CN116411003A - 基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统编辑载体的构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR‑Cas系统编辑载体的构建及其应用。本发明第一方面提供一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR‑Cas系统构建的核酸分子，包括Repeat序列和crRNA序列，所述Repeat序列位于所述crRNA序列的上游和下游，其中：Repeat序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；crRNA序列靶向刺糖多孢菌基因组中PAM序列的下游序列，可由反向互补的两条引物退火合成，所述PAM序列包括TCA、TCG、CCA、CCG中的一种。本发明可敲除刺糖多孢菌基因组的目标基因，为刺糖多孢菌的功能基因组研究、代谢工程及合成生物学改造育种提供了有力的遗传操作工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统编辑载体的构建及其应用，涉及合成生物学基因组编辑技术领域。
背景技术
刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)是一种具有重要工业价值，其发酵产生的多杀菌素是一种市场价值巨大的绿色生物农药，其不仅具有高效、广谱的杀虫作用，而且还具有非常低的哺乳动物毒性与优良的环境友好性，已在100多个国家，200多种农作物上进行注册登记，成为绿色农用抗生素的杰出代表。
同时，刺糖多孢菌也是一种公认的遗传操作困难菌株，传统DNA双交换敲除效率极低。近年来，基于II类CRISPR系统的CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1(Cas12a)的基因组编辑技术已经被广泛应用于多种细胞的基因组编辑；但是，外源的Cas9或Cpf1蛋白对刺糖多孢菌的细胞毒性较大，并且编码Cas9或Cpf1的基因长度较大，约4kb(Kilo base pair)，连同质粒骨架、同源臂等，整个编辑质粒长度可超过10kb，使得编辑质粒难以导入细胞，限制了外源CRISPR-Cas系统在刺糖多孢菌中的应用。
随着基因组测序的发展，不同类型的CRISPR-Cas系统在原核生物基因组中不断被发现。有超过50％的细菌基因组中包含CRISPR系统，其中90％的CRISPR-Cas系统属于I类系统，不同于仅需一个效应蛋白(如Cas9、Cpf1)的II类CRISPR系统，I类系统依赖于多个Cas蛋白组成的效应复合体Cascade来发挥功能。将细菌中广泛存在的I类内源CRISPR-Cas系统进行改造利用，已成为规避外源Cas蛋白毒性，实现高效基因组编辑的一种新兴的、强大的遗传工具，尤其针对遗传操作困难的非模式物种或菌株。但截止目前，还没有利用内源CRISPR-Cas系统对刺糖多孢菌进行基因组编辑的报道。
发明内容
本发明提供一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统编辑载体的构建及其应用，用于对刺糖多孢菌基因组进行编辑，具体用于敲除刺糖多孢菌基因组中的目标基因。
本发明第一方面提供一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统构建的核酸分子，所述核酸分子包括Repeat序列和crRNA序列，所述Repeat序列位于所述crRNA序列的上游和下游，其中：
所述Repeat序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述crRNA序列为靶向刺糖多孢菌基因组内目标基因的序列，所述目标基因的上游包括PAM序列，所述PAM序列为TCA、TCG、CCA、CCG中的一种。
进一步地，所述核酸分子还包括提供修复模板的同源臂序列，所述同源臂序列包括第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂与所述目标基因在刺糖多孢菌基因组内的上游同源臂和下游同源臂相同。
本发明第二方面提供一种表达载体，所述表达载体包括上述任一所述的核酸分子。
进一步地，所述表达载体还包括启动子J23119。
本发明第三方面提供上述表达载体的构建方法，包括：
构建载体模板，所述载体模板包括Repeat序列和编码BbsI限制性内切酶的识别序列，所述Repeat序列位于所述识别序列的上游和下游；
利用II-S型限制内切酶BbsI对所述载体模板进行切割，通过Golden Gate方法，将所述crRNA序列与所述载体模板的切割产物连接，得到所述表达载体。
进一步地，所述方法还包括：
以刺糖多孢菌基因组作为模板，扩增目标基因的上游同源臂和下游同源臂；
将所述上游同源臂和下游同源臂与所述表达载体连接，构建得到包括所述同源臂序列的表达载体。
本发明第四方面提供上述表达载体在刺糖多孢菌基因组编辑中的应用，所述基因编辑包括敲除刺糖多孢菌基因组中的目标基因。
本发明第五方面提供一种刺糖多孢菌基因组编辑的方法，所述基因编辑包括敲除刺糖多孢菌基因组中的目标基因，包括：
将上述任一所述的表达载体导入刺糖多孢菌中，实现刺糖多孢菌基因组内目标基因的敲除。
进一步地，将所述表达载体导入刺糖多孢菌中，具体包括如下步骤：
将所述表达载体转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，随后通过接合转移将表达载体转化至刺糖多孢菌中。
进一步地，将导入所述表达载体的刺糖多孢菌进行平板培养，挑选阳性转化子，得到敲除所述目标基因的刺糖多孢菌。
本发明利用刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统，引导该菌内源的Cas蛋白复合体对目标序列进行切割，无需引入外源Cas蛋白，避免了外源Cas蛋白的毒性问题，而且导入刺糖多孢菌内的序列长度通常仅约100bp左右，精简了编辑质粒的构建及长度，使得编辑质粒更小，更易高效导入细胞，提高编辑质粒的转化效率；同时，本发明导入刺糖多孢菌内的表达载体编码的crRNA可引导内源的Cas蛋白复合体靶向细菌自身基因组识别并切割，具有反筛效应，长出的接合子理论上都是编辑成功的突变体，提高了目标基因的敲除效率。综上，本发明可敲除刺糖多孢菌基因组的目标基因，为刺糖多孢菌的功能基因组研究、代谢工程及合成生物学改造育种提供了有力的遗传操作工具。
附图说明
图1为刺糖多孢菌内源的Type I-B型CRISPR/Cas系统；
图2为PAM序列的验证结果；
图3为利用刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统进行spnR2敲除的示意图，其中，A为将编辑质粒pWT-J23119-Repeat-TSpnR2-Repeat-HA导入刺糖多孢菌，对10个接合子进行菌落PCR验证结果；B为spnR2敲除菌株测序验证结果；
图4为利用刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统进行NcoI敲除的示意图，其中，A为将编辑质粒pWT-J23119-Repeat-TNcoI-Repeat-HA导入刺糖多孢菌，对4个接合子进行菌落PCR验证结果；B为NcoI敲除菌株测序验证结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请所使用的引物及其编号和序列如表1所示：
表1本发明所使用的引物及其编号和序列
图1为刺糖多孢菌内源的Type I-B型CRISPR/Cas系统，如图1所示，刺糖多孢菌具有典型的Type I-B型的CRISPR-Cas系统，包含Cas1-Cas8的8个Cas蛋白，在Cas蛋白上下游各有一个CRISPR阵列，由若干“Repeat+Spacer+Repeat”单元组成，其中矩形方块代表Spacer，黑色菱形代表Repeat。基于刺糖多孢菌内源CRISPR(“Repeat+Spacer+Repeat”)的特征，保持Repeat序列不变，将Spacer序列替换为可靶向基因组目标基因的crRNA，同时保证目标序列的5′端有PAM序列，实现并利用刺糖多孢菌内源的Cas蛋白复合体对目标序列进行切割。
为了确定PAM序列，本申请进行如下实验：
步骤1、将刺糖多孢菌CRISPR阵列中的Spacer序列进行Blast，寻找对应的可能Protospacer(来自于噬菌体或外源质粒)，然后选取Protospacer 5′上游8个碱基进行比对，通过Weblogo(http://weblogo.threeplusone.com/)作图分析，推测其可能的PAM序列为“NCG/A”。
步骤2、通过质粒干扰实验来验证该菌内源CRISPR-Cas系统的活性及确定PAM序列，具体步骤如下：首先选择刺糖多孢菌CRISPR2阵列中最新被捕获的Spacer序列，记为“C2S1”。以AAC作为对照，分别以TCA、TCG、CCA、CCG为例，构建干扰质粒(含有PAM+C2S1)。具体步骤如下：1)用EcoRI和BglII双酶切pCM265质粒，得到线性化的载体；2)成对的引物AAC-C2S1-F/R、TCA-C2S1-F/R、TCG-C2S1-F/R、CCA-C2S1-F/R、CCG-C2S1-F/R混合均匀；3)在PCR仪上执行退火程序：95℃5min、16℃10min；4)退火后的引物对和线性化的载体通过Solution I连接(Takara DNA Ligation Kit)，得到含有不同PAM序列的干扰质粒。最后通过接合转移的方法将各个干扰质粒分别导入刺糖多孢菌；通过比较接合子生长的数量既可以验证刺糖多孢菌内源的CRISPR/Cas系统是否具有功能，也可以验证该系统工作所需要的PAM序列。
实验结果如图2所示，在同等实验条件下，空质粒对照组pCM265、非PAM序列的AAC阴性对照组均长出了大量接合子(～1500)，TCA组仅有几个接合子，TCG、CCA、CCG则均没有接合子长出。这些结果说明，刺糖多孢菌内源的CRISPR-Cas系统是具有活性的，并且TCA、TCG、CCA、CCG是其发挥功能所需的PAM序列。
为了有效的驱动miniCRISPR的转录，本发明选择了放线菌中常用的一个强启动子J23119来驱动miniCRISPR的转录。将miniCRISPR模块克隆至游离型质粒pWT297，得到靶向质粒pWT-J23119-Repeat-Target-Repeat。但不排除采用其它具有类似功能的启动子如kasOp等驱动miniCRISPR转录。
miniCRISPR模块编码的crRNA可以引导内源的Cascade复合体靶向自身基因组进行切割形成双链断裂。为精准修复双链断裂，通过PCR的方法获得切割位点上下游各约2.5kb的同源臂(HA，Homologous Arm)片段，将上下游同源臂克隆至上述靶向质粒，最终得到编辑质粒pWT-J23119-Repeat-Target-Repeat-HA。将编辑质粒通过接合转移导入刺糖多孢菌，可对目标基因进行识别、切割以及同源重组修复，实现对目标基因的精准编辑。
进一步地，本发明所采用的上下游同源臂长度分别约为2.5kb，分别位于目标基因的上下游，此外，可以根据需要，对同源臂长度、序列、位置等做简单的调整，实现目标基因的敲除、插入、单碱基突变等编辑结果。
为了便于更换靶向质粒pWT-J23119-Repeat-Target-Repeat中的Target序列。本申请还构建了helper质粒pWT-J23119-Repeat-2xBbsI-Repeat，通过II-S型限制内切酶BbsI切割线性化pWT-J23119-Repeat-2xBbsI-Repeat质粒，然后通过Golden Gate的方法，快速简捷的更换针对不同基因的Target序列。
实施例1利用内源CRISPR-Cas系统敲除spnR2基因
SpnR2是一种GntR家族的调控蛋白，可能对多杀菌素生物合成具有重要的影响。为研究其具体功能，采用本发明所述的基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法对spnR2基因进行敲除，具体实施方法如下：
步骤1、spnR2基因的核苷酸序列为TSpnR2“cggtcatgactcggtctcggacgcagacct”，其5’端PAM序列为“CCG”。设计并合成两条引物TSpnR2-F和TSpnR2-R。各取10μl于PCR管混合，随后置于PCR仪，运行退火程序：95℃5min，16℃10min。将两条单链PCR引物退火形成双链DNA片段，并且分别在5’端具有CAAC、GGAC的黏性末端。
步骤2、helper质粒pWT-J23119-Repeat-2xBbsI-Repeat用BbsI酶切，回收线性化之后的载体。将上述退火的DNA片段和线性化后的载体通过Solution I连接(Takara DNALigation Kit)，连接体系转化Top10感受态细胞，涂布于添加安普霉素(Apra)抗性的LB平板，过夜培养，挑选转化子扩大培养抽提质粒，并最终通过sanger测序鉴定，获得靶向spnR2基因的靶向质粒pWT-J23119-Repeat-TSpnR2-Repeat。
步骤3、用EcoRV酶切pWT-J23119-Repeat-TSpnR2-Repeat靶向质粒，回收线性化之后的载体。分别采用引物对SpnR-HU-F/R、SpnR-HD-F/R，以刺糖多孢菌基因组作为模板进行PCR扩增，分别得到用于敲除spnR2基因的上下游同源臂。将上下游同源臂和上述线性化之后的靶向质粒重组连接，最终获得针对spnR2的敲除质粒pWT-J23119-Repeat-TSpnR2-Repeat-HA。
步骤4、将敲除质粒pWT-J23119-Repeat-TSpnR2-Repeat-HA转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，随后通过接合转移将敲除质粒转化至刺糖多孢菌出发菌株NRRL 18395，在2cmc平板30℃培养8～10天(注：2cmc培养基配方：10g/L可溶性淀粉、2g/L胰蛋白胨、1g/L氯化钠、2g/L(NH4)2SO4、1g/L磷酸氢二钾、2g/L MgSO4·7H2O、2g/L Casamino acid、1ml微量元素溶液、2g/L CaCO3、20g/L琼脂，调节pH至7.2)(注：微量元素溶液(g/L)：1g/L七水合硫酸亚铁、1.55g/L四水合氯化锰、1.75g/L七水合水硫酸锌)。
步骤5、挑选接合子转划至新的含有Apra(安普霉素)及Nd(萘啶酮酸)双抗的2cmc平板，30℃培养2～3天。利用引物spnR-GF、spnR-GR对长出的接合子进行菌落PCR，以出发菌株NRRL 18395作为对照。通过扩增条带大小的变化初步判断spnR2的基因是否敲除成功。若spnR2被成功敲除(约260bp)，则PCR扩增出的条带长度要小于以出发菌株为模板PCR扩增的条带。
本发明随机挑选了10个接合子进行PCR验证，结果如图3显示，以spnR-GF/GR为引物对进行PCR时，Sas001对照菌株及10个接合子均可以扩增出目标条带，且接合子为模板扩增出的条带大小略小于出发菌株NRRL18395为模板扩增的条带。这表明验证的接合子均实现了对spnR2基因的敲除，敲除效率为100％。通过sanger测序对敲除结果进一步的进行了确认。
实施例2利用内源CRISPR-Cas系统敲除NcoI基因
刺糖多孢菌基因组内富含甲基化修饰限制系统(RM)，有研究显示RM系统是限制该菌遗传转化困难的重要原因，尤其是其中的NcoI RM系统。为提高该菌的遗传转化效率，本发明选择了NcoI RM系统中的限制性内切酶基因NcoI进行了敲除。
步骤1、NcoI基因目标序列为TNcoI“tccttgaagcagatgcggtcgagtggcttc”，其5’端PAM序列为“CCG”。设计并合成两条引物TNcoI-F和TNcoI-R，采用与实施例1相同的方法，构建了靶向NcoI的质粒pWT-J23119-Repeat-TNcoI-Repeat。随后利用EcoRV进行线性化。并通过引物NcoI-HU-F/R、NcoI-HD-F/R，以刺糖多孢菌基因组为模板通过PCR扩增获得敲除NcoI的上下游同源臂。随后将其同源臂克隆至靶向质粒，最终获得敲除NcoI的编辑质粒pWT-J23119-Repeat-TNcoI-Repeat-HA。
步骤2、采用与实施例1相同的方法，将编辑质粒pWT-J23119-Repeat-TNcoI-Repeat-HA通过接合转移导入刺糖多孢菌出发菌株NRRL 18395，最终获得4个接合子。
对4个接合子分别利用引物NcoI-GF、NcoI-GR进行PCR验证，结果如图4所示，其扩增条带小于NRRL 18395对照组。Sanger测序结果表明NcoI基因被敲除。这些结果显示，获得的4个接合子均为NcoI敲除的突变菌株，敲除效率为100％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统构建的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括Repeat序列和crRNA序列，所述Repeat序列位于所述crRNA序列的上游和下游，其中：
所述Repeat序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述crRNA序列为靶向刺糖多孢菌基因组内目标基因的序列，所述目标基因的上游包括PAM序列，所述PAM序列为TCA、TCG、CCA、CCG中的一种。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括提供修复模板的同源臂序列，所述同源臂序列包括第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂与所述目标基因在刺糖多孢菌基因组内的上游同源臂和下游同源臂相同。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求1-2任一项所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括启动子J23119。
5.权利要求3-4任一项所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括：
构建载体模板，所述载体模板包括Repeat序列和编码BbsI限制性内切酶的识别序列，所述Repeat序列位于所述识别序列的上游和下游；
利用II-S型限制内切酶BbsI对所述载体模板进行切割，通过Golden Gate方法，将所述crRNA序列与所述载体模板的切割产物连接，得到所述表达载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括：
以刺糖多孢菌基因组作为模板，扩增目标基因的上游同源臂和下游同源臂；
将所述上游同源臂和下游同源臂与所述表达载体连接，构建得到包括所述同源臂序列的表达载体。
7.权利要求3-4任一项所述的表达载体在刺糖多孢菌基因组编辑中的应用，所述基因编辑包括敲除刺糖多孢菌基因组中的目标基因。
8.一种刺糖多孢菌基因组编辑的方法，其特征在于，所述基因编辑包括敲除刺糖多孢菌基因组中的目标基因，包括：
将权利要求3-4任一项所述的表达载体导入刺糖多孢菌中，实现刺糖多孢菌基因组内目标基因的敲除。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述表达载体导入刺糖多孢菌中，具体包括如下步骤：
将所述表达载体转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，随后通过接合转移将表达载体转化至刺糖多孢菌中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将导入所述表达载体的刺糖多孢菌进行平板培养，挑选阳性转化子，得到敲除所述目标基因的刺糖多孢菌。
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