CN111454981A - 一种dna双链断裂修复工具及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA双链断裂修复工具及其应用。通过利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统构建干涉质粒，所述干涉质粒电击转化到运动发酵单胞菌中进行基因干涉，产生DNA双链断裂，所述修复工具选择DNA双链断裂两端的微同源序列进行修复，在干涉位置造成基因组缺失。本发明提供一种内源的不需要外源修复系统和外源同源序列的DNA双链断裂修复工具，相比现有技术同源重组构建的DNA修复系统，具有构建方式简单并且构建周期短的特点，并且利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统就可实现基因组的单基因失活、多基因失活以及长片段缺失。

Description

一种DNA双链断裂修复工具及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种DNA双链断裂修复工具及其应用。
背景技术
当今，随着能源的枯竭和环境污染日益严重，生物乙醇作为可再生资源受到广泛关注。目前，酿酒酵母菌和运动发酵单胞菌是发酵生产乙醇的主要菌株。相比于酿酒酵母菌，运动发酵单胞菌在发酵中具有温度耐受度更高、生产周期更短、原料利用率更高、不需要通气、代谢途径简单等优势；另外，运动发酵单胞菌还具有通过ED代谢途径进行糖酵解的特征。由此，运动发酵单胞菌在工业生产和基础研究领域都具有极高的研究价值。但是目前对运动发酵单胞菌的基因工程改良方面还在起步阶段，运动发酵单胞菌在发酵中底物利用范围窄、酒精耐受度低、酸耐受力低等问题，都亟需研究解决。
原核生物相比真核生物，绝大多数缺乏非同源末端连接的修复系统，且自身的同源重组效率非常低。目前，原核生物的DNA双链断裂修复主要依靠外源同源序列介导的同源重组和外源非同源修复系统介导的非同源末端连接，构建方式复杂且周期长。随着CRISPR系统越来越广泛的应用，传统的同源重组已经满足不了现在的基因编辑引起的DNA双链断裂修复的需求。而针对目前出现的问题，如何针对原核生物尤其是运动发酵单胞菌设计一种新型DNA修复工具，在基因水平上进行改良，以更好的适应生物乙醇发酵生产的需求成为亟需解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA双链断裂修复工具及其应用，通过在穿梭质粒插入一段mini-CRISPR序列构成高效便利的DNA双链断裂修复工具，相比现有技术同源重组构建的DNA修复系统，具有构建方式简单并且构建周期短的特点，并且利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统就可实现基因组的单基因失活、多基因失活以及长片段缺失。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种DNA双链断裂修复工具，利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统构建干涉质粒，所述干涉质粒电击转化到运动发酵单胞菌中进行基因干涉，产生DNA双链断裂，所述修复工具选择DNA双链断裂两端的微同源序列进行修复，在干涉位置造成基因组缺失。
优选的是，所述干涉质粒为非同源序列。
优选的是，所述微同源序列长0-12bp。
优选的是，在干涉位置造成的基因组缺失为12-623bp大小。
优选的是，所述干涉质粒的具体构建过程，包括以下步骤：
步骤1：在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上的一个启动子和终止子中间插入mini-CRISPR序列，构建成针对不同基因组的干涉质粒pPmT；
步骤2：在基因组上选择靶基因中一个5’端为CC的32nt序列作为前间隔序列，并将所述前间隔序列的两条单链进行合成，通过退火，连接到pPmT上；
步骤3：将步骤2中构建的pPmT转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉，获取基因组缺失。
优选的是，步骤1中所述mini-CRISPR序列是由两个来自运动发酵单胞菌的重复序列和加在所述重复序列中间的间隔序列组成，所述间隔序列包含两个酶切位点。
优选的是，所述酶切位点为BsaI。
优选的是，所述mini-CRISPR序列还包括通过构建含有两个或三个基因间隔序列的干涉质粒，同时干涉两个或三个基因，造成多基因失活。
优选的是，所述mini-CRISPR序列还包括通过构建一段长片段两端基因的前间隔序列的干涉质粒，造成长片段缺失。
本发明还提供一种所述的DNA双链断裂修复工具在利用运动发酵单胞菌发酵生产乙醇中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的运动发酵单胞菌是具有I-F型CRISPR系统的细菌，通过在运动发酵单胞菌和大肠杆菌的穿梭质粒上插入mini-CRISPR序列，构建成针对不同基因的干涉质粒，然后将干涉质粒电击转化，此过程仅需要两天时间，相比同源重组，在构建干涉质粒的基础上添加同源臂就需要三天的时间，本发明构建方法明显具有构建方式简单、周期短的特点。同时，还可以发现，本发明提供了一种内源的不需要外源修复系统和外源同源序列的DNA双链断裂修复工具，特别适用于运动发酵单胞菌的基因编辑，以及其他没有内源修复系统和基因编辑效率低下的细菌的基因编辑的应用，利用该修复工具可以实现对运动发酵单胞菌基因水平上的包括单基因失活、多基因失活和长片段缺失等改造，更便于通过运动发酵单胞菌发酵生产生物乙醇方面的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明实施例1中所述的间隔序列及酶切位点；
图1b本发明实施例1穿梭质粒pEZ15图谱；
图1c为本发明实施例1中在穿梭质粒pEZ15上插入mini-CRISPR序列；
图1d为本发明实施例1中间隔序列和pPmT质粒连接后构建的pPmT-ZMO1807质粒图谱；
图1e为本发明实施例1挑取单菌落后PCR验证的电泳图；
图1f为本发明实施例1中pPmT-ZMO1807质粒转入运动发酵单胞菌进行基因干涉和修复的过程；
图2a为本发明实施例2在穿梭质粒pEZ15上插入包含两个分别来自ZMO1807、ZMO1815基因的间隔序列和三个重复序列的mini-CRISPR序列；
图2b为本发明实施例2所构建的pPmT-KO10kb质粒图谱；
图2c为本发明实施例2中pPmT-KO10kb质粒转入运动发酵单胞菌进行基因干涉和修复的过程；
图3a为本发明实施例3穿梭质粒pEZ15上插入ZMO0038、ZMO1807基因的间隔序列和三个重复序列的mini-CRISPR序列所构建的pPmT-2genes质粒图谱；
图3b为本发明实施例3中pPmT-2genes质粒转入运动发酵单胞菌进行基因干涉和修复的过程。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用的运动发酵单胞菌为运动发酵单胞菌ZM4菌株，是由农业农村报沼气科学研究所生物质能技术研究中心赠予，购自中国工业微生物菌株保藏中心(编号CICC10273)，其原始株来源于美国菌种保藏中心，编号ATCC31821。
实施例1
利用DNA双链断裂修复工具造成单基因失活的方法，包括以下步骤：
A、在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上(图1b)，在一个启动子和终止子中间加一段mini-CRISPR序列，所述mini-CRISPR序列是由两个来自运动发酵单胞菌的重复序列(5’-gttcactgccgcacaggcagcttagaaaa-3’)和夹在中间的间隔序列组成，其中，间隔序列中包括两个酶切位点BsaI(如图1a所示)，经BsaI限制性内切酶酶切后产生黏性末端后，连接上相应的32nt间隔序列后，就可以构建成针对不同基因的干涉质粒，命名为pPmT；
B、在基因组上选择来自基因号ZMO1807(即：Zymomonas mobilis ATCC10988)基因中任意一段5’端为CC的32nt序列作为前间隔序列(即：attgccggaaaaatggttcttgatttgcagca)，将此序列的两条单链由北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成(引物为F:GAAAattgccggaaaaatggttcttgatttgcagcaR:GAACtgctgcaaatcaagaaccatttttccggcaat)，作为间隔序列，95℃、5-10min退火后，与酶切后的pPmT用T4连接酶在22℃条件下酶连30min(如图1b、1c所示)，然后热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经过10-12h孵育后，挑取单菌落进行PCR验证(如图1e所示)并测序，测序正确的菌株用质粒抽提试剂盒抽提质粒pPmT-ZMO1807；
C、将构建好的pPmT-ZMO1807质粒于1600V、200Ω、25μF条件下，电击转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉(如图1f所示)。
D、运动发酵单胞菌内源的CRISPR系统对靶标的基因组位置进行干涉后，产生了DNA双链断裂，DNA双链断裂修复工具(microhomology-mediated end-joining，即MMEJ工具)选择DNA双链断裂两端的0-12bp微同源序列进行修复，在干涉位置造成12-623bp大小的基因组缺失。
实施例2
利用DNA双链断裂修复工具造成长片段缺失的方法，包括以下步骤：
A、在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上，在一个启动子和终止子中间加一段包含两个分别来自运动发酵单胞菌ATCC10988菌株ZMO1807、ZMO1815基因的间隔序列(5’-attgccggaaaaatggttcttgatttgcagca-3’和5’-agcatagctttgccccagataaggagtgctaa-3’)和三个重复序列(5’-gttcactgccgcacaggcagcttagaaa-3’)的mini-CRISPR序列(如图2a所示)，两个基因在基因组上相距10kb，可以构建成针对长片段的干涉质粒(构建方法同实施例1)，命名为pPmT-KO10kb(图2b)；
B、将构建好的pPmT-KO10kb质粒于1600V、200Ω、25μF条件下，电击转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉(如图2c所示)；
C、运动发酵单胞菌内源的CRISPR系统对靶标的两处基因组位置(分别在ZMO1807、ZMO1815基因)进行干涉后，在ZMO1807、ZMO1815基因内都产生了DNA双链断裂，MMEJ工具选择DNA双链断裂两端的6bp微同源序列进行修复，最终产生基因组缺失16kb大小的菌株。
实施例3
利用DNA双链断裂修复工具造成多基因失活的方法，包括以下步骤：
A、在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上，在一个启动子和终止子中间加一段包含两个分别来自ZMO0038、ZMO1807基因的间隔序列(5’-gtaagggcgatagcggcttcatcaatagaagg-3’和5’-attgccggaaaaatggttcttgatttgcagca-3’)和三个重复序列(5’-gttcactgccgcacaggcagcttagaaa-3’)的mini-CRISPR序列(如图3a所示)，可以构建成针对两个基因的干涉质粒(构建方法同实施例1)，命名为pPmT-2genes；
B、将构建好的pPmT-2genes质粒于1600V、200Ω、25μF条件下，电击转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉(如图3b所示)。
C、运动发酵单胞菌内源的CRISPR系统对靶标的两处基因组位置(分别在ZMO0038、ZMO1807基因)进行干涉后，在ZMO0038、ZMO1807基因内都产生了DNA双链断裂，MMEJ工具在两个基因断裂处选择断裂两端的0～6bp微同源序列进行修复，最终产生ZMO0038、ZMO1807两个基因部分缺失、基因失活的菌株。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种DNA双链断裂修复工具，其特征在于，利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统构建干涉质粒，所述干涉质粒电击转化到运动发酵单胞菌中进行基因干涉，产生DNA双链断裂，所述修复工具选择DNA双链断裂两端的微同源序列进行修复，在干涉位置造成基因组缺失。
2.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述干涉质粒为非同源序列。
3.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述微同源序列长0-12bp。
4.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，在干涉位置造成的基因组缺失为12-623bp大小。
5.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述干涉质粒的具体构建过程，包括以下步骤：
步骤1：在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上的一个启动子和终止子中间插入mini-CRISPR序列，构建成针对不同基因组的干涉质粒pPmT；
步骤2：在基因组上选择靶基因中一个5’端为CC的32nt序列作为前间隔序列，并将所述前间隔序列的两条单链进行合成，通过退火，连接到pPmT上；
步骤3：将步骤2中构建的pPmT转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉，获取基因组缺失。
6.如权利要求5所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，步骤1中所述mini-CRISPR序列是由两个来自运动发酵单胞菌的重复序列和加在所述重复序列中间的间隔序列组成，所述间隔序列包含两个酶切位点。
7.如权利要求6所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述酶切位点为BsaI。
8.如权利要求6所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述mini-CRISPR序列还包括通过构建含有两个或三个基因间隔序列的干涉质粒，同时干涉两个或三个基因，造成多基因失活。
9.如权利要求6所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述mini-CRISPR序列还包括通过构建一段长片段两端基因的前间隔序列的干涉质粒，造成长片段缺失。
10.一种如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具在利用运动发酵单胞菌发酵生产乙醇中的应用。
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