CN111850025B - 一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法，利用CRISPR技术与NHEJ修复系统偶联，实现了对结核分枝杆菌基因的高效、快速的遗传操作。本发明的基因编辑系统通过高表达NHEJ元件和抑制RecA介导的同源重组来提升NHEJ修复效率，并使DNA双链断裂发生在菌体生长的稳定期，能够实现精确删除以及同时引入多重突变，并可用于构建突变库，为研究结核分枝杆菌提供了有效的技术手段。

Description

一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法

技术领域

本发明涉及基因编辑系统，特别涉及一种基于CRISPR/Cas系统的非同源末端连接技术对结核分枝杆菌进行基因编辑的系统和方法。

背景技术

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的结核病(TB)是威胁人类健康的重要传染病。世界卫生组织(WHO)2018年全球结核病报告显示2017年全球范围内估算有1000万结核病新发病例，约有157万例患者死亡；结核病仍然是全球十大死因之一，是高于艾滋病在内的单一传染病的头号杀手。与此同时，耐药结核病仍然是严重危害公共健康的疾病，2017年全球估算新发利福平耐药结核病(Resistant to Rifampicin,RP-TB)患者55.8万例(48.3-63.9万)，其中82％为耐多药结核病(Multidrug-Resistant TB,MDR-TB)。而在MDR-TB患者中，估算8.5％为广泛耐药结核病(Extensivelydrug-resistant TB,XDR-TB)。因此，了解结核分枝杆菌的耐药机制，寻找参与耐药的相关基因，进而开发抗结核病新药物对于提高耐多药/广泛耐药结核病的治疗效果显得尤为重要。目前，对于结核分枝杆菌基因的研究一直受限于缺乏有效的遗传操作技术来构建基因敲除突变株和点突变株。虽然现已有许多基因操作工具成功应用于分枝杆菌中，如自杀质粒、条件复制转运载体、分枝杆菌噬菌体转导、反向遗传选择标记及长片段线性DNA分子，但这些方法较容易使细菌生长受限且具有假阳性概率高、同源臂过长、自杀质粒构建过程繁琐及重组效率低等诸多缺点。如何实现对结核分枝杆菌基因组的快速高效基因编辑仍是一个很大的难题。因此，建立高效的结核分支杆菌遗传操作系统可为深入研究结核分枝杆菌基因的功能，进而了解结核分枝杆菌耐药相关机制提供可靠的技术支持，具有重要的研究意义。

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR-associated protein)系统，即成簇的规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白，广泛存在于细菌和古生菌基因组中，作为一种获得性免疫系统来有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件造成的干扰。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier以化脓链球菌出发，首次在体外证明了II型CRISPR系统的切割机制，也为后续的应用奠定了重要基础。正是由于CRISPR系统具有精确识别及特异性剪切DNA序列功能的特点而被开发成一种高效的基因编辑工具。它以成本低廉、操作简便、效率高及通用性广等优势，成为新一代具有代表性的基因编辑技术。在应用中，CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂(Double strandsbreak,DSB)。DSB是DNA损伤中最严重的一种形式，通常会启动同源重组(HR)或非同源末端连接修复(NHEJ)这两种修复途径。非同源末端连接是一种易于出错的修复机制，通常会在DNA断裂处引入插入或缺失，从而导致基因的敲除。同源重组则具有高保真性，能够按照模板对断裂处进行精确修饰。

在真核细胞中，DSBs形成后，CRISPR/Cas系统主要联合HR或NHEJ两条修复途径来完成基因编辑。与同源重组相比，NHEJ在不依赖DNA同源性的情况下将两个DNA的断裂端彼此连接在一起，从而快速地修复DSB，是最活跃的修复机制，而且效率高。

1.同源重组

原核生物的DSB修复主要依赖于同源重组。同源重组(HR)是细菌间基因水平转移的一种基本特征，即被转移的DNA片段不能独立复制，必须同受体染色体具有同样序列的DNA分子发生断裂、交换再重新连接的过程。细菌中的RecA系统是最为人们熟知的较早的同源重组酶系统，通过应用RecA介导同源重组，人们已经实现了很多形式的修饰。RecA蛋白是由recA基因编码的单亚基蛋白，分子量约为38KD，广泛存在于各类生物中，在多种生理过程中起着重要的作用。在催化同源染色体进行链交换的过程中，RecA蛋白非特异性结合单链DNA，形成RecA纤维聚合体，特异性搜寻同源序列并配对，因此当recA基因突变后同源重组便停止等。

RecX是一个调节蛋白，发现于许多细菌中，一般认为RecX能够直接下调RecA蛋白活性。在大肠杆菌当中，recX基因在recA基因的下游。recX和recA基因组成一个操纵子，共同转录。作为RecA的调节蛋白RecX蛋白能够直接与RecA结合，阻断其与单链DNA的结合，从而破坏链交换的起始与延长或促进RecA纤维聚合体的分解。

2.非同源末端连接

原核生物的DSB修复一直被认为只依赖于HR，直到生物信息学研究表明，许多具有明显分类学多样性的细菌和古细菌具有典型的与真核生物Ku70和Ku80的中心区域同源的Ku基因，并且该Ku基因与包含推测的DNA连接酶的基因位于同一操纵子内，这才阐明了NHEJ通路在细菌中的存在。和真核生物一样，细菌的NHEJ也依赖于Ku和DNA连接酶(LigD)，不同的是，几乎所有真核生物细胞中都有Ku和LigIV(LigD)蛋白的表达，而目前只发现一小部分细菌的基因组编码Ku和LigD，主要包括分枝杆菌属Mycobacterium、假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus和土壤杆菌属Agrobacterium。其中，NHEJ研究最广泛深入的细菌是分枝杆菌。NHEJ修复通路的一个简单的模型是：Ku识别并结合在断裂的双链末端，防止核酸酶的降解，从而增加DNA的半衰期，随之招募LigD，在Ku的促进作用下，LigD对末端进行修饰和连接。

3.同源重组与非同源末端连接的关系

原核生物的DSB修复主要依赖于HR。因而对于HR与NHEJ两种修复途径之间关系的研究还较少。但普遍的观点也认为HR与NHEJ存在着一种协同又竞争的关系。协同作用体现在HR和NHEJ在修复不同类型的染色体DNA损伤各自发挥着重要作用。Glikman等人发现recA依赖的修复过程参与到抗紫外线诱导的DNA损伤，而NHEJ在分枝杆菌中并不参与此过程；对于电离辐射产生的DSB，NHEJ的缺乏对指数期或稳定期早期细胞的敏感性没有影响，但对在7H9中培养的处于稳定期后期的细菌抵抗电离辐射是必需的，而对生长在LB培养基中的细菌却没有影响。此外，丝裂霉素C引起的DNA双链断裂损伤主要依靠recA依赖的同源重组进行修复；而具有不相容的DNA末端只有NHEJ能够对其进行修复。在利用I-SceI核酸内切酶诱导的DNA双链断裂修复过程中，当删除recA后，会导致NHEJ修复能力大幅度提高；同时删除recA和kuC导致细胞死亡率增高，这表明了同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)介导的DSB修复之间存在着动态的竞争关系，但具体机制仍然是未解之谜。

目前，已有研究将CRISPR-Cas系统联合NHEJ运用于原核生物的遗传操作中。2017年，Zheng等人在大肠杆菌中利用质粒高表达异源Ku和LigD蛋白，实现了对CRISPR-Cas9系统引入的DSBs的修复并伴随着核苷酸切除，从而达到了基因敲除的目的。此外，D.Nayak等人也将CRISPR-Cas介导的基因编辑系统运用到了慢生长的古菌乙酸甲烷八叠球菌中，实现了高效的大片段删除，丰富了古菌的遗传操作系统。由于分支杆菌本身就具有NHEJ修复系统，是否可以将CRISPR-Cas系统与NHEJ联合运用到结核分枝杆菌中，实现快速高效地进行基因敲除？

发明内容

针对传统同源重组系统在操作中存在的构建过程繁琐、耗时长，且需要模板，并对感受态转化效率有较高的要求等问题，本发明利用CRISPR技术与NHEJ修复系统偶联，实现对结核分枝杆菌基因的高效、快速的遗传操作。

本发明包括以下三个方面：1)高表达NHEJ元件增加NHEJ修复效率；2)抑制RecA介导的HR，进而增加NHEJ修复效率；3)通过诱导启动表达使CRISPR-Cas介导的DSB断裂发生在菌体生长的稳定期。为实现高效的CRISPR-Cas介导的NHEJ进行基因组编辑，本发明对该系统进行了优化，实现了精确删除以及同时引入多重突变，从而为研究有关基因的功能和耐药机制提供有效的技术手段。

在本发明的第一方面，提供了一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统，这是一种双质粒的CRISPR-Cas辅助的NHEJ编辑系统，包括CRISPR系统表达质粒和NHEJ元件表达质粒，其中，所述CRISPR系统表达质粒包含sgRNA作用元件和cas基因，所述NHEJ元件表达质粒包含NHEJ元件基因以及降低recA依赖的同源重组的基因元件recX或recA_mtbR61C。

所述CRISPR系统表达质粒可以是用于构建突变株的复制性穿梭载体，也可以是应用于突变库高通量筛选的整合载体。所述穿梭载体含有分枝杆菌复制起点oriM。

优选的，上述cas基因为cas9基因，更优选为来源于嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的cas9_sth1基因。

进一步的，所述CRISPR系统表达质粒上的cas基因和sgRNA作用元件均由诱导型启动子驱动表达，例如在PtetO启动子的调控下诱导表达。

为了降低Cas蛋白的泄露表达量，在所述cas基因的终止密码子前加入ssrA降解标签。优选的，ssrA序列参照分枝杆菌高GC含量及密码子偏好性的特点进行了优化，序列如下：

5’-GCCGCCGACTCGCACCAGCGCGACTACGCCCTGGCCGCC-3’(SEQ ID No：21)

在本发明实施例构建的一个表达CRISPR系统的复制性穿梭质粒pYC1640上，其中sgRNA作用元件的序列如序列表中SEQ ID No：19所示，包含优化的PtetO诱导型启动子，以及sgRNA的骨架结构(sgRNA scaffold)和BbsI酶切位点。

为了更有效地实现基因的精准删除，所述CRISPR系统表达质粒包含成对的sgRNA作用元件，即两个相连的sgRNA作用元件序列，可以接入两个不同的sgRNA靶标序列，如序列表中SEQ ID No：20所示。

在本发明实施例中构建的CRISPR系统表达质粒载体还含有博来霉素(Zeocin)抗性基因。

优选的，上述NHEJ元件表达质粒含有来自于海分枝杆菌的NHEJ元件，包括kuC、nrgA和ligD三个基因；同时还含有降低recA依赖的同源重组的基因元件recX或recA_mtbR61C。

在本发明的实施例中，在NHEJ元件表达质粒上，recX由组成型启动子如Pmyc驱动表达，而recA_mtbR61C由其自身启动子驱动表达。含有recX的载体载体命名为pNHEJ-recX_mtb，而含有recA_mtbR61C的载体命名为pNHEJ-recA_mu。

进一步的，所述NHEJ元件表达质粒还包含复制起点oriE、不稳定复制子pMF1以及sacB反向筛选标记。

在本发明的另一方面，基于上述基因编辑系统提供了一种对结核分枝杆菌进行基因编辑的方法，包括以下步骤：

1)将针对目标基因片段的sgRNA靶标序列连接到所述CRISPR系统表达质粒上的sgRNA作用元件中，得到含有靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒；

2)用所述NHEJ元件表达质粒转化结核分枝杆菌，并将转化子制备成感受态细胞；

3)用步骤1)制备的含有靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒转化步骤2)制备的感受态细胞，对得到的转化子进行验证，得到目标基因片段被编辑的转化子。

上述步骤3)优选采用电击转化的方法，向高表达NHEJ元件和RecX(或RecA_mu)的结核分枝杆菌感受态细胞电击转化含有靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒。

在本发明的一个实施例中，所述CRISPR系统表达质粒为穿梭载体，在步骤1)中将针对目标基因片段的一个靶标序列连接到该质粒中，再经过步骤2)和3)获得目标基因片段被编辑的结核分枝杆菌。

在本发明的另一写实施例中，所述CRISPR系统表达质粒为穿梭载体，在步骤1)中将两个不同的靶标序列连接到成对的sgRNA作用元件中，得到含有两个靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒，再经过步骤2)和3)获得大片段删除的结核分枝杆菌或者双重突变的结核分枝杆菌。

在本发明的又一实施例中，所述CRISPR系统表达质粒为整合载体，在步骤1)构建含有不同靶标序列sgRNA的多个CRISPR系统表达质粒，在步骤3)将这些将CRISPR系统表达质粒混合转化含有所述NHEJ元件表达质粒的结核分枝杆菌感受态细胞，构建结核分枝杆菌突变库。

综上所述，本发明利用CRISPR-Cas系统与NHEJ联用，实现了一步法在结核分枝杆菌中进行基因敲除的应用，将原有传统方法构建结核分枝杆菌突变株的时间从半年缩短到了3个月，同时由于可以高效引入双重突变，使构建多重突变成为可能，且能够在半年内完成。此外，在进一步的运用中，可以利用该技术构建突变子库进行耐药基因的筛选与研究，为结核分枝杆菌耐药相关的研究提供了可靠的技术支持。

附图说明

图1.本发明所构建的载体结构示意图，其中：A为NHEJ表达载体pNHEJ-recX_mtb，B为NHEJ表达载体pNHEJ-recA_mu，C为表达Cas9_sth1和sgRNA的复制性穿梭质粒pYC1640(用于构建敲除株)，D为表达Cas9_sth1和sgRNA的整合性质粒pYC1446(用于突变库的构建及筛选)。

图2.实施例1中将Cas9蛋白在结核分枝杆菌中提前表达，再转入表达sgRNA的质粒的转化效率统计结果，显示Cas9蛋白提前表达不能促使NHEJ的发生。

图3.实施例1中向高表达NHEJ元件和RecX(或RecA_mu)的结核分枝杆菌H37Ra电击转化含有靶向序列sgRNA的质粒的转化效率以及NHEJ效率的统计结果，其中，转化效率根据每次转化所长的菌落总数计算所得，而NHEJ效率为PCR确定出的突变株占总PCR个数的比例。

图4.结核分枝杆菌中CRISPR-Cas9_sth1辅助的非同源末端连接介导的突变结果统计，其中黑色加粗部分代表sgRNA序列，大写加下划线序列表示PAM序列，(a)为高表达RecA促使NHEJ介导的突变，(b)为高表达RecX促使NHEJ介导的突变。

图5.实施例2中通过成对PAM确定出四种不同方向的Cas9sth1-sgRNA示意图，每组中C/C、C/W、W/W、W/C方向是由成对PAM在沃森链(W)或克里克链(C)上的位置决定。

图6.实施例2中用四种不同方向的Cas9sth1-sgRNA介导的同一基因内NHEJ突变分析结果，其中：A显示了利用四种不同方向的成对Cas9sth1-sgRNA介导的NHEJ进行基因删除的菌存活率和NHEJ效率，存活率为实验组所长菌落占对照组所长菌落的比例，NHEJ效率为PCR鉴定出发生突变的菌落占PCR总菌落数的比例；B显示了对四种不同方向发生NHEJ的具体结果分析，AcDel代表精确删除，Del代表删除，ReDel代表各个sgRNA处分别发生缺失突变，InDel代表发生删除的同时又发生插入，频率计算为各种突变事件占总突变数的比例。

图7.实施例2中四种不同方向的Cas9sth1-sgRNA介导的NHEJ对RD1区域的突变分析，其中：A显示了在不同基因上利用成对PAM确定出四种不同方向的Cas9sth1-sgRNA示意图；B显示了利用四种不同方向的成对Cas9sth1-sgRNA介导的NHEJ对RD1进行基因删除的菌存活率和NHEJ效率，存活率为实验组所长菌落占对照组所长菌落的比例，NHEJ效率为PCR鉴定出发生突变的菌落占PCR总菌落数的比例；C显示了对四种不同方向发生NHEJ的具体结果分析，AcDel代表精确删除，SiDel代表只有一个sgRNA处发生突变，ReDel代表各个sgRNA处分别发生缺失突变，Del代表大片段非精准删除，频率计算为各种突变事件占总突变数的比例。

图8.实施例4构建的H37Ra突变库结果统计，显示了针对约300个克隆进行PCR确认出的各组sgRNA的个数以及每组sgRNA对应的转化子中野生型和突变株的统计结果。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例详细介绍本发明基因编辑系统的具体构建过程，并通过实施例进一步阐述本发明基因编辑系统的使用方法和实验结果。

以下实验中，运用了来自于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9，命名为Cas9_sth1。我们构建了表达Cas9_sth1和sgRNA的复制性穿梭质粒pYC1640和整合质粒pYC1446。复制性穿梭质粒pYC1640和整合质粒pYC1446都是对pLJR965(参见Programmabletranscriptional repression in mycobacteria using an orthogonal CRISPRinterference platform[J].Nat Microbiol,2017,2:16274.)进行了优化以及改造得到的，Cas9_sth1和sgRNA均在TetO启动子的调控下诱导表达。

以下实验中运用的NHEJ元件包含kuC、nrgA、ligD三个基因，来自于海分枝杆菌。所构建的表达NHEJ元件的质粒还同时含有降低recA依赖的同源重组的基因元件recX或recA_mtbR61C，命名为pNHEJ-recX_mtb或pNHEJ-recA_mu，其中pNHEJ-recX_mtb上的recX在Pmyc组成型启动子下进行表达，pNHEJ-recA_mu上的recA_mtbR61C是在其自身启动子的驱动下进行表达。

一、质粒系统的构建及优化

1、双质粒系统的构建

首先以海分枝杆菌基因组为模板，利用PCR的方法对参与非同源末端连接的kuC，nrgA，ligD三个基因进行扩增，所用引物如下：

NHEJ frag1 F：5’-tggcgcggccgcggtacccaagaagcacagtgagtcg-3’(SEQ ID No：1)；

NHEJ frag1 R：5’-gttactacaccggcatcgccgaggtgatgatcccgcata-3’(SEQ ID No：2)；

NHEJ frag2 F：5’-ggcgatgccggtgtagtaaccgaagacgtcagacttggtg-3’(SEQ IDNo：3)；

NHEJ frag2 R：5’-cccccgacgtcaggtggacgaggtattgctggaatgg-3’(SEQ ID No：4)。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物通过无缝连接(seamlessassembly)的方式与pJV53(含有重组酶gp60和gp61的穿梭质粒)经NheI/KpnI酶切的线性载体连接得到pNHEJ。

而后将结核分枝杆菌的recX基因与组成型启动子Pmyc合成后通过HindIII和SalI酶切位点连接到pNHEJ，得到pNHEJ-recX_mtb，如图1中A所示；另外，将含有自身启动子的recA_mtbR61C基因合成后通过无缝连接(seamless assembly)的方式连接到pNHEJ，得到pNHEJ-recA_mu，如图1中B所示。

为了方便质粒丢失，以sacB基因作为反向筛选标记。我们以pAC-crRNA(参见CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria.Appl EnvironMicrobiol.2017Aug 17；83(17).)为模板，利用如下引物对sacB进行PCR扩增：

sacB F：5’-acgaggcagacctcaccatcacatatacctgccgt-3’(SEQ ID No：5)

sacB R：5’-ctgacgctcatggaacacactgcttccggtagtca-3’(SEQ ID No：6)

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物通过无缝连接(seamlessassembly)的方式克隆到pNHEJ-recX_mtb以及pNHEJ-recA_mu。

已有研究将CRISPR干扰技术(CRISPRi)成功运用于结核分枝杆菌，其中pLJR965即为表达有dcas9_sth1和sgRNA的质粒。首先，我们利用反式PCR的方法使dCas9_sth1的第9位丙氨酸以及第599位丙氨酸分别回复突变为天冬氨酸和组氨酸(A9D，A599H)，最终获得具有剪切酶活性的cas9_sth1，命名该质粒为pYC1286。

具体过程：首先以pLJR965为模板，利用如下引物对Cas9_sth1的1-327位氨基酸的编码序列进行扩增：

primer F for JR965：5’-ggggtaccgtctgacgctcatggaacaa-3’(SEQ ID No：7)

primer R for JR965：5’-gctctagaagcagcttggcgatgtactt-3’(SEQ ID No：8)

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物通过KpnI和XbaI酶切位点连接到pUC19上，然后通过反式PCR将第9位丙氨酸突变成天冬氨酸，PCR引物如下：

primer F for mut965：5’-tgggcctggatatcggcatcggctcggtgggcgt-3’(SEQ IDNo：9)

primer R for mut965：5’-gccgatatccaggcccagcaccaggtccgacatatcga-3’(SEQID No：10)

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后DpnI处理半小时后PCR回收，回收产物直接转化到DH5α后对长出的克隆进行测序验证。最后抽提点突变成功的质粒通过NdeI和NcoI酶切位点再连接到pLJR965载体上，得到质粒pYC1250；同样，利用如下引物对Cas9_sth1的282-712位氨基酸的编码序列进行扩增：

primer F for pYC1250：5’-ggggtaccacgacctgaacaacctgacc-3’(SEQ ID No：11)

primer R for pYC1250：5’-cccaagcttcgacaccttggtgtcgatct-3’(SEQ ID No：12)

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物通过KpnI和HindIII酶切位点连接到pUC19上，然后通过反式PCR将第599位丙氨酸突变成组氨酸，PCR引物如下：

primer F for mutA599H：5’-gtggaccacatcctgccgctgtcgatcaccttcga-3’(SEQID No：13)

primer R for mutA599H：5’-caggatgtggtccacctcgaactggttcgagttgttga-3’(SEQ ID No：14)

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后DpnI处理半小时后PCR回收，回收产物直接转化到DH5α后对长出的克隆进行测序验证。最后抽提点突变成功的质粒通过SbfI和NcoI酶切连接到pYC1250，最终得到质粒pYC1286。

sgRNA作用元件序列如下：

其中实线下划线部分是经优化后的PtetO诱导型启动子，虚线下划线部分是sgRNA的骨架结构(sgRNA scaffold)，下有着重号的部分是BbsI酶切位点。

该sgRNA作用元件序列基因合成后通过BamHI、Nhe I酶切位点连接到载体pSL003(参见Development and application of homologous recombination knockout systemin Mycobacterium tuberculosis][J].Wei Sheng Wu Xue Bao,2012,52(9):1151-1159.)上，随后对该质粒进行NotI和MluI酶切并通过无缝连接(seamless assembly)的方式将原有oriM替换为来源于pBp4质粒载体(参见A new single-copy mycobacterial plasmid,pMF1,from Mycobacterium fortuitum which is compatible with the pAL5000replicon[J].Microbiology,2000,146(2):297-303.)不稳定的oriM，得到中间质粒psgRNA。引物如下：

primer F for pBp4：5’-gaacgaccgagcgcaagggagccggatgggtagttg-3’(SEQ IDNo：15)

primer R for pBp4：5’-aagatctggtaccgcctccgtggcgtaatcgtcgc-3’(SEQ IDNo：16)

随后利用基因合成的方式合成经密码子优化去除常用酶切位点的P_teto+Cas9_sth1，并通过SpeI酶切位点连接到psgRNA，最终得到表达Cas9_sth1和sgRNA的质粒pYC1640，如图1中C所示。

而在进行文库筛选时，表达Cas9_sth1和sgRNA的质粒需要为整合质粒。因此，我们以上述pSL003为模板，利用引物pirmer F for Zeo和primer R for Zeo对博来霉素(Zeocin)抗性基因进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物通过无缝连接(seamless assembly)的方式克隆到pYC1286，得到质粒pYC1446，如图1中D所示。

pirmer F for Zeo：5’-ttcccgccagctagcctctgccagtgttacaacca-3’(SEQ ID No：17)

primer R for Zeo：5’-gcctttcgtttattgatacaagtttcgaggtcgac-3’(SEQ ID No：18)

针对需要突变的靶标基因，根据靶标基因内部的PAM序列，选择位于PAM区5’端的至少20-bp作为靶标序列进行合成，合成序列如下：

其中

表示sgRNA靶标序列，

表示其反向互补序列，下有着重号的N尽量保证是G或者A。

将合成的两条单链进行退火后连接到经BbsI酶切后的pYC1640载体或经BsmBI酶切后的pYC1446载体上即得到所需靶标质粒。

2、成对sgRNA设计

成对sgRNA的设计即为将两个sgRNA作用元件序列相连，模板如下：

其中实线下划线部分是经优化后的PtetO诱导型启动子，虚线下划线部分是sgRNA的骨架结构，下有着重号的部分是两个不同的sgRNA靶标序列，可依据实际需求直接替换。

该序列基因合成后连接到经BamHI、Nhe I酶切的载体pYC1640上，使载体上原有的sgRNA作用元件序列替换为上述SEQ ID No：20，即可转化到结核分枝杆菌中实现精准删除。

在利用成对sgRNA进行双重突变时，为了降低Cas9的泄露表达量，我们在cas9_sth1基因的终止密码子前通过重组的方式加入了ssrA降解标签。ssrA序列参照分枝杆菌高GC含量及密码子偏好性的特点进行了优化，序列如下：

5’-GCCGCCGACTCGCACCAGCGCGACTACGCCCTGGCCGCC-3’(SEQ ID No：21)

二、结核分枝杆菌中CRISPR-Cas系统辅助的非同源末端连接技术实验流程

结核分枝杆菌H37Ra和H37Rv操作一样，H37Rv需要在P3实验室进行。以下以H37Ra菌株为例，详细介绍实验流程。

1制备H37Ra::pNHEJ-recX或H37Ra::pNHEJ-recA_mu的感受态细胞

首先需要将pNHEJ-recX或pNHEJ-recA_mu转化到野生型感受态细胞，约14天后长出单克隆；

挑取新鲜的含有pNHEJ-recX或pNHEJ-recA_mu质粒的单菌落接种于10mL的7H9+OADC培养基(含有Km)中，37℃静置培养直到长到饱和(约10-15天)；

取适量饱和菌液转接到含有100mL 7H9+OADC+Km的滚瓶(roller bottle)中，初始OD₆₀₀0.02左右；

37℃继续滚动培养约5天左右，OD₆₀₀约为0.6-0.8左右，加入10mL的15％甘氨酸后继续培养24h；

收集菌体：100mL的菌液以3700×g、10分钟、25℃的条件离心，丢弃上清。用100mL事先温浴加热的10％甘油水(新鲜制备，最好不要高压，用滤膜滤)洗。第一次洗的时候，先加2mL 10％甘油水用1mL枪头上下轻轻吹打重悬细菌，不要漩涡震荡，然后再加更多的10％甘油水至25mL，离心；

丢弃上清，加少于2mL的10％甘油水重悬，三次清洗所用的10％甘油水的体积依次减为原培养体积的1/2、1/4、1/8，最后一般100mL的菌液用2mL的10％甘油水重悬；吹匀菌体后，每只200μL分装放-80℃冰箱备用。

注意：结核分枝杆菌的感受态最好制备完成后转化对照质粒验证其转化效率。如果制备过程中有菌体聚集现象，可在10％甘油水中加入0.05％的吐温80。

2感受态细胞的电击转化

加入300ng-500ng的sgRNA表达质粒(pYC1640衍生质粒)到感受态细胞中，室温进行电击，电击参数是：电压2.5kV，电容25μF，电阻1000Ω。转化后立即加入1mL 7H9+OADC的培养基，转移至15mL离心管置于滚瓶中37℃滚动培养48h，而后继续加入约2mL的K+Zeo抗性培养基液体筛选，2天后使细菌在液体培养的条件模拟稳定期状态，促进NHEJ修复途径的发生，涂在含有相应抗生素和50ng/mL ATc的7H10+OADC的平板上，37℃培养21-28天。约一个月后，观察并计数实验组以及对照组长出的克隆数。一般情况下，含有靶标序列的实验组长出的菌落数约为对照组的二十分之一；随后通过菌落PCR和测序对转化子进行验证。

3突变株鉴定

随机挑选克隆划线于无抗固体培养基上，将平板置于37℃培养(方便丢sgRNA辅助质粒)，再从上面挑选克隆至20μL无菌水中，漩涡混合，85℃30分钟裂解细菌。25μL PCR反应体系取1μL用作PCR反应的模板，用相应的正向引物和反向引物鉴定突变株。由于结核分枝杆菌基因组高GC，PCR反应体系中可以加入5％的DMSO以及0.5μL的10％甘油水，反应程序如下：

96℃预变性2分钟；

96℃变性10秒；

58℃退火30秒；

72℃延伸(根据片段大小确定延伸时间)30个循环；

72℃后延伸5分钟。

PCR对照为野生型菌株，而后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测并利用成像分析系统观察结果，并送测序验证。选取丢失片段大小合适的阳性克隆丢失辅助质粒的过程：

挑取单克隆接种到3mL 7H9+OADC+Kan(此时Kan的终浓度用5μg/mL)中待菌液长到饱和后，1:100转接到3mL的7H9+OADC无抗培养基继续培养5天，随后梯度稀释涂板到含有2％的蔗糖7H10平板上，长出克隆后依次划Km平板、Zeocin平板以及无抗性平板，确认是否丢失抗性。

实施例1.CRISPR-Cas系统辅助的NHEJ技术运用于结核分枝杆菌

鉴于CRISPR-Cas系统辅助的NHEJ技术在真核生物以及大肠杆菌中的应用均是先将CRISPR系统转入到细胞内，使胞内积累一定量的Cas9蛋白以便更好发生基因编辑。于是我们在结核分枝杆菌中同样利用双质粒系统进行。以下实施例均是在H37Ra减毒株中进行验证。

首先在第一个质粒上表达Cas9、NHEJ相关元件以及抑制recA的元件，即pNHEJ-Cas9_sth1-recX_mtb以及pNHEJ-Cas9_sth1-recA_mu；而后将含有pNHEJ-Cas9_sth1-recX_mtb或pNHEJ-Cas9_sth1-recA_mu质粒的细胞制备成感受态。我们随机选取非必需基因Ra3448为靶标基因，并在其开放阅读框内选择了PAM序列，确定PAM序列5’端的21bp为靶标序列。合成靶标序列并退火连接到psgRNA质粒中，得到质粒psgRNA-Ra3448。随后将psgRNA-Ra3448质粒转入到含pNHEJ-Cas9_sth1以及pNHEJ-Cas9_sth1-recX_mtb的感受态细胞中，富集2天后分别涂板到K+Zeo的7H10+OADC平板以及K+Zeo+50ng/mL ATc的7H10+OADC平板。21-28天后待平板上长出形态清晰可见的克隆后对平板上的菌落进行计数并计算出转化效率。如图2所示，转入含有靶向序列Ra3448的sgRNA质粒后，+/-ATc诱导Cas9_sth1的表达没有显著差异，长出的转化子均只有对照组的1％。随后对平板上的克隆进行PCR验证发现均没有突变产生。由图2可知，即使诱导性启动子控制的Cas9_sth1在不加诱导剂的情况下仍然有泄露表达，且Cas9_sth1的剪切活性很强；当第一个质粒表达cas9_sth1使得胞内大量积累Cas9_sth1蛋白时，转入含有靶标序列的psgRNA后Cas9_sth1能够立即在sgRNA的引导下在靶标序列处引入DNA双链断裂(DSB)，使得修复还没来得及发生便已导致细胞死亡。

考虑到NHEJ的活性在稳定期更强，我们猜测后转入CRISPR-Cas系统使DSB发生在稳定期可能能够提高NHEJ介导的基因编辑效率。于是，我们构建了一组新的双质粒系统，表达NHEJ元件的质粒和表达Cas9_sth1-sgRNA的质粒。先转入表达pNHEJ元件的质粒，当再转入含有靶标序列的sgRNA(表达Cas9_sth1-sgRNA的质粒)后，我们发现约有4.5％的转化子发生了突变(图3)，证实后表达Cas9sth1确实能够提高NHEJ介导的基因编辑。

随后，我们将RecAmu或RecXmtb构建到第一个质粒(表达NHEJ元件的质粒)上。此外，为了能够更为方便地丢掉辅助质粒，我们在表达NHEJ元件的质粒上引入sacB反向筛选标记，并将Cas9sth1和sgRNA表达在含有不稳定的oriM的质粒上，即最终得到了如图1所示的NHEJ表达质粒pNHEJ-recX_mtb或pNHEJ-recA_mu以及CRISPR表达质粒pYC1640。

接下来，我们选择了三个不同基因Ra2117、Ra2896、Ra3448作为靶标基因检测NHEJ介导的编辑效率。同样，我们分别在这三个基因的开放阅读框内随机选择了PAM序列，确定PAM序列5’端的约20bp为靶标序列，合成靶标序列并退火连接到pYC1640质粒中。从图3所示结果可以看出，向含有pNHEJ-recX_mtb或pNHEJ-recA_mu的结核分枝杆菌(M.tuberculosis::pNHEJ-recX_mtb or M.tuberculosis::pNHEJ-recA_mu)感受态细胞中转入对照组pYC1640后，转化效率能够达到10⁴以上，而当转入含有靶标序列的pYC1640衍生质粒后，每组均能长出几千个转化子，相当于对照组的10％。随后我们挑取平板上的菌落进行PCR测序验证并统计NHEJ效率。相较于高表达RecA突变株，高表达RecX促使NHEJ介导的编辑效率更高，均能达到80％以上(图3)。通过对这三组转化子靶向位点的测序结果进行统计分析，如图4所示，我们发现大多数转化子的突变都从PAM上游第三个碱基开始发生缺失，缺失范围从1bp到324bp，其中有一些同时会发生插入。与此同时，对突变株进行全基因组测序并没有发现在基因组其他位置引入突变。至此，我们已初步证实了CRISPR-Cas系统辅助的非同源末端技术能够高效地在结核分枝杆菌中进行基因敲除。

实施例2.CRISPR-Cas辅助的NHEJ进行精确地大片段删除

如图4所示，我们发现在结核分枝杆菌中，CRISPR-Cas9_sth1辅助的NHEJ进行基因删除时，删除的片段大小通常都小于20bp，这对于完全破坏基因的功能仍存在一定的局限性。于是，为了进一步探索使用该系统在结核分支杆菌中产生更大片段删除的可能性，我们设计了成对sgRNA，探索利用双sgRNA在一个基因内引入两处DSB是否能够发生大片段删除。依据成对PAM确定出四种不同方向的sgRNA的组合方式，C/C、C/W、W/W、W/C方向是由成对PAM在沃森链(W)或克里克链(C)上的位置决定(图5)。

我们在Ra2117的开放阅读框内的克里克链上随机选择了两个不同的PAM序列，并确定了两个靶标序列：5’-acttgtggtgttcacggcgt-3’(SEQ ID No：22)以及5’-acctgggtgatggccgcctccc-3’(SEQ ID No：23)，并将两个不同的靶标序列依据成对sgRNA序列模板进行基因合成，连接到经BamHI和NheI酶切的载体pYC1640上，得到以C/C方向的成对sgRNA组合。此外，我们在保持第一个靶标序列5’-acttgtggtgttcacggcgt-3’不变的情况下，又在沃森链上随机选择了一个PAM序列，并确定了如下的靶标序列：5’-gtccggcacgccgatatcctgg-3’(SEQ ID No：24)，并将这两个靶标序列依据成对sgRNA序列模板进行基因合成，连接到经BamHI和NheI酶切的载体pYC1640上，得到以C/W方向的成对sgRNA组合。同理，我们在Ra2117的开放阅读框内设计了W/W，W/C两种不同方向组合的成对sgRNA。将含有成对sgRNA的质粒转入到含有pNHEJ-RecX_mtb的结核分枝杆菌(M.tuberculosis::pNHEJ-recX_mtb)感受态细胞中，加无抗性7H9+OADC复苏培养48小时后，再补加2mL含有卡那霉素和博来霉素(K+Zeo)的液体培养基继续筛选2天后涂板。25天左右后对平板上的菌落进行计数并计算出转化效率，并每组选取12-24个菌落进行PCR验证及测序，计算出NHEJ效率。存活率为实验组转入成对sgRNA质粒所长菌落占转入对照组质粒pYC1640所长菌落的比例结果。如图6所示，与对照组相比，四组实验组长出来约0.95％-6.77％的转化子，其编辑效率为30％-90％不等。对结核分枝杆菌中利用单“剪刀”引入DNA双链断裂的结果分析，我们发现绝大多数缺失突变都很保守，大多数发生在切口处并保留PAM近端的3个碱基对。因此针对成对Cas9sth1-sgRNA引入切口的连接方式进行研究，我们发现当PAM的位置为C/W的组合方式，NHEJ的准确性更高，即完全按照剪切位点发生片段删除。可见，利用成对Cas9sth1-sgRNA介导的非同源末端连接在结核分枝杆菌中可以对单个基因实现精准的大片段删除。

既然利用成对sgRNA实现了对单个基因的精准删除，于是我们探索利用成对sgRNA对多个基因进行大片段的删除。卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)是一种活的减毒牛型结核分枝杆菌(mycobacterium bovis)，主要用于结核病的防治。已知RD1区域是在卡介苗BCG基因组上缺失而在致病性结核分枝杆菌中存在的区域。RD1区基因全长9455bp，包含9个开放阅读框(Rv3871-3879c)，分别编码9种蛋白。之前有研究报道显示删除RD1区域的突变体在免疫缺陷小鼠和免疫功能正常小鼠中毒力均显著减弱，证明了该区域可以被删除。因此，我们针对RD1区域外侧的两个基因Rv3871和Rv3879c，分别设计了两种方向的sgRNA(如图7中A所示)。将四组不同方向的成对sgRNA按照成对sgRNA设计模板合成后，酶切连接到经BamHI和NheI酶切的载体pYC1640上。随后将表达成对sgRNA的pYC1640衍生质粒转入到含有pNHEJ-RecX_mtb的结核分枝杆菌(M.tuberculosis::pNHEJ-recX_mtb)感受态细胞中，加无抗性7H9+OADC复苏培养48小时后，再补加2mL含有卡那霉素和博来霉素(K+Zeo)的液体培养基继续筛选2天后涂板。25天左右后对平板上的菌落进行计数并计算出转化效率，并每组选取12-24个菌落进行PCR验证及测序，计算出NHEJ效率。存活率为实验组转入成对sgRNA质粒所长菌落占转入对照组质粒pYC1640所长菌落的比例结果。从图7中B和C所示结果可以看出，大约有对照组的0.1％～0.5％的转化子长出来。每组均挑出一定数量的转化子进行PCR验证确定CRISPR-Cas系统辅助的NHEJ的突变效率，结果显示在所有PCR的转化子中，有21.875％的发生了大片段丢失，且在第II组中发生精准删除的效率更高；与此同时，我们还发现了其中有一些转化子只在目标基因的靶向序列处发生突变。

实施例3.CRISPR-Cas辅助的NHEJ实现同时引入双重突变

既然在上述实验进行大片段删除时发现可以只在目标基因的靶向序列处发生突变。于是我们设计了四组靶向不同基因的成对sgRNA来对两个基因同时引入突变，结果如下表所示。

注：Do del efficiency(％)表示引入双重突变的效率；Sin del efficiency(％)表示只在其中一个基因的靶标序列引入突变的效率。

当没有ssrA降解标签存在时，大约有对照组的0.1％～0.45％的转化子长出来，其中前三组约有10-15％左右的转化子发生了突变，而另一对Ra2520-Ra2624长出的转化子个数较少，且经过PCR验证均为野生型。这表明了当靶向两个基因时，Cas9_sth1的剪切作用对基因组引入两处DSBs立即导致细菌的死亡，使得NHEJ修复还没来得及发生。于是，我们在Cas9_sth1的C端融合了ssrA降解标签，降低菌体内Cas9_sth1的表达量提高了转化子数量以及突变效率。ssrA是一种具有类似tRNA分子和mRNA分子双重功能的小分子RNA，也被称为10SaRNA或tmRNA，具有丙氨酸-tRNA和mRNA的性质。ssrA能够在一系列辅助因子的作用下与核糖体结合，终止翻译过程并促使带有标签的蛋白被ClpX水解，从而降低蛋白表达水平。当在Cas9_sth1的C端加入降解标签降低其体内蛋白水平，四组实验组的转化子约为对照组的1％，且突变效率大大提高，从而通过降低Cas9_sth1实现高效地引入双重突变。

实施例4.CRISPR-Cas联合NHEJ实现突变库的构建

CRISPR-Cas系统在真核细胞中进行基因编辑具有高效性，同时又有广泛的靶序列存在，因而可无偏倚地进行全基因组功能的高通量筛选，以鉴定出与特定表型相关的基因。正是由于NHEJ的修复能力较强，使得CRISPR敲除在真核细胞得以实现。由于NHEJ修复效率在原核生物中较低，导致利用CRISPR的筛选在细菌中尚未得到应用。

鉴于我们构建的CRISPR-Cas9_sth1辅助NHEJ修复系统的高效，我们进一步探索利用该系统在结核分枝杆菌进行突变库的构建。结核分枝杆菌H37Rv的基因组上具有至少79对毒素-抗毒素基因。于是，我们试图构建一个小的突变体库来研究验证构建突变库的可能性。

首先，我们同样利用三个不同基因Ra2117、Ra2896、Ra3448作为靶标基因检测NHEJ效率，将上述实施例1中选择的靶标序列进行合成并退火连接到整合性质粒pYC1446。向含有pNHEJ-recX_mtb或pNHEJ-recA_mu的结核分枝杆菌(M.tuberculosis::pNHEJ-recX_mtb orM.tuberculosis::pNHEJ-recA_mu)感受态细胞中转入含有靶标序列的pYC1446衍生质粒。结果发现利用整合质粒pYC1446衍生质粒进行NHEJ介导的基因编辑时，转化效率很高，转入含有靶标序列的转化子数量通常能够达到10⁴-10⁵，并且85％以上的均为突变株。此外，高表达recX的编辑效率更高，这与之前复制性质粒的结果相一致。于是，我们选取利用高表达recX的辅助质粒来进行突变库的构建。接着，我们针对43个毒素基因以及一个推测是必需基因的毒素基因Ra0636(Rv0627)设计了88个sgRNA。将表达sgRNA的混合质粒转化到含有pNHEJ-recX_mtb的结核分枝杆菌(M.tuberculosis::pNHEJ-recX_mtb)感受态细胞，长出约3×10⁴个克隆。同时我们挑取约300个克隆进行了PCR以及测序验证，确认这些克隆包含了74个sgRNA，有85％的转化子为突变株(图8)。同时在这些突变株中，我们利用两个不同的sgRNA对Ra0636(Rv0627)均证实能够发生突变，说明该基因不是一个必需基因。也进一步验证该系统能够用于必需基因的验证。随后，同样为了验证该系统是否适用于H37Rv，我们首先将表达有NHEJ以及RecX的质粒在P3实验室中转入到了H37Rv感受态中。随后将含有pNHEJ-recX的H37Rv制备感受态并转入混合质粒文库。通过PCR验证发现，该系统在H37Rv中同样具备较高的突变效率，能够高效便捷地构建突变子库。

综上所述，我们利用CRISPR-Cas系统与NHEJ联用，实现了一步法在结核分枝杆菌中进行基因敲除的应用，将原有传统方法构建结核分枝杆菌突变株的时间从半年缩短到了3个月，同时由于可以高效引入双重突变，使构建多重突变成为可能，且能够在半年内完成。此外，在进一步的运用中，可以利用该技术构建突变子库进行耐药基因的筛选与研究，为结核分枝杆菌耐药相关的研究提供了可靠的技术支持。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用

<130> WX2019-90-001

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttccgtctcc ggcgagggtg agggcggt 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgccctcacc ctcgccggag acggaatc 28

<210> 3

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggtcagct tgccgtaggt ggcgtcgccc gtcgcagtcg gaaccgccta gaacttgtgg 60

ccgttgacgt caccgtcca 79

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttcaagtcc gccatgccgg agggttgt 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaccctccgg catggcggac ttgaaatc 28

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggagatgg tgcgctcctg gacgtcgcgc tcctaggaac ggtgaaccta gaagtcgtgg 60

cgcttcatgt ggtccgggt 79

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taaggaggac ggtaacatcc tgggccgt 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcccaggat gttaccgtcc tccttatc 28

<210> 9

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagttgtagt tgtactccag cttgtggccc ctgttcgtcg aatcctgcta gaagtcgatg 60

cccttcagct cgatgcggt 79

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttaggcggtt ccgactgcga cgggcggt 28

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcgcccgtcg cagtcggaac cgcctaatc 29

<210> 12

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agggtcagct tgccgtaggt ggcgtcgccc tcaccctcgc cggagacgga gaacttgtgg 60

ccgttgacgt caccgtcca 79

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttaggttcac cgttcctagg agcgcggt 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcgctccta ggaacggtga acctaatc 28

<210> 15

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaggagatgg tgcgctcctg gacgtaaccc tccggcatgg cggacttgaa gaagtcgtgg 60

cgcttcatgt ggtccgggt 79

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgacgaacag gggccacaag ctggaggt 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctccagcttg tggcccctgt tcgtcatc 28

<210> 18

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gagttgtagt tgtactccag cttgtggccc aggatgttac cgtcctcctt gaagtcgatg 60

cccttcagct cgatgcggt 79

<210> 19

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc ggactagaag aagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 20

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc ggacttgacc tagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 21

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc ggactttgcc tagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 22

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc gctcgctgcc tagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tactggccgt cgttttacaa cgtcgtgt 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtatc 28

<210> 25

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggtgtcgccc tcgaacttga cctcggcacg cgtcttgtag aagcactgga cgccgtaggt 60

cagggtggtg accagggtc 79

<210> 26

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cagctcgtcc atgccgtggg tgatgccggc ggcggtgacg ttgacgtcac cgtccagctc 60

gaccaggatc gggacgacg 79

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttc gtgctcattt cgggcggcga 60

atctctcggc gtcgaaatg 79

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtctaagaac tttaaataat ttctactgtt gtagat 36

Claims (10)

1.一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统，是一种双质粒的CRISPR-Cas辅助的NHEJ编辑系统，包括 CRISPR系统表达质粒和NHEJ元件表达质粒，其特征在于，所述CRISPR系统表达质粒包含序列如序列表中SEQ ID No：19所示的sgRNA作用元件和cas9基因，所述NHEJ元件表达质粒包含NHEJ元件基因以及降低recA依赖的同源重组的基因元件recX或recA _mtb R61C，所述NHEJ元件表达质粒含有来自于海分枝杆菌的NHEJ元件，包括kuC、nrgA和ligD三个基因。

2.如权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR系统表达质粒是穿梭载体或整合载体，其上的cas9基因和sgRNA作用元件均由诱导型启动子驱动表达。

3.如权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述cas9基因为来源于嗜热链球菌的cas9_sth1基因。

4.如权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR系统表达质粒上的cas9基因的终止密码子前加入了ssrA降解标签，其序列为5’-GCCGCCGACTCGCACCAGCGCGACTACGCCCTGGCCGCC-3’。

5.如权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR系统表达质粒含有成对的sgRNA作用元件。

6.如权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述NHEJ元件表达质粒还包含复制起点oriE、不稳定复制子pMF1和sacB反向筛选标记。

7.一种对结核分枝杆菌进行基因编辑的方法，利用权利要求1~6任一所述的基因编辑系统进行如下步骤：

1) 将针对目标基因片段的sgRNA靶标序列连接到所述CRISPR系统表达质粒上的sgRNA作用元件中，得到含有靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒；

2) 用所述NHEJ元件表达质粒转化结核分枝杆菌，并将转化子制备成感受态细胞；

3) 用步骤1）制备的含有靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒转化步骤2）制备的感受态细胞，对得到的转化子进行验证，得到目标基因片段被编辑的结核分枝杆菌。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3）向高表达NHEJ元件和RecX或RecA_mtbR61C的结核分枝杆菌感受态细胞电击转化含有靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR系统表达质粒为穿梭载体，在步骤1）中将针对目标基因片段的一个靶标序列连接到该质粒中，再经过步骤2）和3）获得目标基因片段被编辑的结核分枝杆菌；或者，在步骤1）中将两个不同的靶标序列连接到成对的sgRNA作用元件中，得到含有两个靶标序列sgRNA的CRISPR系统表达质粒，再经过步骤2）和3）获得大片段删除的结核分枝杆菌或者双重突变的结核分枝杆菌。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR系统表达质粒为整合载体，在步骤1）构建含有不同靶标序列sgRNA的多个CRISPR系统表达质粒，在步骤3）将这些CRISPR系统表达质粒混合转化含有所述NHEJ元件表达质粒的结核分枝杆菌感受态细胞，构建结核分枝杆菌突变库。

Images