JP6014042B2 - 組換え微生物による一酸化炭素からのブタノールの産生 - Google Patents
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Description
従来の技術の一つ又はそれより多い不都合を克服すること、或いは少なくとも公共に既知の技術に対する有用な代替技術を提供することが本発明の目的である。
最初の側面において、本発明は、カルボキシド栄養性(carboxydotrophic)酢酸産生性組換え微生物を提供し、これは、1−ブタノール及び/又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。
一つの態様において、一つ又はそれより多い酵素は:
チオラーゼ
3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ
クロトナーゼ/クロトニル−CoAヒドラターゼ
ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ
電子伝達フラビンタンパク質A
電子伝達フラビンタンパク質B
からなる群から選択される。
好ましくは、一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い核酸は、配列番号1から番号6の核酸又は機能的に等価なこれらの変種から選択される。
一つの態様において、微生物は:
ホスホトランスブチリラーゼ;
酪酸キナーゼ;
フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素;
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ;
ブタノールデヒドロゲナーゼ;
二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼ;
からなる群から選択される一つ又はそれより多い酵素を発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。
一つの態様において、本発明の組換え微生物は、寄託番号DSM24138でDSMZ(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany)に寄託された微生物を定義する特徴を有する。
第3の側面において、本発明は、配列番号28又は機能的に等価なそのアミノ酸変種によるメチルトランスフェラーゼを提供する。
好ましくは、核酸は、図2に示す順序で配列番号1から6を含んでなる。
好ましくは、核酸は、チオラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質A及び/又は電子伝達フラビンタンパク質Bをコードする核酸から選択される。
一つの態様において、核酸は、更にホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ/ブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸から選択される。
一つの態様において、発現構築物は、ブタノール生合成経路中の少なくとも2種の酵素、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも11種又は少なくとも12種の酵素をコードする。
第7の側面において、本発明は、第5の側面の発現構築物及び第6の側面のメチル化構築物を含んでなる組成物を提供する。
第8の側面において、本発明は:
a.(i)発現構築物及び(ii)メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなる第6の側面によるメチル化構築物のシャトル微生物への導入;
b.メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現;
c.シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離;並びに
d.目的微生物への少なくとも発現構築物の導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
一つの態様において、発現構築物のみが目的微生物に導入される。もう一つの態様において、発現構築物及びメチル化構築物の両方が目的微生物に導入される。
好ましくは、組換え微生物は、1−ブタノール及び/又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
a.配列番号28又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼによるin vitroの発現構築物のメチル化
b.目的微生物への発現構築物の導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
好ましくは、組換え微生物は、1−ブタノール及び/又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
a.好ましくは配列番号27又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子のシャトル微生物のゲノムへの導入;
b.シャトル微生物への発現構築物の導入;
c.シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離;及び、
d.目的微生物への少なくとも発現構築物の導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
好ましくは、組換え微生物は、1−ブタノール及び/又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
a.メチルトランスフェラーゼによるin vitroの第5の側面による発現構築物のメチル化
b.目的微生物への発現構築物の導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供する。
第9の側面において、本発明は:
a.(i)第5の側面による発現構築物及び(ii)メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物のシャトル微生物への導入;
b.メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現;
c.シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離;並びに
d.目的微生物への少なくとも発現構築物の導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
一つの態様において、発現構築物のみが目的微生物に導入される。もう一つの態様において、発現構築物及びメチル化構築物の両方が目的微生物に導入される。
第10の側面において、本発明は:
a.(i)発現構築物及び(ii)メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物のシャトル微生物への導入;
b.メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現;
c.シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離;並びに、
d.目的微生物への少なくとも発現構築物の導入;
を含んでなる、1−ブタノール又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
一つの態様において、発現構築物のみが目的微生物に導入される。もう一つの態様において、発現構築物及びメチル化構築物の両方が目的微生物に導入される。
好ましくは、メチル化構築物は第6の側面において定義されたとおりである。
第11の側面において、本発明は、組換え微生物を使用して基質を発酵することを含んでなる、微生物発酵による1−ブタノール及び/又はその前駆体の産生の方法を提供する。
好ましくは、組換え微生物は、第8から第10の側面のいずれかに記載したとおりである。
第13の側面において、本発明は、本明細書中で定義されるとおりのメチル化構築物を含んでなるシャトル微生物を提供する。
好ましくは、シャトル微生物は、E.coli、Bacillus subtillis又はLactococcus lactisである。
第15の側面において、本発明は、配列番号16から23からなる群から選択される配列を有する核酸を提供する。
第18の側面において、本発明は、本明細書中の以下の表7から10に記載される群及びこれらの機能的に等価ないずれもの一つ又はそれより多い変種から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸を提供する。
第21の側面において、本発明は、配列番号32から38及び123から135からなる群から選択される配列を有する核酸を提供する。
全てがその新規な側面と考えられるべき本発明のこれらの及び他の側面は、以下の説明から明白となり、これは、付属する図面を参照して実施例によって与えられる。
本明細書中で言及する場合、“1−ブタノールの前駆体”は、ブチリルCoA、ブチルる−リン酸、酪酸、及びブチルアルデヒドを含む。
本明細書中で言及する場合、“シャトル微生物”は、その中でメチルトランスフェラーゼ酵素が発現する微生物であり、そして目的微生物とは別個である。
本明細書中で言及する場合、“主要な発酵産物”は、最高の濃度及び/又は収率で産生される一つの発酵産物を意味することを意図する。
一つの側面において、本発明は、1−ブタノール及び/又はその前駆体を主要な発酵産物として産生するためにCOを使用することが可能な遺伝子組換え微生物を提供する。微生物は、好ましくは1−ブタノール及び/又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する酢酸産生性組換え微生物である。一つの特別な態様において、酢酸産生性組換え微生物は、概略1mM又は発酵ブロスのリットル当たり0.075g/lより大きい濃度でCOを含んでなる基質からの発酵によって1−ブタノール又はその前駆体を産生することが可能である。
一つの特別な態様において、微生物は、Clostridium autoethanogenum DSM23693である。
a.(i)発現構築物及び(ii)メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物のシャトル微生物への導入;
b.メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現;
c.シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離;並びに、
d.一つ又はそれより多い構築物の目的微生物への導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
a.好ましくは配列番号28又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼによる、in vitroの発現構築物のメチル化;及び
b.好ましくは第5の側面による発現構築物の目的微生物への導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
a.好ましくは配列番号27又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子のシャトル微生物のゲノムへの導入;
b.シャトル微生物への発現構築物の導入;
c.シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離;及び、
d.目的微生物への少なくとも発現構築物の導入;
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
本発明は、更にC.autoethanogenum、C.ljungdahlii、及びC.ragsdaleiからのメチルトランスフェラーゼ核酸配列及び制限障害系の分析後に開発された、ハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子(配列番号28)を提供する。
本発明のもう一つの態様において、チオラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ及び電子伝達タンパク質又は機能的に等価なこれらの変種から選択される一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い核酸を含んでなる発現構築物が存在する。好ましくは、電子伝達タンパク質は、電子伝達フラビンタンパク質A又は電子伝達フラビンタンパク質Bである。特別な態様において、電子伝達フラビンタンパク質A及び電子伝達フラビンタンパク質Bの両方は、発現構築物上に含まれる。
本発明は、更に宿主生命体、そして特に、本明細書中に記載されるいずれか一つ又はそれより多い核酸を含んでなる、ウイルス、細菌、及び酵母を含む微生物を提供する。
遺伝子組換えは、C.acetobutylicumからのチオラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、及び2種の電子伝達フラビンタンパク質遺伝子を制御する、強力な天然のC.autoethanogenumプロモーターからなる合成オペロンを含有するプラスミドを使用して行った(図1−2)。このプラスミドを、新規なメチルトランスフェラーゼを使用してin vivoでメチル化し、そして次いでC.autoethanogenum DSM23693に形質移入した。主要な発酵産物としての1−ブタノールの産生を、異なった工業ガス流(製鋼所廃棄ガス、合成ガス)に対して示した。
標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術を、本発明において使用し、そしてこれらは、Sambrook et al,1989及びAusubel et al,1987によって記載されている。使用されたClostridium acetobutylicum ATCC824のブタノール生合成遺伝子のDNA配列は、NCBIから得られた(表1)。C.autoethanogenum DSM10061のホスホトランスアセチラーゼ/酢酸キナーゼオペロンプロモーターを配列決定し、そして標的遺伝子の発現のために使用した(表1)。RT−PCR実験は、このプロモーターが、高いレベルで恒常的に発現することを示した(図8)。
誘導性lacプロモーターに融合されたハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子(配列番号28)を、C.autoethanogenum(配列番号24)、C.ljungdahlii(配列番号25)、及びC.ragsdalei(配列番号26)(図4a、4b及び4c)からのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の整列によって設計した。メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、配列番号28によるメチルトランスフェラーゼ酵素の産生をもたらした。メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の整列データを図4dに示す。
完全なトランスフォーメーション実験中に、C.autoethanogenum DSM23693及びC.ljundahlii(DSM13528)を、10g/lのフルクトース及び炭素源としての37℃の約2.1kg/cm2(30psi)の製鋼所廃棄ガス(Glenbrook,NZのNew Zealand Steelの現場から収集;組成:44%CO、32%N2、22%CO2、2%H2)を伴うPETC培地(表4)中で、Hungate(1969)及びWolfe(1971)によって記載された標準的な嫌気性技術を使用して増殖した。
C.autoethanogenum:DNAの移動を確認するために、プラスミドのミニプレップを、10mlの培養体積からQIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を使用して行った。クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のために(Burchhardt and Durre,1990)、4種の分析されたクローンから単離されたプラスミドDNAは、部分的に分解され、そしてアガロースゲル上にスメアのみをもたらし、一方、本来のC.autoethanogenum DSM23693種からのプラスミドの単離は、全くシグナルをもたらさなかった(図6)。然しながら、単離されたプラスミドDNAの品質は、プラスミドの全ての関連する異なった領域を包含する4組のプライマーを使用する対照PCRを行うために十分であった(表5)。PCRは、illustraのPuReTaq Ready−To−GoTMPCR Beads(GE Healthcare)で、標準的な条件(95℃で5分間;95℃で30秒間、50℃で30秒間、そして72℃で1分間の32サイクル;72℃で10分間)を使用して行った。全ての4種の分析された形質転換体のPCRは、テンプレートとしての本来のメチル化されたプラスミド混合物と同じシグナルをもたらした(図6)。更なる対照として、それぞれ1μlの部分的に分解された単離されたプラスミドを、E.coli XL1−Blue MRF’Kan(Stratagene)中に再度形質転換し、これからプラスミドが明確に単離され、そして制限消化によって確認することができた。
唯一のエネルギー及び炭素源としてのCOからの1−ブタノールの産生を示すために、酵母抽出物及びフルクトースを含まないPRTC培地を調製し、そして新規なブタノールプラスミドpMTL85245−thlA−crt−hbdを内部に持つC.autoethanogenum及びC.ljungdahlii系と共にインキュベートした。ボトルを、二つの工業的供給源、製鋼所廃棄ガス(Glenbrook,NZのNew Zealand Steelの現場から収集;組成:44%CO、32%N2、22%CO2、2%H2)及び合成ガス(Range Fuels Inc.,Broomfield,CO;組成:29%CO、45%H2、13%CH4、12%CO2、1%N2)からの、約2.1kg/cm2(30psi)のCOを含有するガス流で加圧した。1−ブタノールの産生は、数代の継代培養期間にわたる両方の系及び両方のガス混合物で証明することができた。酪酸の同時形成が同様に観察された。1−ブタノール又は酪酸のいずれもは、C.autoethanogenum DSM23693及びC.ljungdahlii DSM13528の組換えされていない系の試料中では同一の条件下で検出されなかった。
発現プラスミドは、アセチル−CoAからのブチリル−CoAの産生のために必要な遺伝子のみを含有する。次いでブチリル−CoAは、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼの作用によってブタノールに直接転換することができる(図1)。第2の可能性は、ブチリル−CoAが、ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼにより酪酸に転換されることであり(図1)、この場合、ATPは、基質レベルのリン酸化(SLP)により得られる。Wood−Ljungdahl経路の操作は、ATPを必要とするために、酢酸産生性細胞は、SLPからのATPに依存し、これは、更に既知のことごとくの酢酸産生性細菌が酢酸を産生するという事実を反映する(Drake et al.,2006)。然しながら、組換え細胞は、今やSLPにより、更に酪酸を産生することによってATPを発生することができる。次いで酪酸は、アルデヒド:フェレドキシン酸化還元酵素(AOR)により、ブチルアルデヒドに更に還元することができる(図1)。この反応は、Wood−Ljungdahl経路の初期の工程の、一酸化炭素デヒドロゲナーゼによるCOの酸化によって提供される還元されたフェレドキシンによって促進することができる(CO+Fdred→CO2+Fdox)。次いでブチルアルデヒドは、ブタノールデヒドロゲナーゼによりブタノールに転換することができる(図1)。外部的に加えられた酪酸の、C.autoethanogenumの培養によるブタノールへの転換は、証明されている(WO2009/113878)。
遺伝子発現研究を、ブタノールプラスミドpMTL85245−thlA−crt−hbdを内部に持つC.autoethanogenum中の導入されたチオラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質A及び電子伝達フラビンタンパク質B遺伝子の好結果な発現を確認するために行った。更に、C.autoethanogenum(表7)のゲノム中で確認された推定上のブチルアルデヒド(butaraldehyde)、ブタノールデヒドロゲナーゼ、リン酸アセチル/ブチリルトランスフェラーゼ 酢酸/酪酸キナーゼ、アルデヒド;フェレドキシン酸化還元酵素遺伝子の選択されたものは、更に標準的な発酵条件下で発現することが見いだされた(図60)。
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Claims (10)
- 外因性チオラーゼ;外因性3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ;外因性クロトナーゼ/クロトニル−CoAヒドラターゼ;外因性ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、並びに外因性電子伝達フラビンタンパク質A及びBを含む組換え微生物であって、ガス状基質から1−ブタノール及びその前駆体の少なくとも一つを主要な発酵産物として産生し、
Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahlii(クロストリジウム・リュングダリイ)、Clostridium ragsdalei、及びClostridium coskatii
からなる群から選択される、前記組換え微生物。 - ブチリル−CoAを産生する、請求項1に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、外因性ホスホトランスブチリラーゼ及び外因性酪酸キナーゼをさらに含み、酪酸を産生する、請求項1に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、内因性又は外因性フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素をさらに含み、ブチルアルデヒドを産生する、請求項3に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、外因性ブタノールデヒドロゲナーゼをさらに含み、1−ブタノールを産生する、請求項4に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、発酵ブロスのリットル当たり少なくとも0.075グラムの1−ブタノールを産生する、請求項5に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、発酵ブロスのリットル当たり少なくとも0.075〜20グラムの1−ブタノールを産生する、請求項6に記載の組換え微生物。
- チオラーゼが配列番号1の核酸配列によりコードされ、3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼが配列番号2の核酸配列によりコードされ、クロトナーゼ/クロトニル−CoAヒドラターゼが配列番号3の核酸配列によりコードされ、ブチリル−CoAデヒドロゲナーゼが配列番号4の核酸配列によりコードされ、電子伝達フラビンタンパク質Aが配列番号5の核酸配列によりコードされ、電子伝達フラビンタンパク質Bが配列番号6の核酸配列によりコードされる、請求項1に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、Clostridium autoethanogenumである、請求項1に記載の組換え微生物。
- 寄託番号DSM24138で、DSMZに寄託された組換え微生物。
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