JPH01157393A - 酵母における安定なゲノム組込みおよび外来コーディング配列の発現 - Google Patents
酵母における安定なゲノム組込みおよび外来コーディング配列の発現Info
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- JPH01157393A JPH01157393A JP63243737A JP24373788A JPH01157393A JP H01157393 A JPH01157393 A JP H01157393A JP 63243737 A JP63243737 A JP 63243737A JP 24373788 A JP24373788 A JP 24373788A JP H01157393 A JPH01157393 A JP H01157393A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、強力な酵母プロモーターによって制御される
外来コーディング配列を含有するＴｙベースのベクター
を用いることによって宿主酵母染色体中へ逆転写酵素介
在転位を行う方法に関する。
外来コーディング配列を含有するＴｙベースのベクター
を用いることによって宿主酵母染色体中へ逆転写酵素介
在転位を行う方法に関する。
発明の背景
ペーケら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）は、セル
（Ｃｅｌｌ）、４０．４９１−５００（１９８５）機能
性Ｔｙｌ要素に係るＴｙ１転位についての効果的なアッ
セイを展開している。ＧＡＬ ｌプロモーターに制御さ
れたＴｙｌ要素（ＴｙＨ３）はマルチコピー２ミクロン
、ＵＲＡ３プラスミド、に包含され、低温にて炭素源と
してのガラクトース上で細胞を増殖させた場合、転位が
誘導される。さらに、転位をあまり抑制することなく短
鎖ＤＮＡ配列（すなわち、４０ｂｐ ＩａｃＯフラグ
メント）が（３’ＬＴＲ近くの）Ｔｙｌ非必須領域に挿
入された。
（Ｃｅｌｌ）、４０．４９１−５００（１９８５）機能
性Ｔｙｌ要素に係るＴｙ１転位についての効果的なアッ
セイを展開している。ＧＡＬ ｌプロモーターに制御さ
れたＴｙｌ要素（ＴｙＨ３）はマルチコピー２ミクロン
、ＵＲＡ３プラスミド、に包含され、低温にて炭素源と
してのガラクトース上で細胞を増殖させた場合、転位が
誘導される。さらに、転位をあまり抑制することなく短
鎖ＤＮＡ配列（すなわち、４０ｂｐ ＩａｃＯフラグ
メント）が（３’ＬＴＲ近くの）Ｔｙｌ非必須領域に挿
入された。
ベークら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）は、セル
（Ｃｅｌｌ）、を隻、４９１−５００（１９８５）、遺
伝的に標識されたＴｙｌ要素（すなわち、１ａｃＯセグ
メントを含有するＴｙｌ要素）が制御可能な酵母のＧＡ
ＬＩプロモーターに融合され、ガラクトース誘導に際し
、標識した要素およびゲノムＴｙｌ要素の転位頻度が共
に劇的に増加するＴｙ１転位を研究するための系を記載
している。また、ベークら（Ｂｏｅｋｅ ａｔ ａ、
Ｉ。
（Ｃｅｌｌ）、を隻、４９１−５００（１９８５）、遺
伝的に標識されたＴｙｌ要素（すなわち、１ａｃＯセグ
メントを含有するＴｙｌ要素）が制御可能な酵母のＧＡ
ＬＩプロモーターに融合され、ガラクトース誘導に際し
、標識した要素およびゲノムＴｙｌ要素の転位頻度が共
に劇的に増加するＴｙ１転位を研究するための系を記載
している。また、ベークら（Ｂｏｅｋｅ ａｔ ａ、
Ｉ。
）は、ドナーＴｙｌに埋め込まれたイントロン（３９８
ヌクレオチドの酵母リポソーム蛋白５１遺伝子イントロ
ン、ｒｐ５１）が転位の間にＴｙｌ要素から正しくスプ
ライシングされ、これはＴｙｉ ＲＮＡが転位におけ
る中間体であることを証明するものであると記載してい
る。さらに、ベークら（Ｂ ｏｅｋｅｅｔ、 ａｌ、
）は、転位の間に起こるＬＴＲ間の配列多形の挙動はレ
トロウィルスの逆転写モデルに従うと結論している。ベ
ークら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、）は、遺伝的に
標識したＴｙｌ要素の転写に関しては何等観察しておら
ず、また何等示唆していない。
ヌクレオチドの酵母リポソーム蛋白５１遺伝子イントロ
ン、ｒｐ５１）が転位の間にＴｙｌ要素から正しくスプ
ライシングされ、これはＴｙｉ ＲＮＡが転位におけ
る中間体であることを証明するものであると記載してい
る。さらに、ベークら（Ｂ ｏｅｋｅｅｔ、 ａｌ、
）は、転位の間に起こるＬＴＲ間の配列多形の挙動はレ
トロウィルスの逆転写モデルに従うと結論している。ベ
ークら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、）は、遺伝的に
標識したＴｙｌ要素の転写に関しては何等観察しておら
ず、また何等示唆していない。
ガルフィンケルら（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ ｅｔ ａ
ｔ、 ）は、セル（Ｃｅｌｌ）、土２，５０７−５１７
（１９８５）、ＧＡＬＩプロモーターの制御下で、１ａ
ｃＯセグメントを含有するＴｙｌ要素（ＴｙＨ３）を有
するプラスミドを含有する転位誘導された細胞中に、Ｔ
ｙｌにコード付けされた逆転写酵素の活性が実際に存在
すると記載している。
ｔ、 ）は、セル（Ｃｅｌｌ）、土２，５０７−５１７
（１９８５）、ＧＡＬＩプロモーターの制御下で、１ａ
ｃＯセグメントを含有するＴｙｌ要素（ＴｙＨ３）を有
するプラスミドを含有する転位誘導された細胞中に、Ｔ
ｙｌにコード付けされた逆転写酵素の活性が実際に存在
すると記載している。
ベークら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）は、酵母
遺伝学および分子生物学についての第１２回国際会議（
Ｔ＋ｙｓｌｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ０ｎＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、ニシンバラ、スコツトラン１’、９月１７
〜２１日、１９８４年、ＧＡＬＩプロモーター要素が２
つの異なるＴＶ要素、Ｔｙｌ ７３（ＬＹＳ２遺伝子に
おけるノックアウト突然変異として単離したＴｙ要素）
およびＴｙＨ３（ｈｉｓ ３Δ４の復帰変異体（プロ
モーター欠失）として単離したＴｙ要素）の転写を促進
する、２ミクロンベクター上での遺伝子融合（ｐＧＴｙ
ｌ ７３およびｐＧＴｙＨ３）を記載している。また、
ベークら（Ｂｏｅｋｅ ａｔ ａｌ、 ）は、ｐＧ
ＴｙＨ３およびｐＧＴｙｌ ７３で形質転換した細胞が
グルコース含有培地上で正常に増殖するが、ＧＡＬＬプ
ロモーターが誘導された場合、ｐＧＴｙ１７３によって
わずかに、ｐＧＴｙＨ３によってかなり増殖が抑制され
ると記載している。また、ベークら（Ｂｏｅｋｅ ｅ
ｔ ａｔ、 ）は、Ｔｎ９０３からのＫｍ’遺伝子が
ＴＶ要素のオーブンリープづングフレームに対応する２
つの地点に挿入されるｐＧＴｙＨ３プラスミドのインサ
ージョン突然変異を記載している。ベークら（Ｂｏｅｋ
ｅ ｅｔ ａｌ、 ）は、（ａ）ｐＧＴｙＨ３、ｐ
ｃ、”ｒｙｔ ７３またはｐＧＴｙＨ３インターナルイ
ンサージョン突然変異プラスミドの転位、または（ｂ）
ｐＧＴｙＨ３インターナルインサージョン突然変異体プ
ラスミドで形質転換した細胞によるＫｍ’遺伝子の転写
については何等観察も示唆もしていない。
遺伝学および分子生物学についての第１２回国際会議（
Ｔ＋ｙｓｌｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ０ｎＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、ニシンバラ、スコツトラン１’、９月１７
〜２１日、１９８４年、ＧＡＬＩプロモーター要素が２
つの異なるＴＶ要素、Ｔｙｌ ７３（ＬＹＳ２遺伝子に
おけるノックアウト突然変異として単離したＴｙ要素）
およびＴｙＨ３（ｈｉｓ ３Δ４の復帰変異体（プロ
モーター欠失）として単離したＴｙ要素）の転写を促進
する、２ミクロンベクター上での遺伝子融合（ｐＧＴｙ
ｌ ７３およびｐＧＴｙＨ３）を記載している。また、
ベークら（Ｂｏｅｋｅ ａｔ ａｌ、 ）は、ｐＧ
ＴｙＨ３およびｐＧＴｙｌ ７３で形質転換した細胞が
グルコース含有培地上で正常に増殖するが、ＧＡＬＬプ
ロモーターが誘導された場合、ｐＧＴｙ１７３によって
わずかに、ｐＧＴｙＨ３によってかなり増殖が抑制され
ると記載している。また、ベークら（Ｂｏｅｋｅ ｅ
ｔ ａｔ、 ）は、Ｔｎ９０３からのＫｍ’遺伝子が
ＴＶ要素のオーブンリープづングフレームに対応する２
つの地点に挿入されるｐＧＴｙＨ３プラスミドのインサ
ージョン突然変異を記載している。ベークら（Ｂｏｅｋ
ｅ ｅｔ ａｌ、 ）は、（ａ）ｐＧＴｙＨ３、ｐ
ｃ、”ｒｙｔ ７３またはｐＧＴｙＨ３インターナルイ
ンサージョン突然変異プラスミドの転位、または（ｂ）
ｐＧＴｙＨ３インターナルインサージョン突然変異体プ
ラスミドで形質転換した細胞によるＫｍ’遺伝子の転写
については何等観察も示唆もしていない。
今回、修飾したエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖ
ｉ−ｓｉａｅ）ＴｙｌまたはＴｙ２要素よりなるベクタ
ー系を用いることによって、適当な酵母プロモーターに
よって制御される外来コーディング配列の酵母染色体へ
の安定な逆転写酵素介在転移および組込みが誘導できる
ことが判明した。かかる修飾したＴｙｌまたはＴｙ２要
素は強力な酵母プロモーターを有する発現カセットを含
有し、２キロベース（ｋｂ）もの大きなサイズを有する
注目の外来遺伝子（例えば、ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫまた
はｐＣＵ Ｐ １− ＧＡＬＫ）が比較的効率よく転位
され得る。事実、（転位誘導後のスクリーニングによっ
て観察されるごと＜）１回の実験でゲノムあたりいくつ
かの転位現象が得られる。高コピー数の組み込まれたベ
クターが多数回転位サイクルの後に得られる。該コピー
は染色体へ安定に組み込まれ、かつ分散させられ（縦列
反復せず）、選択圧の不存在において宿主の広範な増殖
を可能とする。他方、プラスミドは通常分離偏りを有す
るが、かかる組み込まれたベクターは細胞集団に均等に
分配されることに注意することが重要である。かくして
、本発明の方法は、明確なレベルでの、かつ効率が各細
胞集団で同一である注目の外来コーディング配列産生物
の合成を可能とする。また、エス・セレビシエ（Ｓ。
ｉ−ｓｉａｅ）ＴｙｌまたはＴｙ２要素よりなるベクタ
ー系を用いることによって、適当な酵母プロモーターに
よって制御される外来コーディング配列の酵母染色体へ
の安定な逆転写酵素介在転移および組込みが誘導できる
ことが判明した。かかる修飾したＴｙｌまたはＴｙ２要
素は強力な酵母プロモーターを有する発現カセットを含
有し、２キロベース（ｋｂ）もの大きなサイズを有する
注目の外来遺伝子（例えば、ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫまた
はｐＣＵ Ｐ １− ＧＡＬＫ）が比較的効率よく転位
され得る。事実、（転位誘導後のスクリーニングによっ
て観察されるごと＜）１回の実験でゲノムあたりいくつ
かの転位現象が得られる。高コピー数の組み込まれたベ
クターが多数回転位サイクルの後に得られる。該コピー
は染色体へ安定に組み込まれ、かつ分散させられ（縦列
反復せず）、選択圧の不存在において宿主の広範な増殖
を可能とする。他方、プラスミドは通常分離偏りを有す
るが、かかる組み込まれたベクターは細胞集団に均等に
分配されることに注意することが重要である。かくして
、本発明の方法は、明確なレベルでの、かつ効率が各細
胞集団で同一である注目の外来コーディング配列産生物
の合成を可能とする。また、エス・セレビシエ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノム配列のうちほとんどは古
典的増殖条件において必須ではないので、本発明の方法
は、発現カセットを高コピー数でゲノムに導入すること
を可能とする。
典的増殖条件において必須ではないので、本発明の方法
は、発現カセットを高コピー数でゲノムに導入すること
を可能とする。
発明の開示
本発明は、機能性ＴｙｌまたはＴ ｙ ２要素に作動可
能に連結したプロモーター、好ましくは誘導性プロモー
ターよりなり、該ＴｙｌまたはＴｙ２要素が外来コーデ
ィング配列に作動可能に連結した強力な酵母プロモータ
ーを含有する発現カセットよりなることを特徴とするベ
クターを提供するものである。
能に連結したプロモーター、好ましくは誘導性プロモー
ターよりなり、該ＴｙｌまたはＴｙ２要素が外来コーデ
ィング配列に作動可能に連結した強力な酵母プロモータ
ーを含有する発現カセットよりなることを特徴とするベ
クターを提供するものである。
また、本発明は、かかるベクターで形質転換した宿主酵
母細胞、好ましくはエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）；および強力な酵母プロモーターが機
能するのが可能な条件下でかかる形質転換宿主酵母細胞
、好ましくはエス・セレビシエ（Ｓ。
母細胞、好ましくはエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）；および強力な酵母プロモーターが機
能するのが可能な条件下でかかる形質転換宿主酵母細胞
、好ましくはエス・セレビシエ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を培養することを特徴とする安
定なゲノム組込みおよび外来コーディング配列の発現を
行う方法を提供するものである。
定なゲノム組込みおよび外来コーディング配列の発現を
行う方法を提供するものである。
「発現カセット」なる語は、酵母中で完全な遺伝子発現
単位として機能するＤＮＡの独立区分されたいずれの領
域も意味する。「完全な遺伝子発現単位」なる語は、構
造遺伝子およびプロモーターならびにその転写および翻
訳に必要な調節領域を意味する。「プロモーター」なる
語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合およびコーディング配
列の転写が起こるのを可能とする、構造遺伝子のコーデ
ィング配列から上流のいずれの領域も意味する。「調節
領域」は、遺伝子の転写を調節するいずれの領域も意味
する。「構造遺伝子」は、ＲＮＡ合成用の鋳型として働
き、酵母中において注目する蛋白の合成を可能とするコ
ーディング配列を意味する。
単位として機能するＤＮＡの独立区分されたいずれの領
域も意味する。「完全な遺伝子発現単位」なる語は、構
造遺伝子およびプロモーターならびにその転写および翻
訳に必要な調節領域を意味する。「プロモーター」なる
語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合およびコーディング配
列の転写が起こるのを可能とする、構造遺伝子のコーデ
ィング配列から上流のいずれの領域も意味する。「調節
領域」は、遺伝子の転写を調節するいずれの領域も意味
する。「構造遺伝子」は、ＲＮＡ合成用の鋳型として働
き、酵母中において注目する蛋白の合成を可能とするコ
ーディング配列を意味する。
「誘導性プロモーター」なる語は、エス・セレビシエ（
Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のごとき宿主酵母細胞
中で機能するプロモーターであって、その活性が外部の
信号または状態、例えば温度変化、栄養物の存在または
不存在等によって制御されるものを意味する。
Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のごとき宿主酵母細胞
中で機能するプロモーターであって、その活性が外部の
信号または状態、例えば温度変化、栄養物の存在または
不存在等によって制御されるものを意味する。
［機能性ＴｙｌまたはＴｙ２要素」なる語は、外来遺伝
子のコーディング配列に作動可能に連結した強力な酵母
プロモーターよりなり、かかる要素で形質転換されたエ
ス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のご
とき宿主酵母細胞のゲノム中に転位されるその能力を依
然保持している、天然に生じるＴｙｌまたはＴｙ２要素
のいずれの誘導体も意味する。
子のコーディング配列に作動可能に連結した強力な酵母
プロモーターよりなり、かかる要素で形質転換されたエ
ス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のご
とき宿主酵母細胞のゲノム中に転位されるその能力を依
然保持している、天然に生じるＴｙｌまたはＴｙ２要素
のいずれの誘導体も意味する。
「作動可能に連結した」なる語は、プロモーターおよび
コーディング配列がコーディング配列の転写および翻訳
を可能とするように融合していることを意味する。
コーディング配列がコーディング配列の転写および翻訳
を可能とするように融合していることを意味する。
「強力な酵母プロモーター」なる語は、エス・セレビシ
エ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のごとき宿主酵母
細胞中で機能し、かつ酵母中で高発現レベルにて異種蛋
白の産生を可能とするプロモーターを意味する。
エ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のごとき宿主酵母
細胞中で機能し、かつ酵母中で高発現レベルにて異種蛋
白の産生を可能とするプロモーターを意味する。
［外来コーディング配列」なる語は、宿主酵母細胞ゲノ
ム内で天然に生じないコーディング配列を意味する。
ム内で天然に生じないコーディング配列を意味する。
「転位」なる語は、従前に存在するＴＶ要素によって占
められていない位置における、本発明のベクターの機能
性ＴｙｌまたはＴｙ２要素の宿主酵母細胞染色体への逆
転写酵素介在非相同挿入を意味する。転位が現実に起こ
るメカニズムはベーケら（Ｂｏｅｋｅ、 ｅｔ ａ
ｔ、 ）、セル（Ｃｅｌｌ）、４０．４９１−５００（
１９８５）、にかなり詳細に記載されている。
められていない位置における、本発明のベクターの機能
性ＴｙｌまたはＴｙ２要素の宿主酵母細胞染色体への逆
転写酵素介在非相同挿入を意味する。転位が現実に起こ
るメカニズムはベーケら（Ｂｏｅｋｅ、 ｅｔ ａ
ｔ、 ）、セル（Ｃｅｌｌ）、４０．４９１−５００（
１９８５）、にかなり詳細に記載されている。
「トランスクリブション・ラン・スルー」なる語は、本
発明のベクターの機能性ＴｙｌまたはＴｙ２要素の完全
な転写を意味する。
発明のベクターの機能性ＴｙｌまたはＴｙ２要素の完全
な転写を意味する。
第１ （ａ）図は、実施例に記載されるベクターで用い
るＧＡＬＫ発現カセットを組み立てるのに用いる適合イ
ー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＧＡＬＫ構造遺伝子を示す
。かかるＧＡＬＫは修飾されたアミノ末端領域を含有す
るが、活性なガラクトキナーゼをコード付けする。
るＧＡＬＫ発現カセットを組み立てるのに用いる適合イ
ー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＧＡＬＫ構造遺伝子を示す
。かかるＧＡＬＫは修飾されたアミノ末端領域を含有す
るが、活性なガラクトキナーゼをコード付けする。
第１ （ｂ）図は、ＣＡＲｌ（アルギナーゼ）、ＡＲＧ
３（オルニチントランスカルバミラーゼ）およびＣＵＰ
ｌ（メタロチオネイン）遺伝子の５′末端を示す。各
５′領域はＡＴＧの後にＢａｍ８１部位を含有し、それ
によりＧＡＬＫどの機能的連結を可能とする。
３（オルニチントランスカルバミラーゼ）およびＣＵＰ
ｌ（メタロチオネイン）遺伝子の５′末端を示す。各
５′領域はＡＴＧの後にＢａｍ８１部位を含有し、それ
によりＧＡＬＫどの機能的連結を可能とする。
第１ （Ｃ）図は、発現カセットをつくるための、Ｂａ
ｍＨＩ部位を用いるＣＡＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰ
ｌプロモーター領域とＧＡＬＫコーディング配列との連
結を示す。
ｍＨＩ部位を用いるＣＡＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰ
ｌプロモーター領域とＧＡＬＫコーディング配列との連
結を示す。
第２（ａ）図、バートＡはｐＧＡＬ １−ＴＹ １組立
体を含有するｐＪｅｆ１２６７の構成を示す。
体を含有するｐＪｅｆ１２６７の構成を示す。
第２（ｂ）図、パートＢはｐＪｅｆ１２６７の誘導体で
あって、ｐＪｅｆ１２６７のＳａｃＩ制限部位に導入さ
れたＣＡＲ１プロモーター−ＧＡＬＫ、（ｐＲＩＴ１２
９３８、ＡＲＧ３プロモーター−ＧＡＬＫ（ｐＲＩＴ１
２９４６）およびＣＵＰＩプロモーター−ＧＡＬＫ（ｐ
ＲＩ Ｔ ｌ ２９４５）よりなる発現カセットを含を
するｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８、ｐＲＩＴ１２９４６お
よびｐＲＩＴ１２９４５の構成を示す。
あって、ｐＪｅｆ１２６７のＳａｃＩ制限部位に導入さ
れたＣＡＲ１プロモーター−ＧＡＬＫ、（ｐＲＩＴ１２
９３８、ＡＲＧ３プロモーター−ＧＡＬＫ（ｐＲＩＴ１
２９４６）およびＣＵＰＩプロモーター−ＧＡＬＫ（ｐ
ＲＩ Ｔ ｌ ２９４５）よりなる発現カセットを含を
するｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８、ｐＲＩＴ１２９４６お
よびｐＲＩＴ１２９４５の構成を示す。
第２（ｂ）図は、実施例に記載したＧＡＬＫ発現カセ７
）を含有するｐＧＡＬｌ−Ｔｙ１組立体の構造を示す。
）を含有するｐＧＡＬｌ−Ｔｙ１組立体の構造を示す。
矢印はＴＶおよびＧＡＬＫ転写の方向を表わす。
Ｔｙ要素はレトロウィルスのプロウィルスおよびショウ
ジヨウバエのコピア（ｃｏｐｉａ）要素族に構造的に似
た、酵母ザノ力ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から天然に生
じる転位性要素である。かかるＴｙ要素の詳細な総説に
ついては、例えばメロ−ら（Ｍｅｌｌｏｒｅｔ ａｌ
、 ）、イース１（Ｙｅａｓｔ）、Ｉ、１４５−１５２
（１９８６）参照。かかるＴｙ要素は公知の技術によっ
てエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃ６ｒｅｖｉｓｉａｅ）
株から単離できる。エス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の多くの株が公の寄託機関、例えばア
メリカン・タイプ・カルチャー−コレクシラン（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メ
リーランド州、米国から入手できる。これらの要素の数
および分布は株間で異なる。これらの要素は長さが約５
．９キロベース（ｋｂ）である。約３３５塩基対（ｂｐ
）の末端反復デルタ配列または真直ぐな長い末端反復（
ＬＴＲ）が５ 、３ ｋｂの内側領域を取り囲む。Ｔｙ
要素はＬＴＲからＬＴＲにかけて転写され、末端で４５
ヌクレオチドだけ余分なＲＮＡか形成される。この構造
はレトロウィルスのゲノムＲＮＡの全長構造と同一であ
る。Ｔｙ要素は５’ＬＴＲに隣接してｔＲＮＡプライマ
ー結合部位として働き得る配列および３’ＬＴＲに隣接
して第二鎖合成のプライマーとして働き得るオリゴ−プ
リン・トラクト（ｔｒａｃｃ）を含有する。さらに、Ｔ
ｙ要素の機能的構成はレトロウィルスのｇａｇ−ｐｏｌ
領域の構成と同様である。Ｔｙ要素には、２つの重複す
るオーブンリーディングフレーム；すなわち、恐らくは
レトロウィルスｇａｇ遺伝子と同等であってＤＮＡ結合
蛋白に相同の蛋白を特異化するＬｙａ ；およびプロテ
アーゼに相同の蛋白、インテグラーゼ、およびレトロウ
ィルス ｐｏｌ遺伝子の逆転写酵素領域をコード付けす
るｔｙｂかある。ｔｙｂの遺伝子産生物は、ｔｙｂをｔ
ｙａとに関するフレームに入れるｔｙａ末端での特異的
フレームンフトに由来するＬｙａ−ｔｙｂ融合蛋白とし
て合成されると考えられる。２つの群のＴｙ要素、すな
わち、２つの大きな内部置換が本質的に異なる Ｔｙｌ
およびｒｙ２がある。本発明の効果的なＴｙｌおよびＴ
ｙ２ベース発現ベクターの組み立てには、転写ターミネ
ータ−様要素を含有しない強力な酵母プロモーター、ま
たはこれらの組立体の転位に必要な大きなＲＮＡの合成
が干渉されないようにトランスクリプション・ラン・ス
ルーを禁する他のいずれかの配列を用いることを要する
（第１図）。
ジヨウバエのコピア（ｃｏｐｉａ）要素族に構造的に似
た、酵母ザノ力ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から天然に生
じる転位性要素である。かかるＴｙ要素の詳細な総説に
ついては、例えばメロ−ら（Ｍｅｌｌｏｒｅｔ ａｌ
、 ）、イース１（Ｙｅａｓｔ）、Ｉ、１４５−１５２
（１９８６）参照。かかるＴｙ要素は公知の技術によっ
てエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃ６ｒｅｖｉｓｉａｅ）
株から単離できる。エス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の多くの株が公の寄託機関、例えばア
メリカン・タイプ・カルチャー−コレクシラン（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メ
リーランド州、米国から入手できる。これらの要素の数
および分布は株間で異なる。これらの要素は長さが約５
．９キロベース（ｋｂ）である。約３３５塩基対（ｂｐ
）の末端反復デルタ配列または真直ぐな長い末端反復（
ＬＴＲ）が５ 、３ ｋｂの内側領域を取り囲む。Ｔｙ
要素はＬＴＲからＬＴＲにかけて転写され、末端で４５
ヌクレオチドだけ余分なＲＮＡか形成される。この構造
はレトロウィルスのゲノムＲＮＡの全長構造と同一であ
る。Ｔｙ要素は５’ＬＴＲに隣接してｔＲＮＡプライマ
ー結合部位として働き得る配列および３’ＬＴＲに隣接
して第二鎖合成のプライマーとして働き得るオリゴ−プ
リン・トラクト（ｔｒａｃｃ）を含有する。さらに、Ｔ
ｙ要素の機能的構成はレトロウィルスのｇａｇ−ｐｏｌ
領域の構成と同様である。Ｔｙ要素には、２つの重複す
るオーブンリーディングフレーム；すなわち、恐らくは
レトロウィルスｇａｇ遺伝子と同等であってＤＮＡ結合
蛋白に相同の蛋白を特異化するＬｙａ ；およびプロテ
アーゼに相同の蛋白、インテグラーゼ、およびレトロウ
ィルス ｐｏｌ遺伝子の逆転写酵素領域をコード付けす
るｔｙｂかある。ｔｙｂの遺伝子産生物は、ｔｙｂをｔ
ｙａとに関するフレームに入れるｔｙａ末端での特異的
フレームンフトに由来するＬｙａ−ｔｙｂ融合蛋白とし
て合成されると考えられる。２つの群のＴｙ要素、すな
わち、２つの大きな内部置換が本質的に異なる Ｔｙｌ
およびｒｙ２がある。本発明の効果的なＴｙｌおよびＴ
ｙ２ベース発現ベクターの組み立てには、転写ターミネ
ータ−様要素を含有しない強力な酵母プロモーター、ま
たはこれらの組立体の転位に必要な大きなＲＮＡの合成
が干渉されないようにトランスクリプション・ラン・ス
ルーを禁する他のいずれかの配列を用いることを要する
（第１図）。
事実、かかる系においては、誘導性プロモーターが誘導
された場合に産生される大きなＲＮＡが転位マシーナリ
（ｍａｃｈ ｉ ｎｅ−ｒｙ）の合成用ｍＲＮＡとして
用いられ、それが転位プロセスにおける鋳型でもある。
された場合に産生される大きなＲＮＡが転位マシーナリ
（ｍａｃｈ ｉ ｎｅ−ｒｙ）の合成用ｍＲＮＡとして
用いられ、それが転位プロセスにおける鋳型でもある。
本発明は、機能性ＴｙｌまたはＴｙ２要素に作動可能に
連結したプロモーターよりなり、該ＴｙｌまたはＴｙ２
要素が外来コーディング配列に作動可能に連結した強力
な酵母プロモータを含有する発現カセットよりなること
を特徴とするベクターを提供するものである。かかるベ
クターは当該分野でよく知られた常法によって組み立て
ることができる。好ましくは、Ｔｙｌ要素を用いてかか
るベクターを組み立てるが、用いるかかるＴｙｌ要素は
ベークら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）、セル（
Ｃｅｌｌ）、−生Ｊ−１４９１−５００（１９８５）に
詳細に記載されているＴｙＨ３に由来するものである。
連結したプロモーターよりなり、該ＴｙｌまたはＴｙ２
要素が外来コーディング配列に作動可能に連結した強力
な酵母プロモータを含有する発現カセットよりなること
を特徴とするベクターを提供するものである。かかるベ
クターは当該分野でよく知られた常法によって組み立て
ることができる。好ましくは、Ｔｙｌ要素を用いてかか
るベクターを組み立てるが、用いるかかるＴｙｌ要素は
ベークら（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）、セル（
Ｃｅｌｌ）、−生Ｊ−１４９１−５００（１９８５）に
詳細に記載されているＴｙＨ３に由来するものである。
前記したごとく、本発明のベクターはＴｙｌまたはＴｙ
２要素に作動可能に連結したプロモーターよりなる。
２要素に作動可能に連結したプロモーターよりなる。
ベクターが形質転換する宿主酵母細胞中で機能するいず
れの誘導性または非誘導性プロモーターも用いることが
できる。好ましくは、該プロモーターは誘導性である。
れの誘導性または非誘導性プロモーターも用いることが
できる。好ましくは、該プロモーターは誘導性である。
また、好ましくは、用いるプロモーターは１９８７年４
月２８日に発行された米国特許第４６６１４５４号に記
載されているＧＡＬＩプロモーターである。前記したご
とく、本発明のベクターの機能性ＴｙｌまたはＴｙ２要
素は外来コーディング配列に作動可能に連結した強力な
酵母プロモーターを含有する発現カセットよりなる。誘
導性または非誘導性であるかにかかわらず、ベクターが
形質転換する宿主酵母細胞中で機能するいずれの強力な
プロモーターも用いることができるが、かかるプロモー
ターは外来コーディング配列のトランスクリプション・
ラン・スルーを可能とするものでなければならない。好
ましくは、該強力な酵母プロモーターはニス・セルビシ
ｘ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａ ＲＧ ３遺伝
子またはエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）ＣＵ Ｐ ｌ遺伝子からのものである。生物学的
活性を有する蛋白を産生するために宿主酵母細胞中で転
写および翻訳できるいずれの外来コーディング配列も用
いることができる。好ましくは、かかる蛋白は治療上の
生物学的活性を有する。
月２８日に発行された米国特許第４６６１４５４号に記
載されているＧＡＬＩプロモーターである。前記したご
とく、本発明のベクターの機能性ＴｙｌまたはＴｙ２要
素は外来コーディング配列に作動可能に連結した強力な
酵母プロモーターを含有する発現カセットよりなる。誘
導性または非誘導性であるかにかかわらず、ベクターが
形質転換する宿主酵母細胞中で機能するいずれの強力な
プロモーターも用いることができるが、かかるプロモー
ターは外来コーディング配列のトランスクリプション・
ラン・スルーを可能とするものでなければならない。好
ましくは、該強力な酵母プロモーターはニス・セルビシ
ｘ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａ ＲＧ ３遺伝
子またはエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）ＣＵ Ｐ ｌ遺伝子からのものである。生物学的
活性を有する蛋白を産生するために宿主酵母細胞中で転
写および翻訳できるいずれの外来コーディング配列も用
いることができる。好ましくは、かかる蛋白は治療上の
生物学的活性を有する。
また、本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿
主酵母細胞を提供するものである。かかる形質転換はイ
ト−ら（Ｉｔｏ ａｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・
オブ・バタテリオロジ＝（Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
。
主酵母細胞を提供するものである。かかる形質転換はイ
ト−ら（Ｉｔｏ ａｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・
オブ・バタテリオロジ＝（Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
。
）、上５３，１６３−１６８（１９８３）の方法による
ごとく、通常の技術によって行うことができる。好まし
くは、該宿主酵母細胞はサツカロミセス（Ｓ ａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属し、最も好ましくは、エス・
セレビシエ（Ｓ 、 ｃ６ｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属す
る。
ごとく、通常の技術によって行うことができる。好まし
くは、該宿主酵母細胞はサツカロミセス（Ｓ ａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属し、最も好ましくは、エス・
セレビシエ（Ｓ 、 ｃ６ｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属す
る。
また、本発明は、本発明のベクターに含まれる強力な酵
母プロモーターが機能するのを可能とする条件下で、本
発明の形質転換宿主を培養することを特徴とする安定し
たゲノム取込みおよび外来コーディング配列の発現を行
う方法を提供するものである。例えば、用いる強力な酵
母プロモーターがＧＡＬＩのごとき誘導性プロモーター
である場合、宿主酵母細胞をＧＡＬ ｌプロモーターの
誘導を可能とするために十分なガラクトースを含有する
培地中で培養すべきである。同様に、用いる強力な酵母
プロモーターがエス・セレビシエ（Ｓ。
母プロモーターが機能するのを可能とする条件下で、本
発明の形質転換宿主を培養することを特徴とする安定し
たゲノム取込みおよび外来コーディング配列の発現を行
う方法を提供するものである。例えば、用いる強力な酵
母プロモーターがＧＡＬＩのごとき誘導性プロモーター
である場合、宿主酵母細胞をＧＡＬ ｌプロモーターの
誘導を可能とするために十分なガラクトースを含有する
培地中で培養すべきである。同様に、用いる強力な酵母
プロモーターがエス・セレビシエ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａ ＲＧ ３プロモーターであ
る場合、用いる培地はＡＲＧ３プロモーターの誘導を可
能とするのに十分なＮＨ，＋を含有すべきである。
る場合、用いる培地はＡＲＧ３プロモーターの誘導を可
能とするのに十分なＮＨ，＋を含有すべきである。
すべての強力な酵母プロモーター配列には、ターミネー
タ−様要素またはその他調節蛋白に作用する配列のごと
きトランスクリブション・ラン・スルーを抑制する配列
が無い訳ではない。例えば、ＵＲＡ３プロモーター領域
は（最初のＡＴＧに向けての上流の塩基４５および１５
５間に）強力な両二方向ターミネータ−を含有する。ヤ
ーガーら（Ｙａｒｇｅｒ ａｔ ａｌ、 ）、モレ
キュラーやアンド拳セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１
． Ｃｅ１１． Ｂ ｉｏｌ。
タ−様要素またはその他調節蛋白に作用する配列のごと
きトランスクリブション・ラン・スルーを抑制する配列
が無い訳ではない。例えば、ＵＲＡ３プロモーター領域
は（最初のＡＴＧに向けての上流の塩基４５および１５
５間に）強力な両二方向ターミネータ−を含有する。ヤ
ーガーら（Ｙａｒｇｅｒ ａｔ ａｌ、 ）、モレ
キュラーやアンド拳セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１
． Ｃｅ１１． Ｂ ｉｏｌ。
）、６．１０９５（１９８６）参照。ＣＡＲｌプロモー
ター、実施例に記載されているＣＡＲＩ ５’領域の場
合、これらの可能な干渉のうち１またはいくつかが起こ
るかも知れない。
ター、実施例に記載されているＣＡＲＩ ５’領域の場
合、これらの可能な干渉のうち１またはいくつかが起こ
るかも知れない。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。
、本発明はこれらに限定されるものではない。
犬鼻餞
材料および方法
３１株およびプラスミド
一エス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
の２つの株を実施例で用いた；ＧＲＦ ｌ ６７（ｈｉ
ｓ３Δ２００、ｕｒａ３−１６７）およびＪＷＧ２−Ｉ
Ｄ（ｔ、ｒｐ ｌ ｕｒａ ３ ｇａ
ｌｌ Δ）−プラスミドｐＪｅｆ７２４は先に記載
したｐＧＴＹＨ３と同一である。ベークら（Ｂｏｅｋｅ
ｅｔａｌ、 ）、セル（Ｃｅｌｌ）、旦、４９１−５
００（１９８５）参照。ｐＪｅｆ１２６７はｐＪｅｆ７
２４ｉ＝由来する（Ｔｙｌ ３’ Ｂｇｌ、！１部
位の代わりに５ａｃ１部位を導入）。ｐＪｅｆ７２４は
２ミクロンベースのプラスミドである。これらの実施例
に記載する転位実験で用いるすべてのＴＶベースのプラ
スミドは、前記したごとく、前掲、外米ＤＮＡコーディ
ング配列（ＧＡＬＫカセット）をＳａｃＩ制限部位に導
入したｐＪｅｆ１２６７の誘導体である。また、ＧＡＬ
Ｋ発現カセットを低コピー数プラスミドＹＣｐ５０にも
導入した。ジョンストンおよびデイヒス（Ｊ’ｏｈｎｓ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ）、モレキュラー〇ア
ンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ
。
の２つの株を実施例で用いた；ＧＲＦ ｌ ６７（ｈｉ
ｓ３Δ２００、ｕｒａ３−１６７）およびＪＷＧ２−Ｉ
Ｄ（ｔ、ｒｐ ｌ ｕｒａ ３ ｇａ
ｌｌ Δ）−プラスミドｐＪｅｆ７２４は先に記載
したｐＧＴＹＨ３と同一である。ベークら（Ｂｏｅｋｅ
ｅｔａｌ、 ）、セル（Ｃｅｌｌ）、旦、４９１−５
００（１９８５）参照。ｐＪｅｆ１２６７はｐＪｅｆ７
２４ｉ＝由来する（Ｔｙｌ ３’ Ｂｇｌ、！１部
位の代わりに５ａｃ１部位を導入）。ｐＪｅｆ７２４は
２ミクロンベースのプラスミドである。これらの実施例
に記載する転位実験で用いるすべてのＴＶベースのプラ
スミドは、前記したごとく、前掲、外米ＤＮＡコーディ
ング配列（ＧＡＬＫカセット）をＳａｃＩ制限部位に導
入したｐＪｅｆ１２６７の誘導体である。また、ＧＡＬ
Ｋ発現カセットを低コピー数プラスミドＹＣｐ５０にも
導入した。ジョンストンおよびデイヒス（Ｊ’ｏｈｎｓ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ）、モレキュラー〇ア
ンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ
。
Ｂｉｏｌ、）、土、１４４０（１９８４）参照。ｐＲ−
ＩＴ１２９３８、ｐＲＩＴ１２９４５、ＰＲＩ−Ｔ１２
９４６からのＨ１ｎｄｎ［−Ｎｅｏ Ｉ （Ｔ ４ポリ
メラーゼ処理）フラグメントをＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍ
Ｈ１（Ｔ４ポリメラーゼ処理）によって消化したＹｃｐ
５０に移入した。第２ａ図参照。ＸＹ１２はＰＦＬｌの
誘導体であり（シュバリエら（Ｃｈｅｖａ １１１ｅｒ
ｅｔ ａｌ、 ）、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）、１ｍ １
ｌ−１９（１９８０））、ＡＲＧ３遺伝子の転写停止配
列と共に ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ発現カセットを含有す
る。
ＩＴ１２９３８、ｐＲＩＴ１２９４５、ＰＲＩ−Ｔ１２
９４６からのＨ１ｎｄｎ［−Ｎｅｏ Ｉ （Ｔ ４ポリ
メラーゼ処理）フラグメントをＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍ
Ｈ１（Ｔ４ポリメラーゼ処理）によって消化したＹｃｐ
５０に移入した。第２ａ図参照。ＸＹ１２はＰＦＬｌの
誘導体であり（シュバリエら（Ｃｈｅｖａ １１１ｅｒ
ｅｔ ａｌ、 ）、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）、１ｍ １
ｌ−１９（１９８０））、ＡＲＧ３遺伝子の転写停止配
列と共に ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ発現カセットを含有す
る。
ｂ、培地
ＹＥＰＤに富む培地（酵母エキス、ペプトン、グルコー
スまたはガラクトース各２％）およびＹＮＢ最小培地（
アミノ酸を含まない酵母窒素ベース０，６７％、硫酸ア
ンモニウムは含むまたは含まない）をエス・セレビシエ
（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の増殖に用いた。
スまたはガラクトース各２％）およびＹＮＢ最小培地（
アミノ酸を含まない酵母窒素ベース０，６７％、硫酸ア
ンモニウムは含むまたは含まない）をエス・セレビシエ
（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の増殖に用いた。
硫酸アンモニウムを含まないＹＮＢには唯一の窒素源と
してアルギニンｌ ｍｇ／ ｍＱを補足した。ＹＮＢ培
地には唯一の炭素源としてグルコース２％またはガラク
トース２％を補足しｌこ。
してアルギニンｌ ｍｇ／ ｍＱを補足した。ＹＮＢ培
地には唯一の炭素源としてグルコース２％またはガラク
トース２％を補足しｌこ。
フルオロオルチン酸含有培地はベーケら（Ｂｏｅ−ｋｅ
ｅｔ ａｌ、 ）、（モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジエネティクス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔ、 ）、−り旦１−１３４５−３４６（１９８４
））に記載されている。
ｅｔ ａｌ、 ）、（モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジエネティクス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔ、 ）、−り旦１−１３４５−３４６（１９８４
））に記載されている。
Ｃ３形質転換
プラスミドＤＮＡでのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）形質
転換は、コーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ、
）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
転換は、コーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ、
）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、６９，２１１０ ２１１４（１９７
２）に準じて行った。酵母の形質転換はイト−ら（Ｉｔ
ｏ ｅｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・オブ・バタテ
リオロジー（Ｊ 、 ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、 ）、上５
３，１６３−１６８（１９８３）に記載されている。
２）に準じて行った。酵母の形質転換はイト−ら（Ｉｔ
ｏ ｅｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・オブ・バタテ
リオロジー（Ｊ 、 ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、 ）、上５
３，１６３−１６８（１９８３）に記載されている。
（１）若干の修正を行ったが、デイビスら（Ｄａｖ−ｉ
ｓ ｅｔ ａｌ、 ）、メソッズ・イン拳エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）、６５．４０４−４１１（１９８０）に準じ
て、エス・セレビシエ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）の全ゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ制限、電気泳動
およびサザーンブロッ］・分析はマニアティスら（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 ）、モレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌ ａｂ
ｏ−１ａ（□ｒｙ Ｍａｎｔｉａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｓ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
（１９８２）に記載されているように行った。
ｓ ｅｔ ａｌ、 ）、メソッズ・イン拳エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）、６５．４０４−４１１（１９８０）に準じ
て、エス・セレビシエ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）の全ゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ制限、電気泳動
およびサザーンブロッ］・分析はマニアティスら（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 ）、モレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌ ａｂ
ｏ−１ａ（□ｒｙ Ｍａｎｔｉａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｓ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
（１９８２）に記載されているように行った。
（２）転位した発現カセットの検出には、１．１ｋｂＧ
Ａ Ｌ Ｋ Ｄ Ｎ Ａフラグメントを用いた。第
１（ａ）、ｌ （ｂ）およびｌ （ｃ）図参照。４２０
ｂｐ特異的ＴｙｌＤＮＡフラグメントをレジデント（ｒ
ｅｓｉｄｅｎｔ）ｔｙ１転位（Ｂｇｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ
フラグメント）の分析に用いた。８５０ｂｐ Ｘｍｎ１
−ＢａｍＨＩ ＣＡＲＩ ＤＮＡフラグメントをサ
ザーンプロットにおけるゲノムＤＮＡの全消化の対照と
して用いる（それらのゲノムに組み込まれたｐＡＲＧ３
−ＧＡＬＫまたはｐｃＵＰｌ−ＧＡＬＫカセットを有す
る株のＤＮＡ分析）。
Ａ Ｌ Ｋ Ｄ Ｎ Ａフラグメントを用いた。第
１（ａ）、ｌ （ｂ）およびｌ （ｃ）図参照。４２０
ｂｐ特異的ＴｙｌＤＮＡフラグメントをレジデント（ｒ
ｅｓｉｄｅｎｔ）ｔｙ１転位（Ｂｇｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ
フラグメント）の分析に用いた。８５０ｂｐ Ｘｍｎ１
−ＢａｍＨＩ ＣＡＲＩ ＤＮＡフラグメントをサ
ザーンプロットにおけるゲノムＤＮＡの全消化の対照と
して用いる（それらのゲノムに組み込まれたｐＡＲＧ３
−ＧＡＬＫまたはｐｃＵＰｌ−ＧＡＬＫカセットを有す
る株のＤＮＡ分析）。
ｅ、ガラクトキナーゼの特異的活性の測定リモンドら（
Ｒｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（Ｇ ｅｎ
ｅ）、２５．２４９−２６２（１９８３）に記載されて
いるごとく、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬＫ）酵素活性を
測定し、全蛋白レベルに対して標準化し、ローリ−ら（
Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｍ ）、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ。
Ｒｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（Ｇ ｅｎ
ｅ）、２５．２４９−２６２（１９８３）に記載されて
いるごとく、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬＫ）酵素活性を
測定し、全蛋白レベルに対して標準化し、ローリ−ら（
Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｍ ）、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ。
）、１９３．２６５−２７５（１９５１）の７オリン（
Ｆｏｌｉｎ）法によって定量した。
Ｆｏｌｉｎ）法によって定量した。
ｆ、転位実験（第２ａ図および第２ｂ図も参照）プラス
ミドｐＪｅｆ７２４（または記載した誘導体、前掲）を
用いて、以下のごとくに転位を行った。
ミドｐＪｅｆ７２４（または記載した誘導体、前掲）を
用いて、以下のごとくに転位を行った。
（１）−１−ス・セレビシェ（Ｓ −ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）受容株の３０°ＣにおけるＹＮＢグルコース２％
培地上での形質転換（ｕｒａ ３突然変異の補完）。
ａｅ）受容株の３０°ＣにおけるＹＮＢグルコース２％
培地上での形質転換（ｕｒａ ３突然変異の補完）。
（２）形質転換体の精製（単離したコロニー）。
（３）転位の誘導。２２℃においてＹＮＢガラクトース
２％培地上で５日間細胞を増殖させる。
２％培地上で５日間細胞を増殖させる。
（４）ｕｒａ３コロニー（フルオロオロチン酸含有培地
上でプラスミドを喪失した株）の選択。
上でプラスミドを喪失した株）の選択。
（５）ｕｒａ ３株（ＹＥＰＤ培地上の単離したコロニ
ー）の精製。
ー）の精製。
（６）受容体株がｇａｌｌ（ＪＷＧ２− ＩＤ）である
場合、炭素源としてガラクトース上で増殖するｕｒａ３
株について探索する。ＧＡＬＫの特異的ＤＮＡプローブ
を用いるハイブリダイゼーションによる全ゲノムＤＮＡ
の分析。
場合、炭素源としてガラクトース上で増殖するｕｒａ３
株について探索する。ＧＡＬＫの特異的ＤＮＡプローブ
を用いるハイブリダイゼーションによる全ゲノムＤＮＡ
の分析。
３、本発明のベクターの組み立ておよび転位実験の結果
本発明のベクターは、ここに参照のために挙げるベーク
ら（Ｂｏｅｋｅ ｅＬ ａｌ、 ）、セル（Ｃｅｌ
ｌ）、−１艷−１４９１−５００（１９８５）に記載さ
れているｐＧＴｙＨ３（ｐＪｅｆ７２４）組立体の誘導
体として調製することができる。例えば、ｐＧＴｙＨ３
においては、機能性Ｔｙ１転写の合成がガラクトース誘
導によって制御されるように、ＧＡＬｌプロモーターの
ごとき強力な酵母プロモーターでＴｙ１５’ＬＴＲのＵ
３領域を置き換える。本発明の各ベクターにおいて、Ｔ
ｙ１要素が依然機能性であるように、外来コーディング
配列を非必須Ｔｙｌ領域に挿入する。例えば、常法によ
りＳａｃＩ制限部位を含有する合成りＮＡ配列をまずＴ
ＹＨ３の３’ＢｇｌｌＩ部位に挿入してｐＪｅｆ１２６
７を得た。
ら（Ｂｏｅｋｅ ｅＬ ａｌ、 ）、セル（Ｃｅｌ
ｌ）、−１艷−１４９１−５００（１９８５）に記載さ
れているｐＧＴｙＨ３（ｐＪｅｆ７２４）組立体の誘導
体として調製することができる。例えば、ｐＧＴｙＨ３
においては、機能性Ｔｙ１転写の合成がガラクトース誘
導によって制御されるように、ＧＡＬｌプロモーターの
ごとき強力な酵母プロモーターでＴｙ１５’ＬＴＲのＵ
３領域を置き換える。本発明の各ベクターにおいて、Ｔ
ｙ１要素が依然機能性であるように、外来コーディング
配列を非必須Ｔｙｌ領域に挿入する。例えば、常法によ
りＳａｃＩ制限部位を含有する合成りＮＡ配列をまずＴ
ＹＨ３の３’ＢｇｌｌＩ部位に挿入してｐＪｅｆ１２６
７を得た。
常法により外来コーディング配列をユニークＳａｃ■制
限部位に挿入した。第２図参照。イー・コリ（Ｅ 、
ｃｏｌｉ）ガラクトキナーゼ構造遺伝子（ＧＡＬＫ）を
外来コーディング配列の例として選択した（これは、選
択マーカーとしても使用でき、かくしてニス・セルベシ
エ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇａｌ ｌ受容体
株における転位現象についての選択が可能となる）。
限部位に挿入した。第２図参照。イー・コリ（Ｅ 、
ｃｏｌｉ）ガラクトキナーゼ構造遺伝子（ＧＡＬＫ）を
外来コーディング配列の例として選択した（これは、選
択マーカーとしても使用でき、かくしてニス・セルベシ
エ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇａｌ ｌ受容体
株における転位現象についての選択が可能となる）。
用いるＧＡＬＫコーディング配列は修飾したＮＨ２末端
領域を含有するが、活性なガラクトキナーゼをコード付
けする。リモンドら（Ｒｙｍｏｎｄｅｔ ａｌ、 ）
、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）、■、２４９−２６２（１９８
３）参照。３つの異なるエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロモーター領域をＴｙｌベクタ
ー、すなわち、ＣＡＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰＩにお
けるＧＡＬＫに融合する。これらのプロモーター領域の
配列は対応するニス・セルベシ工（Ｓ −ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）遺伝子のＡＴＧから５′上流領域に対応し、
ＧＡＬＫとの機能的共働を可能とするＢａｍＨＩ制限部
位に適合するものであった。
領域を含有するが、活性なガラクトキナーゼをコード付
けする。リモンドら（Ｒｙｍｏｎｄｅｔ ａｌ、 ）
、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）、■、２４９−２６２（１９８
３）参照。３つの異なるエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロモーター領域をＴｙｌベクタ
ー、すなわち、ＣＡＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰＩにお
けるＧＡＬＫに融合する。これらのプロモーター領域の
配列は対応するニス・セルベシ工（Ｓ −ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）遺伝子のＡＴＧから５′上流領域に対応し、
ＧＡＬＫとの機能的共働を可能とするＢａｍＨＩ制限部
位に適合するものであった。
第２図参照。
ＣＡＲｌ遺伝子（アルギナーゼ構造遺伝子）の５′領域
は２つの異なる制御、すなわち、窒素異化産物抑制（ク
ニンら（Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ、 ）、モレキュ
ラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（（Ｍｏｌ。
は２つの異なる制御、すなわち、窒素異化産物抑制（ク
ニンら（Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ、 ）、モレキュ
ラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（（Ｍｏｌ。
５ｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ）、１．１３３９−１３４８
（１９８５）およびアルギニン特異的誘導（メセンギー
およびドウポイス（Ｍｅｓｓｅｎｇｕｙ ａｎｄ
Ｄｕｂｏｉｓ）、モレキュラー・アンド・ジエナル・ジ
ェネティクス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）
、１８９．１４８−１５６（１９８３）に対応する少な
くとも２つの調節領域を含有する。プロモーター領域お
よびほとんどの調節配列を含有する８ ２０ｂｐ Ｘ
ｍｎ１−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントとしてＣＡ
Ｒｌ遺伝子の５′領域を単離する。窒素異化産物抑制に
関与する対照領域は完全には包含されない。
（１９８５）およびアルギニン特異的誘導（メセンギー
およびドウポイス（Ｍｅｓｓｅｎｇｕｙ ａｎｄ
Ｄｕｂｏｉｓ）、モレキュラー・アンド・ジエナル・ジ
ェネティクス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）
、１８９．１４８−１５６（１９８３）に対応する少な
くとも２つの調節領域を含有する。プロモーター領域お
よびほとんどの調節配列を含有する８ ２０ｂｐ Ｘ
ｍｎ１−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントとしてＣＡ
Ｒｌ遺伝子の５′領域を単離する。窒素異化産物抑制に
関与する対照領域は完全には包含されない。
ＡＲＧ３（オルニチントラ〕／スカルバミラーゼ構造遺
伝子）５′配列は２つの調節領域を含有する。
伝子）５′配列は２つの調節領域を含有する。
ＡＲＧ３は「一般アミノ酸制御」およびメセンギイら（
Ｍｅｓｓｅｎｇｕｙ ｅＬ ａｌ、 ）、（１９８
３）、前掲、およびクラベールら（Ｃｒａｂｅｅｌ
ｅｔ ａｌ、）、モレキュラー・アンド・セリュラー
・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、
）、え、１３３９−１３４８（１９８５）によって記載
されているアルギニン特異的制御によって調節される。
Ｍｅｓｓｅｎｇｕｙ ｅＬ ａｌ、 ）、（１９８
３）、前掲、およびクラベールら（Ｃｒａｂｅｅｌ
ｅｔ ａｌ、）、モレキュラー・アンド・セリュラー
・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、
）、え、１３３９−１３４８（１９８５）によって記載
されているアルギニン特異的制御によって調節される。
プロモーターおよびすべての調節配列を含有する８００
ｂｐ Ｘｈ。
ｂｐ Ｘｈ。
１−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントにはＡＲＧ３の
５′領域が含有される。第１ （ｂ）図参照。
５′領域が含有される。第１ （ｂ）図参照。
ＣＵＰＩ（エス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃａｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）メタロチオネイン構造遺伝子）５′配列は銅誘
導に関与するＤＮＡ領域を含有する。用いるＣＵＰ １
遺伝子の３００ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグ
メントはこれらのＤＮＡ領域を含有する。
ｉａｅ）メタロチオネイン構造遺伝子）５′配列は銅誘
導に関与するＤＮＡ領域を含有する。用いるＣＵＰ １
遺伝子の３００ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグ
メントはこれらのＤＮＡ領域を含有する。
ＧＡＬＫ遺伝子に関するＢａｍＨ１部位を用いることに
よって、これらの３つのプロモーター、すなわち、ＣＡ
ＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰＩをＧＡＬＫと連結させ、
得られたＤＮＡフラグメントを（Ｔ４ポリメラーゼでの
処理の後）ｐＪｅｆ１２６７のＳａｃＩユニ一ク部位に
挿入した。得られたマルチコピープラスミド、すなわち
、ｐＲＩＴ１２９３８、（第２（ｂ）図）；ＲＩＴ１２
９４６（第２（ｂ）図）およびｐＲＩＴ＋、２９４５（
第２（ｂ）図）をＧＡｌ＋ｕｒａ３ エス・セレビシ
エ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株、およびｇａｌ
ｌ ｕｒａ３ エス・セレビシエ（Ｓ。
よって、これらの３つのプロモーター、すなわち、ＣＡ
ＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰＩをＧＡＬＫと連結させ、
得られたＤＮＡフラグメントを（Ｔ４ポリメラーゼでの
処理の後）ｐＪｅｆ１２６７のＳａｃＩユニ一ク部位に
挿入した。得られたマルチコピープラスミド、すなわち
、ｐＲＩＴ１２９３８、（第２（ｂ）図）；ＲＩＴ１２
９４６（第２（ｂ）図）およびｐＲＩＴ＋、２９４５（
第２（ｂ）図）をＧＡｌ＋ｕｒａ３ エス・セレビシ
エ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株、およびｇａｌ
ｌ ｕｒａ３ エス・セレビシエ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株（ＪＷＧ２−ＩＤ）における
転位実験で用いた。なぜなら、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ）ガラクトキナーゼはｇａｌｌ突然変異を補完でき
るからである（炭素源としてのガラクトース（２％）上
での増殖）。
転位実験で用いた。なぜなら、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ）ガラクトキナーゼはｇａｌｌ突然変異を補完でき
るからである（炭素源としてのガラクトース（２％）上
での増殖）。
同一の発現カセットを含有する低コピー数ＹＣｐ５０組
立体を含む本明細書中にて記載するベクターで形質転換
したかかるエス・セレビシエ（Ｓ。
立体を含む本明細書中にて記載するベクターで形質転換
したかかるエス・セレビシエ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株のガラクトース上での増殖速
度の比較を異なる調節条件で行った。
度の比較を異なる調節条件で行った。
補完効率（ガラクトース上での増殖速度）は調節条件、
およびＧＡＬＫ発現カセットのコピー数に関係する。第
１表から理解されるごと＜、ＣＡＲ１プロモーターは窒
素源としてのアルギニン上でより効率的であり（特異的
誘導、窒素異化産物抑制は無し）、ＡＲＧ３プロモータ
ーは窒素源としてＮＨ，＋を用いたときがより効率的で
あり（アルギニンの不存在において抑制無し）、および
ＣＵＰＩプロモーターは銅の存在においてより効率的で
ある（特異的誘導）。これらの効果は低コピー数プラス
ミドを用いる場合により顕著である。
およびＧＡＬＫ発現カセットのコピー数に関係する。第
１表から理解されるごと＜、ＣＡＲ１プロモーターは窒
素源としてのアルギニン上でより効率的であり（特異的
誘導、窒素異化産物抑制は無し）、ＡＲＧ３プロモータ
ーは窒素源としてＮＨ，＋を用いたときがより効率的で
あり（アルギニンの不存在において抑制無し）、および
ＣＵＰＩプロモーターは銅の存在においてより効率的で
ある（特異的誘導）。これらの効果は低コピー数プラス
ミドを用いる場合により顕著である。
はとんどの転位実験はｇａｌｌ Δ ｕｒａ ３
ｔｒｐ １株、ＪＷＧ２−ＩＤにおいて行った。なぜな
ら、転位の誘導およびプラスミドのキユアリングの誘導
の後、ｌまたはいくつかの転位現象を支持した（すなわ
ち、染色体中へ組み込まれた発現カセットの１またはい
くつかのコピーを有する）株は、炭素源としてのガラク
トース上でのそれらの増殖能力によって容易に同定でき
るからである。かかる株の増殖速度が、低コピー数ＹＣ
ｐ５０プラスミドに位置する対応ＧＡＬＫカセットを含
有するＪＷＧ２−ＩＤ株の増殖速度と同様であることに
注目すると興味深い。
ｔｒｐ １株、ＪＷＧ２−ＩＤにおいて行った。なぜな
ら、転位の誘導およびプラスミドのキユアリングの誘導
の後、ｌまたはいくつかの転位現象を支持した（すなわ
ち、染色体中へ組み込まれた発現カセットの１またはい
くつかのコピーを有する）株は、炭素源としてのガラク
トース上でのそれらの増殖能力によって容易に同定でき
るからである。かかる株の増殖速度が、低コピー数ＹＣ
ｐ５０プラスミドに位置する対応ＧＡＬＫカセットを含
有するＪＷＧ２−ＩＤ株の増殖速度と同様であることに
注目すると興味深い。
一連の転位実験の結果を第２表に要約し、そこに転位効
率を示す。他の実験はより低温（１６°Ｃ）で行い、同
様の結果が得られた（効率は大幅には増加せず）。
率を示す。他の実験はより低温（１６°Ｃ）で行い、同
様の結果が得られた（効率は大幅には増加せず）。
３つの発現カセット（ｐＣＡＲｌ −ＧＡＬＫ。
ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫおよびｐＣＵＰ １−ＧＡＬＫ）
を用いて、異なる調節条件（ＣＡＲＩおよびＡＲＧ３プ
ロモーターの場合は窒素源としてＮＨ，＋またはアルギ
ニン、ＣＵＰＩプロモーターの場合は銅の存在および不
存在下）において転位アッセイを行った。ｐＪｅｆ１２
６７に同等であるプラスミドｐＪｅｆ７２４（ＳａｃＩ
部位の代わりに元のＢｇｌＩ（部位）をＧＡＬ＋株（Ｇ
ＲＦ ｌ ６７−ｈｉｓ３ ｕｒａ３ ）への転位実
験で対照（すなわち、外来ＤＮＡをＴｙｌに挿入せず）
として用いた。Ｔｙｌを含有するプラスミドｐＲＩ ’
ｒ ｌ ２９３ ｇ（ｐＣＡＲ１−ＧＡＬＫ）組立体を
同一のＧＡＬ＋株に、およびｇａｌｌ ６株、Ｊ Ｗ
Ｇ ２− Ｉ ＤＱｒｐｌ ｕｒａ３ ｇａｌｌΔ
）に導入した。
を用いて、異なる調節条件（ＣＡＲＩおよびＡＲＧ３プ
ロモーターの場合は窒素源としてＮＨ，＋またはアルギ
ニン、ＣＵＰＩプロモーターの場合は銅の存在および不
存在下）において転位アッセイを行った。ｐＪｅｆ１２
６７に同等であるプラスミドｐＪｅｆ７２４（ＳａｃＩ
部位の代わりに元のＢｇｌＩ（部位）をＧＡＬ＋株（Ｇ
ＲＦ ｌ ６７−ｈｉｓ３ ｕｒａ３ ）への転位実
験で対照（すなわち、外来ＤＮＡをＴｙｌに挿入せず）
として用いた。Ｔｙｌを含有するプラスミドｐＲＩ ’
ｒ ｌ ２９３ ｇ（ｐＣＡＲ１−ＧＡＬＫ）組立体を
同一のＧＡＬ＋株に、およびｇａｌｌ ６株、Ｊ Ｗ
Ｇ ２− Ｉ ＤＱｒｐｌ ｕｒａ３ ｇａｌｌΔ
）に導入した。
ＣＡＲ１−ＧＡＬＫカセット、ｐＲＩＴ１２９３８にお
いて、転位の誘導およびプラスミドのキユアリングの後
、１００以上の株を分析したが、ＪＷＧ２−ＩＤ ｇ
ａｌｌ ６株の能力の分析の後、その窒素源としてア
ルギニンを含むガラクトース上で増殖するＧＡＬＫ転位
は観察されず、ＧＡＬＫ特異的ＤＮＡプローブを用いる
ＤＮＡ分析の後もしかりであった。第２表参照。しかし
ながら、転位マシーナリ（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）の合成
についてはｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８のＧＡＬ １−Ｔ
ｙＩ−ＣＡＲＩ−ＧＡＬＫ組立体は効率的であった。な
ぜなら、プラスミドｐＲＩＴ１２９３８を用いるレジデ
ントＴｙ１転位の誘導が観察された、すなわち１または
多くの転位現象を支持した株が少なくとも４０％となっ
たからであった。第２表参照。
いて、転位の誘導およびプラスミドのキユアリングの後
、１００以上の株を分析したが、ＪＷＧ２−ＩＤ ｇ
ａｌｌ ６株の能力の分析の後、その窒素源としてア
ルギニンを含むガラクトース上で増殖するＧＡＬＫ転位
は観察されず、ＧＡＬＫ特異的ＤＮＡプローブを用いる
ＤＮＡ分析の後もしかりであった。第２表参照。しかし
ながら、転位マシーナリ（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）の合成
についてはｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８のＧＡＬ １−Ｔ
ｙＩ−ＣＡＲＩ−ＧＡＬＫ組立体は効率的であった。な
ぜなら、プラスミドｐＲＩＴ１２９３８を用いるレジデ
ントＴｙ１転位の誘導が観察された、すなわち１または
多くの転位現象を支持した株が少なくとも４０％となっ
たからであった。第２表参照。
これらの結果は、ＣＡＲ１−ＧＡＬＫハイブリッド遺伝
子は効率的な逆転写酵素媒介転位に適合しないことを示
し、これは恐ら＜ＣＡＲＩプロモーターが本発明のベク
ターの転位に必要なトランスクリプション・ラン・スル
ーを可能としない（または低頻度でのみ可能とする）か
らであり、恐らくこのプロモーターが転写ターミネータ
−様配列を含有するからである。埋め込まれた発現カセ
ットの大きさは転位に適合しなくはない。なぜなら、前
記にて詳しく述べたように同様の長さを有する外来ＤＮ
Ａ配列を効率よく転位できるからである。
子は効率的な逆転写酵素媒介転位に適合しないことを示
し、これは恐ら＜ＣＡＲＩプロモーターが本発明のベク
ターの転位に必要なトランスクリプション・ラン・スル
ーを可能としない（または低頻度でのみ可能とする）か
らであり、恐らくこのプロモーターが転写ターミネータ
−様配列を含有するからである。埋め込まれた発現カセ
ットの大きさは転位に適合しなくはない。なぜなら、前
記にて詳しく述べたように同様の長さを有する外来ＤＮ
Ａ配列を効率よく転位できるからである。
ＡＲＧ３−ＧＡＬＫおよびＣＵＰ １−ＧＡＬＫハイブ
リッド遺伝子を含有するＴｙｌベクターの評価結果は、
かかるベクターにおいては、転位が比較的効率的である
ことを示す。第２表に報告する実験において、転位の誘
導およびプラスミドのキユアリングの後、分析した株の
１５〜４４％が少なくともｌの転位現象を支持した（修
飾したＴｙｌの染色体中への組込み）。しかしながら、
かかる修飾したＴｙｌ要素の転位頻度はもとのｐＧＡＬ
ＩＴｙ１組立体を用いて得たＴｙ１転位頻度の約１０分
のｌの低さである（すなわち、ｐＧＡＬｌ＋染色体のＴ
ｙｌ要素によって制御されるｔｙｌ要素の転位）。
リッド遺伝子を含有するＴｙｌベクターの評価結果は、
かかるベクターにおいては、転位が比較的効率的である
ことを示す。第２表に報告する実験において、転位の誘
導およびプラスミドのキユアリングの後、分析した株の
１５〜４４％が少なくともｌの転位現象を支持した（修
飾したＴｙｌの染色体中への組込み）。しかしながら、
かかる修飾したＴｙｌ要素の転位頻度はもとのｐＧＡＬ
ＩＴｙ１組立体を用いて得たＴｙ１転位頻度の約１０分
のｌの低さである（すなわち、ｐＧＡＬｌ＋染色体のＴ
ｙｌ要素によって制御されるｔｙｌ要素の転位）。
転位の誘導およびプラスミドのキユアリングの後、ＡＲ
Ｇ３プロモーターの最適発現のために窒素源としてＮＨ
，”を含み、炭素源としてのガラクトース上で増殖する
それらの能力について、ｐｃＵＰｌ−ＧＡＬＫの場合は
ＣＵＰｌプロモーターの最適発現のための銅の存在にお
いて、これらの株を分析した。これらの条件下、ＧＡＬ
Ｋ特異的プローブを用いるＤＮＡ分析によって測定した
ごとく、ガラクトース上で増殖する能力は染色体に組み
込まれたＧＡＬＫコピーの存在に常に関係している。■
またはいくつかの組み込まれたベクターコピーを含有す
る株、および対応する低コピー数のＹＣｐ５０について
の組立体を含有する株のガラクトース上での増殖速度は
同様である。
Ｇ３プロモーターの最適発現のために窒素源としてＮＨ
，”を含み、炭素源としてのガラクトース上で増殖する
それらの能力について、ｐｃＵＰｌ−ＧＡＬＫの場合は
ＣＵＰｌプロモーターの最適発現のための銅の存在にお
いて、これらの株を分析した。これらの条件下、ＧＡＬ
Ｋ特異的プローブを用いるＤＮＡ分析によって測定した
ごとく、ガラクトース上で増殖する能力は染色体に組み
込まれたＧＡＬＫコピーの存在に常に関係している。■
またはいくつかの組み込まれたベクターコピーを含有す
る株、および対応する低コピー数のＹＣｐ５０について
の組立体を含有する株のガラクトース上での増殖速度は
同様である。
かかる実験において、ＧＡＬＫプローブで認識されるＢ
ａｍＨＩゲノムフラグメントの数によって見積もると（
Ｔｙ１組立体にはただ１つのＢａｍＨＩ部位がある）、
１，２または３つの転位現象を支持する（１１２または
３つのコピーが組み込まれた）株が容易に得られた。
ａｍＨＩゲノムフラグメントの数によって見積もると（
Ｔｙ１組立体にはただ１つのＢａｍＨＩ部位がある）、
１，２または３つの転位現象を支持する（１１２または
３つのコピーが組み込まれた）株が容易に得られた。
これらの実験において、ＡＲＧ３−ＧＡＬＫまたはＣＵ
ＰＩ−ＧＡＬＫカセットに関して有意な変動が、異なる
調節条件において、特にｐＣＵＰｌ−ＧＡＬＫプラスミ
ドｐＲＩ Ｔ １２９４５の場合に観察されず、そこで
は、（銅の不存在および銅の存在により）ガラクトキナ
ーゼ合成における変動に由来するガラクトース上での増
殖速度における大きな変動はｇａｌｌ Δ株ＪＷＧ２
−ＩＤにおける転位効率に有意には影響を与えなかった
（第２表参照）。
ＰＩ−ＧＡＬＫカセットに関して有意な変動が、異なる
調節条件において、特にｐＣＵＰｌ−ＧＡＬＫプラスミ
ドｐＲＩ Ｔ １２９４５の場合に観察されず、そこで
は、（銅の不存在および銅の存在により）ガラクトキナ
ーゼ合成における変動に由来するガラクトース上での増
殖速度における大きな変動はｇａｌｌ Δ株ＪＷＧ２
−ＩＤにおける転位効率に有意には影響を与えなかった
（第２表参照）。
第３表に示すごとく、Ｔｙｌに挿入されたＧＡＬＫカセ
ットの発現に関しては、ＧＡＬＫ発現に対するＧＡＬＫ
プロモーターの誘導の影響は小さいかまたは存在しない
。事実、ｐＲＩＴ１２９４６（ＡＲＧ３−ＧＡＬＫカセ
ット）を含有する株は、炭素源としてグルコース（Ｔｙ
ｌの発現なし）またはガラクトース（Ｔｙ１発現の誘導
）上でそれらを増殖させた場合、同様量のガラクトシキ
ナーゼを合成し、ガラクトシキナーゼの特異的活性はＡ
ＲＧ３−ＧＡＬＫがＴｙｌ要素に挿入されない通常の２
ミクロンプラスミドに関するのと同じオーダーである。
ットの発現に関しては、ＧＡＬＫ発現に対するＧＡＬＫ
プロモーターの誘導の影響は小さいかまたは存在しない
。事実、ｐＲＩＴ１２９４６（ＡＲＧ３−ＧＡＬＫカセ
ット）を含有する株は、炭素源としてグルコース（Ｔｙ
ｌの発現なし）またはガラクトース（Ｔｙ１発現の誘導
）上でそれらを増殖させた場合、同様量のガラクトシキ
ナーゼを合成し、ガラクトシキナーゼの特異的活性はＡ
ＲＧ３−ＧＡＬＫがＴｙｌ要素に挿入されない通常の２
ミクロンプラスミドに関するのと同じオーダーである。
他方、染色体に組み込まれたｌのｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ
コピーを有する株は、同一発現カセットを持つ低コピー
数プラスミドを含有する同−株と同様量のガラクトキナ
ーゼを合成する。
コピーを有する株は、同一発現カセットを持つ低コピー
数プラスミドを含有する同−株と同様量のガラクトキナ
ーゼを合成する。
本発明の方法の効率を増大させるためには、発現カセッ
ト以外にもエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅ−ｖｉ
ｓｉａｅ）ＣＵ Ｐ ｌ （メタロチオネイン）遺伝子
のごとき適当な選択マーカーを本発明のベクターに導入
し、それにより単純な実験における転位現象の高コピー
数を支持する株の選択を可能とすることができる。選択
マーカーとしてＣＵＰ ｌ遺伝子を用いる場合、用いる
受容体様はＣｕｐｌｓまたはＣｕｐｌΔ株でなければな
らない。選択マーカーを用いる場合に起こる可能性のあ
る転位効率の減少を避けるためには、転写の効率的なエ
ンカブシデーション（ｅｎｃａｐｓ １ｄａｔ １ｏｎ
）を可能とし、「ヘルパー」プラスミドを用いて転位マ
シーナリ（ｍ ａ ｃｈｉｎｅｒｙ）が産生されるよう
にベクターのＴＶ配列を最小サイズまで減少させるのが
有用であろう。例えば、Ｔｙｌの最初のＢｇ１１１部位
まで延びる５′配列でおそらく十分であろう。かかるベ
クターは、５″Ｂｇｌ■部位からＴｙｌ要素上のＳａｃ
Ｉ部位に対応する地点まで延びる内部Ｔｙｌ配列が存在
しない以外は、例えば、ｐＲＩ Ｔ ｌ ２９４６に同
一である。おそらく、その３’ＬＴＲがもう１つの転写
停止配列で置き換えられているが誘導性プロモーター（
例えば、ＧＡＬＩ）によって制御される「ヘルパー」Ｔ
ｙ要素と連結させてかかるベクターを用いるべきである
。該「ヘルパー」要素は本発明のプラスミドから独立し
たプラスミドの部分である得る。該「ヘルパー」Ｔｙ要
素は転位しないが、転位のために本発明のプラスミドに
よって要求されるＴｙａおよびＴｙｂ蛋白を産生ずる。
ト以外にもエス・セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅ−ｖｉ
ｓｉａｅ）ＣＵ Ｐ ｌ （メタロチオネイン）遺伝子
のごとき適当な選択マーカーを本発明のベクターに導入
し、それにより単純な実験における転位現象の高コピー
数を支持する株の選択を可能とすることができる。選択
マーカーとしてＣＵＰ ｌ遺伝子を用いる場合、用いる
受容体様はＣｕｐｌｓまたはＣｕｐｌΔ株でなければな
らない。選択マーカーを用いる場合に起こる可能性のあ
る転位効率の減少を避けるためには、転写の効率的なエ
ンカブシデーション（ｅｎｃａｐｓ １ｄａｔ １ｏｎ
）を可能とし、「ヘルパー」プラスミドを用いて転位マ
シーナリ（ｍ ａ ｃｈｉｎｅｒｙ）が産生されるよう
にベクターのＴＶ配列を最小サイズまで減少させるのが
有用であろう。例えば、Ｔｙｌの最初のＢｇ１１１部位
まで延びる５′配列でおそらく十分であろう。かかるベ
クターは、５″Ｂｇｌ■部位からＴｙｌ要素上のＳａｃ
Ｉ部位に対応する地点まで延びる内部Ｔｙｌ配列が存在
しない以外は、例えば、ｐＲＩ Ｔ ｌ ２９４６に同
一である。おそらく、その３’ＬＴＲがもう１つの転写
停止配列で置き換えられているが誘導性プロモーター（
例えば、ＧＡＬＩ）によって制御される「ヘルパー」Ｔ
ｙ要素と連結させてかかるベクターを用いるべきである
。該「ヘルパー」要素は本発明のプラスミドから独立し
たプラスミドの部分である得る。該「ヘルパー」Ｔｙ要
素は転位しないが、転位のために本発明のプラスミドに
よって要求されるＴｙａおよびＴｙｂ蛋白を産生ずる。
また、Ｔｙベクターの発現レベルは、ＧＡＬＩプロモー
ターの修飾または変形、例えば、ＣＵＰｌ ５′配列
での置き換えによって増加させることができる。
ターの修飾または変形、例えば、ＣＵＰｌ ５′配列
での置き換えによって増加させることができる。
本発明のベクター系はエビソームに比し、多くの利点を
提供できる。ベクターコピーは染色体に安定に組み込ま
れかつ分散され（縦列反復せず）、選択圧の不存在にお
いての増殖を可能とする。また、プラスミドは通常分離
に偏りがあるが、組み込まれたカセットは細胞集団に均
一に分散される。
提供できる。ベクターコピーは染色体に安定に組み込ま
れかつ分散され（縦列反復せず）、選択圧の不存在にお
いての増殖を可能とする。また、プラスミドは通常分離
に偏りがあるが、組み込まれたカセットは細胞集団に均
一に分散される。
かくして、本発明の方法は明確な濃度での、かつ各細胞
集団で効率が同一である遺伝子産生物の合成を可能とす
る。
集団で効率が同一である遺伝子産生物の合成を可能とす
る。
以下の第１表は、マルチコピー数プラスミドｐＲＩＴ１
２９４６、ｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８またはｐＲＩＴ１
２９４５、あるいはＹＣｐ５０由来の低コピー数プラス
ミド、すなわち、ｐＲＩ Ｔ Ｉ ２９４７、ｐＲＩＴ
１２９４８またはｐＲＩＴ１２９４９を含有するｇａｌ
１株、ＪＷＧ２−ＩＤの増殖特性を示すものである。
２９４６、ｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８またはｐＲＩＴ１
２９４５、あるいはＹＣｐ５０由来の低コピー数プラス
ミド、すなわち、ｐＲＩ Ｔ Ｉ ２９４７、ｐＲＩＴ
１２９４８またはｐＲＩＴ１２９４９を含有するｇａｌ
１株、ＪＷＧ２−ＩＤの増殖特性を示すものである。
以下の第２表は、異なる増殖条件下でのＧＡＬｋ発現カ
セットの転位頻度を示すものである。
セットの転位頻度を示すものである。
以下の第３表は、ｐＪｅｆ１２６７またはＹ Ｃｐ５０
由来のプラスミド上のｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ発現カセッ
トを持つ、またはエス・セレビシエ（Ｓ。
由来のプラスミド上のｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ発現カセッ
トを持つ、またはエス・セレビシエ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖ ｉｓ １ａｅ）宿主染色体に組み込まれた
ｌのトランスポゾン（ＴＹｌ−ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ）
を有するＪＷＧ２−ＩＤによって産生されたガラクトキ
ナーゼの濃度を示すものである。
ｌのトランスポゾン（ＴＹｌ−ｐＡＲＧ３−ＧＡＬＫ）
を有するＪＷＧ２−ＩＤによって産生されたガラクトキ
ナーゼの濃度を示すものである。
第１ Ｃａ）図は、実施例に記載するベクターで用いる
ＧＡＬＫ発現カセットを組み立てるのに用いる適合イー
・コリ（Ｅ 、 ｃｏｌｉ）Ｇ Ａ Ｌ Ｋ構造遺伝子
を示す図であり、 第１ （ｂ）図は、ＣＡＲｌ（アルギナーゼ）、ＡＲＧ
３（オルニチントランスカルバミラーゼ）およびＣＵＰ
ｌ（メタロチオネイン）遺伝子の５′末端を示す図で
あり、 第１ （ｃ）図は、発現カセットを得るためにＢａｍＨ
Ｉ部位を用いてＣＡＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰＩプロ
モーターとＧＡＬＫコーディング配列とを連結したとこ
ろを示す図であり、 第２図、パー１−Ａ、はｐＧＡＬＫ−ＴＹ１組立体を含
有するｐＪｅｆ１２６７の構成を示す図であり、 第２（ａ）図、バートＢ１はｐＪｅｆ１２６７の誘導体
であって、ｐＪｅｆ１２６７のＳａｃＩ制限部位に導入
されたＣＡＲｌプロモーター−ＧＡＬＫ（ｐＲＩＴ１２
９３８）、ＡＲＧ３プロモーター−ＧＡＬＫ（ｐＲＩＴ
Ｉ ２９４６）およびＣＵＰ ｌプロモーター−ＧＡＬ
Ｋ（ｐＲＩ Ｔ ｌ ２９４５）よりなる発現カセット
を含有するｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８、ｐＲＩＴ１２９
４６およびｐＲＩＴ１２９４５の構成を示す図であり、 第２（ｂ）図は実施例に記載したＧＡＬＫ発現カセット
を含有するｐＧＡＬ １−Ｔｙ１組立体の構造を示す図
である。 特許出願人 スミス・クライン−アール・アイ・ティ
ＧＡＬＫ発現カセットを組み立てるのに用いる適合イー
・コリ（Ｅ 、 ｃｏｌｉ）Ｇ Ａ Ｌ Ｋ構造遺伝子
を示す図であり、 第１ （ｂ）図は、ＣＡＲｌ（アルギナーゼ）、ＡＲＧ
３（オルニチントランスカルバミラーゼ）およびＣＵＰ
ｌ（メタロチオネイン）遺伝子の５′末端を示す図で
あり、 第１ （ｃ）図は、発現カセットを得るためにＢａｍＨ
Ｉ部位を用いてＣＡＲＩ、ＡＲＧ３およびＣＵＰＩプロ
モーターとＧＡＬＫコーディング配列とを連結したとこ
ろを示す図であり、 第２図、パー１−Ａ、はｐＧＡＬＫ−ＴＹ１組立体を含
有するｐＪｅｆ１２６７の構成を示す図であり、 第２（ａ）図、バートＢ１はｐＪｅｆ１２６７の誘導体
であって、ｐＪｅｆ１２６７のＳａｃＩ制限部位に導入
されたＣＡＲｌプロモーター−ＧＡＬＫ（ｐＲＩＴ１２
９３８）、ＡＲＧ３プロモーター−ＧＡＬＫ（ｐＲＩＴ
Ｉ ２９４６）およびＣＵＰ ｌプロモーター−ＧＡＬ
Ｋ（ｐＲＩ Ｔ ｌ ２９４５）よりなる発現カセット
を含有するｐＲＩ Ｔ ｌ ２９３８、ｐＲＩＴ１２９
４６およびｐＲＩＴ１２９４５の構成を示す図であり、 第２（ｂ）図は実施例に記載したＧＡＬＫ発現カセット
を含有するｐＧＡＬ １−Ｔｙ１組立体の構造を示す図
である。 特許出願人 スミス・クライン−アール・アイ・ティ
Claims (29)
- （１）機能性Ｔｙ１またはＴｙ２要素に作動可能に連結
したプロモーターよりなり、該Ｔｙ１またはＴｙ２要素
が外来コーディング配列に作動可能に連結した強力な酵
母プロモーターを含有する発現カセットよりなることを
特徴とするベクター。 - （２）該プロモーターがＧＡＬ１であることを特徴とす
る特許請求の範囲第（１）項記載のベクター。 - （３）該ベクターが機能性Ｔｙ１要素よりなることを特
徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のベクター。 - （４）該機能性Ｔｙ１要素がＴｙＨ３の誘導体であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載のベクタ
ー。 - （５）該ベクターがさらに選択マーカーを含有すること
を特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のベクター
。 - （６）該選択マーカーがサッカロミセス・セレビシエ（
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＵＰ１遺伝子であること
を特徴とする特許請求の範囲第（５）項記載のベクター
。 - （７）該外米コーディング配列が生物学的活性を有する
蛋白質についてコード付けすることを特徴とする特許請
求の範囲第（１）項記載のベクター。 - （８）該蛋白質が治療上の生物学的活性を有することを
特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載のベクター。 - （９）該強力な酵母プロモーターがエス・セレビシエ（
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ３遺伝子からのもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載
のベクター。 - （１０）該強力な酵母プロモーターがエス・セレビシエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＵＰ１遺伝子からのも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記
載のベクター。 - （１１）ｐＪｅｆ１２６７の誘導体であって、そのＳａ
ｃ I 部位に挿入された発現カセットよりなることを特
徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のベクター。 - （１２）ベクターで形質転換した宿主酵母細胞であって
、該ベクターが機能性Ｔｙ１またはＴｙ２要素に作動可
能に連結したプロモーターよりなり、該Ｔｙ１またはＴ
ｙ２要素が外来コーディング配列に作動可能に連結した
強力な酵母プロモーターを含有する発現カセットよりな
ることを特徴とする該宿主酵母細胞。 - （１３）サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属することを特徴とする特許請求の範囲第（１２
）項記載の宿主。 - （１４）エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）種に属することを特徴とする特許請求の範囲第（１３
）項記載の宿主。 - （１５）該プロモーターがＧＡＬ１であることを特徴と
する特許請求の範囲第（１２）項記載の宿主。 - （１６）該ベクターが機能性Ｔｙ１要素よりなることを
特徴とする特許請求の範囲第（１２）項記載の宿主。 - （１７）該機能性Ｔｙ１要素がＴｙＨ３の誘導体である
ことを特徴とする特許請求の範囲第（１６）項記載の宿
主。 - （１８）該発現カセットがさらに選択マーカーを含有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項記載の
宿主。 - （１９）該選択マーカーがエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＵＰ１遺伝子であることを特徴と
する特許請求の範囲第（１８）項記載の宿主。 - （２０）該外来コーディング配列が生物学的活性を有す
る蛋白質についてコード付けすることを特徴とする特許
請求の範囲第（１２）項記載の宿主。 - （２１）該蛋白質が治療上の生物学的活性を有すること
を特徴とする特許請求の範囲第（２０）項記載の宿主。 - （２２）該強力な酵母プロモーターがエス・セレビシエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ３遺伝子からのも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項
記載の宿主。 - （２３）該強力な酵母プロモーターがエス・セレビシエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＵＰ１遺伝子からのも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項
記載の宿主。 - （２４）該ベクターがｐＪｅｆ１２６７の誘導体であっ
て、そのＳａｃ I 部位に挿入された発現カセットより
なることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項記載
の宿主。 - （２５）強力な酵母プロモーターが機能することを可能
とする条件下で特許請求の範囲第（１２）項記載の宿主
を培養することを特徴とする安定なゲノム組込みおよび
外来コーディング配列の発現を行う方法。 - （２６）該強力な酵母プロモーターが誘導性プロモータ
ーであることを特徴とする特許請求の範囲第（２５）項
記載の方法。 - （２７）該誘導性プロモーターがＧＡＬ１であることを
特徴とする特許請求の範囲第（２６）項記載の方法。 - （２８）該誘導性プロモーターがエス・セレビシエ（Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＵＰ１遺伝子からのもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第（２６）項記載
の方法。 - （２９）該誘導性プロモーターがエス・セレビシエ（Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ３遺伝子からのもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第（２６）項記載
の方法。
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