CN112746075B - 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 - Google Patents

诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112746075B
CN112746075B CN202110142885.9A CN202110142885A CN112746075B CN 112746075 B CN112746075 B CN 112746075B CN 202110142885 A CN202110142885 A CN 202110142885A CN 112746075 B CN112746075 B CN 112746075B
Authority
CN
China
Prior art keywords
crispr
plasmid
cas system
editing
inducible
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110142885.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112746075A (zh
Inventor
佘群新
赵鹏鹏
冯明霞
冯旭
于振霄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202110142885.9A priority Critical patent/CN112746075B/zh
Publication of CN112746075A publication Critical patent/CN112746075A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112746075B publication Critical patent/CN112746075B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供诱导型内源CRISPR‑Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用，属于基因组学及基因工程和生物技术领域。本发明诱导型内源CRISPR‑Cas系统只需要构建一个含有多种spacer的CRISPR簇与多个供体DNA片段的质粒，以及具有诱导型的内源CRISPR‑Cas系统的菌株。利用诱导时产生的大量CRISPR‑Cas效应复合物完成对多个基因的同时靶向切割以及多个供体DNA同源重组修复，从而实现多个基因的同时编辑。上述方法基因编辑效率高，进行原核生物多基因编辑时可以一次性或者以更少的次数完成，大大节约所需的时间、精力与成本，可应用宿主范围广，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编 辑中的应用
技术领域
本发明属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
CRISPR-Cas系统是一种广泛存在于原核生物中的获得性免疫系统，大约90％古菌和40％细菌均含有该免疫系统(Grissa et al 2007)。其免疫过程主要分为：适应、crRNA加工以及干扰三个阶段，如此来帮助宿主完成记忆、靶向和裂解外源入侵核酸。根据Cas标志性蛋白的不同，CRISPR-Cas系统又分为两大类(Class1和Class2)和六类型(I型至VI型)(Makarova et al 2020)。其中属于Class1的CRISPR-Cas系统是I、III和IV型，它们是由多个Cas蛋白与crRNA组装成效应复合物来发挥作用的。而属于Class 2的CRISPR-Cas系统是II、V和VI型，它们是由单个Cas蛋白与crRNA结合而成的效应复合物来发挥作用。由于单蛋白的异源表达的优势，属于Class 2的CRISPR-Cas系统已经被广泛地开发成为了基因组编辑的工具。
然而，Cas9与Cas12这一类基因编辑工具在一些极端环境微生物的使用依然有限，例如，尚未见这些单蛋白CRISPR-Cas系统在极端嗜酸嗜热的古菌中应用的报道。这主要是因为目前所开发的Cas9与Cas12均来自于常温或中温菌，这些Cas蛋白是否可以在生存温度高达75℃的极端微生物中发挥功能，依然未知。此外利用原核生物的内源CRISPR-Cas系统进行基因编辑已成为一项非常重要的遗传操作工具。实际上，已有研究表明内源CRISPR-Cas系统在基因编辑在微生物基因编辑中展现出了巨大的优势。
冰岛硫化叶菌Rey15A就是一个典型的例子。它是古菌中一个广泛运用的模式生物，其生存所需的温度高达75℃。冰岛硫化叶菌Rey15A具有三种CRISPR-Cas系统，包括一个I-A型以及两个III-B型(Cmrα和Cmrβ)CRISPR-Cas系统。近年来，利用古菌内源的CRISPR-Cas系统已经被用来开发成了比较成熟的内源性基因编辑工具(Li,et al 2016)。然而，由于古菌的生长周期较长，基于目前开发的利用内源性CRISPR-Cas系统进行单基因编辑的方法已不能满足目前构建古菌模式生物底盘细胞的效率需求。对于进行多个位点基因编辑的需求时，进行逐一的单个基因编辑的方式无疑是非常耗时耗力的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用。本发明诱导型内源CRISPR-Cas系统只需要构建一个含有多种spacer的CRISPR簇与多个供体DNA片段的质粒，以及具有诱导型的内源CRISPR-Cas系统的菌株。利用诱导时产生的大量CRISPR-Cas效应复合物完成对多个基因的同时靶向切割以及多个供体DNA同源重组修复，从而实现多个基因的同时编辑。因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种诱导型内源CRISPR-Cas系统，所述诱导型内源CRISPR-Cas系统包括含有诱导型内源性CRISPR-Cas系统的菌株和多基因编辑质粒pMGE；
其中，所述多基因编辑质粒pMGE，其通过在原核生物基因组多个拟编辑区域各选择一段protospacer序列，设计相应引物扩增得到所需CRISPR簇，将其与pSe-Rp质粒进行同源重组，得到能表达多种crRNA的人工CRISPR质粒(pMS)，然后将所要编辑的多个基因所需的供体DNA片段连接到上述的pMS质粒即得。
所述含有诱导型内源性CRISPR-Cas系统的菌株可通过“一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法”(CN 105331627B)提供的方法获得。
本发明的第二个方面，提供上述诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法，所述构建方法包括含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的菌株的构建和多基因编辑质粒pMGE的构建；
其中，所述含有诱导型内源性CRISPR-Cas系统的菌株的构建方法可参见“一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法”(CN 105331627B)。
更具体的，所述含有诱导型内源性CRISPR-Cas系统的菌株的构建方法包括：
1)单编辑质粒的构建：在原核生物基因组上拟编辑区域选取一段序列作为protospacer即靶标位点，根据protospacer设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’-AAAG-Nn-3’，反向引物：5’-TAGC-N’n-3’，其中Nn和N’n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe-Rp经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒；再将包含突变序列和与宿主细胞基因组上靶标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述人工CRISPR质粒上，得到单编辑质粒(pGE)；
2)突变菌株的获得：单编辑质粒转化至含有内源CRISPR-Cas系统的原核生物感受态细胞，质粒上的CRISPR簇转录出pre-crRNA，经过细胞内Cas6蛋白被加工成多种成熟的crRNA，这些crRNA分别与基因组表达的Cas蛋白形成靶标效应复合物。效应复合物靶标并切割目标DNA序列，随后单编辑质粒上的供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，如此完成将内源性CRISPR-Cas系统的启动子更换为诱导型启动子，即得含有诱导型的内源CRISPR-Cas系统的突变菌株。
所述多基因编辑质粒的构建方法包括：
1)PCR一步法构建CRISPR簇：所述多基因编辑质粒pMGE，其通过在原核生物基因组多个拟编辑区域各选择一段protospacer序列，设计相应引物扩增得到所需CRISPR簇；
所述多个拟编辑区域至少为2个，如2个或3个或者更多；相对应的，所述protospacer序列可依次命名为S1、S2和S3，根据所需的repeat-S1-repeat-S2-repeat或repeat-S1-repeat-S2-repeat-S3-repeat的CRISPR簇序列，分别设计两对或三对互有重叠区域的引物；
更具体的，按照(第一条引物)：(n个中间引物)：(最后一条引物)＝20:(1)n:20的比例，通过PCR扩增得到上述所需的CRISPR簇；
2)构建多基因编辑质粒：
将上述得到的CRISPR簇与pSe-Rp质粒进行同源重组，得到能表达多种crRNA的人工CRISPR质粒(pMS)，然后将所要编辑的多个基因所需的供体DNA片段连接到上述人工CRISPR质粒即得。
更具体的，所述pSe-Rp质粒经过BspMI酶切处理；
所述同源重组为Gibson同源重组。
本发明的第三个方面，提供上述诱导型内源CRISPR-Cas系统在原核生物基因组多基因编辑中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种原核生物多基因编辑的方法，所述方法包括：将上述多基因编辑质粒转化至含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的菌株细胞(感受态细胞)中，在无诱导物的培养基上得到大量的转化子；所述转化子在含有诱导物的培养基中培养，菌株细胞中的内源CRISPR-Cas系统被大量诱导，从而完成多个基因的同时编辑。
其中，所述原核生物为所有含有内源性CRISPR-Cas系统的原核生物，包括细菌和古菌，进一步包括含有内源I型或III型CRISPR-Cas系统，或同时含有内源I型和III型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌，例如：冰岛硫化叶菌(优选原核冰岛硫化叶菌S.islandicusREY15A)，大肠杆菌Escherichia coli，表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis，腐败希瓦菌Shewanella putrefaciens，嗜热细菌Thermus thermophilus，嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，强烈火球菌Pyrococcus furiosus，嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius，硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus，热自养甲烷热杆菌Methanothermobacter thermautotrophicus，盐富饶菌Haloferax volcanii，黑胫病菌Pectobacterium atrosepticum，白喉棒状杆菌Corynebacterium diphtheriae等。
所述多基因编辑包括多基因敲除、多位点插入、多位点点突变中的任意一种或多种。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案提供的利用诱导型的内源CRISPR-Cas系统进行原核生物多基因编辑的方法，只需要构建一个含有多种spacer的CRISPR簇与多个供体DNA片段的质粒，以及具有诱导型的内源CRISPR-Cas系统的菌株。通过先转化后诱导的方式，利用诱导时产生的大量CRISPR-Cas效应复合物完成对多个基因的同时靶向切割以及多个供体DNA同源重组修复，从而实现多个基因的同时编辑。
相对于原核生物中传统的单个基因逐一编辑策略，上述方法基因编辑效率高，进行原核生物多基因编辑时可以一次性或者以更少的次数完成，大大节约所需的时间、精力与成本。可应用宿主范围广，含有内源性CRISPR-Cas系统的所有原核生物都可以应用。可应用于同时多种基因编辑方式，多位点缺失、多位点插入、多位点点突变或者以上三种方式的混合需求等，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明构建的诱导型内源性CRISPR-Cas系统示意图。
图2是本发明在原核生物细胞中利用诱导型的内源性CRISPR-Cas系统进行多基因编辑的原理示意图。
图3是本发明构建含有多拷贝不同spacer的CRISPR簇的多编辑质粒的原理示意图。
图4是本发明实施例1构建含有诱导型内源CRISPR-Cas系统且CRISPR array缺失的菌株相关图，其中，A为实施例1中进行诱导型内源CRISPR-Cas系统改造结果验证示意图；B为实施例1中进行转化子PCR验证的结果图；
图5为本发明实施例2中利用诱导型内源CRISPR-Cas系统以实现原核生物基因组上多个基因同时编辑相关图，其中，A为实施例2中进行双基因敲除结果验证示意图；B为实施例2中进行双基因敲除构建的pMGE质粒示意图；C为实施例2中进行双基因敲除得到的平板转化子示意图；D为实施例2中由转化子进行0.1‰阿拉伯糖诱导培养的菌苔结果图；E为实施例2中诱导后菌苔进行PCR验证的结果图。
图6为本发明实施例3中利用诱导型内源CRISPR-Cas系统以实现原核生物基因组上多个基因同时编辑相关图，其中，A为实施例3中进行双基因敲除结果验证示意图；B为实施例3中进行双基因敲除构建的pMGE质粒示意图；C为实施例3中进行双基因敲除得到的平板转化子示意图；D为实施例3中由转化子进行0.1‰阿拉伯糖诱导培养的菌苔结果图；E为实施例3中诱导后菌苔进行PCR验证的结果图。
图7为本发明实施例4中利用诱导型内源CRISPR-Cas系统以实现原核生物基因组上多个基因同时编辑相关图，其中，A为实施例4中进行双基因敲除结果验证示意图；B为实施例4中进行双基因敲除构建的pMGE质粒示意图；C为实施例4中进行双基因敲除得到的平板转化子示意图；D为实施例4中由转化子进行0.1‰阿拉伯糖诱导培养的菌苔结果图；E为实施例4中诱导后菌苔进行PCR验证的结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，基于目前开发的利用内源性CRISPR-Cas系统进行单基因编辑的方法已不能满足目前构建古菌模式生物底盘细胞的效率需求。对于进行多个位点基因编辑的需求时，进行逐一的单个基因编辑的方式无疑是非常耗时耗力的。
有鉴于此，本发明提供一种利用诱导型内源CRISPR-Cas系统同时进行多个基因编辑的方法。该方法将多基因编辑分成两步：(1)首先将多编辑质粒转化至含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的细胞中，在无诱导物的培养基上得到大量的转化子。(2)转化子在含有诱导物的培养基中培养，细胞中的内源CRISPR-Cas系统被大量诱导，从而完成多个基因同时编辑的目标。此方法巧妙地避免了在转化子阶段由于多个稳点被靶标而无法及时完成同源重组修复而造成细胞死亡的情况。同时只需要构建一个具有诱导型的内源CRISPR-Cas系统的菌株，以及一个含有靶向不同基因的CRISPR簇与多个供体DNA片段的多基因编辑质粒即可。
本发明的一个具体实施方式中，构建含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的突变株，包括以下步骤：
1)单编辑质粒的构建：
根据已有的利用内源CRISPR-Cas系统进行单基因编辑的方法，在内源CRISPR-Cas系统启动子区域或其上游区选择一段protospacer序列，设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’-AAAG-Nn-3’，反向引物：5’-TAGC-N’n-3’，其中Nn和N’n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe-Rp经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒(pAC)；再将包含诱导型启动子和与宿主基因组上靶标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述pAC质粒上，得到单编辑质粒(pGE)；
2)突变菌株的获得：
单编辑质粒转化至含有内源CRISPR-Cas系统的原核生物感受态细胞，质粒上的CRISPR簇转录出pre-crRNA，经过细胞内Cas6蛋白被加工成多种成熟的crRNA，这些crRNA分别与基因组表达的Cas蛋白形成靶标效应复合物。效应复合物靶标并切割目标DNA序列，随后单编辑质粒上的供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，如此完成将内源性CRISPR-Cas系统的启动子更换为诱导型启动子，得到含有诱导型的内源CRISPR-Cas系统的突变菌株。
本发明的又一具体实施方式中，提供多基因编辑质粒的构建，包括以下步骤：
1)PCR一步法构建CRISPR簇：
在原核生物基因组上需要编辑的多个基因区域各选择一段protospacer序列，这里命名为S1、S2、S3等，根据所需的repeat-S1-repeat-S2-repeat或者repeat-S1-repeat-S2-repeat-S3-repeat的CRISPR簇序列，分别设计两对或者三对互有重叠区域的引物，如图2所示，以repeat-S1-repeat-S2-repeat-S3-repeatCRISPR簇为例，分别设计并合成引物，为primer1至primer6。按照(第一条引物)：(n个中间引物)：(最后一条引物)＝20:(1)n:20的比例，通过PCR扩增得到上述所需的CRISPR簇。
2)构建多基因编辑质粒：
PCR扩增得到的CRISPR簇，将其与经过BspMI酶切过的pSe-Rp质粒进行Gibson同源重组反应，在这里，CRISPR簇中的repeat和质粒pSe-Rp上的repeat为重组所需同源臂。如此，得到能表达多种crRNA的人工CRISPR质粒(pMS)，再将所要编辑的多个基因所需的供体DNA片段连接到上述的pMS质粒上，得到多基因编辑质粒pMGE。Gibson重组反应所用的试剂为2×MultiF Seamless Assembly Mix(ABclonal,RK21020)，具体操作步骤可参考该试剂说明书。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种利用诱导型内源CRISPR-Cas系统同时进行多基因编辑的方法，包括：
将构建好的pMGE多基因编辑质粒通过电转化将其导入到含有诱导型内源性CRISPR-Cas系统的突变菌株的感受态细胞中，转化产物在无诱导物的固体培养基中培养，长成的转化子挑至添加了诱导物的培养基中富集培养。诱导物的存在使得CRISPR-Cas蛋白进行大量的诱导表达，这些Cas蛋白与多基因编辑质粒转录出的crRNA组装成能够靶标多个基因的效应复合物。被靶标的多个基因区域通过与质粒上的供体DNA发生同源重组，最终完成多个基因的同时编辑。
上述步骤中，所述的内源CRISPR-Cas系统为原核生物基因组编码的CRISPR-Cas系统，所述方法应用范围包括但不限于冰岛硫化叶菌(优选原核冰岛硫化叶菌S.islandicusREY15A)，大肠杆菌Escherichia coli，表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis，腐败希瓦菌Shewanella putrefaciens，嗜热细菌Thermus thermophilus，嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，强烈火球菌Pyrococcus furiosus，嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius，硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus，热自养甲烷热杆菌Methanothermobacter thermautotrophicus，盐富饶菌Haloferax volcanii，黑胫病菌Pectobacterium atrosepticum，白喉棒状杆菌Corynebacterium diphtheriae等。
所述多基因编辑包括但不限于多基因敲除、多位点插入、多位点点突变中的任意一个或多个。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别说明，实施例中的实验操作均按常规实验条件或按照材料、试剂制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
构建含有诱导型内源CRISPR-Cas系统且CRISPR array缺失的菌株
本实施例以构建含有诱导型内源I-A CRISPR-Cas系统的冰岛硫化叶菌Rey15A突变株为例进行说明：
1.单编辑质粒的构建
(1)冰岛硫化叶菌Rey15A基因组上的I-A CRISPR-Cas系统的基因簇包含csa5、cas7、cas5、cas3、’cas3、’cas8和cas6基因，该基因簇的启动子在csa5基因上游区域。该基因簇上游还存在一个spacer获取的基因簇(Cascis)，以及两个CRISPR簇(C RISPR array1和CRISPR array2)。为了将I-A CRISPR-Cas系统基因簇的自身启动子更换成为一个阿拉伯糖诱导型的启动子，选择I-A基因簇上游的csa1基因中的序列“T GGGCTGCTATAGAAGCTATCTTCAGAAAGGCAAATAAGG”共40个碱基为protosp acer，其5’端紧邻CCN-PAM(protospacerAdjacent Motif)，所以能被宿主内源I-A型CRIISPR-Cas系统所靶向。根据该protospacer设计两条反向互补的引物(IAspacerF和IAspacerR)(表1)，两条引物通过退火形成两端含有粘性末端的spacer片段。
(2)表1.各实施例中所用到的引物序列
Figure BDA0002929934790000081
Figure BDA0002929934790000091
Figure BDA0002929934790000101
Figure BDA0002929934790000111
上表中具有加粗标识的是进行Gibson反应所需的同源片段。
(3)载体pGE-1(He et al 2016)经过LguI酶切处理，酶切产物与上述spacer片段进行酶连，得到人工CRISPR质粒pAC(pAC中LguI酶切位点在插入spacer片段后消除)。
(4)设计扩增spacer获取的基因簇、两个CRISPR簇和I-A CRISPR-Cas系统基因簇自身启动子都缺失的供体DNA所需的四条引物，其中两条是上述片段缺失的over lap PCR引物(IALarmR/IA-RarmF)，两条为分别带着PaeI与XhoI酶切位点引物(IA-PaeI-LarmF/IA-XhoI-RarmR)(表1)。通过Overlap PCR得到同源重组修复所需的两条供体DNA片段。
(5)上述供体DNA与pAC分别经过PaeI与XhoI酶切，随后酶连与转化，得到单编辑质粒pGE-IA。
(6)将P50启动子设计为两条反向互补的引物(P50F、P50R)，两条引物通过退火形成两端分别含有NheI和LguI粘性末端的片段。
(7)由于在设计引物IALarmR、IA-RarmF的同时引入了新的酶切位点NheI和Lg uI，因此在上述的pGE-IA经过NheI和LguI酶切后，酶切产物与上述的P50启动子片段酶连可得到pGE-IA-P50。
2.突变菌株的获得
(1)一株III-B CRISPR-Cas缺失的、来源于冰岛硫化叶菌Rey15A的遗传操作菌株E234(△pyrEF△lacS)的突变株(命名为ΔαβE234，△pyrEF△lacS△III-B)，作为出发菌株，制备成感受态细胞。500ng单编辑质粒pGE-IA电转化至ΔαβE234感受态细胞，涂布SVT(0.2％sucrose，0.1％Tryptone plus 1％vitamin solution)固体培养基，76℃培养6天，挑取转化子于SVT固体培养基进行富集培养，得到菌苔。
(2)分别用引物对IA-PaeI-LarmF/IA flankingR(表1)进行PCR检测，发现11个转化子发生了启动子更换，以及spacer获取基因簇与两个CRISPR簇缺失的突变株，命名为冰岛硫化叶菌P50IA。
(3)通过在培养基中添加50μg/ml的5-氟乳清酸物质，反筛去掉单编辑质粒。
实施例2
一种利用诱导型内源CRISPR-Cas系统以实现原核生物基因组上多个基因同时编辑的方法，包括以下步骤：
本实施例利用含有诱导型内源I-A型CRISPR系统的冰岛硫化叶菌P50IA，对其基因组上的SiRe_2599和SiRe_0020双基因进行敲除为例进行说明：
1.编辑质粒的构建
(1)在冰岛硫化叶菌S.islandicus REY15A基因组上的SiRe_2599选取+633至+683共40个碱基作为protospacer1(S1)和SiRe_0020选取+214至+264共40个碱基作为protospacer2(S2)，上述S1和S2序列5’端都紧邻CCN-PAM(protospacer Adjacent Motif)，所以都能被宿主内源I-A型CRIISPR-Cas系统所靶向。基于上述两个protosp acer设计四条引物(2S-S1-2599-F/2S-S1-2599-R/2S-S2-0020-F/2S-S2-0020-R)(表1)，四条引物添加(20:1:1:20)的比例通过PCR的方式获得CRISPR簇片段。
(2)pGE载体经过BspMI酶切处理，酶切产物与上述CRISPR簇片段进行同源重组反应，得到pGE-S1-S2质粒。
(3)设计扩增SiRe_2599和SiRe_0020缺失片段的供体DNA所需的各四条引物。对于SiRe_2599基因，设计两条在SiRe_2599基因上缺失1068bp的Overlap PCR引物(2599Larm-R/2599Rarm-F)和分别带有salI酶切位点两端的同源序列的两条引物(2599-salILH-LarmF/2599-salIRH-RarmR)。对于SiRe_0020基因，设计两条在SiRe_0020基因上缺失630bp的Overlap PCR引物(0020Larm-R/0020Rarm-F)和分别带有NotI酶切位点两端的同源序列的两条引物(0020-NotIH-Larm-F/0020-NotIH-Rarm-R)。通过Overlap PCR得到同源重组修复所需的两条供体DNA片段。
(4)上述SiRe_2599供体DNA片段与通过SalI单酶切的pGE-S1-S2质粒进行Gibson组装反应，经转化验证，得到pGE-S1-S2-2599质粒。再将通过NotI单酶切的pGE-S1-S2-2599质粒与SiRe_0020供体DNA片段进行Gibson组装反应，经转化验证，得到pMGE-S1-S2-2599-0020质粒。
2.突变株的筛选
(1)将900ng pMGE-S1-S2-2599-0020质粒通过电转导入到冰岛硫化叶菌P50IA感受态细胞中，涂布SVT(0.2％sucrose，0.1％Tryptone plus 1％vitamin solution)固体培养基，76℃培养6天，再挑取转化子于ASVT(A：arabinose 0.01‰)固体培养基上培养三天，得到诱导后的菌苔。
(2)挑取16个菌苔分别用(2599flankingF/R和0020flankingF/R)进行PCR检测，发现挑取的16个菌苔中有7个菌苔发生了双基因敲除，另有2个菌苔发生了单基因敲除，发生双基因敲除的概率为43％，初步证明该方法可适用于双基因敲除。
实施例3
一种利用诱导型内源CRISPR-Cas系统以实现原核生物基因组上多个基因同时编辑的方法，包括以下步骤：
本实施例利用含有诱导型内源I-A型CRISPR系统的冰岛硫化叶菌P50IA，对其基因自上的SiRe_1994和SiRe_0811双基因进行敲除为例进行说明：
1.编辑质粒的构建
(1)在冰岛硫化叶菌REY15A基因组上的SiRe_1994选取+160至+200共40个碱基作为protospacer3(S3)和SiRe_0811选取+408至+448共40个碱基作为protospacer4(S4)，上述S3和S4序列5’端都紧邻CCN-PAM，所以都能被宿主内源I-A型CRIISPR-Cas系统所靶向。基于上述两个protospacer设计四条引物(2S-S3-1994-F/2S-S3-1994-R/2S-S4-0811-F/2S-S4-0811-R)(表1)，四条引物添加(20:1:1:20)的比例通过PCR的方式获得CRISPR簇片段。
(2)pGE载体经过BspMI酶切处理，酶切产物与上述CRISPR簇片段进行Gibson组装反应，得到pGE-S3-S4质粒。
(3)设计扩增SiRe_1994和SiRe_0811缺失片段的供体DNA所需的各四条引物。对于SiRe_1994基因，设计两条在SiRe_1994基因上缺失507bp的Overlap PCR引物(1994Rarm-F/1994Larm-R)和分别带有NotI酶切位点两端的同源序列的两条引物(1994-NotILH-LarmF/1994-NotIRH-RarmR)。对于SiRe_0811基因，设计两条在SiRe_0811基因上缺失846bp的Overlap PCR引物(0811SOE-R/0811SOE-F)和分别带有SalI酶切位点两端的同源序列的两条引物(0811-SalI-Larm-F/0811-salI-Rarm-R)。通过Overlap PCR得到同源重组修复所需的两条供体DNA片段。
(4)上述SiRe_1994供体DNA片段与通过NotI单酶切的pGE-S1-S2质粒进行Gibson组装反应，经转化验证，得到pGE-S1-S2-1994质粒。再将通过SalI单酶切的pGE-S1-S2-1994质粒与SiRe_0811供体DNA片段进行Gibson组装反应，经转化验证，得到pMGE-S1-S2-1994-0811质粒。
2.突变株的筛选
(1)将900ng pMGE-S1-S2-1994-0811质粒通过电转导入到冰岛硫化叶菌P50IA(△pyrEF△CRISPR array△lacS△III-B)感受态细胞中，涂布SVT固体培养基，76℃培养6天，再挑取转化子于ASVT(A：arabinose 0.01‰)固体培养基上培养三天，得到诱导后的菌苔。
(2)各挑取16个菌苔分别用(1994flankingF/R和0811flankingF/R)进行PCR检测，发现挑取的16个菌苔中有4个菌苔发生了双基因敲除，另有2个菌苔发生了单基因敲除，发生双基因敲除的概率25％，进一步证明该方法可用于双基因敲除。
实施例4
一种利用诱导型内源CRISPR-Cas系统以实现原核生物基因组上多个基因同时编辑的方法，包括以下步骤：
本实施例利用含有诱导型内源I-A型CRISPR系统的冰岛硫化叶菌P50IA，对其基因组上的SiRe_2599和SiRe_1616双基因进行敲除为例进行说明：
1.编辑质粒的构建
(1)在冰岛硫化叶菌REY15A基因组上的SiRe_2599选取+633至+683共40个碱基作为protospacer1(S1)和SiRe_1616选取+599至+639共40个碱基作为protospacer5(S5)，上述S1和S5序列5’端都紧邻CCN-PAM，所以都能被宿主内源I-A型CRIISPR-Cas系统所靶向。根据上述S1和S5设计两条反向互补的引物(2599S-F/2599S-R)(1616S-F/1616S-R)。分别将上述S1两对引物以及S5两对引物退火形成含有粘性末端的DNA片段。
(2)pGE载体经过BspMI酶切处理，酶切产物分别与上述S1和S5的退火片段进行酶连，经过转化，分别得到pGE-S1和pGE-S5质粒。
(3)设计扩增SiRe_2599和SiRe_1616缺失片段的供体DNA所需的各四条引物。对于SiRe_2599基因，设计两条在SiRe_2599基因上缺失1068bp的Overlap PCR引物(2599Rarm-F/2599Larm-R)和分别带有SalI酶切位点两端的同源序列的两条引物(2599-salILH-LarmF/2599-salIRH-RarmR)。对于SiRe_1616基因，设计两条在SiRe_1616基因上缺失1398bp的Overlap PCR引物(1616SOE-F/1616SOE-F)和分别带有NotI酶切位点两端的同源序列的两条引物(1616-NotI-Larm-F/1616-NotI-Rarm-R)。通过Overlap PCR得到同源重组修复所需的两条供体DNA片段。
(4)将上述SiRe_2599供体DNA片段与通过SalI单酶切的pGE-S1质粒进行Gibson组装反应，经转化验证，得到pAC-S1-1994质粒。同时将上述SiRe_1616供体DNA片段与通过NotI单酶切的pAC-S5质粒进行Gibson组装反应，经转化验证，得到pGE-S5-1616质粒。
(5)设计扩增pAC-S5-1616质粒上从阿拉伯糖启动子到SiRe_1616供体DNA片段的两条引物(1616plasmid-F/1616plasmid-R)，其分别带有SphI酶切位点两侧的同源序列。用上述两条引物进行PCR扩增，得到S5-1616片段。
(6)将上述S5-1616片段与通过SphI酶切的pAC-S1-2599质粒进行Gibson组装反应，进过转化验证，得到pMGE-S5-1616-S1-2599质粒。
2.突变株的筛选
(1)将900ng pMGE-S5-1616-S1-2599质粒通过电转导入到冰岛硫化叶菌P50IA感受态细胞中，涂布SVT固体培养基，76℃培养6天，再挑取转化子于ASVT(A：arabinose 0.01‰)固体培养基上培养三天，得到诱导后的菌苔。
(2)各挑取8个菌苔分别用(2599flankingF/R和1616flankingF/R)进行PCR检测，发现挑取的8个菌苔中有4个菌苔发生了双基因敲除，另有3个菌苔发生了单基因敲除，发生双基因敲除的概率为50％，更加充分的说明了该方法用于双基因敲除具有广泛的适用性。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用
<130>
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acatgcatgc ttaaccccac gtatagcc 28
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgctcgagc gggctagcct acacaccaaa ggaataagg 39
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctagctagct aggtgaagag catgcatcac caccatc 37
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgctcgagt catttcttct caccacc 27
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagtgggctg ctatagaagc tatcttcaga aaggcaaata agg 43
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agcccttatt tgcctttctg aagatagctt ctatagcagc cca 43
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctagatgtgc aacaagttag gtatactatt tataaaatag ttaggtcata aaagtacccg 60
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cctcgggtac ttttatgacc taactatttt ataaatagta tacctaactt gttgcacat 59
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctaaagaca acatattctc cac 23
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctaatctac tatagaattg aaagcctatt cctattctat acttattaat ggca 54
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
catgtctttc aattctatag tagattagct tagtattatt gccattaata agtatagaa 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
actaagctaa tctactatag aattgaaaga catgtagaag aatttccaat cagattata 59
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctttcaattc tatagtagat tagcttactt cgtctataat ctgattggaa attc 54
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gctaatctac tatagaattg aaagtaaatt cttctcaagc tcatgaagat t 51
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgatgtgcgg ccgcttgatc agcggcgaat tcgttgttgt caac 44
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaagaaagac atgaagtgtt aagcaaagtg aaggaattg 39
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccttcacttt gcttaacact tcatgtcttt cttcttctag aaacttc 47
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaagtcgacg ctgatcaagc ttctgaaggt ttatgacaag ggtt 44
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tggtggtgat gatgatgtgc tagaacactt gaacttagaa ctcca 45
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cttggtcttt tctaaggatt tctgcccctt tagacaca 38
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gggcagaaat ccttagaaaa gaccaagata ctaatgtt 38
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
catcataagc gtgtataact ggtac 25
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cctaatccac catactcaat gtc 23
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gctaatctac tatagaattg aaagtcagct attttaggag acatattaca tctt 54
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cttcactttc aattctatag tagattagct ttcaaggcca agatgtaata tgtctccta 59
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgaaagctaa tctactatag aattgaaagt gaaggcatag aagatctatt cgataaagt 59
<210> 27
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ctttcaattc tatagtagat tagctttgta tatcacttta tcgaatagat cttc 54
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttgaaagtcg acgctgatca agcataggat tatttattcc ccaacca 47
<210> 29
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ttaatggtgg tgatgatgat gtgctggcta ttatctcagc ttcatatc 48
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gacggaaaat atacaatctt cctttacatg gcttaactgt 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gccatgtaaa ggaagattgt atattttccg tcatttgtcc 40
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gaatattcga tagctggaag agc 23
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctactccatt aaatccctta acaaccacg 29
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gctaatctac tatagaattg aaagcttgac tccttcatcc aaagcc 46
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
attgtaggct tcggttccta cagcactaac gtgaact 37
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
acgttagtgc tgtaggaacc gaagcctaca attatat 37
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tgatgtgcgg ccgcttgatc agcgttatag tttattatcg ctcc 44
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ttacgcgtcg accttgactc cttcatccaa agcc 34
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aaggaaaaaa gcggccgctt agctgaccca tggcgtat 38
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aaaggcctgt aggaagggct gaatttagga gacttggttt ttgt 44
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tagcacaaaa accaagtctc ctaaattcag cccttcctac aggc 44
<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aaaggttcta aaatacctta cgagtgggtt gaggtaagga agac 44
<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tagcgtcttc cttacctcaa cccactcgta aggtatttta gaac 44
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
aaagtcgacg ctgatcaagc agggctgttg acggtgttgt tgta 44
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cgttatctgg agaatttgga ggagaaacta gggaaga 37
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ctcctccaaa ttctccagat aacgaaacgt cattg 35
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tggtggtgat gatgatgtgc cctagataac tcgcttaagg gatg 44
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gtacattaaa gtacaattgt gctg 24
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gtatacctaa cttgtttaac atgcctagat aactcgctta agggatg 47
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gatatgaggg atttcaattc tcc 23
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
caactcctca ccctttctta tt 22

Claims (8)

1.一种诱导型内源CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述诱导型内源CRISPR-Cas系统包括含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的菌株和多基因编辑质粒pMGE；
其中，所述多基因编辑质粒pMGE，其通过在原核生物基因组多个拟编辑区域各选择一段protospacer序列，设计相应引物扩增得到所需CRISPR簇，将其与pSe-Rp质粒进行同源重组，得到能表达多种crRNA的人工CRISPR质粒，然后将所要编辑的多个基因所需的供体DNA片段连接到上述的pMS质粒即得；
所述诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法包括含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的菌株的构建和多基因编辑质粒pMGE的构建；
所述含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的菌株的构建方法包括：
1）单编辑质粒的构建：在原核生物基因组上拟编辑区域选取一段序列作为protospacer即靶标位点，根据protospacer设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’-AAAG-Nn-3’，反向引物：5’-TAGC-N’n-3’，其中Nn和N’n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe-Rp经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒；再将包含突变序列和与宿主细胞基因组上靶标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述人工CRISPR质粒上，得到单编辑质粒；
2）突变菌株的获得：单编辑质粒转化至含有内源CRISPR-Cas系统的原核生物感受态细胞，质粒上的CRISPR簇转录出pre-crRNA，经过细胞内Cas6蛋白被加工成多种成熟的crRNA，所述crRNA分别与基因组表达的Cas蛋白形成靶标效应复合物；效应复合物靶标并切割目标DNA序列，随后单编辑质粒上的供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，即得含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的突变菌株；
所述多基因编辑质粒pMGE的构建方法包括：
1）PCR一步法构建CRISPR簇：所述多基因编辑质粒pMGE，其通过在原核生物基因组多个拟编辑区域各选择一段protospacer序列，设计相应引物扩增得到所需CRISPR簇；
2）构建多基因编辑质粒：
将上述得到的CRISPR簇与pSe-Rp质粒进行同源重组，得到能表达多种crRNA的人工CRISPR质粒（pMS），然后将所要编辑的多个基因所需的供体DNA片段连接到上述人工CRISPR质粒即得。
2.如权利要求1所述的诱导型内源CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述多基因编辑质粒pMGE的构建方法的步骤1）中，
按照（第一条引物）：（n个中间引物）：（最后一条引物）=20：（1）n：20的比例，通过PCR扩增得到上述CRISPR簇。
3.如权利要求1所述的诱导型内源CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述多基因编辑质粒pMGE的构建方法的步骤2）中，
所述pSe-Rp质粒经过BspMI酶切处理；
所述同源重组为Gibson同源重组。
4.权利要求1所述诱导型内源CRISPR-Cas系统在原核生物基因组多基因编辑中的应用。
5.一种原核生物多基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1中的多基因编辑质粒转化至含有诱导型内源CRISPR-Cas系统的菌株细胞中，在无诱导物的培养基上得到大量的转化子；所述转化子在含有诱导物的培养基中培养，从而完成多个基因的同时编辑。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述原核生物为所有含有内源CRISPR-Cas系统的原核生物，包括含有内源I型或III型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌，或同时含有内源I型和III型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述原核生物包括冰岛硫化叶菌Sulfolobusislandicus，大肠杆菌Escherichia coli，表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis，腐败希瓦菌 Shewanella putrefaciens，嗜热细菌Thermus thermophilus，嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，强烈火球菌Pyrococcus furiosus，嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius， 硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus，热自养甲烷热杆菌Methanothermobacter thermautotrophicus，盐富饶菌Haloferax volcanii，黑胫病菌Pectobacterium atrosepticum和白喉棒状杆菌Corynebacterium diphtheriae。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多基因编辑包括多基因敲除、多位点插入、多位点点突变中的任意一种或多种。
CN202110142885.9A 2021-02-02 2021-02-02 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 Active CN112746075B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110142885.9A CN112746075B (zh) 2021-02-02 2021-02-02 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110142885.9A CN112746075B (zh) 2021-02-02 2021-02-02 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112746075A CN112746075A (zh) 2021-05-04
CN112746075B true CN112746075B (zh) 2022-11-11

Family

ID=75653538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110142885.9A Active CN112746075B (zh) 2021-02-02 2021-02-02 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112746075B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116004688A (zh) * 2021-10-21 2023-04-25 中国科学院深圳先进技术研究院 肠道菌拟杆菌的基因编辑方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331627B (zh) * 2015-09-30 2019-04-02 华中农业大学 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法
CN110331158B (zh) * 2019-07-30 2021-09-14 湖北大学 基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用
CN110628761A (zh) * 2019-09-27 2019-12-31 北京理工大学 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112746075A (zh) 2021-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2141238B1 (en) DNA cloning vector plasmids and methods for their use
AU2020223370B2 (en) Enzymes with RuvC domains
JP6165789B2 (ja) 核酸分子のインビトロでの連結および組み合わせアセンブリのための方法
US10913941B2 (en) Enzymes with RuvC domains
AU2005248371B2 (en) Methods for dynamic vector assembly of DNA cloning vector plasmids
KR20230021657A (ko) Ruvc 도메인을 포함하는 효소
CN112746075B (zh) 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用
EP1088085A2 (en) Vector construction by host cell-mediated recombination
US20220220460A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN100494384C (zh) T载体及其构建方法
US20240110167A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN115747242B (zh) 消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用
Abécassis et al. Producing chimeric genes by CLERY: in vitro and in vivo recombination
CN116064631A (zh) 一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用
JP2002199887A (ja) 分裂酵母ゲノム上ｌｙｓ１座位へ外来ＤＮＡを効率よく導入する方法とそれに用いるベクター
CN117701561A (zh) 一种优化的向导RNA、CRISPR/AcC2C9基因编辑系统及基因编辑方法
JP2023038910A (ja) 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
GB2617659A (en) Enzymes with RUVC domains
CN117143898A (zh) 一种sgRNA表达载体、CRISPR基因编辑表达质粒及其制备方法
CN116411003A (zh) 基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统编辑载体的构建及其应用
Wilson et al. In vivo excision, cloning, and broad-host-range transfer of large bacterial DNA segments using VEX-Capture
US20090305359A1 (en) Method for producing circular duplex polynucleotides from linear duplex polynucleotides and applications thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant