CN112538496A - 一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明构建了适用于植物内生真菌露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体，并对新型单端孢霉烯的关键生物合成基因Tri18进行敲除，并通过代谢产物对比分析进一步验证目的基因的功能，为后期解析露湿漆斑菌A553中单端孢霉烯trichothecenes生物机合成制奠定分子生物学基础，促进trichothecenes类化合物在抗肿瘤药物先导化合物方面的开发利用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
背景技术
露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553是一种来源于药用植物广藿香的内生真菌，露湿漆斑菌是大豆的主要致病真菌，对大豆产量造成了不可估量的损失。据报道单端孢霉烯毒素是一种含有大环内酯结构的倍半萜类化合物，具有显著的细胞毒活性，是露湿漆斑菌的毒力因子。本课题组前期从露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553中分离得到了多种具有显著细胞毒活性的单端孢霉烯类化合物，其中部分化合物具有一定的特异性抗肿瘤活性，具有开发成为特异性抗肿瘤药物先导化合物的潜力。在此基础上，本课题组对M.roridum A553进行了转录组及基因组测序，从中发掘了单端孢霉烯的生物合成基因簇。从中发掘了单端孢霉烯生物合成的相关基因Tri18，预测其编码的酰基转移酶在大环单端孢霉烯骨架形成过程中发挥重要作用，但其如何通过生物合成生成D型大环单端孢霉烯仍需进一步解析。因此，建立M.roridum A553的基因敲除体体系对于验证单端孢霉烯的生物合成关键基因，进而解析其生物合成机制至关重要。
CRISPR/Cas9是近年来兴起的由sgRNA骨架介导Cas9核酸酶对靶向基因切割，通过非同源末端修复和同源重组途径使目的基因发生突变或缺失从而使目的基因失活的技术。研究者们不断发掘了nCa9和Cas12a等技术以提高CRISPR/Cas9的特异性和基因编辑效率。激活诱导性胞苷脱氨酶与CRISPR/Cas9结合可使碱基C变为T，从而使编码基因突变或失活，这比通过基因突变和基因删除具有更高的效率。CRISPR/Cas9系统由于构建简单，基因敲除效率相对较高，成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞和植物等真核细胞的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于植物内生真菌独特生境导致及相对复杂的遗传背景，且CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中敲除效率相对较低，目前CRISPR/Cas9系统尚未应用于露湿漆斑菌M.roridum A553目的基因敲除。
发明内容
本发明的目的在于克服目前露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553缺乏有效的遗传操作手段的现状，提供一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：
在pFC332载体基础上，设计Tri18基因的靶点序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'，设计并分别扩增5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为混合模板进行融合PCR，得到5S rRNA-Tri18-sgRNA片段；
用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pFC332载体和5SrRNA-Tri18-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5S rRNA-Tri18-sgRNA片段连接至pFC332载体中，连接产物转化至Trans5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5S rRNA-Tri18-sgRNA片段进行菌液PCR验证，由此获得适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。
优选，所述的5S rRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的含靶点序列的sgRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供根据所述的构建方法构建得到的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。
本发明还提供含有所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的真菌。
优选，所述的真菌为露湿漆斑菌A553。
本发明还提供所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体在露湿漆斑菌A553基因敲除中的应用。
优选，包括以下步骤：将所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体通过原生质体介导法导入露湿漆斑菌A553原生质体，用含有潮霉素的PDA平板筛选，挑取阳性克隆并提取基因组DNA扩增Cas9基因验证重组载体的导入，并通过测序验证目标基因的敲除。
本发明构建了适用于植物内生真菌露湿漆斑菌M.roridum A553的CRISPR/Cas9载体，并对新型单端孢霉烯的关键生物合成基因Tri18进行敲除，并通过代谢产物对比分析进一步验证目的基因的功能，为后期解析露湿漆斑菌M.roridum A553中单端孢霉烯trichothecenes生物机合成制奠定分子生物学基础，促进trichothecenes类化合物在抗肿瘤药物先导化合物方面的开发利用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前，真菌的基因敲除一般采取导入目的基因同源臂通过发生同源重组的方法实现基因敲除，但在目的基因被切割后，丝状真菌中存在非同源末端修复和同源重组两种修复方式，而同源重组发生的效率较低，因此丝状真菌目的基因的敲除效率较低。CRISPR/Cas9基因敲除系统具有载体构建简单、成本低、基因敲除效率相对较高等优势，Cas9蛋白通过对靶标序列NGG附近4bp左右的碱基进行双链切割，然后通过非同源末端修复实现目的基因的缺失、突变或插入等，从而终止目的基因的表达。因此CRISPR/Cas9系统十分适用于丝状真菌的遗基因敲除，验证活性次级代谢产物生物合成机制的同时从而发掘更多具有生物活性的先导化合物。
本发明的植物内生真菌露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553公开于专利申请号CN201811607953.9，发明名称为：一种露湿漆斑菌A553单端孢霉烯合酶基因Tri5启动子及其应用。
附图说明
图1为5S rRNA-Tri18-sgRNA片段构建；其中，泳道1-2为5S rRNA片段(即片段1)，泳道3为含靶点序列的sgRNA片段(即片段2)；
图2为M.roridum A553原生质体的制备；A，20倍显微镜观察结果；B，40倍显微镜观察结果；C，100倍显微镜观察结果；
图3为M.roridum A553 Tri18目的基因扩增图；图中Cas9下对应的标号分别为用引物Cas9-F和Cas9-R对1、4、5、7、10、12号阳性克隆扩增Cas9基因，图中18-Gene sgR1下对应的标号分别为用引物Tri 18F和Tri 18R对1、4、5、7、10、12号阳性克隆扩增Tri18基因；
图4为M.roridum A553 Tri18测序验证图；
图5为突变菌株ΔTri18 A553和野生M.roridum A553次级代谢产物比对图；图A为突变菌株ΔTri18 A553的次级代谢产物图，图B为野生M.roridum A553的次级代谢产物图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：靶向单端孢霉烯生物合成基因Tri18敲除载体的构建
设计露湿漆斑菌单端孢霉烯的生物合成基因Tri18(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的CRISPR/Ca9靶点序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'。
在pFC332质粒基础上，对pFC332进行PacI和BglII位点双酶切，插入了一段序列：5S rRNA-Tri18-sgRNA片段(即5S rRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子，其中包含在M.roridum A553中适用的5S rRNA启动子、在M.roridum A553中发挥作用的sgRNA靶向序列骨架基因及其终止子)。其中引物5S rRNA-sgRNA-F中包含了Tri18基因中的靶点序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'。
构建载体所设计的引物如表1所示，并利用酶切连接方式构建pFC332-sgRNA-Tri18载体。构建方法具体如下所示：
表1引物序列
以M.roridum A553基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5S rRNA-promoter-R为前后引物，用Prime STAR MAX(TAKARA,日本)高保真预混液进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5S rRNA启动子的片段1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，图1)。反应体系50μL：5S RNA-F 0.5μL，5S RNA-R 0.5μL，5S RNA 1μL，2×prime star 25μL，ddH2O 23μL。PCR程序：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，最后72℃延伸10min。
人工合成sgRNA及其终止子序列作为模板，以引物5SrRNA-sgRNA-F(含Tri18靶点gRNA)、sgRNA-Terminator-R为前后引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的片段2(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，图1)。
以上述制备得到的片段1，2为混合模板，用Prime STAR MAX(TAKARA,日本)高保真预混液进行融合PCR，从而得到5S rRNA-Tri18-sgRNA片段。对pFC332质粒进行PacI和BglII双酶切(Fermentas,USA)，与经同样的酶酶切后的5S rRNA-Tri18-sgRNA片段片段用T4 DNA连接酶进行连接至酶切后的pFC332，连接产物转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性LB筛选，菌液PCR验证，得到靶向Tri18基因的CRISPR/Cas9载体，命名为pFC332-sgRNA-Tri18。
实施例2：M.roridum A553单端孢霉烯生物合成基因Tri18的敲除：
外源基因导入M.roridum A553原生质体方法如下：
(1)M.roridum A553原生质体制备方法如下：
挑取适量M.roridum A553的菌丝体接种于200mL PDA液体培养基中，30℃、180r/min培养7天。用两层纱布将菌液过滤，挑选生长较好的菌球2g(湿重)于50mL离心管中，用PBS缓冲液洗涤两次，使残留的PDA培养基充分洗去。称取0.10g裂解酶溶解于20mL KC缓冲液(0.6M KCl、0.05M CaCl2)，并用0.22μm滤膜过滤，加入洗涤好的菌球中。28℃、68rpm裂解3小时左右。用200目的滤网过滤裂解液，过滤菌丝，再用6层擦镜纸再次过滤，4℃、4000×g离心5min，弃上清。加入5mL KC缓冲液，用移液枪将沉淀轻轻吹打混匀，4℃、4000×g离心5min，弃上清。加入1mL KC缓冲液，重悬，即原生质体制备完成，镜检，观察M.roridum A553原生质体的形态和数量；所制备的原生质体如图2所示。数量为3.0～8.0×107/mL；
将制备好的M.roridum A553原生质体(5×107/mL)与5μg pFC332-sgRNA-Tri18质粒混匀，置于冰上5min，然后再加入200μL体积分数30％PEG4000，30℃放置15min，再加入400μL PEG4000，30℃放置15min，然后加入1.2mL KC buffer终止反应，最后加入4mL的WI缓冲液放置于30℃摇床80rpm低速过夜培养，备用；
(2)将融化的PDA固体培养基冷却至室温后，每次取20mL与步骤(1)中过夜培养的溶液轻轻混匀，此外再加入终浓度为100μg/mL的潮霉素，混匀后均匀涂板，30℃培养5d；
(3)长出较小的菌丝体后，再挑取真菌菌落转移至含终浓度为100μg/mL潮霉素的PDA培养基上，再进行筛选；
(4)在步骤(3)中潮霉素PDA平板上长出的阳性克隆先进行保存(即挑取部分菌丝体转移至新的潮霉素PDA平板)，然后将剩余真菌菌丝体置于无菌EP管中，加入液氮充分研磨，立刻放在100℃的水浴锅中5min，然后再放在液氮中1min，重复该过程3次，最后加入50μL超纯水溶解，最大转速离心5min，取上清(即总基因组DNA)放置于-20℃保存。并设计Cas9基因前后引物Cas9-F和Cas9-R(见表1)扩增Cas9基因序列验证重组载体pFC332-sgRNA-Tri18是否导入成功(图3)；在成功导入基础上，设计靶向基因Tri18上下游引物(Tri 18 F,Tri 18 R，见表1)扩增Tri 18基因(图3)，测序比对验证(图4)。
对5个克隆的测序结果表明，其中一个克隆(对应图3中10号阳性克隆)在18-1Target sequence附近缺失16bp，说明成功敲除了Tri18基因，该菌株命名为突变菌株ΔTri18 A553。
实施例3：M.roridum A553野生株和突变株产物对比分析
对重组M.roridum A553(突变菌株ΔTri18 A553)和野生M.roridum A553进行接种，用YPD培养基进行培养，于28℃培养7天后。收集野生和重组M.roridum A553的发酵液，用等体积乙酸乙酯进行萃取，旋转蒸发浓缩，甲醇溶解产物，用HPLC和Agilent 6430液质联用仪对野生M.roridum A553和突变菌株ΔTri18 A553进行产物分析，用C18柱(4.6×250mm)进行分析检测。检测条件为：50min内洗脱液从30％甲醇增加至100％甲醇，流速为1.0mL/min。发现两者的峰图缺失发生了显著的变化(图5)。说明Tri18的突变对于M.roridum A553代谢产物的产生有显著影响。尚需要相关标准品进一步验证Tri18的突变对M.roridumA553生成单端孢霉烯的影响。上述结果进一步证实该CRISPR/Cas9系统适用于M.roridumA553目的基因的敲除，从而首次构建了药用植物内生真菌露湿漆斑菌的CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除体系。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> DNA
<213> 露湿漆斑菌A553(Myrothecium roridum A553)
<400> 1
cgcagatctc acatacgacc acagggtgtg gaaaacaggg cttcccgtcc gctcagccgt 60
acttaagcca cacgccggga ggttagtagt tgggtgggtg accaccagcg aatcccttct 120
gttgtatg 128
<210> 2
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaatccctt ctgttgtatg tcagttgatc gagaagatag gttttagagc tagaaatagc 60
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct 120
ttttttgttt tttatgtctg aattctgcag atatccatca cactggcggc cgctcgagca 180
tgcatctaga gggccgctta attaagac 208
<210> 3
<211> 1632
<212> DNA
<213> 露湿漆斑菌A553(Myrothecium roridum A553)
<400> 3
atgatggcct ccgtggacca actgaaagtt gatgtccttg tgacaccgaa gcaaaccatc 60
gacgatgagt cttaccttgc ttccggctcc gaacaatcgc catcttcacc cgtcgaatct 120
tccatcacct ccaattcccc gcctccatca gtcaacatgg acaaatctcc ctccaagccc 180
gagcaacctg ctcttcaact tccgacttta gatccctctg aattccgatg gcacccgtct 240
cctgcagaca gctccgtgct tcagaggaag gcaaatggcg tcgaggctct tgttggtatc 300
aaagatgcca acgccatcgg aacatacgat ttctactgca acatcgtctt gcgtgtgggc 360
gaattacccg gtgttacact tccacgtctc aagcgcgcct tcgccaaagc cctgctcgat 420
gcccgttttg agaacccttc aatctcttgc tacggttctt ggggacagaa caaggagcca 480
cacctgccgc acattcagta caagtccttc aaatctcaca gcgaagcgcg tgcttgggcc 540
aacagcatca tctccgtgcg ggcaacgaat ctgactactg ccgaattgcg tgctgaacgc 600
atcaaaaagc gcagagctgc ggcggtccaa aaacctgcca atcctctaga tatcatcatt 660
tctgctgatg tggccaatga gagagctcca cttccggctg gcaccagagt ggacatcatg 720
tgcctttaca accacctcag ctgggacggc aaaggccggt tttttgcttc cgagttggtg 780
aagcgcgctg ctgtgatatt ggaaaagcgt gaggagaaca atgtgcctcc tcaaaaatgg 840
ggcgaagaga aggcgaggct ggacccgccc attctggacg tcatgttggt gggtttggat 900
agagttgggc cagagtacga agctgttcac aggaagctct tgactagcca actacaagcc 960
ggagtaagtc aattcatctg tttatcatgc aatcaggcat gacatctgac agtgtattcg 1020
cggtttctga ggctaacaca atcaattcgt cactgtagtt gagttggggc cttccagtca 1080
ccaacaaccc aggagagcct cttcaattcc gttactgcct cagcatcgat gacagcaaga 1140
aaatcgcaga cgctgtcaaa acacgactgg gctccaaata caacattggt catgttggcc 1200
atgctgcaac agttctggct ctgctcaaac acaaccctat cccggcttct gctcgagatt 1260
cagcattcct cttttcccca ttacccgttg atgggcgcgg attccttgca gaggatcgca 1320
agacgcctcg ttacggaaac gctcaagccg ccgccgtcgt tgagttccag cgactggcgt 1380
cctgggacat caagggagaa gagcctgaag acctgaaagt cgccctagac aacctggcaa 1440
ggaaagtaaa ggaagggttg gattattggc tgggacagtc tgaatatctc ctgcccatca 1500
gcatcgccaa ccacaatttc gtgtcaagcc tcattgcgta cgtcaataat ccagaagtgc 1560
ttttgccctg gatattcttc cagctgacaa catcattcat ctagatcatc gaatgccgtc 1620
ccagaagtcc ac 1632
Claims (7)
1.一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
在pFC332载体基础上，设计Tri18基因的靶点序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'，设计并分别扩增5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为混合模板进行融合PCR，得到5S rRNA-Tri18-sgRNA片段；
用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pFC332载体和5SrRNA-Tri18-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5S rRNA-Tri18-sgRNA片段连接至pFC332载体中，连接产物转化至Trans5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5S rRNA-Tri18-sgRNA片段进行菌液PCR验证，由此获得适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的5S rRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的含靶点序列的sgRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种根据权利要求1或2所述的构建方法构建得到的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。
4.一种含有权利要求3所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的真菌。
5.根据权利要求4所述的真菌，其特征在于，所述的真菌为露湿漆斑菌A553。
6.权利要求3所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体在露湿漆斑菌A553基因敲除中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体通过原生质体介导法导入露湿漆斑菌A553原生质体，用含有潮霉素的PDA平板筛选，挑取阳性克隆并提取基因组DNA扩增Cas9基因验证重组载体的导入，并通过测序验证目标基因的敲除。
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