율로 생산하는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물에 돌연변이원을 처리하여 변이 미생물을 제조한 후, 변이 미생물에 이소프로판올에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 제조한 재조합 변이 미생물이 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 고농도로 생산하는 반면, 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 부산물인 아세톤의 생산 없이 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 고농도로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물로부터 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물로부터 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG)을 처리하여 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG)을 처리하여 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI), 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG), 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물의 제조방법에 의하여 제조된 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 변이 미생물의 제조방법에 의하여 제조된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 부탄올 및 에탄올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올 및 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 대사회로의 조작 및 돌연변이를 이용한 evolution을 통하여 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 대사흐름 조작에 의해 아세톤 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐 아니라 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 생산성을 향상시킬 수 있어 상기 알코올의 산업적 생산에 유용하다.
도 1은 클로스트리듐 균주의 주요 부탄올, 에탄올, 아세톤, 아세트산, 부티르산 생산 대사회로이다.
본 발명에서는 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물에 돌연변이원을 처리하여 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 제조한 재조합 변이 미생물이 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않으면서, 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 고수율로 생산할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주에 돌연변이원(NTG or MNNG)을 처리하여 아세트산, 부티르산, 부탄올, 아세톤 또는 에탄올의 농도가 변화된 변이 미생물을 제조한 후, 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시킨 재조합 변이 미생물을 제작하였다. 그리고, 제작된 재조합 변이 미생물이 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않으면서, 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 고수율로 생산한다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물로부터 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다른 관점에서, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물로부터 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 상기 제조방법으로부터 제조된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물은 (a) 아세틸코에이(acetyl-CoA) 생합성 경로; (b) 부티릴코에이(butyryl-CoA) 생합성 경로; (c) 아세톤 생합성 경로; (d) 에탄올 생합성 경로; (e) 부탄올 생합성 경로; (f) 아세트산 생합성 경로; 및 (g) 부티르산 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상의 생합성 경로가 도입, 제거 또는 조절되어 있는 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "조절"이란 생합성 경로에 존재하는 효소들 중 1개 이상을 evolution 및 mutation 하거나 생합성 경로에 존재하는 효소의 발현을 조절하는 것을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서 "생합성 경로"란 해당과정(glycolysis)을 거쳐서 제공된 탄소로부터 목적 화합물이 합성되는 경로만으로 국한하지 않고, 세포내의 특정 대사산물로부터 목적 화합물이 합성되는 경로들을 포괄하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지고 있다라고 하는 것은 균주 자체에서 원래부터 가지고 있는 것 뿐만 아니라 재조합, 지놈셔플링(genome shuffling) 등의 기법으로 외래의 유전자를 도입한 것까지 모두 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐 속 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 부탄올 및 에탄올 및 아세톤으로 구성된 군에서 1개 이상 생합성할 수 있는 경로를 가지는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 클로스트리듐 속 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합을 통하여 차단하거나 조절하는 생합성 경로는 아세트산 또는 부티르산 생합성 경로인 것을 특징으로 할 수 있으나, 아세트산 생성 경로 및 부티르산 생성 경로로 구성된 군에서 1개 이상 차단하거나 조절하는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 숙주 미생물에 돌연변이원을 처리함으로서 제조할 수 있다. 상기 돌연변이원으로는 미생물을 변이 시킬수 있는 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 프로플라빈(proflavine), 아크리딘 오렌지(acridine orage), N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG), 4-nitroqyinoline 1-oxide(4-NQO), 아질산(HNO2), 하드록실아민(NH2OH), dimethylsulfate(DMS), diethylsulfate(DES), ethyl ethanesulfonate(EES), methyl methanesulfonate(MMS), ethyl methanesulfonate (EMS) 등을 예시할 수 있다.
상기 돌연변이원으로 처리된 상기 변이 미생물의 대사산물은 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여, 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 것임을 특징으로 할 수 있다. 상기 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로는 에탄올, 부탄올, 이소프로판올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 이소부탄올, 프로판올, tert-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 다양한 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물중에서, 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기 변이 미생물의 대사산물중 아세톤을 제거하기 위하여 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, 즉 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자를 상기 변이 미생물에 도입시키는 것을 특징으로 한다. 상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 모두 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 기능을 가진다.
상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자는 adhI이고, 상기 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 hydG인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 상기 adhI 및 hydG로 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii) NRRL B593 유래인 것만을 예시하였으나, 다른 미생물 유래의 유전자라 할지라도, 도입된 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 제한 없이 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG)을 처리하여 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 상기 제조방법으로부터 제조된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법으로부터 제조된 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19 (KCTC 11555BP)을 예시할 수 있고, 재조합 변이 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19(pTHL1-Cm-IPA1) (Clostridium acetobutylicum BKM19(pTHL1-Cm-IPA1)), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2) (Clostridium acetobutylicum(pTHL1-Cm-IPA2)) 등을 예시할 수 있다.
그리고, 본 발명의 일 실시예에서는 아세톤으로의 대사흐름을 증대시키기 위하여 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물 #104(Clostridium acetobutylicum BKM19)에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG) 뿐만 아니라, 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)를 증폭 또는 도입시킨 재조합 미생물을 제작하고, 재조합 미생물이 더욱 향상된 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 감소된 아세톤의 생성능을 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른관점에서, 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물로부터 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물에 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 또는 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 변이 미생물은 부탄올을 포함한 전체 알코올을 16~40 g/l의 농도로 생성하고, 에탄올:부탄올 비가 1:6 ~ 2:1이 되도록 에탄올 및 부탄올을 생성하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 재조합 변이 미생물은 0.01~4 g/l, 바람직하게는 0.1~1 g/l 농도의 아세톤을 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 변이 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법에 관한 것이다.
상기, 부탄올, 에탄올 또는 이소프로판올은 각각 또는 혼합 알코올 형태로 회수할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 변이 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올 및 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올의 제조방법 및 상기 재조합 변이 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양 및 순수 알코올 및 혼합 알코올 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 알코올의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 알코올의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높이기 위하여 gas-stripping 방법(Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005) 등을 이용하여 배양도중에 회수할 수도 있다. 즉, 배양중에 생성된 부탄올 및 에탄올 또는/ 및 이소프로판올을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 숙주균주로 특정 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주들만을 예시하였으나, 다른 클로스트리듐 속이나 다른 속의 미생물을 사용하더라도, 부탄올 및 에탄올 및 아세톤으로 구성된 군에서 1개 이상 생합성할 수 있는 경로를 가지는 한 이에 국한되지 않는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 균주의 돌연변이 유도
클로스트리듐 아세토부틸리쿰(ATCC 824) 균주의 아세트산 생합성 경로 차단 상동성-재조합 균주 및 부티르산 생합성 경로 차단 상동성-재조합 균주 및 젖산 생합성 경로 차단 상동성-재조합 균주를 대상으로 돌연변이를 유도하였다. 상기 균주들은 상동성 재조합에 의한 유전자 결실 방법을 이용하여 제작하였다. 각 균주들은 2X YTG배지 (Bacto Tryptone 16 g, Yeast extract 10 g, NaCl 4 g, Glucose 5 g, 1 리터 당) 10 ml에 3개씩 접종하여 OD 1.0이 될 때까지 혐기챔버에서 37℃로 배양하였다. 배양 종료후, 미생물들을 원심분리 방법으로 회수하고, 다시 3 ml의 2X YTG배지에 현탁시켜 1 ml씩 3개의 1.5 ml 튜브에 분주하였다. 100 mg/ml의 농도로 제조한 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) 스톡을 이용하여 최종농도 200, 500, 1000 ug/ml로 5분동안 돌연변이 처리하였다. 돌연변이 처리된 미생물들은 원심분리로 재회수하고, 2X YTG배지를 이용하여 3번 세척 하였다. 이들을 다시 각각 1 ml의 2X YTG에 현탁시키고, 107배까지 희석하여 40 ug/ml의 에리스로마이신 항생제가 포함된 2X YTG 고체 배지에 도말하여, 37℃ 혐기조건에서 5일 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 콜로니들을 에리스로마이신이 포함된 CGM배지 (표1)에 접종하여 48시간 동안 37℃ 혐기조건에서 배양하였다. 배양 종료 후, 상등액을 회수하여 생산된 아세트산, 부티르산, 아세톤, 에탄올 및 부탄올 농도를 packed column(Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
성분 함량 (g/l)
Glucose 80
K2HPO4 3H2O 0.982
KH2PO4 0.75
MgSO4 0.348
MnSO4 H2O 0.01
FeSO4 7H2O 0.01
(NH4)2SO4 2
NaCl 1
Asparagine 2
p-Aminobenzoic acid 0.004
Yeast extract 5
1차 돌연변이 균주 (g/l)
순번 (#) 부탄올 에탄올 아세톤 아세트산+부티르산
101 3.5 1.7 1.5 7.72
102 5.8 2.2 2.2 6.14
103 8.2 3.5 2.2 3.98
104 9.3 9.2 0.4 2.06
105 10.8 6.9 0.5 1.89
106 6.5 5.1 1.9 2.23
107 7.0 3.3 0.7 5.48
108 6.6 2.9 2.2 4.46
대조군 균주에서는 약 3 g/l 에탄올 및 약 8 g/l 부탄올이 생성되는 반면, 표 2에 나타난 바와 같이, 1차 돌연변이 균주는 다양한 농도의 아세트산, 부티르산, 부탄올, 아세톤, 에탄올을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
1차 돌연변이 균주들 중에서 에탄올 농도가 증가한 #104 균주 (Clostridium acetobutylicum BKM19, 기탁번호 KCTC 11555BP)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 2차 돌연변이를 유발시키고, 대사산물을 분석하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
2차 돌연변이 균주 (g/l)
순번 (#) 부탄올 에탄올 아세톤
201 8.7 7.0 1.3
202 8.2 6.7 1.2
203 10.0 8.4 1.3
204 9.5 7.8 1.4
205 8.0 6.5 1.2
206 9.7 8.6 1.3
207 10.9 8.3 1.6
208 7.4 4.9 1.7
209 6.4 5.0 0.7
210 5.2 3.4 0.6
211 3.3 2.5 0.6
212 5.9 4.3 0.8
표 3에 나타난 바와 같이, 2차 돌연변이 균주 또한 다양한 농도의 부탄올, 에탄올 및 아세톤을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 변이 미생물을 이용한 고농도 부탄올 및 에탄올 생산
상기 실시예 1에서 제작한 변이 미생물들 중, #104 (Clostridium acetobutylicum BKM19, 기탁번호 KCTC 11555BP) 및 #207 균주 (Clostridium acetobutylicum JA94)에 대한 부탄올 및 에탄올 생성능을 확인하였다. CGM 배지 10 ㎖을 함유한 30 ㎖ 시험관을 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼내어 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/㎖를 첨가하고, 상기 변이 미생물을 접종하여 37℃에서 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 혐기조건에서 전배양을 수행하였다. 상기 동일성분으로 구성된 CGM배지를 200 ㎖을 함유한 500 ㎖ 플라스크를 멸균 후 동일한 처리를 한 후, 상기 전배양액 10 ㎖을 접종하여, 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 37℃, 혐기조건에서 2차 전배양 하였다. 그 후 상기 성분으로 구성된 배지 1.8 l를 함유한 5.0 l 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea)를 멸균 후 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5 vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮춘 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/ml을 첨가하고 상기 2차 전배양액 200 ㎖을 접종하여, 37℃ 또는 32℃, 200 rpm에서 60시간 배양하였다. pH 보정은 암모니아수를 이용하였으며 automatic feeding에 의해 5.0 이상으로 유지하였고, 배양 중에는 질소를 0.2 vvm (air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.
상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하였고, 시간별로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 아세톤의 농도를 packed column(Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 변이 미생물 #104는 37℃ 발효에서, 최종농도 약 11.2~13.2 g/l의 부탄올, 약 8.5~12.1 g/l의 에탄올 및 4.3~4.8 g/l의 아세톤을 생산하였고, 32℃ 발효에서 최종농도 17.6 g/l의 부탄올, 10.5 g/l의 에탄올 및 4.4 g/l의 아세톤을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 부탄올 및 에탄올 (BE) 혼합 알코올로써 28.1 g/l를 나타내며, 전체 아세톤-부탄올-에탄올 (ABE)로써는 32.5 g/l를 나타내는 것으로 지금까지 보고된 가장 높은 BE 및 ABE 농도를 나타낸다.
또한, 변이 미생물 #207은 32℃ 발효에서 최종농도 19.9 g/l의 부탄올, 5.0 g/l의 에탄올 및 5.0 g/l의 아세톤을 생산하는 것을 확인하였다. 이는 부탄올 농도가 약 20 g/l에 육박하는 것으로써 지금까지 보고된 가장 높은 부탄올 생산 농도를 나타낸다.
실시예 3: 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입한 재조합 변이 미생물의 아세톤 제거 및 고농도 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올 생산
클로람페니콜 항생제 내성 유전자와 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 싸이올레이즈(thiolase) 프로모터와 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)를 포함하는 외래 단백질 발현용 셔틀 벡터 pTHL1-Cm에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 그리고/또는 전자전달 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하였다.
먼저, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 싸이올레이즈(thiolase) 프로모터와 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)를 포함하는 외래 단백질 발현용 셔틀 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 싸이올레이즈는 세포 생장주기에 크게 영향받지 않고 계속적이고 안정적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999). 따라서 본 실시예에서는 싸이올레이즈(NCBI GeneID:1119056) 상단에 위치한 프로모터를 클로닝하여 pIMP-H1del에 삽입하였다. pIMP-H1del은 2개의 HindIII 제한효소 자리를 가지는 pIMP1으로부터 3408번째 염기서열에 존재하는 HindIII site 1개를 제거하고 743번째 염기열에 존재하는 제한효소 자리만 남겨둔 pIMP1을 주형으로 하는 셔틀 벡터이다. 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(ATCC 824) 균주의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 싸이올레이즈 프로모터를 증폭하였다. 증폭된 싸이올레이즈 프로모터 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII와 PstI 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pIMP-H1del 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1 벡터 제작을 완성하였다.
[서열번호 1]: 5'-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3'
[서열번호 2]: 5'-AAACTGCAGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3'
또한, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머, pSOS95-CM plasmid DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭하고, 증폭된 클로람페니콜 저항성 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL1 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1-Cm 벡터 제작을 완성하였다.
[서열번호 3]: 5'-CCAAGCTTCGACTTTTTAACAAAATATATTG-3'
[서열번호 4]: 5'-CCAAGCTTGACATTAAAAAAATAAGAGTTACC-3'
다음으로 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)를 코딩하는 유전자를 가지는 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii) NRRL B593의 total DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하거나 서열번호 5와 서열번호 7를 이용하여 PCR을 수행함으로써 각각 adhI 및 adhI-hydG 단편을 증폭하였다.
[서열번호 5]: 5'-AAAACTGCAGATGAAAGGTTTTGCAATGCTA-3'
[서열번호 6]: 5'-CCCCCGGGGGTGTATAATCCTCCATGATCTATTATG-3'
[서열번호 7]: 5'-CCCCCGGGGGCCTTCTACACATTTAGGATTCTTAC-3'
증폭된 2종류의 PCR 산물들 각각을 PstI과 AvaI 제한효소로 처리한 뒤, 동일효소로 처리된 pTHL1-Cm 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pTHL1-Cm-IPA1과 pTHL1-Cm-IPA2를 제조하였다.
변이 미생물 #104 균주의 아세톤 생산을 감소시키기 위하여 상기의 플라스미드들을 다음과 같이 형질전환 하였다. 먼저, 바실러스 서브틸리스 파지 (Bacillus subtilis Phage) Φ3T I 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 발현 벡터, pAN1 (Mermelstein et al., Appl. Environ. Microbiol., 59:1077, 1993)을 함유하는 대장균 TOP10에 상기에서 제작된 재조합 벡터들을 도입하여, 상기 벡터들을 클로스트리듐으로의 형질전환에 적합하도록 메틸레이션을 유도하였다. 이렇게 메틸레이션된 벡터를 대장균으로부터 분리 및 정제하고, 이 벡터를 재조합 변이 미생물인 #104 균주에 도입하였다.
형질전환을 위한 competant cell은 다음과 같이 준비하였다. 먼저 10 ml CGM (표 1)에 #104 균주를 접종한 후 OD 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이를 이용하여 2X YTG배지 (Bacto Tryptone 16 g, Yeast extract 10 g, NaCl 4 g, Glucose 5 g, 1 리터 당) 60 ml에 10% 접종하여 4-5 시간 동안 배양하였다. 형질전환버퍼 (EPB, 270 mM sucrose 15 ml, 686 mM NaH2PO4 110 ul, pH 7.4)로 2번 washing한 후, 2.4 ml의 동일 버퍼로 미생물 세포를 현탁시켰다. 이렇게 만들어진 competent cell 600 ul와 재조합 플라스미드 DNA 25 ul를 섞어서 4 mm 전극을 가진 cuvette에 충진 후 2.5 kV, 25 uF의 조건으로 전기 충격을 가하였다. 즉시, 1 ml의 2X YTG배지로 현탁하여 3시간 동안 37℃에서 배양한 후, 40 ug/ml의 에리스로마이신과 5 ug/ml 클로람페니콜이 동시에 포함된 2X YTG 고체배지에 도말하여 형질전환체를 선발하였다. 재조합 변이 미생물 #104(pTHL1-Cm-IPA1) 및 #104(pTHL1-Cm-IPA2)를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여 아세톤 제거 및 알코올 생산능을 평가하였다. 그 결과, 두 가지 방법 모두 아세톤을 0.3~0.4 g/l 농도까지 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, #104(pTHL1-Cm-IPA1)의 경우 부탄올-에탄올-이소프로판올 (BEI) 혼합 알코올을 29.1 g/l 농도까지 생산하고, #104(pTHL1-Cm-IPA2)의 경우 부탄올-에탄올-이소프로판올 (BEI) 혼합 알코올을 26.7 g/l 농도까지 생산하는 것을 확인하였다.
실시예 4: 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 균주에 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가 증폭한 재조합 변이 미생물의 제조
아세톤으로의 대사 흐름을 증대시키기 위하여 C. acetobutylicum ATCC 824의 아세토아세테이트 디카복실라제(adc, acetoacetate decarboxylase) 유전자와 CoA 트랜스퍼라제 (ctfA, ctfB: CoA transferase) 유전자를 pTHL1-Cm에 클로닝하였다. 이때, 프로모터는 아세토아세테이트 디카복실라제(acetoacetate decarboxylase) 유전자의 것을 사용하였으며, 각각의 유전자는 그 자체의 RBS를 사용하였다. adc 프로모터는 용매 생성기에서 강하게 발현되는 것으로 알려져 있다 (Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999). 먼저, C. acetobutylicum ATCC 824의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 adc 프로모터와 RBS를 포함하는 adc 유전자 단편을 증폭하였고, C. acetobutylicum ATCC 824의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 ctfAB 유전자 단편을 증폭하였다.
[서열번호 8]: 5'-ATATGGATCCAAGTGTACTTTTATTTTCGAAAGC-3'
[서열번호 9]: 5'-AATCCCTCCTTTCCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTA-3'
[서열번호 10]: 5'-GTTACCTTAAATGGAAAGGAGGGATTAAAATGAACTCT-3 '
[서열번호 11]: 5'-ATATACGCGTCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTT-3'
다음으로 상기 adc 유전자 및 ctfAB 유전자의 PCR 산물을 혼합한 것을 주형으로 하고, 상기 서열번호 8과 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 adc 유전자와 ctfAB 유전자가 adc 프로모터에 의해 발현되는 인공 아세톤 오페론 가닥을 증폭하였다. 이 증폭된 산물을 BamHI과 MluI 제한효소로 처리한 뒤, 동일 제한 효소로 처리된 pIMP3 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pACT를 제조하였다.
그리고, 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 유전자와 adc 프로모터, adc 터미네이터(terminator)를 클로닝하였다. 먼저, adc 터미네이터와 EagI 제한 효소 서열을 삽입하기 위해 서열번호 12와 13의 프라이머를 상보적으로 결합시킨 후, 위 산물과 BamHI과 EcoRI 제한 효소로 처리된 pUC18 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pUCadcT를 제조하였다.
[서열번호 12]: 5'-GATCCACTACGGCCGTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAA TGC-3'
[서열번호 13]: 5'-AATTGCATTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTACGGCCGTA GTG-3'
그리고, C. acetobutylicum ATCC 824의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 14와 15를 이용하여 PCR을 수행하여 adc의 RBS를 포함하지 않는 adc 프로모터 단편을 증폭한 후, 증폭된 산물을 제한효소 PstI과 BamHI으로 처리한 뒤, 동일 제한 효소로 처리된 pUCadcT 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pUCadcPT를 제작하였다.
[서열번호 14]: 5'-ATATCTGCAGAAGTGTACTTTTATTTTCGAAAGC-3'
[서열번호 15]: 5'-ATATGGATCCTAATAATGTTTAGCTTTTCTAACAT-3'
제작된 pUCadcPT에 고유의 RBS를 포함하는 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질 유전자 단편을 삽입하기 위해 C. beijerinckii NRRL B-593의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 16과 17, 그리고 서열번호 16과 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 각각 adhI 및 adhI-hydg 단편을 증폭하였다.
[서열번호 16]: 5'-ATAT GGATCC TAAGGAGGAACATATTTTATGAAAG-3'
[서열번호 17]: 5'-ATAT CGGCCG TTATAATATAACTACTGCTTTAATTA-3'
[서열번호 18]: 5'-ATAT CGGCCG TTATTTATCACCTCTGCAACCAC-3'
증폭된 2종류의 산물 각각을 BamHI과 EagI 효소로 처리한 뒤, 동일 제한효소로 처리한 pUCadcPT 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 각각 재조합 플라스미드 pSADH1과 pSADH2를 제조하였다.
pACT에 adc 프로모터와 터미네이터가 결합된 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질 유전자를 삽입하기 위해 각각 pSADH1과 pSADH2를 주형으로 하고, 서열번호 19와 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 2종류의 산물 모두를 SphI과 XmaI 제한 효소로 처리한 후, 동일 제한 효소로 처리한 pACT 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 각각 재조합 플라스미드 pIPA3과 pIPA4를 제조하였다.
[서열번호 19]: 5'-CGGGCCTCTTCGCTATTACG-3'
[서열번호 20]: 5'-ATATCCCGGGGGAATTGTGAGCGGATAACA-3'
제작된 pIPA3과 pIPA4는 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 메틸레이션시킨 후, Evolution을 통하여 에탄올 및 부탄올을 각각 10 g/l 이상 생산하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19 (Clostridium acetobutylicum BKM19, KCTC 11555BP)에 도입하여 BKM19(pIPA3) 및 BKM19(pIPA4)를 제작하였다.
실시예 5: 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 균주에 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가 증폭한 재조합 변이 미생물의 고농도 혼합 알코올 생산
실시예 4에서 제작된 재조합 변이 미생물 BKM19(pIPA3)을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여 아세톤 제거 및 알코올 생산능을 평가하였다. 그 결과, 아세톤 농도는 아세톤 생합성 회로가 증폭되었음에도 0.5 g/l 선에서 유지되었으며, 에탄올 5.6 g/l, 이소프로판올 5.2 g/l, 부탄올 18.5 g/l로 혼합 알코올의 총 생산량이 29.3 g/l까지 생산됨을 확인하였다. 이 또한, 지금까지 보고된 가장 높은 BEI 농도를 나타내며, 혼합 알코올 중 부탄올의 비율이 높은 특징을 가진다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11555BP 20090911
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Claims (25)

  1. 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물에 돌연변이원을 처리하여, 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19 (KCTC 11555BP)의 제조방법.
  2. 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물에 돌연변이원을 처리하여, 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가되고, 변이 전 숙주 미생물의 대사산물과 비교하여 아세톤, 아세트산, 부티르산, 젖산, 아세토인, 이산화탄소, 수소 및 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도 또는 종류가 변화된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 숙주 미생물은 (a) 아세트산 생합성 경로; (b) 부티르산 생합성 경로; 및 (c) 젖산 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상의 생합성 경로가 제거되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 돌연변이원은 프로플라빈(proflavine), 아크리딘 오렌지(acridine orage), N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG), 4-nitroqyinoline 1-oxide(4-NQO), 아질산(HNO2), 하드록실아민(NH2OH), dimethylsulfate(DMS), diethylsulfate(DES), ethyl ethanesulfonate(EES), methyl methanesulfonate(MMS), ethyl methanesulfonate (EMS) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 이소프로판올 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자는 adhI이고, 상기 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 hydG인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 adhI 및 hydG는 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii) NRRL B593 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 또는 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG)을 처리하여 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
  13. 부탄올 및 에탄올 생성능을 가지는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(NTG or MNNG)을 처리하여 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조한 후, 상기 변이 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI), 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG), 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
  14. 제1항의 방법에 의하여 제조된 부탄올 및 에탄올 생성능이 증가된 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19 (KCTC 11555BP).
  15. 삭제
  16. 제2항의 방법에 의하여 제조된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물.
  17. 제12항의 방법에 의하여 제조된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물.
  18. 제13항의 방법에 의하여 제조된 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 재조합 변이 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19(pTHL1-Cm-IPA1) (Clostridium acetobutylicum BKM19(pTHL1-Cm-IPA1)) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2) (Clostridium acetobutylicum(pTHL1-Cm-IPA2))인 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
  20. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 변이 미생물은 부탄올을 포함한 전체 알코올을 16~40 g/l의 농도로 생성하는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
  21. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 변이 미생물은 에탄올:부탄올 비가 1:6 ~ 2:1이 되도록 에탄올 및 부탄올을 생성하는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
  22. 제14항의 변이 미생물을 배양하여 부탄올 및 에탄올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올 및 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올의 제조방법.
  23. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항의 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법.
  24. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항의 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올 및 에탄올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올 및 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 및 에탄올의 제조방법.
  25. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항의 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.

















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