CN112760338B - 一种适用于深海真菌FS140的CRISPR/Cpf1载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种适用于深海真菌FS140的CRISPR/Cpf1载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于深海真菌FS140的CRISPR/Cpf1载体及其构建方法和应用。本发明首次利用CRISPR/Cpf1技术构建一种适用于深海真菌G.pallida FS140的基因敲除体系，从而促进G.pallida FS140的基因工程改造，为G.pallida FS140胶霉毒素的生物合成机制的阐明以及获得更多具有显著生物学活性的胶霉毒素类衍生物奠定分子生物学基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于深海真菌G.pallida FS140的CRISPR/Cpf1 载体构建及其转化方法。
背景技术
前期课题组已经从深海真菌G.pallida FS140中分离得到了20种左右胶霉毒素类化合 物，还包括结构罕见的胶霉毒素类二聚体化合物，其中大部分胶霉毒素类化合物物具有较好 的抗肿瘤活性及抗α-葡萄糖苷酶的活性，因此具有开发成为药物先导化合物的前景。在此 基础上，通过对G.pallida FS140进行了基因组测序，预测了胶霉毒素生物合成基因簇，并 对关键胶霉毒素生物合成功能基因进行了体外生化功能验证。由于非模式真菌生物的基因组 序列较大、选择性抗性筛选标记较少、基因编辑效率较低以及生长周期长等限制因素，对真 菌次级代谢产物研究以及功能基因的鉴定有很大的影响，在上述各种研究方法的基础上，通 过改进也可以有效推进真菌次级代谢生物合成领域的研究进程。目前由于深海真菌G.pallida FS140基因敲除体系尚未成功建立，因此胶霉毒素的生物合成机制尚未阐明，不利于通过代 谢工程改造获得新型具有更好生物学活性的胶霉毒素类化合物及其衍生物。
CRISPR/Cas9是一种由crRNA和tracrRNA互补形成RNA二聚体介导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。RuVC1和HNH两个核酸酶活性区域使其具有内切酶 活性，在gRNA引导下能对靶标基因进行切割。然而，CRISPR/Cas9存在细胞毒性、脱靶 效应和基因插入困难等一些亟待解决的问题，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。 Cpf1是2015年报道的一种新型CRISPR效应蛋白，具有许多与Cas9不同的特性，有利于 克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制。与Cas9相比，Cpf1只需一段42-44个核苷酸组成 的单链RNA即可识别和剪切DNA，从而简化了实验设计步骤，更有利于多基因编辑；Cpf1 能够识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列(Protospacer adjacent motif)，可以扩展CRISPR的 编辑范围；此外，Cpf1剪切会产生黏性末端，可促进目的基因通过非同源重组的方式插入 靶定位点。CRISPR/Cpf1的开发有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制，因此 被称为是新一代的CRISPR而由于相应载体的缺乏，CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中较少， 尚未见到利用CRISPR/Cpf1系统对深海真菌进行基因敲除的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于G.pallida FS140的CRISPR/Cpf1载体构建及其转化方法。
本发明的适用于深海真菌Geosmithia pallida FS140的CRISPR/Cpf1载体的构建方法，包 括以下步骤：
①分子筛选标记萎锈灵Carboxin基因片段构建：以pAN7-1质粒为模板，使用PmlI-F/CBX-1引物扩增获得pgpdA启动子片段1；引物CBX-4/PasI-R扩增获得Trpc终止子片段2；使用引物CBX-2/CBX-3扩增获得萎锈灵Carboxin基因片段3；使用引物PmlI-F/PasI-R 进行融合PCR获得1+2+3片段的融合片段，构建得到pgpdA：Carboxin：TtrpC分子筛选标记片段4；利用PacI和PmlI限制性内切酶对pFC332载体和片段4同时进行双酶切并连接， 得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体pFC332-cbx；
②Cpf1载体片段构建：利用NCOI和KPnI限制性内切酶双酶切pCDNA3.1-hASCpf1载体获得Cpf1片段5；使用引物Cpf1-NCOI-F/Cpf1-PmlI-R PCR扩增Cpf1片段5，得到Cpf1含NCOI/PmlI双酶切位点的片段6；利用NCOI和PmlI限制性内切酶双酶切pFC332-cbx载 体，酶切后将片段6使用诺维赞同源重组试剂盒重组至已用NCOI和PmlI双酶切的 pFC332-cbx载体中，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体pFC332-cbx-Cpf1；
③TEF1启动子片段替换CMV启动子片段：利用PacI和KpnI限制性内切酶双酶切pFC332-cbx-Cpf1载体，再使用引物PacI-TEF1-F/KpnI-TEF1-R将TEF1启动子片段7替换CMV启动子片段，使用诺维赞同源重组试剂盒将TEF1启动子片段7重组至已用PacI和KpnI双酶切的pFC332-cbx-Cpf1载体中，得到pFC332-cbx-TEF1-Cpf1；
④将待敲除基因的靶向序列插入到pFC332-cbx-TEF1-Cpf1质粒中的酶切位点BglII和 PacI之间；
引物序列
优选，待敲除基因是GliK基因，所述的将待敲除基因的靶向序列插入到pFC332-cbx-TE F1-Cpf1质粒中的酶切位点BglII和PacI之间是：
靶向序列构建：以p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t质粒为模板,使用引物SNR52-pro moter-F/crRNA-Terminator-R进行PCR扩增获得SNR52启动子和crRNA及SUP4终止子片段； 即是SNR52启动子+crRNA+SUP4终止子片段8，将片段8构建至T载体上进行TA克隆； 以TA克隆阳转化子为模板使用引物gliK-target1-F和gliK-target1-R进行PCR得到SNR52启动子(BglII)：crRNA：靶向序列：SUP4终止子(PacI)片段9；使用BglII和PacI分别对pFC332-cbx-TEF1-Cpf1质粒和片段9进行双酶切，酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliK的重组载体并测序验证；
所述的SNR52-Promoter-F：AGATCTCACATACGACCACAGGGTGTGGA
crRNA-Terminator-R：AAACACCTAATTTCTACTAAGTGTAGATTTTTTTTGTTTTTTATGTCTTTAATTAA
gliK-target1-F：TCCCAAATCATACAGTCCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA T
gliK-target1-R：GTGGGACTGTATGATTTGGGAGGTGTTTCGTCCTTTCATACAACAGA。
优选，所述的GliK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种根据上述构建方法构建得到的CRISPR/Cpf1载体。
本发明的第三个目的是提供一种含有所述的CRISPR/Cpf1载体的真菌。
本发明的第四个目的是提供所述的CRISPR/Cpf1载体在真菌基因敲除中的应用。
优选，所述的真菌为G.pallida FS140。
优选，所述的应用包括以下步骤：
a.在待敲除的基因GliK中寻找靶向位点，对应设计靶向引物并退火形成双链，将其酶 切连接至载体pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA中，得到的靶向敲除重组载体，所述的基因GliK 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
b.将靶向敲除重组载体通过原生质体介导法导入G.pallida FS140原生质体，用萎锈灵 抗性PDA平板筛选，挑取阳性克隆基因组DNA验证重组载体是否成功导入，并通过PCR和 测序进行验证。
本发明构建了适用于深海真菌G.pallida FS140的CRISPR/Cpf1载体，并将靶向敲除重组 载体通过原生质体介导法导入G.pallida FS140原生质体进行验证。旨在为后期FS140胶霉毒 素生物合成基因敲除，为后期解析FS140胶霉毒素生物机制奠定分子生物学基础和促进胶霉 毒素类化合物的开发利用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前，常用的抗药筛选标记是潮霉素(Hyg)抗性基因，而对萎锈灵(Carboxin)抗性基 因的研究较少。在使用潮霉素抗性基因为分子标记的真菌遗传转化实验中，常会出现较多的 假阳性和遗传性能不稳定的转化子，需要大量的筛选工作，降低了工作效率。萎锈灵是近年 来被发现的一种基于自身基因发生点突变而产生的分子标记，在植物的遗传转化中具有广泛 的应用，而在深海真菌研究中应用较少。萎锈灵是一种具有内吸作用的杂环类杀菌剂，可以 通过抑制三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶(EC 1.3.99.1)活性，影响病原菌线粒体的呼吸链电子传 递系统，阻碍能量代谢，抑制病原菌的生长，导致其死亡。
目前，真菌的基因敲除一般采取Cre/loxp同源重组和CRISPR/Cas9的方法进行基因敲 除，但存在同源重组效率低，CRISPR/Cas9也存在细胞毒性、脱靶效应和基因插入困难等一 些亟待解决的问题，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用，并且由于真菌遗传不稳定 性和CRISPR-Cas9编辑系统不通用性，尤其是研究比较少的深海真菌(基因组序列未知)， 很大程度上导致丝状真菌基因敲除进展缓慢，严重阻碍了丝状真菌的遗传操作改造和新型次 级代谢产物的发掘。
与Cas9相比，Cpf1只需一段42-44个核苷酸组成的单链RNA即可识别和剪切DNA，从而简化了实验设计步骤，更有利于多基因编辑；Cpf1能够识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM 序列(Protospacer adjacent motif)，可以扩展CRISPR的编辑范围；此外，Cpf1剪切会产生黏性末端，可促进目的基因通过非同源重组的方式插入靶定位点，此外在插入基因的两端添加 与靶位点对应的黏性末端，就可以使插入基因通过NHEJ修复以可控的方向插入靶位点，而 不必依赖于同源重组。因此，对于同源重组发生概率较低的编辑对象，CRISPR/Cpf1是有利 的基因编辑工具，基因敲除效率相对较高，能有效促进丝状真菌的遗传工程改造，从而发掘 更多具有生物活性的先导化合物。
本发明的深海真菌Geosmithia pallida FS140，其公开于文献：Zhang-Hua Sun,Jiangyong Gu, Wei Ye,Liang-Xi Wen,Qi-Bin Lin,Sai-Ni Li,Yu-Chan Chen,Hao-HuaLi,Wei-Min Zhang.Geospallins A–C:New Thiodiketopiperazines with InhibitoryActivity against Angiotensin-Converting Enzyme from a Deep-Sea-Derived FungusGeosmithia pallida FS140.Marine Drugs 2018,16(12),464.https://doi.org/10.3390/md16120464。该菌种本申请人 也持有，保证自本发明的申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1是GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1质粒图谱及验证；其中，图A为pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA质粒图谱，图B为pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA载体构建与GliK-cpf1-sgRNA序列构建验证图。
图2为G.pallida FS140菌株萎锈灵浓度筛选平板情况。
图3为G.pallida FS140形态特征；其中A为光学显微镜(40×)下孢子形态；B为扫描电 镜(SE,WD＝6.4mm,15.0KV×600，50μm)下菌丝形态特征；C为制备的原生质体形态。
图4为重组载体通过原生质体介导到G.pallida FS140的平板图；其中A为无抗PDA平 板；B为400μg/mL萎锈灵抗性PDA平板(无质粒)；C为400μg/mL萎锈灵抗性PDA平板 (导入重组载体)验证；D为从C平板中挑取转化子至400μg/mL萎锈灵抗性PDA平板传代 验证。
图5为重组载体原生质体转化子引物验证电泳图；其中A为ITS1和ITS4扩增G.pallida FS140菌株的ITS序列；B为GliK-F和GliK-R引物扩增GliK基因片段；C为使用PmlI和 PasI扩增萎锈灵抗性基因序列；D为BglII-F/PmlI-R扩增GliK-cpf1-sgRNA靶向序列片段。
图6是GliK蛋白在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的条件下催化酶活力图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本实施例中所用的PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43 g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B1 10mg，琼脂18g，蒸馏水1L；
本实施例中所用的YPD固体培养基的配方为：每升含有酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄 糖20g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水。
实施例1：靶向胶霉毒素生物合成基因敲除载体的构建
在pFC332质粒基础上，对pFC332进行改造，并使用PacI和BglII位点进行双酶切，将 潮霉素抗性基因替换为萎锈灵抗性基因；Cpf1蛋白替换为Cas9；插入一段序列：SNR52启动子(BglII)：crRNA：SUP4终止子(PacI)(其中包含SNR52启动子、crRNA靶向序列 骨架基因及其终止子)，使质粒在转化进入原生质体后能够同时稳定表达Cpf1蛋白和转录 crRNA(质粒命名为pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA)。
构建载体所设计的引物如表1所示，并利用酶切连接和同源重组结合的方式构建GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1载体。构建方法具体如下所示：
表1引物序列
构建载体方法与步骤：
①分子筛选标记萎锈灵Carboxin基因片段构建：以pAN7-1质粒为模板，使用PmlI-F/CBX-1引物扩增获得pgpdA启动子片段1；引物CBX-4/PasI-R扩增获得Trpc终止子片段2；使用引物CBX-2/CBX-3扩增获得萎锈灵Carboxin基因片段3；使用引物PmlI-F/PasI-R 进行融合PCR获得1+2+3片段的融合片段，构建得到pgpdA：Carboxin：TtrpC分子筛选标记片段4(其核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示)；利用PacI和PmlI限制性内切酶对pFC332载体(见图1B)和片段4(见图1C)同时进行双酶切并连接，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1 载体pFC332-cbx。
②Cpf1(CMV启动子)载体片段构建：利用NCOI和KPnI限制性内切酶双酶切pCDNA3.1-hASCpf1载体获得Cpf1(CMV启动子)片段5；使用引物Cpf1-NCOI-F/Cpf1-PmlI-RPCR扩增Cpf1片段5(见图1D)，得到Cpf1含(NCOI/PmlI)双酶切位点的片段6(其核苷酸 见SEQ ID NO.3所示)；利用NCOI和PmlI限制性内切酶双酶切pFC332-cbx载体，酶切后 将片段6使用诺维赞同源重组试剂盒重组至已用NCOI和PmlI双酶切的pFC332-cbx载体中， 得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体pFC332-cbx-Cpf1(CMV)。
③TEF1启动子片段替换CMV启动子片段：利用PacI和KpnI限制性内切酶双酶切pFC332-cbx-Cpf1(CMV)载体，再使用引物PacI-TEF1-F/KpnI-TEF1-R将TEF1启动子片段 7(其核苷酸见SEQ ID NO.4所示)替换CMV启动子片段，使用诺维赞同源重组试剂盒将 TEF1启动子片段7(见图1E)重组至已用PacI和KpnI双酶切的pFC332-cbx-Cpf1载体中，得 到pFC332-cbx-TEF1-Cpf1。
④GliK基因靶向序列构建：以p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t质粒为模板,使用引 物SNR52-promoter-F/crRNA-Terminator-R进行PCR扩增获得SNR52启动子(BglII)和crRNA 及SUP4终止子(PacI)片段；即是SNR52启动子(BglII)+crRNA+SUP4终止子(PacI)片段8(其核苷酸见SEQ ID NO.5和6所示，斜体双下划线为靶向序列)，将片段8构建至T 载体上进行TA克隆；以TA克隆阳转化子为模板使用引物gliK-target1-F和gliK-target1-R进行PCR得到SNR52启动子(BglII)：crRNA：靶向序列：SUP4终止子(PacI)片段9；使 用BglII和PacI分别对pFC332-cbx-TEF1-Cpf1质粒和片段9进行双酶切，酶切后的片段用 T4 DNA连接酶进行连接，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体 GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliK的重组 载体并测序验证(GliK基因序列见SEQ ID NO.1所示)。
经测序验证确认，通过上述方法分别成功构建了GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1 载体(载体图谱见图1A)，使用BglII-F和PacI-R扩增GliK-cpf1-sgRNA片段(其核苷酸序 列如SEQ ID NO.5和6所示)进行验证，PCR产物条带(见图1F)。
实施例2外源基因导入G.pallida FS140原生质体方法如下：
1)挑取适量的G.pallida FS140菌丝接种于200mL PDB液体培养基中，30℃、180r/min 培养3-4天。挑选生长较好的菌球2g(湿重)于50mL离心管中，用PBS缓冲液洗涤两 次，使残留的PDB培养基充分洗去。称取0.15g裂解酶溶于20mLKC缓冲液(0.6M KCl、 0.05MCaCl2)，并用0.22μm滤膜过滤，加入洗涤好的菌球中，置于28℃、80r/min 摇床中裂解3小时左右。用200目的滤网过滤裂解液，过滤菌丝，再用6层擦镜纸再次 过滤，4℃、6500×g离心10min，弃上清。加入5mLKC缓冲液，用移液枪将沉淀轻轻吹 打混匀，4℃、4000×g离心5min，弃上清。加入1mLKC缓冲液，重悬，即原生质体制 备完成，镜检，观察G.pallida FS140原生质体的形态和计数(见图3)调整原生质体浓度为 2×105个/mL左右，备用。
2)将制备好的原生质体(2×105/mL)与2.5-5μg GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1质 粒混匀，置于冰上5min，然后再加入400μL 40％PEG4000，冰置30min，再加入1600 μL PEG4000，冰置30min，然后用WI缓冲液定容至5mL左右终止反应，放置于28℃摇 床低速过夜培养；
3)将融化的PDA固体培养基冷却至室温后，每次取20mL与步骤(2)中过夜培养的溶液 轻轻混匀，此外，根据前期的抗性筛选结果(见图2)，再加入终浓度为400μg/mL的 萎锈灵，混匀后均匀倒板，同时设置阴性对照(无抗)，30℃培养5d(见图4ABC)；
4)长出较小的菌丝体后，再挑取真菌菌落转移至含终浓度为400μg/mL萎锈灵的PDA培养 基上，再进行筛选(见图4D)；
5)在步骤(4)中萎锈灵PDA平板上长出的阳性克隆菌丝先进行保存(即挑取部分菌丝转 移至新的萎锈灵PDA平板)，然后将剩余真菌菌丝置于无菌EP管中，加入液氮充分研磨，然后立刻放在100℃的水浴锅中5min，然后再放在液氮中1min，重复该过程3次， 最后加入50μL超纯水溶解，最大转速离心5min，取上清(即总基因组DNA)放置于 -20℃保存。分别使用(表1)引物ITS1和ITS4扩增G.pallida FS140菌株的ITS序列； 使用GliK-F和GliK-R引物扩增GliK基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)； 使用PmlI和PasI扩增萎锈灵抗性基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；使用 BglII-F/PmlI-R扩增GliK-cpf1-sgRNA靶向序列片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和6 所示)；4对引物进行验证载体GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1是否导入成功，然 后跑琼脂糖凝胶电泳验证(见图5)，PCR产物使用对应的引物测序验证构建的 CRISPR/Cpf1载体GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1适用于Geosmithia pallida FS140。
实施例3：
将Glik基因(核苷酸序列为：atgaccatacaactccctcacacacctgacagagaagaaggccctggtgc ttctcctgcatgcaagttcaatgcaatccagacattccggtggttatgggacctagtcatcccaactagcgaccttactc aagaaaccggtcgatatcctccgaagacgacgatcgagagacggcgcgcatcaaccacagatagatcgctcgataaggac gaatacctagctgagaaggtcgcaggtcatcaggtcgaagaacatgtccccccggagaagaccgtcctctacctcgcgta cggctcgaatctggccgcggagaccttcctgggcaagcgaggcattaggcctctatcccagatcaacgttgtcgttcccg gcctacgactaactttcgaccttcctgggttaccatacgttgagccatgcttcgcagcgactcggcactggactcataca ccaagagtaacacaaacagaaggaaatggaagtaatgaaggggtcgatgcagaagtgttggagaattcgtccctcgtgcc acaggagaagaacgacatgcctctcgtcggcgtcgtgtatgaggtcactgtcgccgattatgccaagataatagccacag agggtggtgggcgcggataccgagacgtcgttgtcgattgctatccttttcccaaatcatacagtcccaccgatccggtc cctgagtgccccgaaaccaaacccttcaagtcccacaccctcctctctccagccgacgacgcagtctcgggtctcctggc cgcagggaagtcataccgacccgtccgacccaatcctggctacgcccagccctccgcttga)插入到pET-30a载体 的酶切位点NdeI和XhoI之间的位置，获得pET30a-GliK，转化进大肠杆菌BL21(DE3)感 受态细胞，筛选阳性克隆，获得含有pET30a-GliK的大肠杆菌BL21(DE3)，然后进行发酵 培养，IPTG诱导，通过镍柱纯化GliK蛋白。
配制溶液：Buffer A：5mM乙酰辅酶A，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液；Buffer B：1mg/mL 胶霉毒素，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液；Buffer C：0.1-0.2mg/mL GliK蛋白，0.5mg/mLBSA； Buffer D：20mM DTNB(Sigma)，0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲液。反应体系为(按体积分数)： 10％Buffer A；10％Buffer B；10％Buffer C；1％Buffer D；最后加0.1M pH 8.0磷酸钾缓冲 液补足至500uL。将所有的溶剂加到比色皿中，充分混匀，同时设置空白对照组(空白体系： 将Buffer C的蛋白液替换为0.1MpH 8.0磷酸钾缓冲液，其余不变)，并设置3个重复。利 用分光光度计在412nm处测吸光值，通过吸光度的变化计算乙酰转移酶GliK的酶活力。比 酶活定义U/mg：常温下每mL反应体系下每mg蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为 1个酶活单位。通过下文公式计算：
SP＝(△A测-△A空)/0.001/(Cpr*0.1mL)/5min
式中：SP：比酶活(U/mg)；△A测＝△A(10min)-△A(5min)；Cpr是蛋白质的初始浓度
测定GliK蛋白在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的条件下催化酶活力。根据GliK酶活力计算公式，确定GliK酶促反应的最适温度值，以在最优反应温度下的酶活3430U/mg为100％。由图6可知，当温度低于35℃时，催化效率随温度的升高而快速增加； 当反应温度为35℃时，催化效率最大；当反应温度在40-50℃时，酶活从80％下降至20％。 由此可见，GliK蛋白具有催化胶霉毒素得到乙酰胶霉毒素的功能。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明 的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种适用于深海真菌FS140的CRISPR/Cpf1载体及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 831
<212> DNA
<213> 深海真菌FS140(Geosmithia pallida)
<400> 1
atgaccatac aactccctca cacacctgac agagaagaag gccctggtgc ttctcctgca 60
tgcaagttca atgcaatcca gacattccgg tggttatggg acctagtcat cccaactagc 120
gaccttactc aagaaaccgg tcgatatcct ccgaagacga cgatcgagag acggcgcgca 180
tcaaccacag atagatcgct cgataaggac gaatacctag ctgagaaggt cgcaggtcat 240
caggtcgaag aacatgtccc cccggagaag accgtcctct acctcgcgta cggctcgaat 300
ctggccgcgg agaccttcct gggcaagcga ggcattaggc ctctatccca gatcaacgtt 360
gtcgttcccg gcctacgact aactttcgac cttcctgggt taccatacgt tgagccatgc 420
ttcgcagcga ctcggcactg gactcataca ccaagagtaa cacaaacaga aggaaatgga 480
agtaatgaag gggtcgatgc agaagtgttg gagaattcgt ccctcgtgcc acaggagaag 540
aacgacatgc ctctcgtcgg cgtcgtgtat gaggtcactg tcgccgatta tgccaagata 600
atagccacag agggtggtgg gcgcggatac cgagacgtcg ttgtcgattg ctatcctttt 660
cccaaatcat acagtcccac cgatccggtc cctgagtgcc ccgaaaccaa acccttcaag 720
tcccacaccc tcctctctcc agccgacgac gcagtctcgg gtctcctggc cgcagggaag 780
tcataccgac ccgtccgacc caatcctggc tacgcccagc cctccgcttg a 831
<210> 2
<211> 2002
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatgcggag agacggacgg acgcagagag aagggctgag taataagcca ctggccagac 60
agctctggcg gctctgaggt gcagtggatg attattaatc cgggaccggc cgcccctccg 120
ccccgaagtg gaaaggctgg tgtgcccctc gttgaccaag aatctattgc atcatcggag 180
aatatggagc ttcatcgaat caccggcagt aagcgaagga gaatgtgaag ccaggggtgt 240
atagccgtcg gcgaaatagc atgccattaa cctaggtaca gaagtccaat tgcttccgat 300
ctggtaaaag attcacgaga tagtaccttc tccgaagtag gtagagcgag tacccggcgc 360
gtaagctccc taattggccc atccggcatc tgtagggcgt ccaaatatcg tgcctctcct 420
gctttgcccg gtgtatgaaa ccggaaaggc cgctcaggag ctggccagcg gcgcagaccg 480
ggaacacaag ctggcagtcg acccatccgg tgctctgcac tcgacctgct gaggtccctc 540
agtccctggt aggcagcttt gccccgtctg tccgcccggt gtgtcggcgg ggttgacaag 600
gtcgttgcgt cagtccaaca tttgttgcca tattttcctg ctctccccac cagctgctct 660
tttcttttct ctttcttttc ccatcttcag tatattcatc ttcccatcca agaaccttta 720
tttcccctaa gtaagtactt tgctacatcc atactccatc cttcccatcc cttattcctt 780
tgaacctttc agttcgagct ttcccacttc atcgcagctt gactaacagc taccccgctt 840
gagcagacat caccatgcag tccctcgtcg ccacccgctc cagtgctctc aagcagaccg 900
ttcgcggctt cgcagcttct gccgcgcggg cccaggccac cccgctccag aagccggtcc 960
ggaacaagga gttcaagatt taccgttgga ttctcgacgc cctcatcaaa atcaagaacg 1020
agatagaccc taccttgact tttcgtcggt catgccgcga gggtatctgc ggctcgtgtg 1080
caatgaacat taacggccaa aacacgctgg cgtgcctctg caggatcgac acaaacgcga 1140
gcaaggatac caagatctac ccccttcccc acatgtacat tgttaaggac ctcgtgcccg 1200
acctcaccca attctacaag caatacaagt ccatcgagcc ctacctgcag aacgacaacc 1260
ctccagcgga ccgggagttc ttgcagtcgc aggaggacag gaagaagctc gacggcatgt 1320
atgagtgcat cctgtgcgcg tgctgctcga cctcgtgccc cagctactgg tggaaccagg 1380
acgagtacct cgggcccgcg acgctcatgg ccgcctaccg ctggatggcg gactctcggg 1440
acacgtataa ggcgcaccgg atggagaaga tgcagaacga gctcagccta taccgctgcc 1500
acacgatctt caactgcgca cgcacgtgcc ccaagggcct caaccccgcc gcggcgatcg 1560
caaagatgaa gctcgagctt gccgccgagt agagtagatg ccgaccgcgg gatccactta 1620
acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata taagatcgtt ggtgtcgatg 1680
tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga taagatacgt tcatttgtcc 1740
aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat gtcaacaaga ataaaacgcg 1800
ttttcgggtt tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc attgactgca 1860
acctagtaac gccttncagg ctccggcgaa gagaagaata gcttagcaga gctattttca 1920
ttttcgggag acgagatcaa gcagatcaac ggtcgtcaag agacctacga gactgaggaa 1980
tccgctcttg gctccacgcg ac 2002
<210> 3
<211> 3931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acatgccatg gtgacacagt tcgagggctt taccaacctg tatcaggtga gcaagacact 60
gcggtttgag ctgatcccac agggcaagac cctgaagcac atccaggagc agggcttcat 120
cgaggaggac aaggcccgca atgatcacta caaggagctg aagcccatca tcgatcggat 180
ctacaagacc tatgccgacc agtgcctgca gctggtgcag ctggattggg agaacctgag 240
cgccgccatc gactcctata gaaaggagaa aaccgaggag acaaggaacg ccctgatcga 300
ggagcaggcc acatatcgca atgccatcca cgactacttc atcggccgga cagacaacct 360
gaccgatgcc atcaataaga gacacgccga gatctacaag ggcctgttca aggccgagct 420
gtttaatggc aaggtgctga agcagctggg caccgtgacc acaaccgagc acgagaacgc 480
cctgctgcgg agcttcgaca agtttacaac ctacttctcc ggcttttatg agaacaggaa 540
gaacgtgttc agcgccgagg atatcagcac agccatccca caccgcatcg tgcaggacaa 600
cttccccaag tttaaggaga attgtcacat cttcacacgc ctgatcaccg ccgtgcccag 660
cctgcgggag cactttgaga acgtgaagaa ggccatcggc atcttcgtga gcacctccat 720
cgaggaggtg ttttccttcc ctttttataa ccagctgctg acacagaccc agatcgacct 780
gtataaccag ctgctgggag gaatctctcg ggaggcaggc accgagaaga tcaagggcct 840
gaacgaggtg ctgaatctgg ccatccagaa gaatgatgag acagcccaca tcatcgcctc 900
cctgccacac agattcatcc ccctgtttaa gcagatcctg tccgatagga acaccctgtc 960
tttcatcctg gaggagttta agagcgacga ggaagtgatc cagtccttct gcaagtacaa 1020
gacactgctg agaaacgaga acgtgctgga gacagccgag gccctgttta acgagctgaa 1080
cagcatcgac ctgacacaca tcttcatcag ccacaagaag ctggagacaa tcagcagcgc 1140
cctgtgcgac cactgggata cactgaggaa tgccctgtat gagcggagaa tctccgagct 1200
gacaggcaag atcaccaagt ctgccaagga gaaggtgcag cgcagcctga agcacgagga 1260
tatcaacctg caggagatca tctctgccgc aggcaaggag ctgagcgagg ccttcaagca 1320
gaaaaccagc gagatcctgt cccacgcaca cgccgccctg gatcagccac tgcctacaac 1380
cctgaagaag caggaggaga aggagatcct gaagtctcag ctggacagcc tgctgggcct 1440
gtaccacctg ctggactggt ttgccgtgga tgagtccaac gaggtggacc ccgagttctc 1500
tgcccggctg accggcatca agctggagat ggagccttct ctgagcttct acaacaaggc 1560
cagaaattat gccaccaaga agccctactc cgtggagaag ttcaagctga actttcagat 1620
gcctacactg gcctctggct gggacgtgaa taaggagaag aacaatggcg ccatcctgtt 1680
tgtgaagaac ggcctgtact atctgggcat catgccaaag cagaagggca ggtataaggc 1740
cctgagcttc gagcccacag agaaaaccag cgagggcttt gataagatgt actatgacta 1800
cttccctgat gccgccaaga tgatcccaaa gtgcagcacc cagctgaagg ccgtgacagc 1860
ccactttcag acccacacaa cccccatcct gctgtccaac aatttcatcg agcctctgga 1920
gatcacaaag gagatctacg acctgaacaa tcctgagaag gagccaaaga agtttcagac 1980
agcctacgcc aagaaaaccg gcgaccagaa gggctacaga gaggccctgt gcaagtggat 2040
cgacttcaca agggattttc tgtccaagta taccaagaca acctctatcg atctgtctag 2100
cctgcggcca tcctctcagt ataaggacct gggcgagtac tatgccgagc tgaatcccct 2160
gctgtaccac atcagcttcc agagaatcgc cgagaaggag atcatggatg ccgtggagac 2220
aggcaagctg tacctgttcc agatctataa caaggacttt gccaagggcc accacggcaa 2280
gcctaatctg cacacactgt attggaccgg cctgttttct ccagagaacc tggccaagac 2340
aagcatcaag ctgaatggcc aggccgagct gttctaccgc cctaagtcca ggatgaagag 2400
gatggcacac cggctgggag agaagatgct gaacaagaag ctgaaggatc agaaaacccc 2460
aatccccgac accctgtacc aggagctgta cgactatgtg aatcacagac tgtcccacga 2520
cctgtctgat gaggccaggg ccctgctgcc caacgtgatc accaaggagg tgtctcacga 2580
gatcatcaag gataggcgct ttaccagcga caagttcttt ttccacgtgc ctatcacact 2640
gaactatcag gccgccaatt ccccatctaa gttcaaccag agggtgaatg cctacctgaa 2700
ggagcacccc gagacaccta tcatcggcat cgatcggggc gagagaaacc tgatctatat 2760
cacagtgatc gactccaccg gcaagatcct ggagcagcgg agcctgaaca ccatccagca 2820
gtttgattac cagaagaagc tggacaacag ggagaaggag agggtggcag caaggcaggc 2880
ctggtctgtg gtgggcacaa tcaaggatct gaagcagggc tatctgagcc aggtcatcca 2940
cgagatcgtg gacctgatga tccactacca ggccgtggtg gtgctggaga acctgaattt 3000
cggctttaag agcaagagga ccggcatcgc cgagaaggcc gtgtaccagc agttcgagaa 3060
gatgctgatc gataagctga attgcctggt gctgaaggac tatccagcag agaaagtggg 3120
aggcgtgctg aacccatacc agctgacaga ccagttcacc tcctttgcca agatgggcac 3180
ccagtctggc ttcctgtttt acgtgcctgc cccatataca tctaagatcg atcccctgac 3240
cggcttcgtg gaccccttcg tgtggaaaac catcaagaat cacgagagcc gcaagcactt 3300
cctggagggc ttcgactttc tgcactacga cgtgaaaacc ggcgacttca tcctgcactt 3360
taagatgaac agaaatctgt ccttccagag gggcctgccc ggctttatgc ctgcatggga 3420
tatcgtgttc gagaagaacg agacacagtt tgacgccaag ggcacccctt tcatcgccgg 3480
caagagaatc gtgccagtga tcgagaatca cagattcacc ggcagatacc gggacctgta 3540
tcctgccaac gagctgatcg ccctgctgga ggagaagggc atcgtgttca gggatggctc 3600
caacatcctg ccaaagctgc tggagaatga cgattctcac gccatcgaca ccatggtggc 3660
cctgatccgc agcgtgctgc agatgcggaa ctccaatgcc gccacaggcg aggactatat 3720
caacagcccc gtgcgcgatc tgaatggcgt gtgcttcgac tcccggtttc agaacccaga 3780
gtggcccatg gacgccgatg ccaatggcgc ctaccacatc gccctgaagg gccagctgct 3840
gctgaatcac ctgaaggaga gcaaggatct gaagctgcag aacggcatct ccaatcagga 3900
ctggctggcc tacatccagg agctgcgcaa c 3931
<210> 4
<211> 886
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgagacagca gaatcaccgc ccaagttaag cctttgtgct gatcatgctc tcgaacgggc 60
caagttcggg aaaagcaaag gagcgtttag tgaggggcaa tttgactcac ctcccaggca 120
acagatgagg ggggcaaaaa gaaagaaatt ttcgtgagtc aatatggatt ccgagcatca 180
ttttcttgcg gtctatcttg ctacgtatgt tgatcttgac gctgtggatc aagcaacgcc 240
actcgctcgc tccatcgcag gctggtcgca gacaaattaa aaggcggcaa actcgtacag 300
ccgcggggtt gtccgctgca aagtacagag tgataaaagc cgccatgcga ccatcaacgc 360
gttgatgccc agctttttcg atccgagaat ccaccgtaga ggcgatagca agtaaagaaa 420
agctaaacaa aaaaaaattt ctgcccctaa gccatgaaaa cgagatgggg tggagcagaa 480
ccaaggaaag agtcgcgctg ggctgccgtt ccggaaggtg ttgtaaaggc tcgacgccca 540
aggtgggagt ctaggagaag aatttgcatc gggagtgggg cgggttaccc ctccatatcc 600
aatgacagat atctaccagc caagggtttg agcccgcccg cttagtcgtc gtcctcgctt 660
gcccctccat aaaaggattt cccctccccc tcccacaaaa ttttctttcc cttcctctcc 720
ttgtccgctt cagtacgtat atcttccctt ccctcgcttc tctcctccat ccttctttca 780
tccatctcct gctaacttct ctgctcagca cctctacgca ttactagccg tagtatctga 840
gcacttctcc cttttatatt ccacaaaaca taacacaacc ttcacc 886
<210> 5
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agatctcaca tacgaccaca gggtgtggaa aacagggctt cccgtccgct cagccgtact 60
taagccacac gccgggaggt tagtagttgg gtgggtgacc accagcgaat cccttctgtt 120
gtatgaaagg acgaaacacc taatttctac taagtgtaga ttcccaaatc atacagtccc 180
actttttttg ttttttatgt ctttaattaa 210
<210> 6
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agatctcaca tacgaccaca gggtgtggaa aacagggctt cccgtccgct cagccgtact 60
taagccacac gccgggaggt tagtagttgg gtgggtgacc accagcgaat cccttctgtt 120
gtatgaaagg acgaaacacc taatttctac taagtgtaga tcgaccttcc tgggttacca 180
tatttttttg ttttttatgt ctttaattaa 210
Claims (5)
1.一种适用于深海真菌Geosmithia pallida FS140的CRISPR/Cpf1载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
①分子筛选标记萎锈灵Carboxin基因片段构建：以pAN7-1质粒为模板，使用引物PmlI-F和CBX-1引物扩增获得pgpdA启动子片段1；引物CBX-4和PasI-R扩增获得Trpc终止子片段2；使用引物CBX-2和CBX-3扩增获得萎锈灵Carboxin基因片段3；使用引物PmlI-F和PasI-R进行融合PCR获得1+2+3片段的融合片段，构建得到pgpdA：Carboxin：TtrpC分子筛选标记片段4；利用PacI和PmlI限制性内切酶对pFC332载体和片段4同时进行双酶切并连接，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体pFC332-cbx；
②Cpf1载体片段构建：利用NCOI和KPnI限制性内切酶双酶切pCDNA3.1-hASCpf1载体获得Cpf1片段5；使用引物Cpf1-NCOI-F和Cpf1-PmlI-R PCR扩增Cpf1片段5，得到Cpf1含NCOI和PmlI双酶切位点的片段6；利用NCOI和PmlI限制性内切酶双酶切pFC332-cbx载体，酶切后将片段6使用诺维赞同源重组试剂盒重组至已用NCOI和PmlI双酶切的pFC332-cbx载体中，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体pFC332-cbx-Cpf1；
③TEF1启动子片段替换CMV启动子片段：利用PacI和KpnI限制性内切酶双酶切pFC332-cbx-Cpf1载体，再使用引物PacI-TEF1-F和KpnI-TEF1-R将TEF1启动子片段7替换CMV启动子片段，使用诺维赞同源重组试剂盒将TEF1启动子片段7重组至已用PacI和KpnI双酶切的pFC332-cbx-Cpf1载体中，得到pFC332-cbx-TEF1-Cpf1；
④将待敲除基因的靶向序列插入到pFC332-cbx-TEF1-Cpf1质粒中的酶切位点BglII和PacI之间；
引物序列
待敲除基因是GliK基因，所述的将待敲除基因的靶向序列插入到pFC332-cbx-TEF1-Cpf1质粒中的酶切位点BglII和PacI之间是：
靶向序列构建：以p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t质粒为模板,使用引物SNR52-promoter-F/crRNA-Terminator-R进行PCR扩增获得SNR52启动子和crRNA及SUP4终止子片段；即是SNR52启动子+crRNA+SUP4终止子片段8，将片段8构建至T载体上进行TA克隆；以TA克隆阳转化子为模板使用引物gliK-target1-F和gliK-target1-R进行PCR得到含BglII限制性内切酶酶切位点的SNR52启动子crRNA：靶向序列：含PacI限制性内切酶酶切酶位点的SUP4终止子的片段9；使用限制性内切酶BglII和PacI分别对pFC332-cbx-TEF1-Cpf1质粒和片段9进行双酶切，酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接，得到适用于FS140的CRISPR/Cpf1载体GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliK的重组载体并测序验证；
所述的SNR52-Promoter-F：AGATCTCACATACGACCACAGGGTGTGGA
crRNA-Terminator-R：AAACACCTAATTTCTACTAAGTGTAGATTTTTTTTGTTTTTTATGTCTTTAATTAA
gliK-target1-F：TCCCAAATCATACAGTCCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT
gliK-target1-R：GTGGGACTGTATGATTTGGGAGGTGTTTCGTCCTTTCATACAACAGA
所述的GliK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种根据权利要求1所述的构建方法构建得到的CRISPR/Cpf1载体，所述的CRISPR/Cpf1载体是所述GliK-pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA-1质粒，即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliK的重组载体。
3.一种含有权利要求2所述的CRISPR/Cpf1载体的真菌。
4.权利要求2所述的CRISPR/Cpf1载体在真菌基因敲除中的应用，所述的真菌为G.pallida FS140。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a.在待敲除的基因GliK中寻找靶向位点，对应设计靶向引物并退火形成双链，将其酶切连接至载体pFC332-cbx-TEF1-Cpf1-crRNA中，得到的靶向敲除重组载体，所述的基因GliK其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
b.将靶向敲除重组载体通过原生质体介导法导入G.pallida FS140原生质体，用萎锈灵抗性PDA平板筛选，挑取阳性克隆基因组DNA验证重组载体是否成功导入，并通过PCR和测序进行验证。
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|---|
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| 海洋真菌Geosmithia pallida FS140胶霉毒素生物合成相关功能基因的异源表达及初步敲除;刘帅;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》;20191115(第11期);第A006-117页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112760338A (zh) | 2021-05-07 |
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