CN107083392B

CN107083392B - 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用

Info

Publication number: CN107083392B
Application number: CN201710442623.8A
Authority: CN
Inventors: 闫玫漪; 郭晓鹏; 孙义成; 金奇
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN107083392A

Abstract

本发明公布了一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用。该CRISPR/Cpf1系统包括携带优化FnCpf1基因的重组载体和pCR质粒，其中：所述优化FnCpf1基因的序列如SEQ ID No：1所示，其重组载体为含有重组酶gp60和gp61基因的大肠杆菌‑分枝杆菌穿梭载体；所述pCR质粒含有启动子驱动的直接重复序列‑间隔序列‑直接重复序列单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点。利用该CRISPR/Cpf1系统在分枝杆菌中进行CRISPR/Cpf1辅助的同源重组，能获得较高的重组效率，实现对分枝杆菌的基因编辑。

Description

一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用

技术领域

本发明涉及基因编辑系统，特别涉及一种用于分枝杆菌基因编辑的CRISPR/Cpf1系统。

背景技术

结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，导致全球每年有150万人死于该疾病。由于多耐药性结核分枝杆菌突变株的形成，结核病威胁正在逐步扩大。因此，在分枝杆菌中进行遗传操作，特别是构建基因敲除菌株和点突变菌株，对于了解分枝杆菌生长发育、分化、毒力相关基因的功能和耐药基因的机制，进而开发减毒疫苗和治疗药物，都具有重要意义。但是由于结核分枝杆菌生长缓慢(大约16-24小时复制一代)，致病性(需要在3级生物安全实验室进行操作)以及会出现高频率的异常重组现象，导致对结核分枝杆菌的研究一直受到限制。

分枝杆菌中进行基因操作的方法一般是利用同源重组产生等位替换。同源重组是细菌间水平基因转移的一种基本特征，即被转移的DNA片段不能独立复制，必须同受体染色体具有同样序列的DNA分子发生断裂、交换再重新连接的过程。由于分枝杆菌自身重组蛋白活性非常低，发生同源重组的概率非常低，常利用结核分枝杆菌噬菌体Che9c中的重组蛋白gp60和gp61来介导携带短同源臂(50-500bp)的AES线性双链DNA或单链DNA作为模板，靶向染色体互补序列，使其发生所需突变。该方法只需在分枝杆菌内表达噬菌体重组蛋白并且引入相应的等位交换底物(allelic exchange substrates,AESs)，就可构建染色体基因敲除、点突变、小片段插入等。但该方法仍需要利用抗性标签来筛选重组子。如果研究冗余基因的功能，则需要对多种基因进行无标签突变；而去除掉抗性标签则需要利用两步法或引入序列特异性重组酶切除抗性标签(抗性基因两边有同向的两个短的DNA序列可以被特定的重组酶识别)，切除后基因组上仍会留下一个短的能够被重组酶识别的DNA序列。这些都将使重组操作更为复杂且耗时更长，并且无法得到一个真正的无痕突变株。

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR-associated protein)系统，即成簇的规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白，广泛存在于细菌和古生菌基因组中，作为一种获得性免疫系统来有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件造成的干扰。

CRISPR防御的过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段，CRISPR系统会将一段与质粒或噬菌体上基因片段(原间隔序列，proto-spacers)同源的短片段DNA插入到前导序列与第一段重复序列之间，每一次插入活动都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复序列(Repeats)-间隔序列(Spacers)单元，这样使得CRISPR基因座中存在着此种质粒或噬菌体的序列信息，为适应性免疫奠定了结构基础。在表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段长链的CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，这一前体将会在重复序列处被剪切，而后被Cas内切酶加工成小crRNA。成熟的crRNA会与Cas蛋白结合形成Cas/crRNA效应复合体，在干扰阶段发挥作用。在干扰阶段，crRNA作为复合体的向导，协助其寻找与其同源的外源核酸靶标，当crRNA与原间隔序列互补配对完成时，Cas核酸酶会对DNA进行切割从而对靶标进行降解。在这3个阶段中，适应阶段又可称为信息处理阶段，此阶段的作用机制在不同的CRISPR系统中高度保守，主要作用蛋白为Cas1和Cas2蛋白；而表达和干扰阶段又被称为执行阶段。

根据执行阶段效应复合体构象的不同，可将CRISPR系统划分为两大类，Ⅰ类CRISPR系统在表达阶段是由多个cas基因编码所产生的Cascade复合体将长链crRNA前体加工成成熟的crRNA，并与之结合。结合有crRNA的Cascade复合体与Cas3蛋白共同作用于靶标DNA；而Ⅱ类CRISPR系统利用一个较大的单一组分Cas蛋白与crRNA结合来介导干扰。I类CRISPR系统中又包括I型和Ⅲ型两大亚型；Ⅱ类CRISPR系统中包括与以Cas9家族为效应蛋白的Ⅱ型，和最近新发现的Ⅴ型，CRISPR-Cpf1。

正是由于Ⅱ类CRISPR系统简洁的装置及易于设计的特异的DNA靶点，使其作为多功能基因编辑工具已广泛使用在不同生物体内。而在细菌中，当目的基因被Cas核酸酶剪切形成双链断裂后，主要发生高保真的同源重组修复HDR(homology directed repair)。在重组酶的作用下，单链寡核苷酸能够发生同源重组，但效率很低且在没有选择压的情况下很难筛选出突变体，因而没有实用价值；如果在单链寡核苷酸重组过程中，利用CRISPR-Cas系统，构建靶向crRNA引导Cas核酸酶对靶点进行剪切产生双链断裂，则可对未发生重组的进行淘汰，从而筛选出发生重组的突变体。基于此原理，已有研究证实了可利用CRISPR系统在大肠杆菌及乳酸杆菌中偶联λRed重组系统来进行基因编辑操作，且重组效率较高。但在一些细菌中，高表达Cas9蛋白对细菌本身有毒，其中就包括结核分枝杆菌。

虽然目前已实现将dcas9应用于结核分枝杆菌基因沉默中，但由于cas9蛋白有毒性，限制了其在分枝杆菌中功能的发挥。而Cpf1是最近研究发现的Ⅴ型核酸酶切酶，能够识别富含胸腺嘧啶核苷的PAM区(5’-YTN-3’)，并且形成的CRISPR-Cpf1复合物不需要tracrRNA的参与。

发明内容

针对传统同源重组系统在操作中存在的构建过程繁琐、耗时长，以及Cas9蛋白在分枝杆菌中有毒性等问题，本发明对CRISPR/Cpf1系统进行了优化，并将其与重组系统配合使用，应用于分枝杆菌的基因组编辑中，以更为方便快捷地在分枝杆菌中进行遗传操作，从而研究有关基因的功能和耐药机制。

本发明首先提供了一种用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统的优化的FnCpf1基因，其序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

本发明提供的FnCpf1基因编码FnCpf1蛋白，其基因序列参照分枝杆菌高GC含量及密码子偏好性的特点进行了优化。

本发明进一步提供了一种携带优化的FnCpf1基因的重组载体，该载体为含有重组酶gp60和gp61基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体，优化的FnCpf1基因在启动子的驱动下进行表达。

优选的，上述穿梭载体是在pJV53载体上插入了启动子驱动表达的优化的FnCpf1基因。

在本发明的实施例中，首先对FnCpf1基因序列参照分枝杆菌高GC及密码子偏好性的特点进行了优化，然后将其克隆到能够在耻垢分枝杆菌中复制的穿梭载体pJV53上，使FnCpf1在TetO启动子的调控下诱导表达，所制备的载体命名为pJV53-Cpf1。

本发明进而构建了一种双质粒的CRISPR/Cpf1系统，包括上述的携带优化的FnCpf1基因的重组载体和pCR质粒，所述pCR质粒(crRNA表达质粒)含有启动子驱动的直接重复序列(Direct Repeats)-间隔序列(Spacers)-直接重复序列(Direct Repeats)单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点，所述靶标序列连入位点可以是包含两个或更多个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点。

优选的，所述直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元的序列如序列表中SEQID No：2所示。其中所述直接重复序列长36bp，富含回文序列能够形成发卡结构。

本发明实施例中提供的pCR质粒在两个直接重复序列(Direct Repeats)之间含有靶标序列连入所需的BpmI和HindIII酶切位点，以便根据实际应用的需要，在此连入位点通过酶切连接方法连入靶标序列。

优选的，上述pCR质粒中由Hsp60启动子负责驱动直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元。

上述pCR质粒中还含有选择标记基因，所述选择标记基因可以是抗性基因。例如在本发明的实施例中构建了分别含有Hyg抗性基因和Zeocin抗性基因的pCR质粒pCR-Hyg和pCR-Zeo。

进一步的，上述pCR质粒还包含复制起点oriE及温度敏感性复制子pAL5000ts。

利用本发明的双质粒的CRISPR/Cpf1系统，可以在分枝杆菌中进行CRISPR/Cpf1辅助的同源重组，对分枝杆菌进行基因编辑。具体方法包括：将位于靶标基因中PAM序列3’端的靶标序列插入到pCR质粒的靶标序列连入位点中；制备针对靶标基因的等位交换底物；将插入靶标序列的pCR质粒和等位交换底物同时导入含有优化FnCpf1基因重组载体的分枝杆菌细胞中；筛选获得靶标基因被编辑的分枝杆菌克隆。

上述等位交换底物可以是单链DNA，也可以是线性双链DNA。

作为等位交换底物的单链DNA可以是针对靶标序列的靶向前导链的单链DNA寡核苷酸，也可以是针对靶标序列的靶向后随链的单链DNA寡核苷酸，并保证两边同源序列的长度至少达到25nt。

作为等位交换底物的线性双链DNA，其上下游具有同源臂片段。

将本发明构建的CRISPR/Cpf1辅助的同源重组系统应用于与结核分枝杆菌同属但生长速度较快的耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)中，无论是CRISPR/Cpf1辅助单链DNA寡核苷酸同源重组，还是CRISPR/Cpf1辅助双链DNA片段同源重组，都能实现所需突变。实验结果证明该系统能够在分枝杆菌中正常工作并显示较高的重组效率。

附图说明

图1.本发明CRISPR/Cpf1辅助的同源重组系统的载体结构示意图。

图2.FnCpf1在耻垢分枝杆菌中的功能分析结果，其中A显示了FnCpf1对耻垢分枝杆菌生长的影响(在Mc²155::pJV53-Cpf1中通过加ATc诱导FnCpf1的表达)；B显示了耻垢分枝杆菌中FnCpf1表达介导的质粒干扰实验结果。

图3.耻垢分枝杆菌中CRISPR/Cpf1辅助的单链寡核苷酸基因突变示例，显示了向表达重组酶和Cpf1的耻垢分枝杆菌电击转化表达crRNA质粒和寡核苷酸的转化效率和gfp的重组效率，其中，转化效率根据每次转化所长的菌落总数计算所得，而重组效率为GFP阴性克隆所占比例；实验中加入50ng/mL ATc诱导Cpf1的表达。

图4.CRISPR/Cpf1辅助的双链DNA重组实验示例，利用将近1kb的双链DNA片段转化到表达重组酶和Cpf1细胞中，删除gfp基因392bp，1000bp，或4000bp，其中替换实验用hyg抗性基因或Ms5635–5634来进行；转化效率根据每次转化所长的菌落总数计算所得，而重组效率为GFP阴性克隆所占比例。

图5.CRISPR/Cpf1辅助的重组系统对四组TA系统的连续删除实验，通过菌落PCR验证(A)Ms1277-1278，(B)Ms1283-1284，(C)Ms4447-4448，(D)Ms5635-5634删除效果，显示删除效率分别为62％，53％，45％和47％。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

首先对FnCpf1基因序列参照分枝杆菌高GC及密码子偏好性的特点进行了优化(优化后的序列见序列表中SEQ ID No：1)，并将其克隆到能够在耻垢分枝杆菌中复制的穿梭载体上，使FnCpf1在TetO启动子的调控下诱导表达。而后将质粒转入到耻垢分枝杆菌mc²155中，虽然FnCpf1属于外源蛋白，高浓度ATc诱导表达的Cpf1也并没有引起耻垢分枝杆菌的生长受限(见图2中A)。证明了Cpf1可应用于耻垢分枝杆菌。

为了进一步验证FnCpf1在耻垢分枝杆菌中的活性，即是否具有剪切功能，我们通过质粒干扰实验来进行验证。具体方法如下：首先构建了pCpf1-crRNA质粒，即将Cpf1和含有靶向gfp的crRNA或含有对照组的crRNA共表达于同一个质粒上，得到质粒pCpf1-gfp或pCpf1-Ctrl；而后选择将含有GFP基因的质粒pJV53-gfp或对照组pJV53质粒转入到含有pCpf1-gfp或pCpf1-Ctrl的耻垢分枝杆菌感受态细胞中，如果Cpf1能够在crRNA的引导下对GFP靶标基因进行剪切，则将大大降低pJV53-gfp转化子的个数，而不影响对照组pJV53转化数量的多少。实验结果如图2中B所示，在含有pCpf1-gfp的感受态细胞中转入pJV53-gfp长出的转化子数量大大降低，因而证实了Cpf1在耻垢分枝杆菌中是有活性的，且能够介导对靶标DNA的剪切。

上述实验证明了FnCpf1在耻垢分枝杆菌中具有活性。接下来将验证CRIPSR-Cpf1是否能够对同源重组系统有筛选作用。在进行重组实验过程中，如果将FnCpf1与crRNA作用元件构建到同一载体上，会降低转化效率。因而下面的实验将FnCpf1和crRNA作用元件分别构建到两个质粒上。将结合图例详细介绍CRISPR/Cpf1辅助的同源重组系统的构建及应用和实验结果。

1.双质粒系统的构建及优化

首先将FnCpf1进行密码子优化，而后将由P_myc1tetO启动的FnCpf1开放阅读框序列基因合成后通过SpeI酶切位点克隆到pJV53(含有重组酶gp60和gp61的穿梭质粒)上，得到pJV53-Cpf1，如图1中A所示。

为方便后续操作，在直接重复序列(Direct Repeats)-间隔序列(Spacers)-直接重复序列(Direct Repeats)单元的两个Direct Repeats(DR)中间加入BpmI和HindIII酶切位点，便于后续插入靶标序列。参见图1，crRNA作用元件的具体序列如下：

5’-GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAG↓ATTCCGTCTCCGGC

TAGTATTCGGCG

GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGAT-3’(SEQ ID No：2，其中带下划线部分是DR序列，

为BpmI识别位点，

为HindIII酶切位点，“↓”指示BpmI切割位点)

该序列基因合成后通过Pst I、Nhe I酶切位点连接到载体pSL003上，得到载体pSL003-crRNA。

以pSL001为模板，利用PCR方法将Hyg抗性基因进行扩增，所用引物如下：

正向引物pSL001-hyg primer F：5’-CTAGCTAGCTTATCACCAGCCCGTCATCG-3’(SEQID No：3)；

反向引物pSL001-hyg primer R：5’-GGACTAGTTGTTAGGTGGCGGTACTTGG-3’(SEQ IDNo：4)。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物经限制性内切酶Nhe I及Spe I酶切后与载体pSL003-crRNA连接获得pCR中间载体。

为了便于基因操作后对辅助质粒进行丢失，进一步以该pCR中间载体为模板，利用下列引物对hsp60启动子负责驱动的crRNA作用元件及hyg抗性基因进行扩增：

正向引物primer F:5’-TCGTCTCTCGACGCAACGTATGTTAGGTGGCGGTACTTGG-3’(SEQID No：5)；

反向引物primer R:5’-TGCCAATAGGATATCGGCATTCTAGACGGTGACCACAACG-3’(SEQID No：6)；

利用无缝拼接(seamless assembly)的方式与pSL001载体的oriE及温度敏感性复制子pAL5000ts连接得到最终的pCR-Hyg载体，如图1所示。

而后以pSL003为模板，利用PCR方法获得将Zeocin抗性基因进行扩增，所用引物如下：

正向引物pSL003zeocin primer F:5’-CGTACCCTGTGAATAGAGGTCCATAGGAATTCCGACCCGCAC-3’(SEQ ID No：7)；

反向引物pSL003zeocin primer R：5’-TGTTAGGTGGCGGTACTTGGACAAGTTTCGAGGTCGACCC-3’(SEQ ID No：8)。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。以pCR-Hyg为模板，利用PCR方法对除hyg抗性基因外的所有元件进行扩增，所用引物如下：

正向引物pCR-Hyg primer F:5’-CCAAGTACCGCCACCTAACA-3’(SEQ ID No：9)；

反向引物pCR-Hyg primer R:5’-GGACCTCTATTCACAGGGTACG-3’(SEQ ID No：10)。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。将上述两个PCR产物利用seamlessassembly的方式获得重组产物转化Trans1-t1大肠杆菌感受态，通过菌落PCR测序筛选阳性克隆，最终得到pCR-Zeo载体(见图1)。

针对需要突变的靶标基因，根据靶标基因内部的PAM序列(5’-YTN-3’，其中Y代表C或T，N代表A、C、T、G中的任一种)，选择位于PAM区3’端末尾的25bp作为靶标序列进行合成，将合成的两条单链进行退火后连接到经BpmI和HindIII酶切后的pCR载体(如图1中所示载体pCR-Hyg或pCR-Zeo)上即得到所需靶标质粒。综上所用的双质粒系统见图1。

2.等位交换底物的制备

分枝杆菌同源重组系统所需的等位交换底物可以是单链DNA，也可以是线性双链DNA。

单链DNA实验中，重组所用的寡核苷酸设计过程中需保证突变位点位于寡核苷酸的中间，并保证两边同源序列的长度至少达到25nt。已有文献表明靶向复制过程中的后随链的单链DNA重组效率更高，为了验证该理论在本发明中同样适用，设计单链DNA既有靶向前导链的也有靶向后随链的。而前导链后随链的确定可通过累计偏差图对基因组进行分析来确定。

线性双链DNA重组实验中，该方法不需要抗性基因的筛选，因而只需构建针对目的基因的同源臂即可。首先针对包含目的基因及上下游各500bp左右的片段设计引物，以基因组为模板进行扩增并克隆到pUC19中间载体上，而后以含有目的序列的中间载体作为模板进行反式PCR扩增，得到只含有同源臂序列的环状DNA片段，而后转化DH5α大肠杆菌感受态，通过菌落PCR测序筛选阳性克隆后，提质粒进行酶切获得线性双链同源臂片段。

3.Cpf1辅助的基因编辑实验流程

首先制备M.smegmatis::pJV53-Cpf1的感受态细胞。在进行单链DNA寡核苷酸重组时，加入约500ng的重组寡核苷酸或对照寡核苷酸和100ng的crRNA表达质粒到感受态细胞中，轻柔吹吸混匀后电击转化；当进行双链DNA基因删除实验时，加入约700ng的胶回收酶切产物或PCR产物和100ng的crRNA表达质粒到感受态细胞中轻柔吹吸混匀后电击转化。转化后的耻垢分枝杆菌需加入1mL的含有10ng/mL ATc的7H9培养基，转移至15mL离心管中于30℃摇床中震荡培养4h，而后涂在含有相应抗生素和50ng/mL ATc的7H10平板上，30℃培养四天。四天后，可通过菌落PCR和测序对重组子进行验证。正确的阳性克隆丢失辅助质粒的过程可在无抗性培养基中37℃过夜培养后再1:500稀释到无抗性培养基中继续37℃培养24h。最后梯度稀释到无抗性平板上筛选出无抗性的克隆。

4.耻垢分枝杆菌CRISPR/Cpf1辅助的同源重组系统示例验证

(1)CRISPR/Cpf1辅助的单链寡核苷酸基因突变实例

为了能够快速有效地检验CRISPR/Cpf1辅助的同源重组系统的功能，我们在耻垢分枝杆菌基因组上引入GFP报告基因。通过对gfp进行突变，观察突变后荧光信号的有无来鉴别突变体。

首先，在gfp开放阅读框内随机选择了两个不同的PAM序列(第79-81位的TTC和第211-213位的TTC)，确定PAM序列3’端末尾的25bp为靶标序列。两个靶标序列分别标记为gfp1和gfp2，如下所示：

gfp1：5’-TCCGTCTCCGGCGAGGGTGAGGGCG-3’(SEQ ID No：11)；

gfp2：5’-TCCCGCTACCCGGACCACATGAAGC-3’(SEQ ID No：12)。

合成靶标序列并退火连接到pCR-Hyg质粒中(位于两个DR之间)，得到了两个不同的质粒pCR-gfp1和pCR-gfp2。

为验证CRISPR/Cpf1对单链DNA寡核苷酸同源重组具有筛选作用，我们设计了针对PAM区及靶标序列进行突变、破坏gfp表达的单链DNA寡核苷酸，该寡核苷酸对PAM区和靶标序列的前三个碱基进行突变(使TTCTCC突变为TAATAA)，即在GFP报告基因的开放阅读框内连续突变5个碱基，连续引入了两个终止密码子，使gfp提前终止翻译，从而导致突变体丢失绿色荧光。实验过程中，针对这两个不同靶标序列分别设计了靶向前导链的单链DNA寡核苷酸和靶向后随链的单链DNA寡核苷酸来进行基因突变。如图3所示，图中gfp1、gfp2分别表示含有不同靶标序列的pCR质粒转录出的不同crRNA，gfp1.lead、gfp1.lag分别代表针对靶标序列gfp1引入突变的靶向前导链和靶向后随链的寡核苷酸，gfp2.lag代表针对靶标序列gfp2引入突变的靶向后随链的寡核苷酸。

从图3所示结果可以看出，向含有pJV53-Cpf1的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis::pJV53-Cpf1)感受态细胞中共转入对照组pCR-Ctrl及引入突变的单链DNA寡核苷酸，长出了约5×10⁴个转化子，其中突变体所占比率只有0.22％，结果表明在没有剪切的选择压力下，重组效率很低；而向含有pJV53-Cpf1的耻垢分枝杆菌感受态细胞单转入pCR-gfp1，只长出了121个转化子，说明Cpf1对靶标序列有剪切作用。另外，如果共转入pCR-gfp1及靶向后随链的单链DNA寡核苷酸gfp1.lag，长出了几千个转化子并且重组效率高达85％，但如果不对Cpf1进行诱导表达，则只有1.38％的突变体；而共转入pCpf1-gfp及靶向前导链的单链DNA寡核苷酸gfp1.lead时，突变效率只有13.8％。该结果也证实了单链寡核苷酸同源重组过程中，靶向后随链的单链DNA重组效率比靶向前导链的单链DNA重组效率高的理论。共转入pCR-gfp2及靶向后随链的单链DNA寡核苷酸gfp2.lag时，重组效率也高达69％，表明CRISPR-Cpf1对不同靶点进行的单链DNA寡核苷酸重组均具有筛选作用。对上述没有绿色荧光的GFP突变体利用菌落PCR及测序验证发现均为所需突变。因此，该部分结果表明将CRISPR-Cpf1系统与重组系统偶联使用，可在耻垢分枝杆菌中产生有效地单链DNA寡核苷酸重组。

(2)CRISPR/Cpf1辅助的双链DNA重组实例

接下来，我们致力于利用CRISPR/Cpf1重组系统介导无标签双链DNA模板在耻垢分枝杆菌中进行染色体基因敲除。同样，我们选择gfp1作为靶标序列，并针对该靶点构建出四组双链DNA片段，其中删除2-bp的同源臂片段只删除PAM区的TC两个碱基；而删除392-bp、1000-bp及4000-bp的同源臂片段在设计过程中要使所删除片段包含gfp1靶标序列，并保证靶标序列位于被删除片段的中部。具体双链DNA片段制备方法见等位交换底物制备部分。

将不同的双链DNA片段分别和pCR-gfp1质粒共转入到含有pJV53-Cpf1的感受态细胞中，四天后对菌落总数进行计数，并通过荧光信号统计突变体的个数，计算出重组效率。如图4所示，该方法可产生2-bp，392-bp，1000-bp，或4000-bp删除，并且在进行大片段删除时，突变效率也高达45％，且得到的突变体为无标签删除株。

与此同时，我们也利用CRISPR/Cpf1重组系统在耻垢分枝杆菌中进行基因替换，即将gfp的开放阅读框序列完全替换成hyg抗性基因。如图4所示，将通过构建质粒并酶切回收获得的双链DNA片段和pCR-gfp1质粒共转入到含有pJV53-Cpf1的感受态细胞中，长出了约500个转化子，重组效率为45％。接着我们又验证是否可以直接利用双链DNA PCR产物来进行基因操作。因此，我们对插入位点的原序列Ms5635-5634及其上下游各500bp进行扩增，将PCR产物与pCR-gfp1共转入到含有pJV53-Cpf1的感受态细胞中，验证该PCR产物能否进行同源重组回复突变，即将整合到Ms5635-5634位点的GFP报告基因去掉。结果表明，PCR产物同样可以进行同源重组。因而在后续的同源臂构建过程中省去了构建质粒并酶切回收的步骤，可直接通过PCR获得，简化了该方法的操作过程。

(3)CRISPR-Cpf1辅助的双链DNA重组系统进行连续删除实例

为了研究冗余基因的功能，突变多个基因可能是必要的。如四组TA系统，Ms1277-1278，Ms1283-1284，Ms4447-4448和Ms5635-5634都存在于耻垢分枝杆菌中。传统同源重组的方法需要每一步对抗性标签切除后再进行下一个基因的敲除。为了证明CRISPR-Cpf1辅助的同源重组系统能够方便快捷地进行连续敲除，我们应用不同抗性的pCR质粒(pCR-Hyg和pCR-Zeo),把Ms1277-1278，Ms1283-1284，Ms4447-4448和Ms5635-5634基因中随机选择的四组靶标序列分别克隆到pCR-Hyg和pCR-Zeo载体中。而后将针对Ms1277-1278进行框内删除(in frame deletion)的双链DNA片段和含有Ms1277-1278靶标序列的pCR-Hyg质粒共转入含有pJV53-Cpf1的感受态细胞中，四天后对长出来的克隆进行PCR验证。接着挑取测序正确的突变株单克隆继续制备感受态，并共转入针对Ms1283-1284进行框内删除(in framedeletion)的双链DNA片段和含有Ms1283-1284靶标序列的pCR-Zeo质粒，四天后继续筛选Ms1283-1284突变株。以此类推，利用不同抗性的pCR质粒交叉使用最终构建出了删除四组TA系统的突变株，对转化子进行PCR验证发现对四组TA系统的重组效率分别为62％，53％，45％和47％(如图5所示)。利用该方法在构建4种基因的读码框内删除过程中，省去了丢失辅助质粒的时间，仅需要大约五周左右，而之前的利用抗性基因筛选的重组方法则最少需要十周。因此，该结果表明我们的新型重组系统在耻垢分枝杆菌中进行多种基因无标签和无痕突变是具有时效性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用

<130> WX2017-90-001

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3903

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcgatct accaagagtt cgtgaataag tatagcctga gcaagacctt gcggttcgag 60

ttgatcccgc agggcaaaac cttggaaaac attaaggcgc gcgggctgat cctggatgat 120

gagaagcggg ccaaggacta taaaaaggcc aagcagatta tcgataaata tcatcagttc 180

ttcatcgagg aaatcctgtc gagcgtgtgc atcagcgaag acttgttgca gaactatagc 240

gacgtgtact tcaaattgaa aaagtcggac gacgacaatc tgcaaaaaga cttcaagtcg 300

gccaaagaca ccatcaagaa acagatttcg gagtacatca aggactcgga aaagttcaaa 360

aacctgttca accagaactt gatcgacgcg aaaaagggcc aggaaagcga tttgatcttg 420

tggctgaagc agtcgaagga taatggcatt gagttgttca aggccaactc ggacattacg 480

gacattgacg aggccctgga aatcattaaa tcgtttaagg gctggaccac gtacttcaag 540

ggcttccatg agaaccggaa aaacgtgtat tcgtcgaacg acattcccac gtcgatcatc 600

taccggatcg tcgatgacaa cttgcccaag ttcttggaaa ataaagcgaa atacgagagc 660

ttgaaggaca aagcgccgga ggccattaac tatgagcaga tcaagaagga cctggccgaa 720

gagctgacct ttgacattga ctacaagacc agcgaggtca atcagcgggt cttctcgttg 780

gatgaggtct ttgaaatcgc caatttcaac aactatttga accagagcgg catcaccaaa 840

tttaatacca ttatcggcgg gaagttcgtc aacggcgaga acacgaagcg gaaggggatc 900

aacgaataca tcaatctgta ctcgcagcag atcaacgaca agaccctgaa aaagtacaag 960

atgagcgtgc tgttcaagca aattctgagc gacaccgaga gcaagtcgtt cgtcattgac 1020

aagctggagg atgacagcga tgtggtcacc acgatgcagt cgttttacga gcaaatcgcg 1080

gccttcaaga ccgtggagga aaagagcatc aaggaaaccc tgagcctgct gttcgatgat 1140

ctgaaggcgc agaagttgga tctgtcgaaa atctacttca agaacgataa gtcgctgacc 1200

gacctgagcc aacaggtctt cgatgattac agcgtcatcg ggaccgccgt cctggagtac 1260

atcacccagc agattgcgcc caaaaacctg gacaatccct cgaaaaaaga gcaggagctg 1320

attgccaaga agaccgagaa ggcgaagtac ttgtcgctgg aaaccatcaa actggcgctg 1380

gaggagttca acaagcaccg cgacattgat aaacaatgcc ggttcgagga gattctggcc 1440

aattttgccg ccattcccat gatcttcgat gagatcgcgc agaataaaga caacctggcg 1500

caaatctcga tcaaatatca gaatcagggc aaaaaagacc tgttacaagc ctcggccgaa 1560

gacgacgtga aagccatcaa ggacctgttg gatcagacga acaacttgtt gcacaagctg 1620

aaaattttcc acatcagcca gagcgaggac aaggccaaca tcttggacaa agacgagcac 1680

ttctacttgg tgttcgaaga gtgctacttc gaattggcca acatcgtccc cctgtacaat 1740

aagattcgca attatattac gcagaagccc tatagcgacg agaaattcaa gttgaatttt 1800

gaaaattcga ccctggcgaa tggctgggac aagaacaaag agcccgacaa caccgccatc 1860

ttgttcatca aggatgataa atattatctg ggggtgatga acaaaaagaa taacaagatc 1920

tttgatgaca aggccatcaa ggagaataag ggcgaggggt acaagaaaat cgtctacaaa 1980

ctgttgcccg gcgccaacaa gatgttgccg aaggtcttct tcagcgcgaa gagcattaaa 2040

ttctataacc ccagcgagga catcctgcgc atccggaatc attcgaccca cacgaagaat 2100

ggcagcccgc aaaagggcta cgagaagttc gagtttaaca tcgaggattg tcggaaattc 2160

atcgacttct ataaacagtc gatcagcaag caccccgagt ggaaggattt cggcttccgc 2220

ttcagcgata cccaacgcta caacagcatc gacgagtttt atcgggaagt ggaaaaccag 2280

gggtacaagt tgaccttcga gaacatttcg gagtcgtaca ttgactcggt cgtcaaccaa 2340

gggaaactgt acctgttcca aatctacaat aaggacttca gcgcgtactc gaaagggcgg 2400

cccaacttgc acaccctgta ttggaaggcc ttgtttgacg agcggaactt acaagacgtc 2460

gtctataaac tgaacgggga ggcggagctg ttttaccgca agcagtcgat cccgaaaaag 2520

attacccacc cggcgaagga ggcgatcgcc aacaaaaaca aggacaaccc gaagaaagag 2580

tcggtcttcg aatacgatct gatcaaagac aagcgcttta ccgaggacaa gttctttttc 2640

cattgtccga tcaccatcaa ttttaagagc agcggcgcga acaagttcaa cgacgagatc 2700

aacctgctgt tgaaagaaaa ggccaatgat gtgcacatcc tgtcgatcga ccggggggaa 2760

cggcacctgg cctactacac cctggtggac ggcaagggca acatcatcaa gcaggatacc 2820

ttcaatatca ttgggaacga ccggatgaaa acgaactacc acgacaagct ggcggccatc 2880

gaaaaggatc gcgacagcgc ccgcaaggac tggaagaaga ttaacaatat caaggagatg 2940

aaggaggggt acttgagcca ggtcgtgcac gagatcgcca agctggtcat tgagtacaac 3000

gcgattgtgg tctttgaaga cctgaacttt ggcttcaaac gggggcggtt caaggtcgag 3060

aagcaggtgt atcagaagct ggaaaaaatg ttgatcgaga agctgaacta tctggtgttc 3120

aaagacaacg agtttgacaa aacggggggc gtcctgcggg cctaccagtt gaccgccccc 3180

ttcgaaacct tcaagaaaat gggcaagcag acgggcatca tctactacgt cccggcgggc 3240

tttacgagca agatctgtcc ggtgaccggc ttcgtcaacc agctgtatcc gaagtatgag 3300

agcgtgtcga aaagccagga gtttttctcg aagttcgata aaatctgtta taacctggat 3360

aaggggtact tcgaattttc gttcgattac aaaaacttcg gggacaaggc ggccaagggg 3420

aaatggacga tcgccagctt cggctcgcgc ctgattaact ttcgcaactc ggacaagaac 3480

cataactggg acacccggga agtgtacccg accaaagaat tggaaaaact gttgaaggac 3540

tatagcatcg agtacgggca cggggagtgc atcaaagccg ccatctgcgg ggaaagcgac 3600

aagaagtttt ttgcgaagct gaccagcgtg ctgaatacga tcttacaaat gcgtaattct 3660

aagaccggca ccgagctgga ctacctgatc tcgccggtgg cggatgtcaa cggcaacttc 3720

ttcgacagcc gccaggcccc gaagaacatg ccgcaggacg cggatgcgaa tggcgcgtac 3780

cacatcgggc tgaaagggct gatgctgctg gggcggatca agaacaacca ggaggggaag 3840

aagctgaatc tggtgattaa gaacgaggaa tatttcgagt tcgtccaaaa tcgcaacaat 3900

tga 3903

<210> 2

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtctaagaac tttaaataat ttctactgtt gtagattccg tctccggcct ccagtagtat 60

tcggcgaagc ttgtctaaga actttaaata atttctactg ttgtagat 108

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctagctagct tatcaccagc ccgtcatcg 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggactagttg ttaggtggcg gtacttgg 28

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgtctctcg acgcaacgta tgttaggtgg cggtacttgg 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgccaatagg atatcggcat tctagacggt gaccacaacg 40

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtaccctgt gaatagaggt ccataggaat tccgacccgc ac 42

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgttaggtgg cggtacttgg acaagtttcg aggtcgaccc 40

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccaagtaccg ccacctaaca 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggacctctat tcacagggta cg 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tccgtctccg gcgagggtga gggcg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcccgctacc cggaccacat gaagc 25

Claims

1.一种基于CRISPR/Cpf1系统及重组系统的用于分枝杆菌基因组编辑的双质粒系统，由携带优化的FnCpf1基因的重组载体和pCR质粒组成，其中，所述优化的FnCpf1基因的序列如序列表中SEQ ID No：1所示；所述重组载体为含有重组酶gp60和gp61基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体，所述优化的FnCpf1基因在启动子的驱动下进行表达；所述pCR质粒含有启动子驱动的直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点。

2.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述重组载体是在pJV53载体上插入了启动子驱动表达的所述优化的FnCpf1基因后的载体。

3.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述靶标序列连入位点是包含两个或更多个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点。

4.如权利要求3所述的双质粒系统，其特征在于，所述直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元的序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

5.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述pCR质粒中由Hsp60启动子负责驱动直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元。

6.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述pCR质粒上含有选择标记基因，并包含复制起点oriE及温度敏感性复制子pAL5000ts。

7.权利要求1所述的双质粒系统在分枝杆菌基因组编辑中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，通过在分枝杆菌中进行CRISPR/Cpf1辅助的同源重组操作实现基因组编辑，具体包括：将位于靶标基因中PAM序列3’端的靶标序列插入到pCR质粒的靶标序列连入位点中；制备针对靶标基因的等位交换底物；将插入靶标序列的pCR质粒和等位交换底物同时导入分枝杆菌细胞中，所述分枝杆菌细胞含有权利要求1中所述的携带优化的 FnCpf1基因的重组载体；筛选获得靶标基因被编辑的分枝杆菌克隆。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述等位交换底物是单链DNA或线性双链DNA。