CN112553238B - 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明首次利用启动子优化后的新型CRISPR/Cas9系统构建二萜类新骨架化合物生物合成基因被敲除的重组拟盾壳霉FS482菌株，建立了一种高效的适用于深海真菌拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除体系，从而为拟盾壳霉FS482新型活性次级代谢产物的生物合成机制的阐明以及获得更多具有显著生物学活性的新型次级代谢产物奠定分子生物学基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
背景技术
深海真菌Paraconiothyrium hawaiiense FS482是一种来源于深海的拟盾壳霉，该真菌能产生具有抑制血管紧张素转化酶的新骨架二萜类化合物，因此具有发掘抗高血压类药物先导化合物的潜力。在此基础上，对P. hawaiiense FS482进行了基因组测序，预测了新骨架化合物的生物合成基因簇。预测该化合物由含有萜类环化酶、P450单加氧酶和甲基转移酶的cluster 66生物合成，P450单加氧酶对其骨架的形成及修饰都发挥重要功能。因此有必要对P450进行缺失以验证其在二萜类新骨架化合物生物合成过程中的功能。但是目前深海真菌P. hawaiiense FS482基因敲除体系尚未成功建立，限制了其活性次级代谢产物生物合成机制解析。因此，本发明将首次建立深海真菌P. hawaiiense FS482的基因敲除体系，从而为活性次级代谢产物生物合成机制的解析及通过合成生物学策略获得得更多新型衍生物奠定基础。
CRISPR/Cas9是一种由sgRNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行切割的基因编辑技术。通过对Cas9的突变及融合可使CRISPR/Cas9系统广泛应用于目的基因的转录激活、甲基化修饰和单碱基突变等。CRISPR/Cas9系统由于构建简单、基因敲除效率相对较高、可控性强、成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞、酵母、细菌的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于深海真菌独特生境导致的相对复杂的遗传背景，且CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中敲除效率相对较低。
发明内容
本发明的目的在于克服目前深海真菌缺乏有效的遗传操作手段的现状，提供一种适用于拟盾壳霉FS482（Paraconiothyrium hawaiiense FS482）的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
本发明首次将优化后的CRISPR/Cas9系统应用于深海真菌拟盾壳霉目的基因的敲除。
本发明的第一个目的是提供一种适用于丝状真菌的CRISPR/Cas9基因敲除载体，其是通过以下步骤制备得到的：
a. 采用限制性内切酶PacI 对pFC332载体进行酶切，对酶切后的pFC332载体进行回收；
b. 以pG-F: CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R: CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC为引物，以埃德菌FS110基因组DNA为模板，扩增并回收得到pG启动子片段；
c. 将pG启动子片段采用同源重组插入至酶切后的pFC332载体，菌液PCR和测序验证pG启动子的插入，构建得到pG-pFC332载体。
通过上述的构建方法，将pFC332载体中的原启动子替换为转录活性更强的pG启动子。
优选，所述的丝状真菌为拟盾壳霉FS482。
本发明还提供一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：
a. 在所述的pG-pFC332载体的基础上，设计P450基因的靶点序列5'-tcagttgatcgagaagatag-3'，设计并扩增5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为模板，进行融合PCR得到5SrRNA- P450-sgRNA片段；
b. 用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pG-pFC332载体、5SrRNA- P450-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5SrRNA- P450-sgRNA片段连接至pG-pFC332载体中，连接产物转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5SrRNA- P450-sgRNA片段进行验证，由此获得适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
优选，所述的5SrRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的含靶点序列的sgRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供按照所述的构建方法构建得到的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
本发明还提供一种CRISPR/Cas9载体应用于拟盾壳霉FS482中P450基因敲除的方法，将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体通过原生质体转化法导入拟盾壳霉FS482原生质体中，对目标基因进行敲除。
优选，以拟盾壳霉FS482基因组为模板扩增P450基因的上下游同源臂LR和RR，然后以LR和RR为模板进行融合PCR，得到LRR片段；通过PEG介导法将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体和LRR片段导入拟盾壳霉FS482原生质体，用潮霉素抗性PDA平板筛选阳性克隆，挑取克隆扩大培养提取基因组DNA验证重组载体的导入，并通过同源臂两端引物验证目标基因的敲除。
本发明构建了适用于深海真菌P. hawaiiense FS482的CRISPR/Cas9载体，并对新骨架抗肿瘤化合物的关键生物合成基因进行敲除，并通过代谢产物对比分析进一步验证目的基因的功能，为后期解析P. hawaiiense FS482中新骨架二萜类化合物生物机合成制奠定分子生物学基础。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前，真菌的基因敲除一般采取导入目的基因同源臂通过同源重组介导的方法进行基因敲除，但丝状真菌中存在非同源末端修复和同源重组两种修复方式，而同源重组发生的效率较低，因此导致丝状真菌的基因编辑进展缓慢，严重阻碍了丝状真菌的遗传操作改造和新型次级代谢产物的发掘。CRISPR/Cas9基因敲除系统具有载体构建简单，基因敲除效率相对较高等优势。本发明通过导入更高效的重组pG-pFC332载体和P450目的基因的同源臂，敲除效率达到100%。因此新型CRISPR/Cas9载体介导的同源重组具有高效敲除目的基因的优势，从而为解析P. hawaiiense FS482中活性次级代谢产物生物合成机制并促进其代谢工程改造。
本发明涉及的拟盾壳霉FS482（Paraconiothyrium hawaiiense FS482）已于2019年12月11日公开于非专利文献（网页）中，其网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN788608.1/，该菌种申请人本人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
本发明涉及的埃德菌（Dichotomomyces cejpii）FS110公开于专利申请号201711107680.7，发明名称为：一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。
附图说明
图1为pG-pFC332重组载体的构建；其中，泳道1-5为以重组菌为模板，扩增pG启动子菌液PCR结果；
图2为重组载体pG-pFC332-sgRNA的构建图：图A为融合片段5SrRNA- P450-sgRNA片段的获得；图B为融合片段5SrRNA- P450-sgRNA片段插入pG-pFC332-sgRNA载体的验证；
图3为P. hawaiiense FS482 P450基因左右同源臂融合片段的获得；
图4为 潮霉素抗性平板筛选获得的P. hawaiiense FS482转化子；
图5为 P. hawaiiense FS482野生菌和重组菌DNA为模板 P450同源片段的扩增；
图6 为P. hawaiiense FS482 P450基因同源片段测序验证图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：靶向新骨架二萜化合物生物合成基因敲除载体的构建
在原始pFC332质粒基础上，对pFC332进行PacI单酶切，在pFC332载体Cas9基因启动子两侧设计同源臂序列，结合埃德菌（Dichotomomyces cejpii）FS110启动子pG碱基序列（pG启动子经体外荧光素酶转录活性实验和潮霉素抗性基因筛选酵母实验证实具有比pgpdA启动子更强的转录活性），设计引物序列pG-F: CATCTAGAGGGCCGCTTAATgaggaccgctcgtcccctat和pG-R: ctagtaatgcgtagaggtgcgtctgccatggtgatgggac；以埃德菌（Dichotomomyces cejpii）FS110基因组为模板，以上述的pG-F和pG-R为引物，扩增pG启动子序列。PCR程序：94℃预变性5 min；94℃变性10 s，55℃退火 15 s，72℃延伸10 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。回收pG 启动子，采用同源重组试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司）将pG启动子插入pFC332载体；用Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit试剂盒将pG启动子通过同源重组连接至已纯化的双酶切pFC332载体，所采用连接体系为：pG启动子 2μL，pFC332 1 μL，Hieff Clone预混液 10 μL，ddH2O 7 μL，总体系20 μL；将连接混合液用移液枪轻轻吹打混匀，50℃孵育30 min。转化DH5α，用含Amp的LB平板筛选，挑取克隆扩大培养，用pG-F和pG-R为引物进行菌液PCR验证，结果如图1所示，泳道1#, 2#, 3#和5#均扩增得到目的片段，经测序验证，pG启动子成功插入pFC332载体，由此构建得到重组的pG-pFC332载体。
然后将含有靶标的sgRNA序列插入至pG-pFC332载体：5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子（5SrRNA- P450-sgRNA片段）通过融合PCR获得。其中引物5SrRNA-sgRNA-F中包含了目标基因P450 ctg417（P450基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示）中的靶标序列tcagttgatcgagaagatag。
构建载体所设计的引物如表1所示，并利用酶切连接方式构建pG-pFC332-sgRNA-P450载体。构建方法具体如下所示：
以P. hawaiiense FS482基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-promoter-R为前后引物，用Prime STAR MAX (TAKARA, 日本）高保真预混液进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）。人工合成sgRNA及其终止子序列，以引物5SrRNA-sgRNA-F（含P450靶点gRNA）、sgRNA-Terminator-R为前后引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的含靶点序列的sgRNA片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示）。以上述制备得到的5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为混合模板，用Prime STAR MAX (TAKARA, 日本）高保真预混液进行融合PCR，从而得到5SrRNA- P450-sgRNA片段（图2A）。对pG-pFC332质粒进行PacI和BglII双酶切（Fermentas, USA），对得到的5SrRNA- P450-sgRNA片段进行PacI和BglII双酶切，将酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性LB平板37℃筛选，通过扩增融合片段进行菌液PCR，成功获得250 bp左右的5SrRNA- P450-sgRNA片段（图2B）并测序验证，得到靶向P. hawaiiense FS482中 P450基因的CRISPR/Cas9载体，命名为pG-pFC332-sgRNA-P450。
基因P450 ctg417同源臂的扩增与融合：以P. hawaiiense FS482基因组为模板，以表1 中的引物 LR-F和LR-R扩增左同源臂LR，长度约为750 bp；以P. hawaiiense FS482基因组为模板，以表1 中的引物 RR-F和RR-R扩增右同源臂RR，长度约为750 bp（图3）；然后以LR和RR为混合模板，用Prime STAR MAX (TAKARA, 日本）高保真预混液进行融合PCR，PCR程序：94℃预变性5 min，94℃变性10 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。获得1500 bp左右的融合片段LRR（图3）。
实施例2
P. hawaiiense FS482中 P450基因生物合成基因的敲除：
外源基因导入P. hawaiiense FS482 原生质体方法如下：
（1）P. hawaiiense FS482原生质体制备方法如下：
挑取适量P. hawaiiense FS482的菌丝接种于200 mL PDA液体培养基中，30℃、180 r/min培养7天。用两层纱布将菌液过滤，挑选生长较好的菌球2 g（湿重）于50 mL离心管中，用PBS缓冲液洗涤两次，使残留的PDA培养基充分洗去。称取0.15 g溶菌酶（sigma,USA)溶解于20 mL KC缓冲液（0.6 M KCl、0.05 M CaCl2），并用0.22 μm滤膜过滤，加入洗涤好的菌球中。28℃、68 rpm裂解3小时左右。用200目的滤网过滤裂解液，过滤菌丝，再用8层无菌擦镜纸再次过滤，4℃、4000 × g离心5 min，弃上清。加入5 mL KC缓冲液，用移液枪将沉淀轻轻吹打混匀，4℃、4000 × g离心5 min，弃上清。加入1 mL KC缓冲液，重悬，即原生质体制备完成，镜检，观察P. hawaiiense FS482原生质体的形态和数量。
将制备好的P. hawaiiense FS482原生质体（1×108/ mL）与 5 μg pG-pFC332-sgRNA-P450质粒以及3μg同源臂融合产物LRR混匀，置于冰上5 min，然后再加入200 μL 体积分数30% PEG4000，30℃放置15 min，再加入400 μL PEG4000，30℃放置15 min，然后加入1.2 mL W5溶液终止反应，最后加入4 mL的WI缓冲液放置于30℃摇床80 rpm低速过夜培养；
（2）将融化的PDA固体培养基冷却至室温后，每次取20 mL与步骤（1）中过夜培养的溶液轻轻混匀，此外再加入终浓度为100 μg/mL的潮霉素，混匀后均匀涂板，30℃培养5 d；
（3）长出较小的菌丝体后，再挑取真菌菌落转移至含终浓度为50 μg/mL潮霉素的PDA培养基上，再进行筛选；
（4）在步骤（3）中潮霉素PDA平板上长出的阳性克隆（图4）菌丝先进行保存（即挑取部分菌丝转移至新的潮霉素PDA平板），然后将剩余真菌菌丝置于无菌EP管中，加入液氮充分研磨，然后立刻放在100℃的水浴锅中5 min，然后再放在液氮中1 min，重复该过程3次，最后加入50 μL超纯水溶解，最大转速离心5 min，取上清（即总基因组 DNA）放置于-20℃保存。采用LR-F和RR-R扩增目的片段，并在右同源臂中间设计引物Ver-R，和LR-F（见表1）扩增同源臂验证目的基因是否成功缺失以及同源臂是否整合在基因组中；结果表明，以野生P. hawaiiense FS482基因组DNA为模板时可扩增获得2.8 kb左右含有P450基因的同源片段，而以突变株为模板仅获得1.1 kb左右的P450基因缺失的同源臂融合片段（图5），通过测序验证，P450目的基因（1.7 kb)通过同源重组完全缺失（图6）。证实所导入同源臂片段成功整合至P. hawaiiense FS482基因组中，并成功敲除P450目的基因。结果表明，本发明所构建的优化后的pG-pFC332-sgRNA-P450 新型CRIPSR/Cas9系统载体能成功敲除深海真菌P. hawaiiense FS482中的目的基因，而且该筛选平板上仅长出一个克隆，经验证目的基因被成功敲除。经过重复验证结果亦然，说明本发明中新型CRIPSR/Cas9系统介导的同源重组敲除目的基因效率达100%，本发明同样也适用于其他丝状真菌，从而为丝状真菌目的基因的缺失提供了一种可靠的方法。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> DNA
<213> 拟盾壳霉FS482(Paraconiothyrium hawaiiense FS482)
<400> 1
cgcagatctc acatacgacc acagggtgtg gaaaacaggg cttcccgtcc gctcagccgt 60
acttaagcca cacgccggga ggttagtagt tgggtgggtg accaccagcg aatcccttct 120
gttgtatg 128
<210> 2
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaatccctt ctgttgtatg tcagttgatc gagaagatag gttttagagc tagaaatagc 60
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct 120
ttttttgttt tttatgtctg aattctgcag atatccatca cactggcggc cgctcgagca 180
tgcatctaga gggccgctta attaagac 208
<210> 3
<211> 1721
<212> DNA
<213> 拟盾壳霉FS482(Paraconiothyrium hawaiiense FS482)
<400> 3
atgggtgggc actggcatct tgtcgtccaa gaagctcata aaagctacgg tacgtacact 60
catgctttat gatcgagctt atccctaatc tgacgacctg ggtaggcgac gtgctacgtg 120
tgagcccaaa cgaactgtct tttgccaacg ccagtgcttg gaaatccata tatggtgtcc 180
aaaaaggcgc accaatcacg aagtcggaat tctgggatat gataggtctg ggattcgacg 240
ctgcatccat tggctcagaa cgagattacc acgctgcttt acggaaacgc gaattgtttg 300
ctgaagcgtt ctctgacaga aatttggcca aacaagaacc tattatgcaa atcttcgtta 360
atcagttgat cgagaagata gggaagctag gtaacactga tgttggaata gacatggaca 420
agtggttcgt gtactttagc ttcgacttga cggggaaaat ggcgttcggg gagtccttcg 480
cctgtcttga aaaaggttgt tacaccgttg tattgtccta catgagagag actgaccatt 540
tgatacagag acgtcacatg aatggctcga tctcattctg cctctctttt tcattgtcaa 600
cgtagccgat aatttcagac gccttccatt cgtagtgacg ctggctagca tgattcccac 660
aaaatggacg aatggcatcc gtagtaagat tgttaaatat tccaaggacc agactgcaaa 720
gtacgtcgtg ttctttcagt gaattggacg aaagcttcaa ctaaatatct ggcaatagac 780
gccttcaggt gaccagtatg cagaatgact ttttcgataa tgtgtccgac aaagttcgga 840
aaggcgaagt ctctgaggaa gaaatggccg ctcatctatt caccttgagg tgagtccccc 900
tgtcaggtgc tgccttgagc tggatgacca aagtgcctaa tacgctagta gtgttgcagc 960
aggagagaca tccgcaacag caatgagcgg aatgctttat tacttgctca gcactcccat 1020
ggcgcatgaa aagctcaaaa gcgaagttcg cggggcgtac gagaatgctc aggacatcga 1080
tattgcttca acccttaggt taccatatct ccaagcggtg ttcaaagaag caatgcgaat 1140
atttcccgta gtgccacaag gcctaccgcg cctgtcgcct ggagctgtga tcgaaggaac 1200
ttatgttcca caaggagtga gatagtatca caatccggct cattgcatat atgcctaaca 1260
ttcggcagac tgagatatat gtgtctggat gggcagtcac ccatgatgag cgctactttc 1320
atgagccata cactttcaaa ccagagcgct ggattgatcc agaatgtcag gacgtgaagc 1380
aggcgagcca accgttcgcc cttggacctc gtgtttgtcc aggaaaacgg tgagagactt 1440
tggccctaac aatgaagttg tagctcacgc ctccagtttt gcattctccc aaatgtcact 1500
tcaattggcg aagatggtct atctgtatga catggaactc cttgacagca gccgcaattg 1560
gaggtcggat tgtagggtcc actacttttg gtggaaaccg gctctgaacg tgcgcttcaa 1620
accgcgcgga cttagctttg tcgtaacgca aggtggctga gtaaattgtc cttcagatgc 1680
acttcacccc tggagagact ctgcgcgtga cgtctctcta g 1721
Claims (4)
1.一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.采用限制性内切酶PacI对pFC332载体进行酶切，对酶切后的pFC332载体进行回收；
b.以 pG-F:CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R:CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC 为引物，以埃德菌FS110基因组DNA为模板，扩增并回收得到pG启动子片段；
c.将pG启动子片段采用同源重组插入至酶切后的pFC332载体，菌液PCR和测序验证pG启动子的插入，构建得到pG-pFC332载体；
d.在所述的pG-pFC332载体的基础上，以P450基因的靶点序列5'-tcagttgatcgagaagatag-3'，设计并扩增5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为模板，进行融合PCR得到5SrRNA-P450-sgRNA片段；
e.用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pG-pFC332载体、5SrRNA-P450-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5SrRNA-P450-sgRNA片段连接至pG-pFC332载体中，连接产物转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5SrRNA-P450-sgRNA片段进行验证，由此获得适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体；
所述的丝状真菌为拟盾壳霉FS482，所述的5SrRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的含靶点序列的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.按照权利要求1所述的构建方法构建得到的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
3.一种CRISPR/Cas9载体应用于拟盾壳霉FS482中P450基因敲除的方法，其特征在于，将权利要求2所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体通过原生质体转化法导入拟盾壳霉FS482原生质体中，对目标基因进行敲除。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以拟盾壳霉FS482基因组为模板扩增P450基因的上下游同源臂，然后进行融合PCR，得到含有P450基因的上下游同源臂的基因片段；通过PEG介导法将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体和所述基因片段导入拟盾壳霉FS482原生质体，用潮霉素抗性PDA平板筛选阳性克隆，挑取克隆扩大培养提取基因组DNA验证重组载体的导入，并通过同源臂两端引物验证目标基因的敲除。
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