CN111088193B

CN111088193B - 一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法

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Publication number: CN111088193B
Application number: CN202010027421.9A
Authority: CN
Inventors: 王昕�; 王静; 陈可泉; 马江峰; 王雪麟; 马琛; 金雨琪; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111088193A

Abstract

本发明公开了一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法。该方法在原先电转化的基础上进行了改进，从感受态的制备，电转参数和复苏时间三方面优化转化方法，使得食甲基丁酸杆菌最终转化频率达到3170，较优化前提高10倍。在目前食甲基丁酸杆菌的研究稀少的大背景下，本发明对于其电转化条件进行了探索及优化，克服了目前对于食甲基丁酸杆菌菌株遗传操作工具研究的难题，具有良好的市场应用前景。

Description

一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法。

背景技术

电转化技术应用于生物领域用于得到有特定功能的工程菌，是一种非常实用的技术。电转化也有人称作高压电穿孔法简称电穿孔法，可用于将DNA导入真核细胞和原核细胞。电转化技术的主要优点在于:对于磷酸钙DNA共沉淀法以及其他技术难以转化的细胞，电穿孔法仍可适用。电转化的效率高，既可用于克隆化基因的瞬间表达，也可用于建立整合有外源基因的细胞系。但是要决定特定细胞系的最佳转化条件必须进行大量工作。

非模式菌株食甲基丁酸杆菌，简称Bm，是一种厌氧芽孢梭菌属，属于单碳厌氧型，可以同时利用多种C1原料进行发酵，如CO₂、CO和甲醇等。另外, 还能代谢多碳物质, 包括葡萄糖、乳糖和丙酮酸，对这些物质代谢的主要产物是醋酸、丁酸或二者皆有, 以及相应的醇类。

Bm可用于生产石油和化学物质，开发食甲基丁酸杆菌作为甲醇利用的模式宿主，对促进甲醇生物转化具有重要意义。然而当前研究中该菌株遗传操作工具的缺乏，限制了其的发展和应用。

目前食甲基丁酸杆菌杆菌的研究非常少，对其遗传操作工具的研究就更加的稀少。基于已有的电转化方法，食甲基丁酸杆菌的转化频率非常低，因此有必要开发出一种高效的电转化频率的方法，突破这一瓶颈。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法，从而解决现有的食甲基丁酸杆菌电转化频率低的问题，丰富食甲基丁酸杆菌的研究，为后续该菌株遗传操作工具的进一步研究提供参考依据。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案来实现：

一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法，以食甲基丁酸杆菌为目的菌株对其转化系统进行研究，包括以下步骤：

(1)电转化感受态的制备

(a)将食甲基丁酸杆菌以1:100转接到25 mLYTF培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3~0.4时，添加细胞弱化剂，37℃厌氧箱静置培养至OD₆₀₀值0.7~0.8；

(b)冰浴30~40 min后，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟，弃去上清，收集菌体；

(c)用10~12 mL等渗的细胞洗涤液重悬菌体，并吹吸均匀，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟收集菌体，重复2-3次；

(d) 用初始菌液体积8~10%的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，再添加细胞增溶剂，将细胞吹吸均匀，以每管50~100μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞;

(2)开始电转化操作

(e)取一管感受态细胞，置于冰上化冻，将2~5μg待转的质粒加入感受态细胞中，混匀，冰浴2~3分钟；

(f)上述混合体系加入预冷的2mm电转杯中，进行电击处理，持续时间5-6ms；

(g)立即加入0.8~1ml YTF培养基，混匀，于厌氧箱中静止复苏2h；

（h）将菌体涂布YTF固体平板，37℃倒置培养3~4天，计转化子数目，计算转化频率。

作为改进的是，步骤1的（a）中细胞壁弱化剂为0.04 mol/L苏氨酸加0.25 mol/L蔗糖。

作为改进的是，步骤1的（c）中细胞洗涤液为添加氯化镁的等渗蔗糖溶液SMP。

作为改进的是，步骤1的（d）中添加的细胞膜增溶剂终浓度为1%的丁醇。

作为改进的是，步骤2的（f）中电击处理条件中电压设定值为2.2 kv。

作为改进的是，步骤2的（f）中电击处理条件中阻设定值分别为200Ω。

作为改进的是，步骤2的（g）中对37℃厌氧箱静置复苏时间为6h。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种提高食甲基丁酸杆菌电转频率的方法的优势如下：

本发明在原先电转化的基础上进行了改进，从感受态的制备，电转参数和复苏时间三方面优化转化方法，使得食甲基丁酸杆菌最终转化频率达到3170，较优化前提高10倍。在目前食甲基丁酸杆菌的研究稀少的大背景下，本发明对于其电转化条件进行了探索及优化，克服了目前对于食甲基丁酸杆菌菌株遗传操作工具研究的难题。

附图说明

图1为不同种类及浓度细胞壁弱化剂对转化频率影响；

图2为不同细胞洗涤液对转化频率影响；

图3为不同种类及浓度细胞膜增溶剂对转化频率影响；

图4为不同电压电转对转化频率影响；

图5为不同电阻电转对转化频率影响；

图6为不同复苏时间对转化频率影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

以下实施例中所用的食甲基丁酸杆菌保存于美国典型菌种保藏中心，编号为ATCC33266，属于现有菌株。

实施例1 筛选不同种类及浓度细胞壁弱化剂

在细胞生长至OD₆₀₀为0.3~0.4时，添加六种不同种类及浓度的细胞弱化剂，分别为0.2 mol/L甘氨酸加0.25 mol/L蔗糖，0.02 mol/L苏氨酸加0.25 mol/L蔗糖，0.04 mol/L苏氨酸加0.25 mol/L蔗糖，4 mg/L溶菌酶，40 mg/L溶菌酶，30 mg/L青霉素(如图1所示，添加0.02 mol/L苏氨酸加0.25 mol/L蔗糖对转化效果最优)。待细胞生长至OD₆₀₀约为0.8时，冰浴30~40 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min，弃上清，收集细胞；用10~12 mL等渗的蔗糖溶液重悬细胞，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟弃上清，收集细胞，重复三次；用初始菌液体积8~10 %的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，以每管50~100μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞。

取一管制作好的感受态细胞，加入2~5μg质粒用电转方法进行转化，电压设定值为2.5kv，电阻设定值为200Ω，电转后的感受态细胞加入0.8~1 mL培养基YTF，于厌氧箱中静止复苏2h。计转化子数目（平板单菌落数），计算转化频率（转化频率=转化子数目/质粒克数），不同种类及浓度细胞壁弱化剂对转化频率影响如图1所示。

实施例2 筛选细胞洗涤液

待细胞生长至OD₆₀₀约为0.8时，冰浴30~40 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10min，弃上清，收集细胞；

用不同细胞洗涤液将细胞吹吸混匀，分别为低（0.18 M）、中(0.27 M)、高渗(0.4M)蔗糖溶液、SMP、EPB和PBS缓冲液(如图2所示，添加氯化镁的等渗蔗糖溶液（SMP）洗涤细胞对转化效果最优)将细胞吹吸混匀4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min,(重复两次)，弃上清，收集细胞；

用初始菌液体积8~10 %的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，以每管50~100μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞。

取一管制作好的感受态细胞，加入2~5μg质粒用电转方法进行转化，电压设定值为2.5kv，电阻设定值为200Ω，电转后的感受态细胞加入0.8~1 mL培养基YTF，于厌氧箱中静止复苏2h。计转化子数目，计算转化频率，不同种类细胞洗涤液对转化频率影响如图2所示。

实施例3 筛选不同种类及浓度的细胞膜增溶剂

细胞生长至OD₆₀₀约为0.8时，冰浴30~40 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min，弃上清，收集细胞；用10~12 mL等渗的蔗糖溶液重悬细胞，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟弃上清，收集细胞，重复三次；

用初始菌液体积8~10 %的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，添加不同种类及浓度的细胞膜增溶剂，包括浓度分别是5%，10%，15%的乙醇和1%，2%，4%的丁醇将细胞吹吸混匀(如图3所示，添加1%的丁醇对转化效果最优)，以每管50~100μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，-80℃保存；

取制作好的感受态细胞，加入2~5μg质粒用电转方法进行转化，电压设定值为2.5kv，电阻设定值为200 Ω，电转后的感受态细胞加入0.8~1 mL培养基YTF，于厌氧箱中静止复苏2h。计转化子数目，计算转化频率，不同种类及浓度细胞壁弱化剂对转化频率影响如图3所示。

实施例4 确定最佳电转电压

细胞生长至OD₆₀₀约为0.8时，冰浴30~40 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min，弃上清，收集细胞；用10~12 mL等渗的蔗糖溶液重悬细胞，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟弃上清，收集细胞，重复三次；用初始菌液体积8~10%的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，以每管50~100μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞。

取一管制作好的感受态细胞，加入2~5μg质粒用电转方法进行转化，电压设定值为1 kv、1.5 kv、1.8kv、2.0 kv、2.2 kv、2.5 kv和3 kv(如图4所示，电压为2.2 kv时对转化效果最优)，电阻设定值为200Ω，电转后的感受态细胞加入0.8~1 mL培养基YTF，于厌氧箱中静止复苏2h。计转化子数目，计算转化频率，不同种类及浓度细胞壁弱化剂对转化频率影响如图4所示。

实施例5 确定最佳电转电阻

细胞生长至OD₆₀₀约为0.8时，冰浴30~40 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min，弃上清，收集细胞；用10~12 mL等渗的蔗糖溶液重悬细胞，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟弃上清，收集细胞，重复三次；用初始菌液体积8~10%的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，以每管50~100 μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞。

取一管制作好的感受态细胞，加入2~5μg质粒用电转方法进行转化，电压设定值为2.5kv，电阻设定值分别为200Ω、400Ω、600Ω和∞(如图5所示，电阻值为200Ω时对转化效果最优)，转后的感受态细胞加入0.8~1 mL培养基YTF，于厌氧箱中静止复苏2h。计转化子数目，计算转化频率，不同种类及浓度细胞壁弱化剂对转化频率影响如图5所示。

实施例6 确定最佳细胞复苏时间

细胞生长至OD₆₀₀约为0.8时，冰浴30~40 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min，弃上清，收集细胞；用10~12 mL等渗的蔗糖溶液重悬细胞，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟弃上清，收集细胞，重复三次；用初始菌液体积8~10 %的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，以每管50~100 uL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞。取一管制作好的感受态细胞，加入2~5μg质粒用电转方法进行转化，电压设定值为2.5kv，电阻设定值为200Ω，电转后的感受态细胞加入0.8~1 mL培养基YTF，于厌氧箱中静止复苏，复苏时间为0、2h、4h、6h、10h、16 h(如图6所示，复苏时间为6h时对转化效果最优)。计转化子数目，计算转化频率，不同种类及浓度细胞壁弱化剂对转化频率影响如图6所示。

综上所述，均采用实施例1-6中最优条件的下方法进行电转方法，计转化子数目，计算转化频率，其他方法实施例1的操作。即通过对原先电转化的基础上进行改造，提高了食甲基丁酸杆菌最终转化频率达到3170，较优化前提高10倍。具有良好的市场前景。

Claims

1.一种提高食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）电转频率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）电转化感受态的制备

a)将食甲基丁酸杆菌以1:100转接到25 mLYTF培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3~0.4时，添加细胞壁弱化剂，37℃厌氧箱静置培养至OD₆₀₀值0.7~0.8，其中，细胞壁弱化剂为0.04mol/L苏氨酸加0.25mol/L蔗糖；

b)冰浴30~40 min后，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟，弃去上清，收集菌体；

c)用10~12 mL等渗的细胞洗涤液重悬菌体，并吹吸均匀，4℃下4000~5000rpm离心8~10分钟收集菌体，重复2-3次，其中，细胞洗涤液为SMP或添加氯化镁的等渗蔗糖溶液；

d) 用初始菌液体积8~10%的等渗蔗糖溶液将细胞吹吸混匀，再添加细胞膜增溶剂，将细胞吹吸均匀，以每管50~100μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，即得到感受态细胞，其中，细胞膜增溶剂按体积比计，为终浓度1%的丁醇；

（2）开始电转化操作

e)取一管感受态细胞，置于冰上化冻，将2~5μg待转的质粒加入感受态细胞中，混匀，冰浴2~3分钟；

f)上述混合体系加入预冷的2mm电转杯中，进行电击处理，持续时间5-6ms，其中，电击处理条件中电压设定值为2.2kv，电阻设定值为200Ω；

g)立即加入0.8~1ml YTF培养基，混匀，于37℃厌氧箱中静止复苏6h；

h)将菌体涂布YTF固体平板，37℃倒置培养3~4天，计转化子数目，计算转化频率。