CN110331158B - 基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用 - Google Patents
基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于运动发酵单胞菌内源CRISPR‑Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用。该方法主要包括以下步骤：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；选取若干个目标编辑靶位点，设计gRNA序列；将若干个gRNA序列串联，构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上；将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。本发明利用运动发酵单胞菌内源CRISPR‑Cas系统构建基因编辑平台，打破外源CRISPR‑Cas9基因组编辑在该类菌株中效率低下的限制，在该菌株中实现多基因的同时快速、高效敲除，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用。
背景技术
近年来，利用微生物进行代谢工程、系统生物学及合成生物学等方面的研究取得了良好的进展，为理性化设计、构建微生物细胞工厂，利用生物体活细胞或酶对可再生生物质，如纤维素等进行物质转化，生产生物能源，实现生物冶炼的工业化提供了重要的理论基础。生物能源再生化是解决人类目前面临的资源、能源短缺及环境污染严重等问题的有效手段之一。
常规的遗传操作方法操作繁琐，周期长，难以满足微生物细胞工厂的构建要求。比如，快速、同时敲除多个基因/基因簇，需要高通量基因编辑技术的辅助，如基于CRISPR-Cas系统的基因编辑平台。然而，由于外源表达Cas9等核酸酶造成的细胞毒性，造成转化效率非常低，最终严重影响基因编辑；对于同时敲除多个基因更是无法实现。
常规的遗传学方法能实现对基因进行突变，但通常只能单个单个地完成，耗时较长，效率太低，无法满足诸如构建复杂的代谢通路等研究的要求。而且，对于每一个目标基因的突变，均需要引入特定的选择标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生的生物安全隐患等等一些问题。此外，为了提高细胞体内DNA重组效率，可利用序列特异性核酸酶对目的基因进行定点剪切，促进基因组与供体DNA的重组，定点引入突变，实现基因组的精准编辑。例如，锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）和转录激活样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）被成功用于对基因组进行定点剪切。但是，对每一个靶标位点的剪切，均需要对上述蛋白进行一次改造，实验步骤较为复杂。相比于ZFN和TALEN技术，基于CRISPR-Cas系统的基因组编辑技术对不同目的DNA的靶定不需要进行蛋白改造，只需要简单改变单个介导RNA（gRNA）序列，易于操作。然而，由于目前常用的Cas9为具多个结构域的大核酸蛋白（大于1000氨基酸），存在难以转运到目的细胞内的潜在难度，更重要的是，随着研究的深入，越来越多的结果显示，异源表达这些核酸酶会对宿主产生不同程度的细胞毒性，对于原核细胞尤为突出。
Cas9对运动发酵单胞菌有较为明显的细胞毒性，在质粒上表达Cas9会造成转化效率上千倍降低，数据比较见图1。此外，要实现多个位点的同时编辑，需要将多个gRNA表达框进行成簇克隆和表达，操作工序繁杂，耗时长。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用。
本发明是这样实现的，基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，包括以下步骤：
步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；
步骤2：选取若干个目标编辑靶位点，针对目标编辑靶位点设计gRNA序列；
步骤3：将若干个所述gRNA序列串联，并构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；
步骤4：将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；
步骤5：将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。
进一步，步骤2中选取3个目标编辑靶位点。
进一步，所述含人工CRISPR表达单元的质粒为在Z. mobilis-E.coli穿梭载体pEZ15Asp上构建人工CRISPR表达单元。
进一步，所述人工CRISPR表达单元包括启动子leader序列，CRISPR簇及终止子。
进一步，所述人工CRISPR簇包括两个repeat，且两个repeat中间插入了两个BsaⅠ的酶切位点。
进一步，步骤5中所述感受态细胞为运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞。
进一步，步骤2中选取目标基因3’末端截取5’-NCC-3’下游紧邻的32 bp序列作为gRNA。
进一步，所述gRNA可位于基因组任一条链上。
进一步，步骤4中，选取若干个目标编辑靶位点上、下游序列作为供体DNA，并分别设计引物，通过融合PCR技术进行扩增和连接。
如权利要求1-8任一所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法在多基因组位点同时编辑中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明利用运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统构建基因编辑平台，打破外源CRISPR-Cas9基因组编辑在该类菌株中效率低下的限制，在该菌株中实现多基因的同时快速、高效敲除，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。
本发明以运动发酵单胞菌为模式菌株，运用其内源CRISPR-Cas系统进行基因组编辑。相对于异源引入的CRISPR-Cas9系统，开发宿主内源CRISPR-Cas基因组编辑工具具有以下有益效果：（1）不存在对大蛋白的转运问题；（2）可有效避免外源Cas核酸蛋白对宿主产生的细胞毒性；（3）宿主自身CRISPR-Cas系统具有完整的功能，能将CRISPR转录本加工成不同的成熟crRNA分子，用来介导Cas效应复合体对不同目标DNA序列靶点的剪切。
因此，将不同的介导序列克隆到同一个CRISPR簇中，即能实现对多个靶位点的同时编辑。相对于传统遗传学操作方法，利用该CRISPR-Cas系统，（1）能对预编辑的目标序列进行持续剪切，具有很强的正选压力，不需要额外使用选择标记，避免了传统操作方法中常遇到的可用选择标记有限、引入抗生素标记产生生物安全隐患；（2）极大程度上缩短了基因编辑的周期。以单个位点编辑为例，常规遗传操作方法至少需要15天才能得到纯化的目的菌株，而利用该CRISPR-Cas系统仅需要3天；对于多位点的编辑则差异更大，常规遗传操作方法只能在单个位点编辑的基础上进行累加，即2位点需至少30天，3位点则需至少45天，以此类推，利用CRISPR-Cas系统则仍然只需要3天（一个编辑周期）。本发明已实现了至少3位点的同时编辑。
附图说明
图1是质粒上表达Cas9的转化效率比较结果；
图2是内源CRISPR-Cas介导的多点同时编辑流程；
图3是运动发酵单胞菌编码的CRISPR-Cas系统；
图4是C2S7和C3S4序列；
图5是CRISPR-Cas系统体内剪切活性检测结果；
图6是人工CRISPR表达单元；
图7是将人工CRISPR簇克隆到编辑质粒的流程示意图；
图8是转化子菌落PCR产物电泳结果；
图9是转化子编辑结果统计分析示意图；
图10是转化子测序结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用，通过将不同的介导序列克隆到同一个CRISPR簇中，实现对多个靶位点的同时编辑，编辑流程如图2所示。具体实验过程如下各实施例所示。
实施例1运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas基因组编辑系统的构建
（1）运动发酵单胞菌基因组编码的CRISPR-Cas系统组学分析
本发明开展的前提是研究菌株需自身编码CRISPR-Cas系统，且具有DNA剪切活性，这就要求宿主基因组编码CRISPR簇和完整的Cas蛋白体系。
以运动发酵单胞菌Z. mobilis 4为模式菌株，对Z. mobilis ZM4测序数据进行了分析，结果显示，该菌株基因组编码4个CRISPR结构序列，根据其在基因组的排列顺序，我们将其依次命名为CRISPR1-CRISPR4，见图1。CRISPR1占据基因组113,783-114,170区域，包含7个repeat序列；CRISPR2占据1,244,355-1,245,866区域，包含9个repeat序列；CRISPR3占据1,598,754-1,599,144区域，包含7个repeat序列。CRISPR4由2个repeat和1个spacer组成，占据1,595,315-1,599,403区域。CRISPR2-4位于同一条链，而CRISPR1位于互补链上。这些CRISPR结构中repeat均为保守的28 bp序列，spacer长度为32或33 bp，其中32 bp占70%。该基因组还编码一个cas基因簇，包括cas1，cas3，csy1，csy2，csy3和csy4基因，其中cas1，cas3形成一个操纵子，而所有csy基因以一个操纵子形式排列。上述结果中cas3基因是一个cas2和cas3基因的融合形式，是I-F型CRISPR-Cas系统的一个标志性特征。
（2）运动发酵单胞菌内源I-F型CRISPR-Cas系统体内剪切活性检测
为了检测Z. mobilis 4菌株I-F型CRISPR-Cas系统是否可在crRNA的介导下体内剪切DNA，根据转录组分析结果，我们分别选取了CRISPR2中spacer7（C2S7）和CRISPR3中spacer4（C3S4），在其序列5’端加上5’-CCC-3’ PAM，见图2。具体操作为：将Z. mobilis-E.col穿梭载体pEZ15Asp用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切体系见表1。与C2S7和C3S4的引物退火（表2）后用T4 DNA连接酶连接（表3）。通过转化到E.coli DH5α中进行质粒扩增，然后对转化子进行菌落PCR验证（表4），构建好的质粒均通过测序验证。同时，将5’加上5’-AAA-3’序列的spacer插入到载体，得到对应的参照质粒。穿梭载体pEZ15Asp上含有壮观霉素抗性编码基因。
表1：载体双酶切体系
| 试剂 | 体积 | 浓度 |
| 载体pEZ15Asp | ~ µL | 2-3ug |
| <i>Xba</i>Ⅰ | 1µL | |
| <i>EcoR</i>Ⅰ | 1µL | |
| Buffer | 2µL | |
| H<sub>2</sub>O | Up to 20 µL |
载体双酶切程序：37℃保温3-4h。
C2S7和C3S4引物序列：
C2S7（CCC）-F：aattCCCGATCGCGGGCAACGGTTTATTCAGCTATCCGCGC，见SEQ ID NO:1；
C2S7（CCC）-R：ctagGCGCGGATAGCTGAATAAACCGTTGCCCGCGATCGGG，见SEQ ID NO:2；
C2S7（AAA）-F：aattAAAGATCGCGGGCAACGGTTTATTCAGCTATCCGCG，见SEQ ID NO:3；
C2S7（AAA）-R：ctagGCGCGGATAGCTGAATAAACCGTTGCCCGCGATCTT，见SEQ ID NO:4；
C3S4（CCC）-F：aattCCCGTCTGGCTGAAATGAGGTCCGACGATTTGCAT，见SEQ ID NO:5；
C3S4（CCC）-R：gttaATGCAAATCGTCGGACCTCATTTCAGCCAGACGGG，见SEQ ID NO:6；
C3S4（AAA）-F：aattAAAGTCTGGCTGAAATGAGGTCCGACGATTTGCAT，见SEQ ID NO:7；
C3S4（AAA）-R：gttaATGCAAATCGTCGGACCTCATTTCAGCCAGACTTT，见SEQ ID NO:8；
表2：引物退火体系
| 试剂 | 体积 |
| PCR Buffer | 1µL |
| 正向引物 | 1µL |
| 正向引物 | 1µL |
| H<sub>2</sub>O | Up to 10 µL |
引物退火程序：95℃保温5min，然后常温退火。
表3：T4 DNA连接酶连接体系
| 试剂 | 体积 | 浓度 |
| 线性化载体 | ~ µL | 100-200ng |
| 退火后引物 | 1µL | |
| T4 DNA连接酶 | 1µL | |
| Buffer | 2µL | |
| H2O | Up to 20 µL |
T4 DNA连接酶连接程序：22℃保温2h。
大肠杆菌DH5α的转化方法：取50µL感受态细胞于冰上，加入5 µL的酶连产物，冰上静置10min，42℃热激35s，加入450µL液体LB，37℃复苏1h。取100 μL涂布于100 μg/mL壮观霉素抗性平板，37℃培养16h。
表4：菌落PCR体系
| 试剂 | 体积 |
| PCRmix | 5µL |
| 正向引物 | 0.5µL |
| 反向引物 | 0.5µL |
| 菌液模板 | 1µL |
| H2O | Up to 10 µL |
PCR程序为：步骤1，98℃，3min；步骤2，98℃，10s；步骤3，55℃，15s；步骤4，72℃，30s；步骤2-步骤4循环25次；步骤5，72℃，2min。
用提取的质粒对ZM4进行电转化。取ZM4感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50 μL加入电转杯中，并在电转杯中加入1 μg质粒。电转条件为1600V，25 μF，200Ω。电转完毕后于RMG液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000 rpm，1 min离心，除去上清。加入200 μL新鲜的RMG培养基，取100 μL涂布于100 μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃孵育2天。
预测，将质粒分别转化到宿主后，如果I-F型CRISPR-Cas系统有活性，插入的protospacer将被剪切，在含有100 μg/mL壮观霉素的RMG培养基平板上进行筛选，则会造成平板上形成少数几个菌落；而转化参照质粒的平板上则会形成大量菌落。
实验结果如图3，转化干涉质粒的效率相比于转化参照质粒要低103倍，由此说明，基因组上CRISPR中表达的crRNA介导I-F型系统的DNA活性对干涉质粒中protospacer进行了剪切，从而确定该系统可被用于DNA序列的定点靶向和切割。
（3）基因组编辑质粒的组成
在质粒pEZ15Asp上构建了一个人工CRISPR表达单元，见图4，由启动子leader序列，CRISPR簇及终止子组成。该人工CRISPR表达单元由三方基因合成公司人工合成。人工CRISPR簇包括两个repeat中间插入了两个BsaⅠ的酶切位点，这两个BsaⅠ的酶切位点的功能是为了方便目标基因上选取的guideRNA序列的插入。本实施例中启动子Leader序列、RgR模块序列以及T7终止子序列分别见SEQ ID NO:32- SEQ ID NO:34。
实施例2 基于运动发酵单胞菌的内源CRISPR-Cas系统在多基因位点同时编辑中的应用
本发明首先选取基因组上三个不同编辑位点设计gRNA，并设计相应供体DNA。然后，构建基因编辑质粒，在质粒上构建人工CRISPR簇用于同时表达相应gRNA，同时，将供体DNA也克隆到同一编辑质粒。最后，将编辑质粒电转化到运动发酵单胞菌细胞，筛选、鉴定准确编辑后的目标菌株。具体操作如下各步骤。
（1）选取敲除靶位点
本发明的多位点基因编辑对象为基因组编码的CRISPR基因1-4（CRISPR1-4），其中CRISPR3和4在基因组上的位置紧邻，把它们作为一个编辑靶标进行敲除。
（2）设计靶序列gRNA
从目标基因序列CRISPR1-4的3’末端截取5’-NCC-3’下游紧邻的32 bp序列作为gRNA，该序列可位于基因组任一条链上。
CRISPR1-gRNA：tgtggggatatgatcggcatcggttttgataa，见SEQ ID NO:9；
CRISPR2-gRNA：tctttaaaaccaccccaatgcaataaaatcta，见SEQ ID NO:10；
CRISPR3＆4-gRNA：aaccatgaaacagaacaacacttaaataagta，见SEQ ID NO:11。
（3）将人工CRISPR簇克隆到编辑质粒
克隆流程见图7。将上述目标基因的gRNA用人工合成的方法串联起来，再与实施例1中制备的含有人工CRISPR表达单元的质粒用Gibson装配，然后对转化子进行菌落PCR（同上，表4）验证，构建好的质粒均通过测序验证。
所用菌落PCR验证引物序列：
pEZ15A-F：ggcaaagccaccctatttttag，见SEQ ID NO:12；
CRISPR3＆4-guideRNA-R：tacttatttaagtgttgttctgtttcatggtt，见SEQ ID NO:13。
（4）将供体DNA序列克隆到编辑质粒
分别选取目标基因上、下游各300左右的序列作为同源重组供体模板DNA，通过融合PCR技术（表5）对其进行扩增和连接，通过Gibson装配的方法连入编辑质粒。转化E.coli DH5α，然后对转化子进行菌落PCR验证（同上，表4），构建好的编辑质粒均通过测序验证。
表5：融合PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| PCRmix | 10µL |
| 正向引物 | 1µL |
| 反向引物 | 1µL |
| 模板1 | 1µL |
| 模板2 | 1µL |
| H2O | Up to 20 µL |
融合PCR程序为：步骤1，98℃，3min；步骤2，98℃，10s；步骤3，55℃，15s；步骤4，72℃，30s；步骤2-步骤4循环25次；步骤5，72℃，2min。
供体DNA引物序列：
CRISPR1-up-F：aggtcaccagctcaccgtctgaattcatgccgccgccaataataac，见SEQ IDNO:14；
CRISPR1-up-R：agggtataatatgtgggtgggcagtgttgtctttgatagc，见SEQ ID NO:15；
CRISPR1-down-F：gctatcaaagacaacactgcccacccacatattataccct，见SEQ ID NO:16；
CRISPR1-down-R：cagatatgccgcaacaggccggcaggatgtatctattagg，见SEQ ID NO:17；
CRISPR2-up-F：cctaatagatacatcctgccggcctgttgcggcatatctg，见SEQ ID NO:18；
CRISPR2-up-R：cgttgcagaagactaatcccgccatcaattctttaggcca，见SEQ ID NO:19；
CRISPR2-down-F：tggcctaaagaattgatggcgggattagtcttctgcaacg，见SEQ ID NO:20；
CRISPR2-down-R：aatctcaatatatttgagcgggctttggtgtcgcttttct，见SEQ ID NO:21；
CRISPR3＆4-up-F：agaaaagcgacaccaaagcccgctcaaatatattgagatt，见SEQ ID NO:22；
CRISPR3＆4-up-R：tgagaacagaatagcctccggatcgtgatcttaacgcttc，见SEQ ID NO:23；
CRISPR3＆4-down-F：gaagcgttaagatcacgatccggaggctattctgttctca，见SEQ IDNO:24；
CRISPR3＆4-down-R：ctcgagagatctgatatcactctagaggcttcttatggttaaaata，见SEQ ID NO:25。
（5）将编辑质粒电转化到运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞
取50 μL感受态细胞于冰上，加入1 μg的编辑质粒，待感受态细胞融化后转入0.1cm的电转杯中。电转条件为1600 V，25 μF，200 Ω。电转完毕后于RM液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000 rpm，1 min离心，除去上清。加入200 μL新鲜的RM培养基，取100 μL涂布于200 μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃培养2天。再用引物CRISPR1-check-F和CRISPR1-check-R；CRISPR2-check-F和CRISPR2-check-R；CRISPR3＆4-check-F和CRISP3＆4-check-R分别进行菌落PCR（同上，表4）筛选阳性克隆。
菌落PCR筛选引物：
CRISPR1-check-F：caggatgccgccgccaataa，见SEQ ID NO:26；
CRISPR1-check-R：gggcgatcgcagcgatgaaa，见SEQ ID NO:27；
CRISPR2-check-F：ggcctgttgcggcatatctg，见SEQ ID NO:28；
CRISPR2-check-R：tattggcggcgtgcagcaaa，见SEQ ID NO:29；
CRISPR3＆4-check-F：ggcaaaattgttggcggcta，见SEQ ID NO:30；
CRISP3＆4-check-R：tcgcaaccagaatgacatgcg，见SEQ ID NO:31。
（6）结果与分析
对得到的转化子进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并进一步对PCR产物进行测序验证。结果如图8-图10所示，检测的16个转化子中，至少发生一处靶位点编辑的占75%，而3号、4号和5号样品为成功同时敲除3个靶基因位点的菌株，测序分析结果说明，所有位点均按实验设计进行了准确编辑，说明了本发明在基因编辑应用中的高效性、精确性和稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7CCC-F)
<400> 1
aattcccgat cgcgggcaac ggtttattca gctatccgcg c 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7CCC-R)
<400> 2
ctaggcgcgg atagctgaat aaaccgttgc ccgcgatcgg g 41
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7AAA-F)
<400> 3
aattaaagat cgcgggcaac ggtttattca gctatccgcg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7AAA-R)
<400> 4
ctaggcgcgg atagctgaat aaaccgttgc ccgcgatctt 40
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4CCC-F)
<400> 5
aattcccgtc tggctgaaat gaggtccgac gatttgcat 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4CCC-R)
<400> 6
gttaatgcaa atcgtcggac ctcatttcag ccagacggg 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4AAA-F)
<400> 7
aattaaagtc tggctgaaat gaggtccgac gatttgcat 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4AAA-R)
<400> 8
gttaatgcaa atcgtcggac ctcatttcag ccagacttt 39
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> CRISPR1-gRNA(CRISPR1-gRNA)
<400> 9
tgtggggata tgatcggcat cggttttgat aa 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> CRISPR2-gRNA(CRISPR2-gRNA)
<400> 10
tctttaaaac caccccaatg caataaaatc ta 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> CRISPR3＆4-gRNA(CRISPR3＆4-gRNA)
<400> 11
aaccatgaaa cagaacaaca cttaaataag ta 32
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(pEZ15A-F)
<400> 12
ggcaaagcca ccctattttt ag 22
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR3＆4-guideRNA-R)
<400> 13
tacttattta agtgttgttc tgtttcatgg tt 32
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR1-up-F)
<400> 14
aggtcaccag ctcaccgtct gaattcatgc cgccgccaat aataac 46
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR1-up-R)
<400> 15
agggtataat atgtgggtgg gcagtgttgt ctttgatagc 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR1-down-F)
<400> 16
gctatcaaag acaacactgc ccacccacat attataccct 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR1-down-R)
<400> 17
cagatatgcc gcaacaggcc ggcaggatgt atctattagg 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR2-up-F)
<400> 18
cctaatagat acatcctgcc ggcctgttgc ggcatatctg 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR2-up-R)
<400> 19
cgttgcagaa gactaatccc gccatcaatt ctttaggcca 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR2-down-F)
<400> 20
tggcctaaag aattgatggc gggattagtc ttctgcaacg 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR2-down-R)
<400> 21
aatctcaata tatttgagcg ggctttggtg tcgcttttct 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR3＆4-up-F)
<400> 22
agaaaagcga caccaaagcc cgctcaaata tattgagatt 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR3＆4-up-R)
<400> 23
tgagaacaga atagcctccg gatcgtgatc ttaacgcttc 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR3＆4-down-F)
<400> 24
gaagcgttaa gatcacgatc cggaggctat tctgttctca 40
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR3＆4-down-R)
<400> 25
ctcgagagat ctgatatcac tctagaggct tcttatggtt aaaata 46
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR1-check-F)
<400> 26
caggatgccg ccgccaataa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR1-check-R)
<400> 27
gggcgatcgc agcgatgaaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR2-check-F)
<400> 28
ggcctgttgc ggcatatctg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR2-check-R)
<400> 29
tattggcggc gtgcagcaaa 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISPR3＆4-check-F)
<400> 30
ggcaaaattg ttggcggcta 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(CRISP3＆4-check-R)
<400> 31
tcgcaaccag aatgacatgc g 21
<210> 32
<211> 148
<212> DNA
<213> 启动子leader(启动子leader)
<400> 32
tttgaccctt tatttgaccc tctttttttg gcatgtaaaa aaatccttta aaatcaatag 60
gttaaaaata ggctctattt ttagggttat ttggctattt ttgcccgata ttcctttcat 120
ttagggggat ttttaattat ttactcta 148
<210> 33
<211> 72
<212> DNA
<213> RgR(RgR)
<400> 33
gttcactgcc gcacaggcag cttagaaagg agaccgaggt ctcagttcac tgccgcacag 60
gcagcttaga aa 72
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> T7终止子(T7终止子)
<400> 34
ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcg 28
Claims (7)
1.基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；
步骤2：选取3个目标编辑靶位点，针对目标编辑靶位点设计gRNA序列；选取目标基因3’末端截取5’-NCC-3’下游紧邻的32 bp序列作为gRNA；
步骤3：将3个所述gRNA序列串联，并构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；
步骤4：将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；
步骤5：将编辑质粒转化至运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞中进行编辑。
2.根据权利要求1所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述含人工CRISPR表达单元的质粒为在Z. mobilis-E.coli穿梭载体pEZ15Asp上构建人工CRISPR表达单元。
3.根据权利要求2所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述人工CRISPR表达单元包括启动子leader序列，CRISPR簇及终止子。
4.根据权利要求3所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述人工CRISPR簇包括四个repeat。
5.根据权利要求1所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述gRNA可位于基因组任一条链上。
6.根据权利要求1所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：步骤4中，选取3个目标编辑靶位点上、下游序列作为供体DNA，并分别设计引物，通过融合PCR技术进行扩增和连接。
7.如权利要求1-6任一所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法在多基因组位点同时编辑中的应用。
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