CN110846239B - 具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 - Google Patents

具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 Download PDF

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CN110846239B CN201911196523.7A CN201911196523A CN110846239B CN 110846239 B CN110846239 B CN 110846239B CN 201911196523 A CN201911196523 A CN 201911196523A CN 110846239 B CN110846239 B CN 110846239B
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Abstract

本发明提供高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法，涉及生物工程领域。该高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌，是在解脂耶氏酵母菌基因组中插入了来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的Rad52基因表达盒后得到的。本发明重组解脂耶氏酵母菌能够具有高效的同源重组效率，构建方法高效，操作简单。

Description

具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术
解脂耶氏酵母是由FDA公认安全的生物体，是研究非常规酵母的优良菌种，其作为合成各种生物化学产品的微生物平台具有巨大的应用潜力。随着代谢工程、合成生物学的飞速发展，解脂耶氏酵母的基因工具已经逐步完善，然而在野生型解脂耶氏酵母细胞中，由于其非同源重组在DNA双链断裂修复中占据主导地位，外源基因大多随机插入到基因组中，而通过同源重组靶向敲除或敲入的概率极低。
Rad52是一种重要的同源重组蛋白，酵母细胞和人细胞均含有Rad52蛋白的同源物。在酿酒酵母中，scRad52已经被鉴定为参与双链断裂缺口(DSB)的同源重组的蛋白质，并且研究表明在哺乳动物细胞中Rad52敲除后没有显着的DNA修复。Shao等人在哺乳动物细胞(HEK293T)中共表达或融合scRad52和Cas9，发现HR效率增加了三倍。无论供体DNA是作为质粒，PCR产物还是ssDNA引入细胞，Rad52与Cas9组成的复合物都可以提高HR效率。随后，研究人员使用Rad52表达策略敲除猪PK15细胞中的基因，HR的效率提高了2.2倍。这些研究表明Rad52的表达是提高HR效率的良好选择，可用于未来精确的基因组编辑研究。
目前大多数提高解脂耶氏酵母同源重组效率的方法为物理化学法和生物法。物理化学法主要是通过DNA抑制剂，将细胞周期同步在易于发生同源重组的细胞周期，但该方法时效较短，成本昂贵；而生物法主要集中于敲除或破坏菌株本身的非同源重组关键基因，如Ku蛋白、LigD基因等，该方法虽然能够长久的提高菌株的同源重组效率，但由于非同源重组机制的破坏不利于其工业化规模培养。有关通过强化同源重组机制提高解脂耶氏酵母同源重组效率的文献和专利还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌介导不同长度同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌，所述重组解脂耶氏酵母菌是在解脂耶氏酵母菌基因组中插入了来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的Rad52基因表达盒后得到的；所述同源重组效率是由在重组解脂耶氏酵母菌中插入腺苷琥珀酸合成酶敲除盒后得到的。
优选的技术方案中，所述表达盒的启动子为解脂耶氏酵母菌的PylRad52启动子；所述终止子为解脂耶氏酵母菌的TylRad52终止子。
优选的技术方案中，所述重组解脂耶氏酵母菌还表达1个或多个标记基因；所述标记基因选自3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒或乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因表达盒。
所述来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的Rad52基因如SEQ ID NO.1所示；所述腺苷琥珀酸合成酶敲除盒：ADE2-1000-up的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；ADE2-1000-dm的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；ADE2-500-up的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；ADE2-500-down的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；ADE2-250-up的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；ADE2-250-down的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；ADE2-100-up的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；ADE2-100-down的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本研究还提供了高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将所述来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的Rad52基因表达盒通过线性质粒形式导入所述解脂耶氏酵母中，然后整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。
本发明还提供了所述高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌介导不同长度同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用。其中，所述不同长度同源臂是指1000bp、500bp、250bp、100bp的同源臂。
本发明的重组解脂耶氏酵母菌能够表达来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的Rad52基因，实验证明该重组解脂耶氏酵母菌具备高效的同源重组效率。当同源臂长为1000bp时同源重组效率最高提高至95％，约为野生菌株的15.8倍，相比敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母菌株高出1.5倍。实现了强化同源重组机制提高解脂耶氏酵母同源重组效率，本发明的重组解脂耶氏酵母菌具有以下优点：
(1)本发明构建的重组解脂耶氏酵母菌，是分别基于野生型解脂耶氏酵母菌株和敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母菌株，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组机制实现基因的整合和敲除，能大幅度提高基因编辑的遗传稳定性。该重组解脂耶氏酵母菌构建方法高效，操作简单。
(2)重组解脂耶氏酵母菌通过异源表达来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的Rad52基因，实现了同源重组效率的有效提高，构建优良的解脂耶氏酵母平台，有利于进一步的基因组编辑，对于将解脂耶氏酵母作为多种高价值化合物的细胞生产平台是具有重要意义的。
附图说明
图1是重组质粒pUC-leu-A08-scRad52的结构图，其中A08-up表示A08位点上游序列，A08-down表示A08位点下游序列，PylRad52表示PylRad52启动子，TylRad52表示TylRad52启动子，Leu表示Leu表达盒，scRAD52表示scRAD52基因。
图2显示了重组质粒pUC-HUH-ADE2-1000的结构图，其中ADE2-1000-up表示ADE2位点上游1000bp同源臂序列，ADE2-1000-dm表示ADE2位点下游1000bp同源臂序列，URA表示ura表达盒。
图3显示了重组质粒pUC-HUH-ADE2-500的结构图，其中ADE2-500-up表示ADE2位点上游500bp同源臂序列，ADE2-500-down表示ADE2位点下游500bp同源臂序列，URA表示ura表达盒。
图4显示了重组质粒pUC-HUH-ADE2-250的结构图，其中ADE2-250-up表示ADE2位点上游250bp同源臂序列，ADE2-250-down表示ADE2位点下游250bp同源臂序列，URA表示ura表达盒。
图5显示了重组质粒pUC-HUH-ADE2-100的结构图，其中ADE2-100-up表示ADE2位点上游100bp同源臂序列，ADE2-100-down表示ADE2位点下游100bp同源臂序列，URA表示ura表达盒。
图6显示了重组菌1-2介导不同长度同源臂的同源重组效率，其中Po1f是指Yarrowia lipolytica Po1f，Po1f-scRad52是指重组菌1，Po1f-Δku70是指Yarrowialipolytica Po1fΔku70，Po1f-Δku70-scRad52是指重组菌2。
图7是重组菌1-2介导1000bp同源臂的同源重组效率比较的示意图，其中Po1f是指Yarrowia lipolytica Po1f，Po1f-scRad52是指重组菌1，Po1f-Δku70是指Yarrowialipolytica Po1fΔku70，Po1f-Δku70-scRad52是指重组菌2。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步的说明。
下面实施例中所使用的实施方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
Yarrowia lipolytica Po1f(MatA，leu2-270，ura3-302，xpr2-322，axp1-2)为解脂耶氏酵母菌，购于美国菌种保藏中心。
Yarrowia lipolytica Po1fΔku70(MatA，Δku70∷hisG，leu2-270，ura3-302，xpr2-322，axp1-2)为解脂耶氏酵母菌，敲除了负责非同源重组的编码基因ku70，购于美国菌种保藏中心。
A08位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体上A08位点上游2521bp、下游2031bp的序列插入pUC57-leu载体(构建方法见实施例1)中所得，leu表达盒在A08位点上下游序列之间。
实施例1、基因元件的扩增与目标质粒的制备
(一)目标基因的制备
酿酒酵母Rad52上位基因簇的scRad52基因的核苷酸序列，经过密码子优化后，序列如SEQ ID NO.1所示，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的scRad52，并插入pUC57中，得到质粒pUC57-scRad52。
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica中的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leu的核苷酸序列(M37309.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成leu，将3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-leu。3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶基因表达盒中的启动子为解脂耶氏酵母菌的Pleu启动子(SEQ ID NO.4)，终止子为解脂耶氏酵母菌的Tleu终止子(SEQ ID NO.5)。
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica中的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因ura的核苷酸序列(genebank登录号AJ306421.1)和hisG标签(genebank登录号AF324729.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。将两个hisG标签编码基因序列插入质粒pUC57中，在两个hisG标签编码基因序列中插入乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，以便实现ura标记回收，得到质粒pUC57-hisG-ura-hisG。乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因表达盒中的启动子为解脂耶氏酵母菌的Pura启动子(SEQ ID NO.6)，终止子为解脂耶氏酵母菌的Tura终止子(SEQ ID NO.7)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以PylRad52-F和PylRad52-R为引物扩增PylRad52启动子。PylRad52的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以TylRad52-F和TylRad52-R为引物扩增TylRad52终止子。TylRad52的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以1000-up-F和up-R为引物扩增ADE2-1000-up核苷酸序列(ADE2位点上游长1000bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以dm-F和1000-dm-R为引物扩增ADE2-1000-dm核苷酸序列(ADE2位点下游长1000bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以500-up-F和up-R为引物扩增ADE2-500-up核苷酸序列(ADE2位点上游长500bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以dm-F和500-down-R为引物扩增ADE2-500-down核苷酸序列(ADE2位点下游长500bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以250-up-F和up-R为引物扩增ADE2-250-up核苷酸序列(ADE2位点上游长250bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以dm-F和250-down-R为引物扩增ADE2-250-down核苷酸序列(ADE2位点下游长250bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以100-up-F和up-R为引物扩增ADE2-100-up核苷酸序列(ADE2位点上游长100bp的同源臂)。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以dm-F和100-down-R为引物扩增ADE2-100-down核苷酸序列(ADE2位点下游长100bp的同源臂)。
(二)重组质粒及一系列同源重组表达质粒的构建
1、重组质粒pUC-leu-A08-scRad52的构建
重组质粒pUC-leu-A08-scRad52是以pUC57-leu为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1f中A08位点上下游同源臂，在该上下游同源臂之间还插入了来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的scRad52表达盒，3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶基因表达盒处于该上下游同源臂之间，质粒图谱如图1。
具体构建方法如下：
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以PylRad52-F和PylRad52-R为引物扩增PylRad52启动子(SEQ ID NO.2)。以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以TylRad52-F和TylRad52-R为引物扩增TylRad52终止子(SEQ ID NO.3)。
以质粒pUC57-scRad52为模板，以scRad52-F和scRad52-R为引物，扩增两端分别带有启动子PylRad52和终止子TylRad52同源臂的scRad52基因。
上述PCR反应中所用PCR酶为宝日医生物技术(北京)有限公司的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶。上述PCR扩增体系如下：
组分 体积
PrimeSTAR Max Premix 25μl
模板 1μl
正向引物 2μl
反向引物 2μl
灭菌蒸馏水 20μl
上述的PCR程序如下：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复30个循环。
用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(购自上海百赛生物技术股份有限公司)纯化回收各片段。
将A08位点整合质粒通过用NEB公司的限制性内切酶PacI和SnaBI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化A08位点整合质粒。
将线性化A08位点整合质粒和本实施例标题1构建的scRad52基因表达盒中的各元件(PylRad52启动子、TylRad52终止子和带有启动子PylRad52和终止子TylRad52同源臂的scRad52基因)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，反应体系见下表。将反应体系在37℃孵育30min后，得到环状的重组载体，该重组载体中A08位点的上下同源臂之间插入了scRad52基因表达盒和3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒(筛选标记)。
一步克隆的体系如下表：
Figure BDA0002294778380000061
线性化载体(x)、插入片段1(y1)、插入片段2(y2)、插入片段3(y3)的添加量可由下面公式计算获得：每片段或线性化载体的最适使用量＝[0.02×片段或线性化载体的碱基对数]ng。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-leu-A08-scRad52。
2、同源重组表达质粒pUC-HUH-ADE2-1000的构建
重组质粒pUC-HUH-ADE2-1000是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1f中ADE2位点上下游1000bp同源臂，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(缩写为URA)在ADE2位点上下游同源臂之间，质粒图谱如图2。
具体构建过程如下：
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以1000-up-F和up-R为引物扩增ADE2-1000-up核苷酸序列(即ADE2位点上游长1000bp的同源臂)。以Yarrowia lipolyticaPo1f基因组DNA为模板，以dm-F和1000-dm-R为引物扩增ADE2-1000-dm核苷酸序列(即ADE2位点下游长1000bp的同源臂)。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对质粒pUC57-hisG-ura-hisG进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒。
将线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒和本实施例标题2构建的ADE2-1000-up利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-1000-up。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对质粒pUC-HUH-ADE2-1000-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-ADE2-1000-up质粒。
将线性化pUC-HUH-ADE2-1000-up质粒和本实施例标题2构建的ADE2-1000-dm利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-1000。
3、同源重组表达质粒pUC-HUH-ADE2-500的构建
重组质粒pUC-HUH-ADE2-500是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1f中ADE2位点上下游500bp同源臂，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因表达盒在上下游同源臂之间，质粒图谱如图3。
具体构建方法如下：
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以500-up-F和up-R为引物扩增ADE2-500-up核苷酸序列(即ADE2位点上游长500bp的同源臂)。以Yarrowia lipolyticaPo1f基因组DNA为模板，以dm-F和500-down-R为引物扩增ADE2-500-down核苷酸序列(即ADE2位点下游长500bp的同源臂)。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对质粒pUC57-hisG-ura-hisG进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒。
将线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒和本实施例标题3构建的ADE2-500-up利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-500-up。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对质粒pUC-HUH-ADE2-500-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-ADE2-500-up质粒。
将线性化pUC-HUH-ADE2-500-up质粒和本实施例标题3构建的ADE2-500-down利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-500。
4、同源重组表达质粒pUC-HUH-ADE2-250的构建
重组质粒pUC-HUH-ADE2-250是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1f中ADE2位点上下游250bp同源臂，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因表达盒在上下游同源臂之间，质粒图谱如图4。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以250-up-F和up-R为引物扩增ADE2-250-up核苷酸序列(即ADE2位点上游长250bp的同源臂)。以Yarrowia lipolyticaPo1f基因组DNA为模板，以dm-F和250-down-R为引物扩增ADE2-250-down核苷酸序列(即ADE2位点下游长250bp的同源臂)。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对质粒pUC57-hisG-ura-hisG进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒。
将线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒和本实施例标题4构建的ADE2-250-up利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-250-up。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对质粒pUC-HUH-ADE2-250-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-ADE2-250-up质粒。
将线性化pUC-HUH-ADE2-250-up质粒和本实施例标题4构建的ADE2-250-down利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-250。
5、同源重组表达质粒pUC-HUH-ADE2-100的构建
重组质粒pUC-HUH-ADE2-100是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1f中ADE2位点上下游100bp同源臂，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因表达盒在上下游同源臂之间，质粒图谱如图5。
以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以100-up-F和up-R为引物扩增ADE2-100-up核苷酸序列。以Yarrowia lipolytica Po1f基因组DNA为模板，以dm-F和100-down-R为引物扩增ADE2-100-down核苷酸序列。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对质粒pUC57-hisG-ura-hisG进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒。
将线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒和本实施例标题5构建的ADE2-100-up利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-100-up。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对质粒pUC-HUH-ADE2-100-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-ADE2-100-up质粒。
将线性化pUC-HUH-ADE2-100-up质粒和本实施例标题5构建的ADE2-100-down利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-ADE2-100。
表1各重组质粒中插入序列
质粒名称 插入序列
pUC-leu-A08-scRad52 scRad52表达盒(P<sub>ylRad52</sub>-scRad52-T<sub>ylRad52</sub>)
pUC-HUH-ADE2-1000 ADE2-1000敲除盒(ADE2-1000-up、ADE2-1000-dm)
pUC-HUH-ADE2-500 ADE2-500敲除盒(ADE2-500-up、ADE2-500-down)
pUC-HUH-ADE2-250 ADE2-250敲除盒(ADE2-250-up、ADE2-250-down)
pUC-HUH-ADE2-100 ADE2-100敲除盒(ADE2-100-up、ADE2-100-down)
表2引物序列
Figure BDA0002294778380000091
Figure BDA0002294778380000101
实施例2、重组菌的构建
(一)重组菌1的构建
将含有scRad52基因表达盒的质粒pUC-leu-A08-scRad52导入Yarrowialipolytica Po1f中，scRad52表达盒和3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶基因表达盒整合到基因组A08位点处，得到重组菌1。具体方法如下：(1)Yarrowia lipolytica Po1f于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。(2)利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation Kit II将pUC-leu-A08-scRad52转化到Yarrowia lipolytica Po1f中，进行同源重组。(3)采用筛选培养基SD-Leu筛选，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌1。其中筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，Yeast Nitrogen Base(YNB，酵母氮碱硫酸铵)6.7g/L，CSM-Leu 0.67g/L，琼脂粉20g/L。
(二)重组菌2的构建
将含有scRad52基因表达盒的质粒pUC-leu-A08-scRad52导入Yarrowialipolytica Po1fΔku70中，scRad52表达盒和3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶基因表达盒整合到基因组A08位点处，得到重组菌2。具体方法如下：(1)Yarrowia lipolytica Po1fΔku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。(2)利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast TransformationKit II将pUC-leu-A08-scRad52转化到Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中，进行同源重组。(3)采用筛选培养基SD-Leu筛选，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌2。其中筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，Yeast Nitrogen Base(YNB，酵母氮碱硫酸铵)6.7g/L，CSM-Leu 0.67g/L，琼脂粉20g/L。
实施例3、重组菌1-2在介导不同长度同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用及其同源重组效率的比较。
(一)同源重组菌株的构建
将重组质粒pUC-HUH-ADE2-1000、pUC-HUH-ADE2-500、pUC-HUH-ADE2-250和pUC-HUH-ADE2-100分别导入重组菌1。具体方法如下：(1)将重组菌1于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后，制备感受态细胞。(2)利用ZymoResearch Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation Kit II分别将重组质粒pUC-HUH-ADE2-1000、pUC-HUH-ADE2-500、pUC-HUH-ADE2-250、pUC-HUH-ADE2-100转化入重组菌1中，进行同源重组，ADE2不同长度同源臂的敲除盒整合至基因组ADE2位点。(3)采用筛选培养基SD-Leu-Ura筛选，收集PCR鉴定正确的阳性克隆，得到一系列同源重组菌。其中筛选培养基SD-Leu-Ura的成分为：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，CSM-Leu-Ura 0.67g/L，琼脂粉20g/L。
同时，将pUC-HUH-ADE2-1000、pUC-HUH-ADE2-500、pUC-HUH-ADE2-250和pUC-HUH-ADE2-100分别导入重组菌2，方法同上。
另外，将pUC-HUH-ADE2-1000、pUC-HUH-ADE2-500、pUC-HUH-ADE2-250和pUC-HUH-ADE2-100分别导入Yarrowia lipolytica Po1f和Yarrowia lipolytica Po1fΔku70，以作为对照，方法同上。
(二)重组菌1-2介导不同长度同源臂的同源重组效率比较
选择酵母中常用的报告基因ADE2为考察基因，基于该基因的缺失可导致磷酸核糖基氨基咪唑的积累使得解脂耶氏酵母中ADE2基因缺失菌落表型呈现淡黄色。以该基因不同同源臂长度为单一变量，分别选取1000bp、500bp、250bp、100bp长度同源臂，构建了一系列同源重组菌株(本实施例标题(一))。
图6是重组菌1-2介导不同长度同源臂的同源重组效率比较的示意图，图7是重组菌1-2介导1000bp同源臂的同源重组效率比较的示意图。同源重组效率为总转化子中发生正确同源重组的菌株数目与总转化子数目之比。
结果表明，在解脂耶氏酵母菌中，来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的scRad52基因的表达可以显著提高其同源重组效率。当同源臂长为1000bp时，重组菌1、重组菌2(Yarrowia lipolytica Po1f-Δku70-scRad52)的同源重组效率分别提高至90％和95％，约为野生型菌株Yarrowia lipolytica Po1f的15.8倍，是Yarrowia lipolytica Po1fΔku70的1.5倍。同时，对于重组菌1和重组菌2(Yarrowia lipolytica Po1f-Δku70-scRad52)，同源重组效率随同源臂长度增长而增高。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
<130> 20191127
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 密码子优化后的scRad52基因
<400> 1
tcaagtaggc ttgcgtgcat gcaggggatt gatctttggt cttccaactt ctcttcgtgt 60
cgatctttgt tgcggaacgg ctggcactgc accatttcca ttaggatgta ctaccttaga 120
aggcggcgca aaccgtggag cagctgcagg cggaaaagct gtagcgttcg ttttaattgg 180
tgtggtttca cgcggtactt gattcccagc cccttctagc atatgaggcc ccagttcttt 240
atcattgttc ttcatgctca attgttttcc ctttggtgca aatttttcat agacagaatc 300
cctcgcggtg gtcatcgttt tgtcttttag cacactcgct ggaatatgct tggacgtagt 360
ctgatcaacg gtgtgcctaa tggattgtgc ctggtatttg ggatcaaaaa tgctctcttc 420
accaatataa cgttcatttt gtacggaagt tgcagcctta gctgtaacaa aggtgatttg 480
ttctgcctct gggtttgagc tagcagttgg gctttgctta gctacaacgg gatccttctc 540
tgtcgttaaa acattactgt ttgtgttgcc catatttatc aagtcgtcgt cttgaaaatc 600
atcgctaaac ataagagaat catcgagaag gtcatcttga tcctgtttgg aagcatcgag 660
agatttgaga tcagtatctt tattactgct gtttttactg ttagcctcag caggtgcggc 720
catcattggg gtacctcgac ttactgtatt ttctattttc accaggttct tcgtcgagtc 780
gggattggta tttgtaactt tagtcaattg ccttctttta ttcgggtatt gttgttgttc 840
ttgattttca tgcaaagtat tcgttcttga gctttcgctg atttcatccg ttggcctaaa 900
caaattgttt tcgtcaaaat ctggcggatc gaacttcacc ttatcgatct ttgccagaaa 960
atctttatcg taaagacaat ttcctagagc attaccaaac cctctcaaag atcttttcaa 1020
ggcatccgta acggcagatt tcttggccct ttcgaaagcg gcaggtttcc gtctttcgtt 1080
ctccacggta ccatacccaa tatcttccct ataagtcccg ctagtcaacg taacacgaac 1140
aattgcagta caccctatgc taaactttcc ctgtcgctca tccaaaaaat cgataactac 1200
actttttacc tccgtagacc agccattata tccaaagatt tgattagcaa gattaattac 1260
tctccaacct tcgatgtatg caatcctgct tgttccaaac ccaactctct tggagatata 1320
ctcaggtcct aatttcttgt ccaatttggt ctgtatgtcc tcggaatggt taccgaaaac 1380
gggcttcttc tcatccatat ccataatttc attcat 1416
<210> 2
<211> 1000
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica Po1f
<400> 2
attcattgtc ttattagttt tctcggcgac cctgaaactg ccacctccca caatttattt 60
atatatagtt tcggcaacct ctcacacgtt atttacagta cttgtatatt cagactacca 120
actaaatcac aactaatatc ccaacagcgc ttacttatcc cttgccccct ccaacgccgc 180
caactccact tattgacgct gaagagatac attttttgct ttatatgaaa catcgctcct 240
ttatctatcc aattatatcc ttctttttgt tacaccattt cgggaagatc gaaatagcta 300
cccctagctg acttcttctc tcaacaaatt tacatctaaa gctaagtaac taaagttggt 360
gactaagaag tggaagtcct tatataggca agtaggtgct gtacgtaagc agattcttca 420
ctggtgatgt taccgcattg tgaagagcaa tatctacgtc tcccggtcac gtgccatgtt 480
gtaggggcaa tctacgcccg ccgcgttctc acagcaagct tgaatttgta atcgagagag 540
cgtttcgcgt gtggacgtgt tgacactaaa actgtaaaat tcaagactga accaggaaca 600
cctcaagagt attatttaga agattataag ggcggtgaca aagctgaagc aatgctaatg 660
ctcattattc atgtctaact tgctcttgtt ttctcctcac ccaccatctt cacgccctcc 720
gtaccatatc ttgctctcct ctaagactgc atttttagct gcttactctg atcataacat 780
tgcaggtatt tttcctgcat cgacatagac gcgtcacacc agagaagttc acctgcaagg 840
atacctgctt tttcgttgta agaaaaaagt gcctgacaaa aactacttcc tcagtgacaa 900
gcatctgatc gtaacgaaac gacttcgttt ccgccggtac cacaacacta accaccttgt 960
ttcctaattg catcaaaaaa cgccacccgc tctactagca 1000
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica Po1f
<400> 3
aaaacgaggg atggacagat ggagggtgta tattagcttc tatcaatttg catatgaatg 60
gtgtacagtc agagtagcaa gtgaatttca agtgtgctgt atgtagtcgt cctgtaccgc 120
tgtaggcgac tggaccaata gggatggtgt tgttctgatg tccagagcta cagtaagcgt 180
cgtagttagt tttattggcc tccaattaat gtgtcgcgtt ttactgtaca gatactggtg 240
actgtacttg gccttccagt gtgctgtgat ttacttgctc attgttttgt tgtcattgtc 300
accatccgtt gtattaattt accagtgttg tggcaaggca ctatcaacta tttcacctaa 360
taataaccca tccataatct ataatcggag agtcacgtcg ttcatccagt ctctctccac 420
tataattttg ttacgtaaca tttttgtgat gcacattagt ctcttagtcg tcgtagtact 480
cgtcgtcaga ctcctccacg agctgctcaa agttgacctt gtaccggagc agagcgccga 540
taccaccaaa gccctggacg aactgggcac cctcggagga ccggtctgtg acaaactcca 600
gctgggcgcc aaagtccttg tagtgctcgg ctagccactc gagcagagga atctcgtcga 660
ccacctccag ctcgttaccc tccttgtcga tcaggtattc ctcggtggga gttcccttct 720
tgatgtgcac aatggtctcc tcgccatcgt tgttcttgag agtcattcgc tggatgtcaa 780
ggttctcgta gacaatgaca gtctcgcagg ctccgagatc cagggccttg agagtctcgt 840
cgtagccgta acagaacttt ccagagtcca tggagatctc gtcgaagtac tgggtcagca 900
gcttcttctc ctgaacgaac ttgacgttgg acagagtctc ggcagacagc tcgatggcct 960
ggttgaagcc gttctctcct ccgtacgaca catcgacagt 1000
<210> 4
<211> 281
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica Po1f
<400> 4
cgtcgcctga gtcatcattt atttaccagt tggccacaaa cccttgacga tctcgtatgt 60
cccctccgac atactcccgg ccggctgggt acgttcgata gcgctatcgg catcgacaag 120
gtttgggtcc ctagccgata ccgcactacc tgagtcacaa tcttcggagg tttagtcttc 180
cacatagcac gggcaaaagt gcgtatatat acaagagcgt ttgccagcca cagattttca 240
ctccacacac cacatcacac atacaaccac acacatccac a 281
<210> 5
<211> 729
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica Po1f
<400> 5
gactctataa aaagggccct gccctgctaa tgaaatgatg atttataatt taccggtgta 60
gcaaccttga ctagaagaag cagattgggt gtgtttgtag tggaggacag tggtacgttt 120
tggaaacagt cttcttgaaa gtgtcttgtc tacagtatat tcactcataa cctcaatagc 180
caagggtgta gtcggtttat taaaggaagg gagttgtggc tgatgtggat agatatcttt 240
aagctggcga ctgcacccaa cgagtgtggt ggtagcttgt tactgtatat tcggtaagat 300
atattttgtg gggttttagt ggtgtttggt aggttagtgc ttggtatatg agttgtaggc 360
atgacaattt ggaaaggggt ggactttggg aatattgtgg gatttcaata ccttagtttg 420
tacagggtaa ttgttacaaa tgatacaaag aactgtattt cttttcattt gttttaattg 480
gttgtatatc aagtccgtta gacgagctca gtgccatggc ttttggcact gtatttcatt 540
tttagaggta cactacattc agtgaggtat ggtaaggttg agggcataat gaaggcacct 600
tgtactgaca gtcacagacc tctcaccgag aattttatga gatatactcg ggttcatttt 660
aggctccgat tcgattcaaa ttattactgt cgaaatcggt tgagcatccg ttgatttccg 720
aacagatct 729
<210> 6
<211> 605
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica Po1f
<400> 6
taccggggtg tgttctgtgg agcattctca cttttggtaa acgacattgc ttcaagtgca 60
gcggaatcaa aaagtataaa gtgggcagcg agtatacctg tacagactgt aggcgataac 120
tcaatccaat taccccccac aacatgactg gccaaactga tctcaagact ttattgaaat 180
cagcaacacc gattctcaat gaaggcacat acttcttctg caacattcac ttgacgccta 240
aagttggtga gaaatggacc gacaagacat attctgctat ccacggactg ttgcctgtgt 300
cggtggctac aatacgtgag tcagaagggc tgacggtggt ggttcccaag gaaaaggtcg 360
acgagtatct gtctgactcg tcattgccgc ctttggagta cgactccaac tatgagtgtg 420
cttggatcac tttgacgata cattcttcgt tggaggctgt gggtctgaca gctgcgtttt 480
cggcgcggtt ggccgacaac aatatcagct gcaacgtcat tgctggcttt catcatgatc 540
acatttttgt cggcaaaggc gacgcccaga gagccattga cgttctttct aatttggacc 600
gatag 605
<210> 7
<211> 1000
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica Po1f
<400> 7
ccatatcgac atcattgacg acttcaccta cgccggcact gtgctccccc tcaaggaact 60
tgctcttaag cacggtttct tcctgttcga ggacagaaag ttcgcagata ttggcaacac 120
tgtcaagcac cagtacaaga acggtgtcta ccgaatcgcc gagtggtccg atatcaccaa 180
cgcccacggt gtacccggaa ccggaatcat tgctggcctg cgagctggtg ccgaggaaac 240
tgtctctgaa cagaagaagg aggacgtctc tgactacgag aactcccagt acaaggagtt 300
cctggtcccc tctcccaacg agaagctggc cagaggtctg ctcatgctgg ccgagctgtc 360
ttgcaagggc tctctggcca ctggcgagta ctccaagcag accattgagc ttgcccgatc 420
cgaccccgag tttgtggttg gcttcattgc ccagaaccga cctaagggcg actctgagga 480
ctggcttatt ctgacccccg gggtgggtct tgacgacaag ggagacgctc tcggacagca 540
gtaccgaact gttgaggatg tcatgtctac cggaacggat atcataattg tcggccgagg 600
tctgtacggc cagaaccgag atcctattga ggaggccaag cgataccaga aggctggctg 660
ggaggcttac cagaagatta actgttagag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg 720
tatatagaga gcgtgcaagt atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct 780
gtctgatcga gtatgtatga tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg 840
gcatgttgtt gtgtttctcg atacggagat gctgggtaca agtagctaat acgattgaac 900
tacttatact tatatgaggc ttgaagaaag ctgacttgtg tatgacttat tctcaactac 960
atccccagtc acaataccac cactgcacta ccactacacc 1000

Claims (7)

1.具有高同源重组效率的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌是在解脂耶氏酵母菌或敲除了ku70基因的解脂耶氏酵母菌基因组中插入了来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的scRad52基因表达盒后得到的，所述表达盒中酿酒酵母Rad52上位基因簇的scRad52基因是经过密码子优化后所得，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述scRad52基因表达盒插入位点为解脂耶氏酵母菌或敲除了ku70基因的解脂耶氏酵母菌基因组中A08位点。
2.根据权利要求1所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述scRad52基因表达盒的启动子为解脂耶氏酵母菌的PylRad52启动子，终止子为解脂耶氏酵母菌的TylRad52终止子。
3.根据权利要求2所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述重组解脂耶氏酵母菌还表达1个或多个标记基因；所述标记基因为3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒或乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因表达盒。
4.权利要求3所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将所述来源于酿酒酵母Rad52上位基因簇的scRad52基因表达盒通过线性质粒形式导入解脂耶氏酵母或敲除了ku70基因的解脂耶氏酵母中，然后整合在基因组上的步骤。
5.根据权利要求4所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于所述重组解脂耶氏酵母菌基因组中还插入了1个或多个标记基因；所述标记基因为3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶基因表达盒或乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因表达盒。
6.权利要求1-3之一所述重组解脂耶氏酵母菌在介导不同长度同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述同源臂的长度为100-1000bp。
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DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展;卞广兴等;《国外医学分子生物学分册》;20070723;第23卷(第2期);第75页右栏第3段，第76页右栏第3段 *
Enhancing CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair in mammalian cells by expressing Saccharomyces cerevisiae Rad52;Simin Shao等;《The International Journal of Biochemistry & Cell Biology》;20171130;第92卷;摘要，第43页左栏第2段-右栏第2段，第3.4节 *
Human and yeast Rad52 proteins promote DNA strand exchange;Baoyuan Bi等;《PNAS》;20040629;第101卷(第26期);第9568-9572页 *
Improving the homologous recombination efficiency of Yarrowia lipolytica by grafting heterologous component from Saccharomyces cerevisiae;Qingchun Jia等;《Metabolic Engineering Communications》;20201231;第11卷;第1-6页 *
Molecular Pathways: Understanding the Role of Rad52 in Homologous Recombination for Therapeutic Advancement;Benjamin H. Lok等;《Clinical Cancer Research》;20121231;第18卷(第23期);第6400-6406页 *
Rad52 Inverse Strand Exchange Drives RNA-Templated DNA Double-Strand Break Repair;M.Mazina等;《Molecular Cell》;20170706;第67卷(第1期);第19-29页 *
The RAD52 ortholog of Yarrowia lipolytica is essential for nuclear integrity and DNA repair;Eduardo Campos-Góngora等;《FEMS Yeast Res》;20130502;第13卷(第5期);第441-452页 *
代谢工程改造解脂耶氏酵母生产脂肪酸及其衍生物;王凯峰等;《化工学报》;20210127;第72卷(第1期);第351-365页 *
影响动物细胞同源重组发生与基因打靶效率的分子机制;李兰等;《生物技术通讯》;20060330;第17卷(第1期);第88-91页 *
新型ScRad52-Cas9基因组精确编辑系统的建立及猪IGF2基因的高效编辑;邵斯旻;《万方数据》;20180929;第1-126页 *

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