JPH08266290A - フサリウムオキシスポラムからのペニシリンｖアミドヒドロラーゼ遺伝子 - Google Patents
フサリウムオキシスポラムからのペニシリンｖアミドヒドロラーゼ遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 フサリウムオキシスポラム４３５株のすべて
又は一部をコードする核酸分子に関する。 【解決手段】 フサリウムオキシスポラムのＰＶＡのす
べて又は一部をコードする核酸配列より成る単離された
核酸分子に関する。
又は一部をコードする核酸分子に関する。 【解決手段】 フサリウムオキシスポラムのＰＶＡのす
べて又は一部をコードする核酸配列より成る単離された
核酸分子に関する。
Description
【０００１】酵素ペニシリンＶアミドヒドロラーゼ遺伝
子は、ペニシリンＶ（フェノキシ−メチルペニシリン）
の６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）への酵素的加
水分解のために使用される。６−ＡＰＡは半合成ペニシ
リンの製造のために使用される活性ベータラクタム核で
ある。種々のペニシリンＶアミドヒドロラーゼ（ＰＶ
Ａ）酵素が、真菌、ストレプトミセスおよび細菌で見い
だされている（ローウェ（Ｌｏｗｅ）ら、１９８６，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：１５１−１５
６））。ＰＶＡ酵素活性は、ローウェ（Ｌｏｗｅ）らに
よりフサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から記載されているが、酵素は
単離も精製もされていない。本発明は、フサリウムオキ
シスポラム４３５株のすべてまたは一部をコードする単
離された核酸分子に関する。ＰＶＡ遺伝子は、クローン
化され配列決定されそして発現されている。
子は、ペニシリンＶ（フェノキシ−メチルペニシリン）
の６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）への酵素的加
水分解のために使用される。６−ＡＰＡは半合成ペニシ
リンの製造のために使用される活性ベータラクタム核で
ある。種々のペニシリンＶアミドヒドロラーゼ（ＰＶ
Ａ）酵素が、真菌、ストレプトミセスおよび細菌で見い
だされている（ローウェ（Ｌｏｗｅ）ら、１９８６，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：１５１−１５
６））。ＰＶＡ酵素活性は、ローウェ（Ｌｏｗｅ）らに
よりフサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から記載されているが、酵素は
単離も精製もされていない。本発明は、フサリウムオキ
シスポラム４３５株のすべてまたは一部をコードする単
離された核酸分子に関する。ＰＶＡ遺伝子は、クローン
化され配列決定されそして発現されている。
【０００２】別の面で本発明は、フサリウムオキシスポ
ラム４３５株からのプロモーター、ＰＶＡ遺伝子のすべ
てまたは一部を含有する発現ベクター、および／または
新規プロモーターに関し：そして該発現ベクターを含有
する宿主細胞に関する。さらに別の面において、本発明
は特にインデューサーとしてのフェノキシアセテートの
存在下でのＰＶＡの産生に関する。図１−完全なＰＶＡ
酵素の６つのペプチド断片のアミノ酸配列。Ｎ−末端の
アミノ酸配列は、配列番号１であり、ペプチドＡのアミ
ノ酸配列は配列番号２であり、ペプチドＢ１のアミノ酸
配列は配列番号３であり、ペプチドＢ２のアミノ酸配列
は配列番号４であり、ペプチドＣのアミノ酸配列は配列
番号５であり、ペプチドＤのアミノ酸配列は配列番号６
であり、ペプチドＥのアミノ酸配列は配列番号７であ
る。
ラム４３５株からのプロモーター、ＰＶＡ遺伝子のすべ
てまたは一部を含有する発現ベクター、および／または
新規プロモーターに関し：そして該発現ベクターを含有
する宿主細胞に関する。さらに別の面において、本発明
は特にインデューサーとしてのフェノキシアセテートの
存在下でのＰＶＡの産生に関する。図１−完全なＰＶＡ
酵素の６つのペプチド断片のアミノ酸配列。Ｎ−末端の
アミノ酸配列は、配列番号１であり、ペプチドＡのアミ
ノ酸配列は配列番号２であり、ペプチドＢ１のアミノ酸
配列は配列番号３であり、ペプチドＢ２のアミノ酸配列
は配列番号４であり、ペプチドＣのアミノ酸配列は配列
番号５であり、ペプチドＤのアミノ酸配列は配列番号６
であり、ペプチドＥのアミノ酸配列は配列番号７であ
る。
【０００３】図２−オリゴヌクレオチドプローブ。４つ
のオリゴヌクレオチドのセットが、ペプチドＣ（配列番
号５）からの７つのアミノ酸の逆転写により得られた。
７つのアミノ酸配列は、配列番号８であり、配列番号８
から逆転写されたＤＮＡ配列は、配列番号９であり、配
列番号９に相補的なＤＮＡ配列は配列番号１０であり、
オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１１である。
のオリゴヌクレオチドのセットが、ペプチドＣ（配列番
号５）からの７つのアミノ酸の逆転写により得られた。
７つのアミノ酸配列は、配列番号８であり、配列番号８
から逆転写されたＤＮＡ配列は、配列番号９であり、配
列番号９に相補的なＤＮＡ配列は配列番号１０であり、
オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１１である。
【０００４】図３−種々のＤＮＡとペプチド断片。ＰＶ
Ａ Ｎ−末端アミノ酸配列は配列番号１２であり、２５
８５翻訳アミノ酸配列は配列番号１３であり、２５８５
ＤＮＡ配列は配列番号１４であり、２５８５−Ｍ ＤＮ
Ａ配列は配列番号１５であり、２５８５−ＦＬ翻訳アミ
ノ酸配列は配列番号１２と同一であり、コード鎖の２５
８５−ＦＬ ＤＮＡ配列は配列番号１６であり、鋳型鎖
（すなわち、コード鎖に相補的）の２５８５−ＦＬ Ｄ
ＮＡ配列は配列番号１７である。すべてのヌクレオチド
配列（配列番号１７を除く）は、左から右に５′から
３′へ示してある。
Ａ Ｎ−末端アミノ酸配列は配列番号１２であり、２５
８５翻訳アミノ酸配列は配列番号１３であり、２５８５
ＤＮＡ配列は配列番号１４であり、２５８５−Ｍ ＤＮ
Ａ配列は配列番号１５であり、２５８５−ＦＬ翻訳アミ
ノ酸配列は配列番号１２と同一であり、コード鎖の２５
８５−ＦＬ ＤＮＡ配列は配列番号１６であり、鋳型鎖
（すなわち、コード鎖に相補的）の２５８５−ＦＬ Ｄ
ＮＡ配列は配列番号１７である。すべてのヌクレオチド
配列（配列番号１７を除く）は、左から右に５′から
３′へ示してある。
【０００５】図４−２５８５−ＦＬの略図。図５−ゲノ
ムＰＶＡ遺伝子のクローニングの略図。図６及び７−Ｐ
ＶＡ ｃＤＮＡ（配列番号１８）と対応するアミノ酸配
列（配列番号１９）。下線を引いたＤＮＡ配列（塩基対
１３４８から１３６８配列番号２０）は、２０量体プロ
ーブ（配列番号１１）に相補的である。星印は停止コド
ンを示す。
ムＰＶＡ遺伝子のクローニングの略図。図６及び７−Ｐ
ＶＡ ｃＤＮＡ（配列番号１８）と対応するアミノ酸配
列（配列番号１９）。下線を引いたＤＮＡ配列（塩基対
１３４８から１３６８配列番号２０）は、２０量体プロ
ーブ（配列番号１１）に相補的である。星印は停止コド
ンを示す。
【０００６】図８及び９−ＰＶＡゲノムＤＮＡ（配列番
号２１）と対応するアミノ酸配列（配列番号２２）。プ
ロモーターは塩基対番号１〜２４０（配列番号２３）で
ある。最初の星印は、転写開始コドンを示し、２番目の
星印は停止コドンを示す。図１０−ｐＷＢ１９Ｎの作成
の略図。図１１−ｐＳＪＣ６２の作成の略図。図１２−
ｐＢＭＦＸＰＶＡ６の作成の略図。図１３−ｐＢＭＦＸ
ＰＶＡ７の作成の略図。図１４−ｐＦ０２０の作成の略
図。図１５−ｐＦ０２０−Ｐの作成の略図。図１６−ｐ
ＢＭＰＶＡ−Ｐの作成の略図。図１７−ｐＦ０２０−Ｍ
の作成の略図。図１８−ｐＢＭＰＶＡ−Ｍの作成の略
図。図１９−ｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０２の作成の略
図。図２０−ｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０４の作成の略
図。
号２１）と対応するアミノ酸配列（配列番号２２）。プ
ロモーターは塩基対番号１〜２４０（配列番号２３）で
ある。最初の星印は、転写開始コドンを示し、２番目の
星印は停止コドンを示す。図１０−ｐＷＢ１９Ｎの作成
の略図。図１１−ｐＳＪＣ６２の作成の略図。図１２−
ｐＢＭＦＸＰＶＡ６の作成の略図。図１３−ｐＢＭＦＸ
ＰＶＡ７の作成の略図。図１４−ｐＦ０２０の作成の略
図。図１５−ｐＦ０２０−Ｐの作成の略図。図１６−ｐ
ＢＭＰＶＡ−Ｐの作成の略図。図１７−ｐＦ０２０−Ｍ
の作成の略図。図１８−ｐＢＭＰＶＡ−Ｍの作成の略
図。図１９−ｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０２の作成の略
図。図２０−ｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０４の作成の略
図。
【０００７】本発明は、フサリウムオキシスポラム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＶＡのすべ
てまたは一部をコードする核酸配列よりなる単離された
核酸分子に関する。好ましくは核酸分子はＤＮＡ分子で
あり、核酸配列はＤＮＡ配列である。本明細書において
すべてのＤＮＡ配列は、左から右への配向が通常の５′
から３′への方向である式で表される（ただし、図３に
示す配列番号１７は除く）。さらに好ましいのは、実質
的に図６と７に示すヌクレオチド配列（特に、配列番号
１８と配列番号２１）のすべてまたは一部を有するＤＮ
Ａ配列；またはこれらのＤＮＡ配列の１つに相補的なＤ
ＮＡ配列；またはこれらのＤＮＡ配列の１つに相補的な
ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列である。好
ましくはこのＤＮＡ配列は緊縮条件下でハイブリダイズ
する。「緊縮性条件」とは、本明細書の「好適な実施態
様の詳細な例」に記載した条件と同等以上に緊縮性であ
る条件である。ＰＶＡの一部をコードするヌクレオチド
配列（例えば、ＤＮＡ配列）の場合は、このヌクレオチ
ド配列は少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであるこ
とが好ましい。
ｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＶＡのすべ
てまたは一部をコードする核酸配列よりなる単離された
核酸分子に関する。好ましくは核酸分子はＤＮＡ分子で
あり、核酸配列はＤＮＡ配列である。本明細書において
すべてのＤＮＡ配列は、左から右への配向が通常の５′
から３′への方向である式で表される（ただし、図３に
示す配列番号１７は除く）。さらに好ましいのは、実質
的に図６と７に示すヌクレオチド配列（特に、配列番号
１８と配列番号２１）のすべてまたは一部を有するＤＮ
Ａ配列；またはこれらのＤＮＡ配列の１つに相補的なＤ
ＮＡ配列；またはこれらのＤＮＡ配列の１つに相補的な
ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列である。好
ましくはこのＤＮＡ配列は緊縮条件下でハイブリダイズ
する。「緊縮性条件」とは、本明細書の「好適な実施態
様の詳細な例」に記載した条件と同等以上に緊縮性であ
る条件である。ＰＶＡの一部をコードするヌクレオチド
配列（例えば、ＤＮＡ配列）の場合は、このヌクレオチ
ド配列は少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであるこ
とが好ましい。
【０００８】好適なＤＮＡ断片は配列番号１１のプロー
ブと配列番号２３のプロモーターである。本発明のＰＶ
Ａ分子は、必ずしも触媒として活性である必要はない。
例えば、触媒として不活性なＰＶＡまたはその断片は、
その蛋白に対する抗体を作成するのに有用である。また
本発明は、修飾された配列も包含する。本出願で使用さ
れる「修飾」という用語は、ヌクレオチドまたはポリペ
プチド配列について言及する時は、天然に見いだされる
野性型配列とは異なるヌクレオチドまたはポリペプチド
配列を意味する。
ブと配列番号２３のプロモーターである。本発明のＰＶ
Ａ分子は、必ずしも触媒として活性である必要はない。
例えば、触媒として不活性なＰＶＡまたはその断片は、
その蛋白に対する抗体を作成するのに有用である。また
本発明は、修飾された配列も包含する。本出願で使用さ
れる「修飾」という用語は、ヌクレオチドまたはポリペ
プチド配列について言及する時は、天然に見いだされる
野性型配列とは異なるヌクレオチドまたはポリペプチド
配列を意味する。
【０００９】本発明のＤＮＡ配列は、当業者に公知の種
々の方法を用いて得られる。少なくとも３つの主要な方
法が使用される： （１）該配列を含有するゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）からの２本鎖ＤＮＡ配列の単離、（２）
ＤＮＡ配列の化学合成；そして（３）ポリメラーゼチェ
イン反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の合成。
々の方法を用いて得られる。少なくとも３つの主要な方
法が使用される： （１）該配列を含有するゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）からの２本鎖ＤＮＡ配列の単離、（２）
ＤＮＡ配列の化学合成；そして（３）ポリメラーゼチェ
イン反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の合成。
【００１０】最初の方法では、ＰＶＡのすべてまたは一
部をコードするＤＮＡ配列を同定するために、ゲノムＤ
ＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされ
る。例えば、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤ
ＮＡ配列を同定するために、フサリウムオキシスポラム
（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のゲノムＤＮＡライブラリ
ーがスクリーニグされる。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするために種々の方法を
使用することができる。
部をコードするＤＮＡ配列を同定するために、ゲノムＤ
ＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされ
る。例えば、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤ
ＮＡ配列を同定するために、フサリウムオキシスポラム
（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のゲノムＤＮＡライブラリ
ーがスクリーニグされる。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするために種々の方法を
使用することができる。
【００１１】例えば、ＰＶＡのすべてまたは一部をコー
ドする標的ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに存在する配列
と同じ配列を有する標識された１本鎖ＤＮＡプローブ配
列は、１本鎖型に変性されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａのクローン化コロニー上で行われるＤＮＡ／ＤＮＡハ
イブリダイゼーション法に使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーはまた、イムノブ
ロッティング法を用いてＰＶＡのすべてまたは一部をコ
ードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡについてスクリー
ニングすることができる。
ドする標的ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに存在する配列
と同じ配列を有する標識された１本鎖ＤＮＡプローブ配
列は、１本鎖型に変性されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａのクローン化コロニー上で行われるＤＮＡ／ＤＮＡハ
イブリダイゼーション法に使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーはまた、イムノブ
ロッティング法を用いてＰＶＡのすべてまたは一部をコ
ードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡについてスクリー
ニングすることができる。
【００１２】イムノブロッティング法またはハイブリダ
イゼーション法に適した典型的なスクリーニング法で
は、通常ベクター内に含有されているゲノムＤＮＡライ
ブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーが最初に寒天平板
に広げられ、次にクローンがフィルター膜（例えば、ニ
トロセルロース膜）に移される。次にＰＶＡのすべてま
たは一部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含
有するクローンを同定するために、ＤＮＡプローブはク
ローンにハイブリダイズされるか、または抗体がクロー
ンに結合される。
イゼーション法に適した典型的なスクリーニング法で
は、通常ベクター内に含有されているゲノムＤＮＡライ
ブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーが最初に寒天平板
に広げられ、次にクローンがフィルター膜（例えば、ニ
トロセルロース膜）に移される。次にＰＶＡのすべてま
たは一部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含
有するクローンを同定するために、ＤＮＡプローブはク
ローンにハイブリダイズされるか、または抗体がクロー
ンに結合される。
【００１３】第２にアプローチでは、ＰＶＡのすべてま
たは一部をコードする本発明のＤＮＡ配列は、化学的に
合成される。例えば、ＰＶＡをコードするＤＮＡ配列
は、１００塩基オリゴヌクレオチドのシリーズとして合
成され、これが（適当な末端制限部位または相補的な末
端配列を介して）連続的に結合されて、ヌクレオチドの
正しい線状の配列が生成する。
たは一部をコードする本発明のＤＮＡ配列は、化学的に
合成される。例えば、ＰＶＡをコードするＤＮＡ配列
は、１００塩基オリゴヌクレオチドのシリーズとして合
成され、これが（適当な末端制限部位または相補的な末
端配列を介して）連続的に結合されて、ヌクレオチドの
正しい線状の配列が生成する。
【００１４】第３のアプローチでは、ＰＶＡのすべてま
たは一部をコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲを用いて合
成される。簡単に説明すると、標的ＤＮＡ配列の反対の
鎖にハイブリダイズする少なくとも１５塩基対の長さの
合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド対（ＰＣＲプライマー）
が、標的配列上でＤＮＡの介在領域を酵素的に増幅する
のに使用される。鋳型の熱変性、プライマーのアニーリ
ング、そしてアニーリングされたプライマーの３′末端
のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のサイクルを繰り返し
て、ＰＣＲプライマーの５′末端により規定される断片
が増幅される。ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｇｅｎｅｔ．５，１８５−１８９（１９８９）を参
照。
たは一部をコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲを用いて合
成される。簡単に説明すると、標的ＤＮＡ配列の反対の
鎖にハイブリダイズする少なくとも１５塩基対の長さの
合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド対（ＰＣＲプライマー）
が、標的配列上でＤＮＡの介在領域を酵素的に増幅する
のに使用される。鋳型の熱変性、プライマーのアニーリ
ング、そしてアニーリングされたプライマーの３′末端
のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のサイクルを繰り返し
て、ＰＣＲプライマーの５′末端により規定される断片
が増幅される。ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｇｅｎｅｔ．５，１８５−１８９（１９８９）を参
照。
【００１５】本発明のＤＮＡ配列は、本発明の種々の方
法において使用される。本ＤＮＡ配列の最も明白な使用
法は、ペニシリンＶから６−ＡＰＡへの変換に有用なＰ
ＶＡを調製することである。しかしこれらは、ＰＶＡに
関連する蛋白をコードする他のＤＮＡ配列をハイブリダ
イゼーションにより選択するように、蛋白のｃＤＮＡや
ゲノムＤＮＡをスクリーニングするためのＤＮＡプロー
ブとして、使用することもできる。さらにＰＶＡのすべ
てまたは一部をコードする本発明のＤＮＡ配列は、フサ
リウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）以外の生物からのＰＶＡ分子をコードするＤ
ＮＡ配列をハイブリダイゼーションにより選択するため
の、他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするためのＤＮＡプローブとして使用する
ことができる。
法において使用される。本ＤＮＡ配列の最も明白な使用
法は、ペニシリンＶから６−ＡＰＡへの変換に有用なＰ
ＶＡを調製することである。しかしこれらは、ＰＶＡに
関連する蛋白をコードする他のＤＮＡ配列をハイブリダ
イゼーションにより選択するように、蛋白のｃＤＮＡや
ゲノムＤＮＡをスクリーニングするためのＤＮＡプロー
ブとして、使用することもできる。さらにＰＶＡのすべ
てまたは一部をコードする本発明のＤＮＡ配列は、フサ
リウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）以外の生物からのＰＶＡ分子をコードするＤ
ＮＡ配列をハイブリダイゼーションにより選択するため
の、他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするためのＤＮＡプローブとして使用する
ことができる。
【００１６】ＰＶＡのすべてまたは一部をコードする本
発明のＤＮＡ配列はまた、種々の突然変異体を調製する
ために修飾（すなわち、突然変異）することもできる。
このような突然変異は、縮重性（すなわち、突然変異に
より、突然変異コドンによりコードされるアミノ酸配列
が変化する）であるか、または非縮重性（すなわち、突
然変異は、突然変異コドンによりコードされるアミノ酸
配列を変化させない）である。これらの修飾ＤＮＡ配列
は、例えば突然変異により、コードされたポリペプチド
中の１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿
入、または添加されるように、当業者に公知の種々の方
法を用いて、ＰＶＡ ＤＮＡ配列を突然変異することに
より調製することができる。例えばモリナガ（Ｍｏｒｉ
ｎａｇａ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．２，６３６−
６３９（１９８４）、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３，８７４９−８７６
４（１９８５）およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４
８２−４９２（１９８５）に記載の部位特異的突然変異
誘発法を使用することができる。さらに、市販の業者か
ら部位特異的突然変異誘発用のキットが購入できる。例
えば部位特異的突然変異誘発を行うためのキットは、ア
マーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）（アー
リントン・ハイツ、イリノイ州）から購入できる。さら
に、セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６，７９１−８０２（１９８８）に記
載の、破壊、欠失および端切り取り法（ｔｒｕｎｃａｔ
ｉｏｎ）を使用してもよい。縮重または非縮重突然変異
のいずれも、本発明のポリペプチドの産生または使用に
有効である。例えば、これらの突然変異は、より高レベ
ルの産生、容易な精製を可能にし、追加の制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を提供する。すべてのこのような修
飾ＤＮＡやポリペプチド分子は、本発明の範囲内に含有
される。
発明のＤＮＡ配列はまた、種々の突然変異体を調製する
ために修飾（すなわち、突然変異）することもできる。
このような突然変異は、縮重性（すなわち、突然変異に
より、突然変異コドンによりコードされるアミノ酸配列
が変化する）であるか、または非縮重性（すなわち、突
然変異は、突然変異コドンによりコードされるアミノ酸
配列を変化させない）である。これらの修飾ＤＮＡ配列
は、例えば突然変異により、コードされたポリペプチド
中の１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿
入、または添加されるように、当業者に公知の種々の方
法を用いて、ＰＶＡ ＤＮＡ配列を突然変異することに
より調製することができる。例えばモリナガ（Ｍｏｒｉ
ｎａｇａ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．２，６３６−
６３９（１９８４）、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３，８７４９−８７６
４（１９８５）およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４
８２−４９２（１９８５）に記載の部位特異的突然変異
誘発法を使用することができる。さらに、市販の業者か
ら部位特異的突然変異誘発用のキットが購入できる。例
えば部位特異的突然変異誘発を行うためのキットは、ア
マーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）（アー
リントン・ハイツ、イリノイ州）から購入できる。さら
に、セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６，７９１−８０２（１９８８）に記
載の、破壊、欠失および端切り取り法（ｔｒｕｎｃａｔ
ｉｏｎ）を使用してもよい。縮重または非縮重突然変異
のいずれも、本発明のポリペプチドの産生または使用に
有効である。例えば、これらの突然変異は、より高レベ
ルの産生、容易な精製を可能にし、追加の制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を提供する。すべてのこのような修
飾ＤＮＡやポリペプチド分子は、本発明の範囲内に含有
される。
【００１７】本発明はまた、特に図７に記載のＰＶＡの
新規のプロモーター（配列番号２３）に関する。本発明
の新規のプロモーターは、他の有用な蛋白またはポリペ
プチドをコードする他の公知のＤＮＡ配列とともに使用
することができる。本発明はさらに、ＰＶＡのすべてま
たは一部をコードするＤＮＡ配列および／またはＰＶＡ
のプロモーターよりなる発現ベクターに関する。この発
現ベクターは好ましくは、実質的に図６または７に記載
のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の１つのすべて
または一部を含有する。さらに好ましいのは、ＰＶＡの
すべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列に機能的に結
合している１つまたはそれ以上の制御ＤＮＡ配列よりな
る発現ベクターである。この意味で使用される時、「機
能的に結合している」という用語は、制御ＤＮＡ配列
が、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列
の複製および／または発現を支配することができること
を意味する。
新規のプロモーター（配列番号２３）に関する。本発明
の新規のプロモーターは、他の有用な蛋白またはポリペ
プチドをコードする他の公知のＤＮＡ配列とともに使用
することができる。本発明はさらに、ＰＶＡのすべてま
たは一部をコードするＤＮＡ配列および／またはＰＶＡ
のプロモーターよりなる発現ベクターに関する。この発
現ベクターは好ましくは、実質的に図６または７に記載
のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の１つのすべて
または一部を含有する。さらに好ましいのは、ＰＶＡの
すべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列に機能的に結
合している１つまたはそれ以上の制御ＤＮＡ配列よりな
る発現ベクターである。この意味で使用される時、「機
能的に結合している」という用語は、制御ＤＮＡ配列
が、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列
の複製および／または発現を支配することができること
を意味する。
【００１８】本発明において有用な発現ベクターは、し
ばしば「プラスミド」の型であり、これは環状２本鎖Ｄ
ＮＡループであることを意味し、これはベクター型では
染色体に結合している。しかし本発明は、同等の機能を
示し後に当該分野で公知になる他の型の発現ベクターを
包含すると考えられる。
ばしば「プラスミド」の型であり、これは環状２本鎖Ｄ
ＮＡループであることを意味し、これはベクター型では
染色体に結合している。しかし本発明は、同等の機能を
示し後に当該分野で公知になる他の型の発現ベクターを
包含すると考えられる。
【００１９】本発明において有用な発現ベクターは典型
的には、複製開始点、ＤＮＡ配列の前（すなわち、上
流）に位置するプロモーター（好ましくは配列番号２３
のプロモーター）、そしてその後に続く、ＰＶＡ、Ｄ−
アミノ酸オキシダーゼ、モノクローナル抗体、インスリ
ン、インターフェロン、表皮増殖因子、成長ホルモンな
どのような構造蛋白のすべてまたは一部をコードするＤ
ＮＡ配列を含有する。構造蛋白のすべてまたは一部をコ
ードするＤＮＡ配列の後には、転写停止配列や残りのベ
クターが続く。発現ベクターはまた、当該分野で公知の
他のＤＮＡ配列、例えば安定性リーダー配列（発現生成
物に安定性を与える）、分泌リーダー配列（発現生成物
を分泌させる）、構造遺伝子の発現を修飾（例えば、増
殖培地中の栄養物質の有無により）させる配列、形質転
換された細胞中で表現型の選択を可能にするマーカー配
列、安定性成分（例えば、プラスミドに有糸分裂の安定
性を与えるセントロメア）、および制限エンドヌクレア
ーゼによる切断のための部位を提供する配列などの、当
該分野で公知の他のＤＮＡ配列を包含する。実際に使用
される発現ベクターの性状は、使用される宿主細胞と融
和性のあるものでなければならない。例えば、真菌細胞
系でクローニングされる時は、発現ベクターは、真菌細
胞のゲノムから単離されたプロモーター（例えば、アス
ペルギルスニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ）のｔｒｐＣプロモーター、およびフサリ
ウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ
ｒｕｍ）からのＰＶＡプロモーター）を含有すべきであ
る。いくつかの発現ベクターは、真菌宿主中で自己複製
プラスミドのインビボ産生を促進する、真菌性の自己複
製性配列（ＡＲＳ；例えば、フサリウムオキシスポラム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびサッ
カロミセスセレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＲＳ）を含有しても
よい。本発明の真菌発現ベクターは、真菌性ＡＲＳを含
有せず、従ってプラスミドが宿主細胞に入ると、これは
宿主細胞中に組み込まれることが好ましい。このような
組み込みは、遺伝的安定性が増強するため好ましい。本
発明で企図される発現ベクターは、本発明のＰＶＡ Ｄ
ＮＡ配列の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）内での複製、真菌細胞内での組み込みおよび好まし
くは発現を支配することができる。大腸菌の種々の宿主
中の適当な複製開始点には、例えばＣｏｌＥ１プラスミ
ド複製開始点がある。適当なプロモーターには、例えば
アスペルギルスニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）からのｔｒｐＣプロモーター、フサ
リウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から
のＰＶＡプロモーター、および大腸菌からのｎｅｏ−ｒ
遺伝子プロモーターがある。適当な停止配列には、例え
ばアスペルギルスニヅランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）
からのｔｒｐＣターミネーター、フサリウムオキシスポ
ラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＶＡターミネータ
ー、大腸菌からのｎｅｏ−ｒ遺伝子ターミネータがあ
る。発現ベクターは、選択性マーカーをコードする配列
を含有することが好ましい。選択性マーカーは好ましく
は抗生物質耐性である。選択性マーカーとしては、フレ
オマイシン耐性（真菌細胞用）、アンピシリン耐性およ
びネオマイシン耐性（細菌用）を使用することが便利で
ある。これらの物質のすべては当該分野で公知であり、
市販されている。
的には、複製開始点、ＤＮＡ配列の前（すなわち、上
流）に位置するプロモーター（好ましくは配列番号２３
のプロモーター）、そしてその後に続く、ＰＶＡ、Ｄ−
アミノ酸オキシダーゼ、モノクローナル抗体、インスリ
ン、インターフェロン、表皮増殖因子、成長ホルモンな
どのような構造蛋白のすべてまたは一部をコードするＤ
ＮＡ配列を含有する。構造蛋白のすべてまたは一部をコ
ードするＤＮＡ配列の後には、転写停止配列や残りのベ
クターが続く。発現ベクターはまた、当該分野で公知の
他のＤＮＡ配列、例えば安定性リーダー配列（発現生成
物に安定性を与える）、分泌リーダー配列（発現生成物
を分泌させる）、構造遺伝子の発現を修飾（例えば、増
殖培地中の栄養物質の有無により）させる配列、形質転
換された細胞中で表現型の選択を可能にするマーカー配
列、安定性成分（例えば、プラスミドに有糸分裂の安定
性を与えるセントロメア）、および制限エンドヌクレア
ーゼによる切断のための部位を提供する配列などの、当
該分野で公知の他のＤＮＡ配列を包含する。実際に使用
される発現ベクターの性状は、使用される宿主細胞と融
和性のあるものでなければならない。例えば、真菌細胞
系でクローニングされる時は、発現ベクターは、真菌細
胞のゲノムから単離されたプロモーター（例えば、アス
ペルギルスニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ）のｔｒｐＣプロモーター、およびフサリ
ウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ
ｒｕｍ）からのＰＶＡプロモーター）を含有すべきであ
る。いくつかの発現ベクターは、真菌宿主中で自己複製
プラスミドのインビボ産生を促進する、真菌性の自己複
製性配列（ＡＲＳ；例えば、フサリウムオキシスポラム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびサッ
カロミセスセレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＲＳ）を含有しても
よい。本発明の真菌発現ベクターは、真菌性ＡＲＳを含
有せず、従ってプラスミドが宿主細胞に入ると、これは
宿主細胞中に組み込まれることが好ましい。このような
組み込みは、遺伝的安定性が増強するため好ましい。本
発明で企図される発現ベクターは、本発明のＰＶＡ Ｄ
ＮＡ配列の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）内での複製、真菌細胞内での組み込みおよび好まし
くは発現を支配することができる。大腸菌の種々の宿主
中の適当な複製開始点には、例えばＣｏｌＥ１プラスミ
ド複製開始点がある。適当なプロモーターには、例えば
アスペルギルスニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）からのｔｒｐＣプロモーター、フサ
リウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から
のＰＶＡプロモーター、および大腸菌からのｎｅｏ−ｒ
遺伝子プロモーターがある。適当な停止配列には、例え
ばアスペルギルスニヅランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）
からのｔｒｐＣターミネーター、フサリウムオキシスポ
ラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＶＡターミネータ
ー、大腸菌からのｎｅｏ−ｒ遺伝子ターミネータがあ
る。発現ベクターは、選択性マーカーをコードする配列
を含有することが好ましい。選択性マーカーは好ましく
は抗生物質耐性である。選択性マーカーとしては、フレ
オマイシン耐性（真菌細胞用）、アンピシリン耐性およ
びネオマイシン耐性（細菌用）を使用することが便利で
ある。これらの物質のすべては当該分野で公知であり、
市販されている。
【００２０】特に好ましいものは、ＰＶＡをコードする
ＤＮＡ配列を含有するｐＢＭＦＸＰＶＡ６と命名された
発現ベクター（本明細書中で後述、または図１０に記
載）、またはｐＢＭＦＸＰＶＡ６の同定用性状を有する
発現ベクターである。またｐＷＢ１９Ｎ，ｐＳＪＣ６
２，ｐＢＭＦＸＰＶＡ７，ｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｐ、そし
てｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｍ（それぞれ本明細書中で後述、
または図８，９，１１，１４および１６に記載）と命名
された発現ベクター、またはｐＷＢ１９Ｎ，ｐＳＪＣ６
２、ｐＢＭＦＸＰＶＡ７，ｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｐ、そし
てｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｍの同定用性状を有する発現ベク
ターである。
ＤＮＡ配列を含有するｐＢＭＦＸＰＶＡ６と命名された
発現ベクター（本明細書中で後述、または図１０に記
載）、またはｐＢＭＦＸＰＶＡ６の同定用性状を有する
発現ベクターである。またｐＷＢ１９Ｎ，ｐＳＪＣ６
２，ｐＢＭＦＸＰＶＡ７，ｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｐ、そし
てｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｍ（それぞれ本明細書中で後述、
または図８，９，１１，１４および１６に記載）と命名
された発現ベクター、またはｐＷＢ１９Ｎ，ｐＳＪＣ６
２、ｐＢＭＦＸＰＶＡ７，ｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｐ、そし
てｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｍの同定用性状を有する発現ベク
ターである。
【００２１】ｐＢＭＦＸＰＶＡ７，ｐＢＭＦＸＰＶＡ−
ＰおよびｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｍを含有する宿主細胞大腸
菌ＤＨ５α株は、ブダペスト条約に従って１９９４年１
２月１４日にアメリカンタイプカルチャーコレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ）、メリーランド州）に寄託され、それぞれ整理番号
ＡＴＣＣ６９７２１，６９７２２および６９７２０を与
えられた。
ＰおよびｐＢＭＦＸＰＶＡ−Ｍを含有する宿主細胞大腸
菌ＤＨ５α株は、ブダペスト条約に従って１９９４年１
２月１４日にアメリカンタイプカルチャーコレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ）、メリーランド州）に寄託され、それぞれ整理番号
ＡＴＣＣ６９７２１，６９７２２および６９７２０を与
えられた。
【００２２】目的のコード配列および対照配列を有する
適当な発現ベクターは、当該分野で標準的公知の組換え
ＤＮＡ技術を用いて作成され、その多くはサムブルーク
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験室マ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８
９）に記載されている。
適当な発現ベクターは、当該分野で標準的公知の組換え
ＤＮＡ技術を用いて作成され、その多くはサムブルーク
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験室マ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８
９）に記載されている。
【００２３】本発明は追加的に、ＰＶＡのすべてまたは
一部をコードするＤＮＡ配列、および／または配列番号
２３のプロモーターよりなる発現ベクターを含有する宿
主細胞に関する。本発明は、好ましくは実質的に図６ま
たは７に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の
１つのすべてまたは一部よりなる発現ベクターを含有す
る。さらに好適なものは、ＰＶＡのすべてまたは一部を
コードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を支配
することができ、該ＤＮＡ配列に機能的に結合している
１つまたはそれ以上のＤＮＡ配列よりなる発現ベクター
を含有する宿主細胞である。追加的に含有されるもの
は、触媒活性のないＰＶＡ分子をコードするように修飾
された（例えば、破壊、欠失または端の切断）ＤＮＡ配
列よりなる発現ベクターを含有する宿主細胞である。適
当な宿主細胞には、真核宿主細胞および原核宿主細胞
（例えば、大腸菌細胞）がある。適当な真核宿主細胞に
は、例えばセファロスポリウムアクレモニウム（Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フ
サリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ）およびペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）細胞があ
る。
一部をコードするＤＮＡ配列、および／または配列番号
２３のプロモーターよりなる発現ベクターを含有する宿
主細胞に関する。本発明は、好ましくは実質的に図６ま
たは７に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の
１つのすべてまたは一部よりなる発現ベクターを含有す
る。さらに好適なものは、ＰＶＡのすべてまたは一部を
コードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を支配
することができ、該ＤＮＡ配列に機能的に結合している
１つまたはそれ以上のＤＮＡ配列よりなる発現ベクター
を含有する宿主細胞である。追加的に含有されるもの
は、触媒活性のないＰＶＡ分子をコードするように修飾
された（例えば、破壊、欠失または端の切断）ＤＮＡ配
列よりなる発現ベクターを含有する宿主細胞である。適
当な宿主細胞には、真核宿主細胞および原核宿主細胞
（例えば、大腸菌細胞）がある。適当な真核宿主細胞に
は、例えばセファロスポリウムアクレモニウム（Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フ
サリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ）およびペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）細胞があ
る。
【００２４】宿主細胞として特に好適な細胞はフサリウ
ムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒ
ｕｍ）株である。発現ベクターは、当該分野で公知の種
々の方法により宿主細胞に導入される。例えば、宿主細
胞のトランスフェクションは、ポリエチレングリコール
介在プロトプラスト形質転換法により行われる。しかし
宿主細胞に発現ベクターを導入する他の方法（例えば、
電気穿孔法、ビオリスティックインジェクション（ｂｉ
ｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、またはプロト
プラスト融合）も使用することができる。
ムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒ
ｕｍ）株である。発現ベクターは、当該分野で公知の種
々の方法により宿主細胞に導入される。例えば、宿主細
胞のトランスフェクションは、ポリエチレングリコール
介在プロトプラスト形質転換法により行われる。しかし
宿主細胞に発現ベクターを導入する他の方法（例えば、
電気穿孔法、ビオリスティックインジェクション（ｂｉ
ｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、またはプロト
プラスト融合）も使用することができる。
【００２５】適当な宿主細胞に発現ベクターが導入され
れば、宿主細胞は、大量の目的のポリペプチド（好適な
例では、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするポリペ
プチド分子）の発現を可能にする条件下で培養される。
ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列を含
有する発現ベクターを含有する宿主細胞は、以下の一般
的アプローチの１つまたはそれ以上の方法を使用して同
定される：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン；（ｂ）マーカー遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞
中のＰＶＡのｍＲＮＡ転写体の産生により測定した転写
レベルの評価；（ｄ）遺伝子生成物の免疫学的検出；
（ｅ）比色的検出；そして（ｆ）酵素測定法（酵素測定
法は好ましい同定方法である）。第１のアプローチで
は、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列
の存在が、ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いてＤＮ
Ａ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンにより検出される。
れば、宿主細胞は、大量の目的のポリペプチド（好適な
例では、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするポリペ
プチド分子）の発現を可能にする条件下で培養される。
ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列を含
有する発現ベクターを含有する宿主細胞は、以下の一般
的アプローチの１つまたはそれ以上の方法を使用して同
定される：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン；（ｂ）マーカー遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞
中のＰＶＡのｍＲＮＡ転写体の産生により測定した転写
レベルの評価；（ｄ）遺伝子生成物の免疫学的検出；
（ｅ）比色的検出；そして（ｆ）酵素測定法（酵素測定
法は好ましい同定方法である）。第１のアプローチで
は、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列
の存在が、ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いてＤＮ
Ａ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンにより検出される。
【００２６】第２のアプローチでは、組換え発現ベクタ
ー宿主系が同定され、ある種のマーカー遺伝子機能（例
えば、抗生物質への耐性、抗真菌剤への耐性、ウラシル
プロトトロフィー）の有無に基づき選択される。マーカ
ー遺伝子はＰＶＡコード配列を制御するのに使用される
プロモーターと同じであるかまたは異なるプロモーター
の制御下で、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤ
ＮＡ配列と同じプラスミドの中に入れられる。誘導体ま
たは選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、ＰＶＡの
すべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列を有する全組
換え発現ベクターの存在を示す。
ー宿主系が同定され、ある種のマーカー遺伝子機能（例
えば、抗生物質への耐性、抗真菌剤への耐性、ウラシル
プロトトロフィー）の有無に基づき選択される。マーカ
ー遺伝子はＰＶＡコード配列を制御するのに使用される
プロモーターと同じであるかまたは異なるプロモーター
の制御下で、ＰＶＡのすべてまたは一部をコードするＤ
ＮＡ配列と同じプラスミドの中に入れられる。誘導体ま
たは選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、ＰＶＡの
すべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列を有する全組
換え発現ベクターの存在を示す。
【００２７】第３のアプローチでは、ハイブリダイゼー
ション測定法によりＰＶＡｍＲＮＡ転写体の産生が評価
される。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは単離され、ノ
ーザンブロットまたはＲＮＡ配列に相補的なプローブを
用いるヌクレアーゼ保護測定法により分析される。ある
いは、宿主細胞が核酸が抽出され、このようなプローブ
への結合について測定される。
ション測定法によりＰＶＡｍＲＮＡ転写体の産生が評価
される。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは単離され、ノ
ーザンブロットまたはＲＮＡ配列に相補的なプローブを
用いるヌクレアーゼ保護測定法により分析される。ある
いは、宿主細胞が核酸が抽出され、このようなプローブ
への結合について測定される。
【００２８】第４のアプローチでは、ＰＶＡのすべてま
たは一部の発現を、例えばウェスタンブロット解析によ
り免疫学的に評価する。第５のアプローチでは、ＰＶＡ
蛋白の発現は、相補性解析により評価される。例えば、
この酵素が欠如していることが公知の細胞中で、培地プ
レート上で無色の基質であるフェノキシ−ｐ−ニトロア
ニリドの黄色のｐ−ニトロアニリンへの酵素的加水分解
についてＰＶＡ活性の発現が検出される。
たは一部の発現を、例えばウェスタンブロット解析によ
り免疫学的に評価する。第５のアプローチでは、ＰＶＡ
蛋白の発現は、相補性解析により評価される。例えば、
この酵素が欠如していることが公知の細胞中で、培地プ
レート上で無色の基質であるフェノキシ−ｐ−ニトロア
ニリドの黄色のｐ−ニトロアニリンへの酵素的加水分解
についてＰＶＡ活性の発現が検出される。
【００２９】第６のアプローチでは、ＰＶＡの発現は公
知の方法を用いてＰＶＡ酵素活性が測定される。例え
ば、本明細書の「好適な実施態様の詳細な実施例」欄に
記載の測定法が使用される。本発明の発現ベクター、プ
ラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当該分野で
公知の種々の方法により測定される。例えば、サンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７（１９７
７）、またはＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７４，５６０−５６４（１９７７）に記載のマ
クサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法
が使用される。
知の方法を用いてＰＶＡ酵素活性が測定される。例え
ば、本明細書の「好適な実施態様の詳細な実施例」欄に
記載の測定法が使用される。本発明の発現ベクター、プ
ラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当該分野で
公知の種々の方法により測定される。例えば、サンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７（１９７
７）、またはＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７４，５６０−５６４（１９７７）に記載のマ
クサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法
が使用される。
【００３０】本発明のＤＮＡ配列を発現するのに必ずし
もすべての発現ベクターやＤＮＡ制御配列が等しく作用
はしないことは理解すべきである。同じ発現系に対して
もすべての宿主細胞が等しく作用はしない。しかし当業
者は本明細書に記載の指示を用いることにより不要な実
験をすることなく、かつ本発明の範囲を逸脱することな
く、発現ベクター、ＤＮＡ制御配列、および宿主細胞の
選択をすることができるであろう。
もすべての発現ベクターやＤＮＡ制御配列が等しく作用
はしないことは理解すべきである。同じ発現系に対して
もすべての宿主細胞が等しく作用はしない。しかし当業
者は本明細書に記載の指示を用いることにより不要な実
験をすることなく、かつ本発明の範囲を逸脱することな
く、発現ベクター、ＤＮＡ制御配列、および宿主細胞の
選択をすることができるであろう。
【００３１】本発明はさらに、ＰＶＡを発現することが
できる発現ベクターを含有する宿主細胞を培養すること
よりなる、ＰＶＡの産生方法に関する。好ましくは発現
ベクターは、ｐＢＭＦＸＰＶＡ６またはｐＢＭＦＸＰＶ
Ａ７である。驚くべきことに、インデューサーとして作
用するフェノキシアセテートの存在下では、ＰＶＡの産
生が実質的に増加することが発見された。
できる発現ベクターを含有する宿主細胞を培養すること
よりなる、ＰＶＡの産生方法に関する。好ましくは発現
ベクターは、ｐＢＭＦＸＰＶＡ６またはｐＢＭＦＸＰＶ
Ａ７である。驚くべきことに、インデューサーとして作
用するフェノキシアセテートの存在下では、ＰＶＡの産
生が実質的に増加することが発見された。
【００３２】本発明はさらに、ＰＶＡのすべてまたは一
部よりなるポリペプチド分子に関し、該ポリペプチド分
子は好ましくは、実質的に図６または７に記載のアミノ
酸配列の１つのすべてまたは一部を有する。ＰＶＡの一
部よりなる分子の場合は、ポリペプチド分子は少なくと
も１０アミノ酸の長さであることが好ましい。本明細書
で同定されるアミノ酸残基は、天然のＬ−型である。標
準的ポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
４３，３５５７−３５５９（１９６９））に従って、ア
ミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す。
部よりなるポリペプチド分子に関し、該ポリペプチド分
子は好ましくは、実質的に図６または７に記載のアミノ
酸配列の１つのすべてまたは一部を有する。ＰＶＡの一
部よりなる分子の場合は、ポリペプチド分子は少なくと
も１０アミノ酸の長さであることが好ましい。本明細書
で同定されるアミノ酸残基は、天然のＬ−型である。標
準的ポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
４３，３５５７−３５５９（１９６９））に従って、ア
ミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す。
【００３３】 対応表 記号 アミノ酸 １文字 ３文字 Ｙ Ｔｙｒ Ｌ−チロシン Ｇ Ｇｌｙ Ｌ−グリシン Ｆ Ｐｈｅ Ｌ−フェニルアラニン Ｍ Ｍｅｔ Ｌ−メチオニン Ａ Ａｌａ Ｌ−アラニン Ｓ Ｓｅｒ Ｌ−セリン Ｉ Ｉｌｅ Ｌ−イソソイシン Ｌ Ｌｅｕ Ｌ−ロイシン Ｔ Ｔｈｒ Ｌ−スレオニン Ｖ Ｖａｌ Ｌ−バリン Ｐ Ｐｒｏ Ｌ−プロリン Ｋ Ｌｙｓ Ｌ−リジン Ｈ Ｈｉｓ Ｌ−ヒスチジン Ｑ Ｇｌｎ Ｌ−グルタミン Ｅ Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸 Ｗ Ｔｒｐ Ｌ−トリプトファン Ｒ Ａｒｇ Ｌ−アルギニン Ｄ Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸 Ｎ Ａｓｎ Ｌ−アスパラギン Ｃ Ｃｙｓ Ｌ−システイン
【００３４】ここに示すすべてのアミノ酸は、左から右
への配向がアミノ末端からカルボキシ末端への通常の方
向にある。本発明のポリペプチドは、合成法（すなわ
ち、公知の方法により、その成分アミノ酸からのポリペ
プチドの化学合成法）より、得られる。例えば、ヒュー
トン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，５１３１−５１３５（１９８
５）に記載の固相法を使用してもよい。ＰＶＡのすべて
または一部をコードするＤＮＡ配列を発現する原核また
は真核宿主細胞中に産生させるか、またはＰＶＡのすべ
てまたは一部をコードするＤＮＡ配列によりコードされ
るｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ポリペプチドを得
ることが好ましい。例えば、図６または７のＤＮＡ配列
は、前述のＰＣＲ法を用いて合成され、適当な発現ベク
ター中に挿入され、次にこれを用いて適当な宿主細胞を
形質転換する。次に組換え宿主細胞を培養してＰＶＡを
産生する。これらの方法によりポリペプチドを産生する
方法は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されて
いる。
への配向がアミノ末端からカルボキシ末端への通常の方
向にある。本発明のポリペプチドは、合成法（すなわ
ち、公知の方法により、その成分アミノ酸からのポリペ
プチドの化学合成法）より、得られる。例えば、ヒュー
トン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，５１３１−５１３５（１９８
５）に記載の固相法を使用してもよい。ＰＶＡのすべて
または一部をコードするＤＮＡ配列を発現する原核また
は真核宿主細胞中に産生させるか、またはＰＶＡのすべ
てまたは一部をコードするＤＮＡ配列によりコードされ
るｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ポリペプチドを得
ることが好ましい。例えば、図６または７のＤＮＡ配列
は、前述のＰＣＲ法を用いて合成され、適当な発現ベク
ター中に挿入され、次にこれを用いて適当な宿主細胞を
形質転換する。次に組換え宿主細胞を培養してＰＶＡを
産生する。これらの方法によりポリペプチドを産生する
方法は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されて
いる。
【００３５】こうして産生されるポリペプチドは次に、
単離され、種々の精製法を用いてある程度まで精製され
る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティクロマトグ
ラフィーのようなクロマトグラフィー法を使用してもよ
い。６−ＡＰＡを調製する以外に、本発明のポリペプチ
ドは種々の他の方法で使用することができる。例えばこ
のポリペプチドを用いて、公知の方法でポリペプチドに
結合することができるポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体を調製することができる。これらの抗体は
次に、試料（例えば、細胞試料）中のポリペプチドを、
免疫測定法（例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素
免疫定量法）を用いて、検出するのに使用できる。これ
らの抗体はまた、本発明のポリペプチドを精製し種々の
供給源から単離するための親和性クロマトグラフィーに
使用することもできる。
単離され、種々の精製法を用いてある程度まで精製され
る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティクロマトグ
ラフィーのようなクロマトグラフィー法を使用してもよ
い。６−ＡＰＡを調製する以外に、本発明のポリペプチ
ドは種々の他の方法で使用することができる。例えばこ
のポリペプチドを用いて、公知の方法でポリペプチドに
結合することができるポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体を調製することができる。これらの抗体は
次に、試料（例えば、細胞試料）中のポリペプチドを、
免疫測定法（例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素
免疫定量法）を用いて、検出するのに使用できる。これ
らの抗体はまた、本発明のポリペプチドを精製し種々の
供給源から単離するための親和性クロマトグラフィーに
使用することもできる。
【００３６】本発明のポリペプチドは、測定されたＤＮ
Ａと測定されるアミノ酸配列を用いて規定されてきた。
ほとんどのアミノ酸配列と停止シグナルに２つ以上のコ
ドンが存在する遺伝子コードの縮重のため、図６と７に
記載のアミノ酸配列と同じ配列をコードする他のＤＮＡ
配列を、本発明のポリペプチドの産生に使用することも
できる。さらに、これらのＤＮＡおよびアミノ酸配列の
アレレ（対立遺伝子）の変化も天然に存在するか、また
は当該分野で公知の方法を用いて意図的に導入される。
これらの変種は、全体の配列の中の１つまたはそれ以上
のアミノ酸の差異、または該配列のなかの１つまたはそ
れ以上のアミノ酸の欠失、挿入、転換または添加により
証明される。このようなアミノ酸の置換は、例えば関与
するアミノ酸の極性、電化、溶解性、疎水性、親水性お
よび／または両親媒性の類似に基づき行われる。例え
ば、陰性荷電のアミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミ
ン酸があり、陽性荷電のアミノ酸にはリジンやアルギニ
ン非荷電性の極性の頭部基または類似の親水性値の非極
性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グル
タミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロ
シンがある。他の考えられる変更としては、前述のポリ
ペプチドの塩やエステル、および前述のポリペプチドの
前駆体、例えばＮ−末端置換基を有する前駆体（例え
ば、使用されるメチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニン、
およびリーダー配列）がある。すべてのこのような変更
は本発明の範囲内に含まれる。
Ａと測定されるアミノ酸配列を用いて規定されてきた。
ほとんどのアミノ酸配列と停止シグナルに２つ以上のコ
ドンが存在する遺伝子コードの縮重のため、図６と７に
記載のアミノ酸配列と同じ配列をコードする他のＤＮＡ
配列を、本発明のポリペプチドの産生に使用することも
できる。さらに、これらのＤＮＡおよびアミノ酸配列の
アレレ（対立遺伝子）の変化も天然に存在するか、また
は当該分野で公知の方法を用いて意図的に導入される。
これらの変種は、全体の配列の中の１つまたはそれ以上
のアミノ酸の差異、または該配列のなかの１つまたはそ
れ以上のアミノ酸の欠失、挿入、転換または添加により
証明される。このようなアミノ酸の置換は、例えば関与
するアミノ酸の極性、電化、溶解性、疎水性、親水性お
よび／または両親媒性の類似に基づき行われる。例え
ば、陰性荷電のアミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミ
ン酸があり、陽性荷電のアミノ酸にはリジンやアルギニ
ン非荷電性の極性の頭部基または類似の親水性値の非極
性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グル
タミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロ
シンがある。他の考えられる変更としては、前述のポリ
ペプチドの塩やエステル、および前述のポリペプチドの
前駆体、例えばＮ−末端置換基を有する前駆体（例え
ば、使用されるメチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニン、
およびリーダー配列）がある。すべてのこのような変更
は本発明の範囲内に含まれる。
【００３７】以下の実施例で本発明をさらに説明する。
これらの実施例は本発明を限定するものではなく、本発
明をさらに理解しやすくするものである。好適な実施態様の詳細な例 実施例において、微生物株、プラスミド、緩衝液、増殖
培地および共通の方法は以下に記載の通りである。微生物株とプラスミド 使用したプラスミド、細菌株および真菌株を、表１に示
す。
これらの実施例は本発明を限定するものではなく、本発
明をさらに理解しやすくするものである。好適な実施態様の詳細な例 実施例において、微生物株、プラスミド、緩衝液、増殖
培地および共通の方法は以下に記載の通りである。微生物株とプラスミド 使用したプラスミド、細菌株および真菌株を、表１に示
す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】緩衝液と培地 ルリアブロス：１％ディフコバクトトリプトン、０．５
％ディフコバクト酵母エキス、０．５％塩化ナトリウ
ム。 ルリア寒天：１．５％ディフコバクト寒天を細くしたル
リアブロス。 ＳＯＣ培地：２％ディフコバクトトリプトン、０．５％
ディフコバクト酵母エキス、１０mM Ｎａｃｌ，２．５
mM ＫＣｌ。オートクレーブ後、１００分の１量の１Ｍ
ＭｇＣｌ2 ，１Ｍ ＭｇＳＯ4 、および２０％グルコ
ースを培地に加える。
％ディフコバクト酵母エキス、０．５％塩化ナトリウ
ム。 ルリア寒天：１．５％ディフコバクト寒天を細くしたル
リアブロス。 ＳＯＣ培地：２％ディフコバクトトリプトン、０．５％
ディフコバクト酵母エキス、１０mM Ｎａｃｌ，２．５
mM ＫＣｌ。オートクレーブ後、１００分の１量の１Ｍ
ＭｇＣｌ2 ，１Ｍ ＭｇＳＯ4 、および２０％グルコ
ースを培地に加える。
【００４１】フサリウム栄養増殖培地：６％デンプン、
４％ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）（ト
レーダープロテイン（Ｔｒａｄｅｒ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）、メンフィス、テネシー州）、０．３％（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ，０．７５％ＫＨ2 ＰＯ 4 ，０．７５％Ｋ2 Ｈ
ＰＯ4 ，１０Ｎ ＮａＯＨでpH６．８に調整。ＰＶＡ産
生培地：０．４％フェノキシアセテートを補足したフサ
リウム栄養増殖培地。
４％ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）（ト
レーダープロテイン（Ｔｒａｄｅｒ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）、メンフィス、テネシー州）、０．３％（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ，０．７５％ＫＨ2 ＰＯ 4 ，０．７５％Ｋ2 Ｈ
ＰＯ4 ，１０Ｎ ＮａＯＨでpH６．８に調整。ＰＶＡ産
生培地：０．４％フェノキシアセテートを補足したフサ
リウム栄養増殖培地。
【００４２】トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）：１０mMトリス−
塩酸（pH７．４），１mM ＥＤＴＡ。 トリス−アセテート電気泳動緩衝液（ＴＡＥ）：４０mM
トリス−酢酸（pH８．０），１mM ＥＤＴＡ。 ２０×ＳＳＣ：３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナト
リウム、１０Ｎ ＮａＯＨ。
塩酸（pH７．４），１mM ＥＤＴＡ。 トリス−アセテート電気泳動緩衝液（ＴＡＥ）：４０mM
トリス−酢酸（pH８．０），１mM ＥＤＴＡ。 ２０×ＳＳＣ：３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナト
リウム、１０Ｎ ＮａＯＨ。
【００４３】５０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶
液：１％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。 ３０×ＮＥＴ：４．５Ｍ ＮａＣｌ，０．４５Ｍトリス
−塩酸（pH７．５）、３０mM ＥＤＴＡ。
液：１％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。 ３０×ＮＥＴ：４．５Ｍ ＮａＣｌ，０．４５Ｍトリス
−塩酸（pH７．５）、３０mM ＥＤＴＡ。
【００４４】方法 一般的クローニング法：ＤＮＡ配列決定と大腸菌からの
プラスミドＤＮＡ抽出は、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ）ら、１９８９、分子クローニング：実験室マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
ＣＳＨ、ニューヨークに記載の方法を使用した。すべて
の制限酵素とＤＮＡ修飾酵素は、市販の業者から得た。
これらは製造業者の指示に従って使用した。他のしばし
ば使用した方法を以下に記載する。
プラスミドＤＮＡ抽出は、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ）ら、１９８９、分子クローニング：実験室マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
ＣＳＨ、ニューヨークに記載の方法を使用した。すべて
の制限酵素とＤＮＡ修飾酵素は、市販の業者から得た。
これらは製造業者の指示に従って使用した。他のしばし
ば使用した方法を以下に記載する。
【００４５】１．大腸菌の電気形質転換（電気穿孔法） 大腸菌ＤＨ５α細胞を新たに一晩培養したもの４mlをル
リアブロス４００ml中に接種し、３７℃でＯＤ600 が
０．６になるまで振盪して増殖させた。細胞を氷上で１
５分間冷却して、冷ロータ中で７，０００×ｇで１０分
間遠心分離して集めた。細胞ペレットを０℃の水２００
mlで２回洗浄し、０℃の１０％グリセロール１０mlで１
回洗浄した。細胞ペレットを、１０％グリセロール中で
０℃で１mlの容量で再懸濁した。細胞懸濁液をドライア
イス上で１．５mlのポリプロピレンチューブ中で４０μ
ｌの一定分量で、−７０℃で凍結して保存した。
リアブロス４００ml中に接種し、３７℃でＯＤ600 が
０．６になるまで振盪して増殖させた。細胞を氷上で１
５分間冷却して、冷ロータ中で７，０００×ｇで１０分
間遠心分離して集めた。細胞ペレットを０℃の水２００
mlで２回洗浄し、０℃の１０％グリセロール１０mlで１
回洗浄した。細胞ペレットを、１０％グリセロール中で
０℃で１mlの容量で再懸濁した。細胞懸濁液をドライア
イス上で１．５mlのポリプロピレンチューブ中で４０μ
ｌの一定分量で、−７０℃で凍結して保存した。
【００４６】凍結した細胞を室温で融解し、直ちに氷の
上に置いた。ＴＥ中約２−３μｌのＤＮＡまたは結合混
合物を細胞に加え、静かに混合し氷の上に１分間置い
た。次に混合物を、あらかじめ冷却した０．２mlの電気
穿孔キュベット（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カタ
ログ＃１６５−２０８６、バイオラッド・ラボラトリー
ズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉ
ｎｃ．））に移した。バイオラッド・ジーン・パルサー
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）装置（バ
イオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カタログ＃１６５−２０
７５）を、キャパシタンス２５μＦ、電圧２．５KVに設
定した。パルスコントローラー（ＴｈｅＰｕｌｓｅ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）カタログ＃１６５−２０９８）は、抵抗２００オー
ムに設定した。これらの条件下でキュベットに１回パル
スをかけた。電気穿孔法の後、ＳＯＣ培地１mlをキュベ
ットに加えた。パウツールピペットを用いて細胞懸濁液
を１７×１００mmポリプロピレンチューブに移し、３７
℃で１時間インキュベートした。細胞を選択培地の上に
広げた（ネオマイシンとアンピシリンをそれぞれ４０μ
ｇ／mlまたは１００μｇ／mlで含有するルリア寒天）。
上に置いた。ＴＥ中約２−３μｌのＤＮＡまたは結合混
合物を細胞に加え、静かに混合し氷の上に１分間置い
た。次に混合物を、あらかじめ冷却した０．２mlの電気
穿孔キュベット（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カタ
ログ＃１６５−２０８６、バイオラッド・ラボラトリー
ズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉ
ｎｃ．））に移した。バイオラッド・ジーン・パルサー
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）装置（バ
イオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カタログ＃１６５−２０
７５）を、キャパシタンス２５μＦ、電圧２．５KVに設
定した。パルスコントローラー（ＴｈｅＰｕｌｓｅ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）カタログ＃１６５−２０９８）は、抵抗２００オー
ムに設定した。これらの条件下でキュベットに１回パル
スをかけた。電気穿孔法の後、ＳＯＣ培地１mlをキュベ
ットに加えた。パウツールピペットを用いて細胞懸濁液
を１７×１００mmポリプロピレンチューブに移し、３７
℃で１時間インキュベートした。細胞を選択培地の上に
広げた（ネオマイシンとアンピシリンをそれぞれ４０μ
ｇ／mlまたは１００μｇ／mlで含有するルリア寒天）。
【００４７】２．フサリウムプロトプロスト形質転換 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）株を、２０mlのポテトデキストロースブ
ロス（ＰＤＢ；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で２４℃で培養した。ミ
クロコニディア（Ｍｉｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ）を、３０
μｍメッシュの層のナイロンフィルター（スペクトラ／
メッシュナイロンＮ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｍｅｓｈ Ｎｙ
ｌｏｎＮ）、スペクトラムメディカル・インダストリー
ズ社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を通して濾過した。ミクロコニ
ディアを室温で１５００×ｇで８分間遠心分離してペレ
ットにした。ミクロコニディアを無菌蒸留水で２回洗浄
した。約１×１０10ミクロコニディアを、１００mlのＰ
ＤＢ中で２４℃で１５時間振盪として発芽させた。発芽
したミクロコニディアを、無菌の５０ml円錐管で室温で
１５００×ｇで８分間遠心分離して集めた。ペレットを
Ｏ緩衝液（１．４Ｍ ＭｇＳＯ4 ，５０mMクエン酸ナト
リウム、pH５．８）で２回洗浄した。発芽したミクロコ
ニディアを、２％ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）（ビ
オスパシフィック社（Ｂｉｏｓ Ｐａｃｉｆｉｃ， Ｉ
ｎｃ．））を含有するＯ緩衝液２０mlで、２４℃で１〜
２時間処理した。９０％以上のプロトプロストが生成し
た時、混合物を２つの１５mlの円錐管中で９００×ｇで
４℃で３０分間遠心分離した。プロトプロストを懸濁液
の上から静かにピペットで取り、Ｔ緩衝液（１．２Ｍソ
ルビトール、５０mM ＣａＣｌ2 ，１０mMトリス−塩
酸、pH７．４）中で４℃で２回洗浄した。プロトプロス
トを、６％ポリエチレングリコール−４００と１％ジメ
チルスルホキシドを含有するＴ緩衝液中で１×１０9 ／
mlで懸濁した。プロトプロストを一定分量ずつ１．５ml
のポリプロピレンチューブに入れてドライアイスで凍結
し、−７０℃で保存した。
ｓｐｏｒｕｍ）株を、２０mlのポテトデキストロースブ
ロス（ＰＤＢ；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で２４℃で培養した。ミ
クロコニディア（Ｍｉｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ）を、３０
μｍメッシュの層のナイロンフィルター（スペクトラ／
メッシュナイロンＮ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｍｅｓｈ Ｎｙ
ｌｏｎＮ）、スペクトラムメディカル・インダストリー
ズ社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を通して濾過した。ミクロコニ
ディアを室温で１５００×ｇで８分間遠心分離してペレ
ットにした。ミクロコニディアを無菌蒸留水で２回洗浄
した。約１×１０10ミクロコニディアを、１００mlのＰ
ＤＢ中で２４℃で１５時間振盪として発芽させた。発芽
したミクロコニディアを、無菌の５０ml円錐管で室温で
１５００×ｇで８分間遠心分離して集めた。ペレットを
Ｏ緩衝液（１．４Ｍ ＭｇＳＯ4 ，５０mMクエン酸ナト
リウム、pH５．８）で２回洗浄した。発芽したミクロコ
ニディアを、２％ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）（ビ
オスパシフィック社（Ｂｉｏｓ Ｐａｃｉｆｉｃ， Ｉ
ｎｃ．））を含有するＯ緩衝液２０mlで、２４℃で１〜
２時間処理した。９０％以上のプロトプロストが生成し
た時、混合物を２つの１５mlの円錐管中で９００×ｇで
４℃で３０分間遠心分離した。プロトプロストを懸濁液
の上から静かにピペットで取り、Ｔ緩衝液（１．２Ｍソ
ルビトール、５０mM ＣａＣｌ2 ，１０mMトリス−塩
酸、pH７．４）中で４℃で２回洗浄した。プロトプロス
トを、６％ポリエチレングリコール−４００と１％ジメ
チルスルホキシドを含有するＴ緩衝液中で１×１０9 ／
mlで懸濁した。プロトプロストを一定分量ずつ１．５ml
のポリプロピレンチューブに入れてドライアイスで凍結
し、−７０℃で保存した。
【００４８】凍結懸濁液を室温で融解して、最終濃度２
mMにヌクレアーゼインヒビターであるオーリントリカル
ボキシテート（ａｕｒｉｎｔｏｒｉｃａｒｂｏｘｙｌａ
ｔｅ）を添加してプロトプロストを形質転換した。１０
μｌのＴＥ中１０〜２０μｌのプラスミドＤＮＡを、２
００μｌのプロトプロスト懸濁液に加え、氷上で３０分
間インキュベートした。６０％ポリエチレングリコール
−４０００／５０mMＣａＣｌ2 の溶液を２つを２００μ
ｌで１つを８００μｌで加え（各添加の間に静かに攪拌
した）、氷上で３０分間インキュベートした。次に１０
mlの１．２Ｍソルビトール／０．５×ＰＤＢを加えて、
静かに攪拌した。プロトプロストを４℃で９００×ｇで
８分間遠心分離してペレットにした。このペレットを、
１．２Ｍソルビトール／０．５×ＰＤＢ０．５mlに懸濁
した。０．１mlのプロトプロスト懸濁物を、新たに２層
に注いであった１．２Ｍソルビトール／０．１×ＰＤＢ
／１．５％寒天平板上に広げた。最下層は７５μｇ／ml
のフレオマイシンを含有する１２．５mlの培地を含有
し、これを上層の１２．５mlの培地に静かに分散させ
た。プレートを２４℃で７日間インキュベートした。２
０μｇ／mlのフレオマイシンを含有する１×ＰＤＡ培地
上で増殖と、プラスミドＤＮＡプローブとＤＮＡドット
−ブロットハイブリダイゼーションにより、形質転換体
が証明された。
mMにヌクレアーゼインヒビターであるオーリントリカル
ボキシテート（ａｕｒｉｎｔｏｒｉｃａｒｂｏｘｙｌａ
ｔｅ）を添加してプロトプロストを形質転換した。１０
μｌのＴＥ中１０〜２０μｌのプラスミドＤＮＡを、２
００μｌのプロトプロスト懸濁液に加え、氷上で３０分
間インキュベートした。６０％ポリエチレングリコール
−４０００／５０mMＣａＣｌ2 の溶液を２つを２００μ
ｌで１つを８００μｌで加え（各添加の間に静かに攪拌
した）、氷上で３０分間インキュベートした。次に１０
mlの１．２Ｍソルビトール／０．５×ＰＤＢを加えて、
静かに攪拌した。プロトプロストを４℃で９００×ｇで
８分間遠心分離してペレットにした。このペレットを、
１．２Ｍソルビトール／０．５×ＰＤＢ０．５mlに懸濁
した。０．１mlのプロトプロスト懸濁物を、新たに２層
に注いであった１．２Ｍソルビトール／０．１×ＰＤＢ
／１．５％寒天平板上に広げた。最下層は７５μｇ／ml
のフレオマイシンを含有する１２．５mlの培地を含有
し、これを上層の１２．５mlの培地に静かに分散させ
た。プレートを２４℃で７日間インキュベートした。２
０μｇ／mlのフレオマイシンを含有する１×ＰＤＡ培地
上で増殖と、プラスミドＤＮＡプローブとＤＮＡドット
−ブロットハイブリダイゼーションにより、形質転換体
が証明された。
【００４９】３．フサリウム株からの染色体ＤＮＡの抽
出 フサリウムプロトプロスト形質転換欄で記載したように
フサリウムプロトプロストを調製した。懸濁物の上部か
らプロトプロストを集め４℃のＴ緩衝液に再懸濁し、プ
ロトプロストを４mlの溶解緩衝液〔０．７Ｍ ＮａＣ
ｌ，１０mMトリス−塩酸、pH８．０，１０mM ＥＤＴＡ
および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）〕に再懸
濁し、静かに混合し３７℃で５分間インキュベートし
た。０．７ＭＮａＣｌ中１０％ヘキサドシルトリメチル
アンモニウム（ＣＴＡＢ）０．１mlを、プロトプロスト
溶解物に加え、静かに混合し６５℃で１５分間インキュ
ベートした。等量のクロロホルム：イソアミルアルコー
ル混合物（２４：１）を加えることにより、染色体ＤＮ
Ａを抽出した。水溶液を集め、０．６mlのイソプロパノ
ールを加えて、染色体ＤＮＡを沈殿させた。１５００×
ｇで５分間室温で遠心分離して染色体ＤＮＡを集めた。
ＤＮＡを７０％エタノールで１回洗浄し、真空下で乾燥
した。ＤＮＡを２００μｇのリボヌクレアーゼＡ（ＥＣ
３．１．２７．５、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．））を含有するＴＥ１mlに再
懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。最終濃
度４００μｇ／mlになるようにプロテイナーゼＫ溶液の
調製物（ＥＣ３．４．２１．１４、ベーリンガー・マン
ハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
ＧｍｂＨ））を加え、ＤＮＡ溶液を３７℃で２０分間イ
ンキュベートした。０．１mlの３Ｍ ＮａＣｌを加え、
等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１）混合物で２回抽出した。水溶液を
集め、２部のエタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿さ
せた。次にＤＮＡを、室温で１５００×ｇで５分間遠心
分離して集めた。ＤＮＡを７０％エタノールで１回洗浄
し、真空下で乾燥し、１mlのＴＥに再懸濁した。
出 フサリウムプロトプロスト形質転換欄で記載したように
フサリウムプロトプロストを調製した。懸濁物の上部か
らプロトプロストを集め４℃のＴ緩衝液に再懸濁し、プ
ロトプロストを４mlの溶解緩衝液〔０．７Ｍ ＮａＣ
ｌ，１０mMトリス−塩酸、pH８．０，１０mM ＥＤＴＡ
および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）〕に再懸
濁し、静かに混合し３７℃で５分間インキュベートし
た。０．７ＭＮａＣｌ中１０％ヘキサドシルトリメチル
アンモニウム（ＣＴＡＢ）０．１mlを、プロトプロスト
溶解物に加え、静かに混合し６５℃で１５分間インキュ
ベートした。等量のクロロホルム：イソアミルアルコー
ル混合物（２４：１）を加えることにより、染色体ＤＮ
Ａを抽出した。水溶液を集め、０．６mlのイソプロパノ
ールを加えて、染色体ＤＮＡを沈殿させた。１５００×
ｇで５分間室温で遠心分離して染色体ＤＮＡを集めた。
ＤＮＡを７０％エタノールで１回洗浄し、真空下で乾燥
した。ＤＮＡを２００μｇのリボヌクレアーゼＡ（ＥＣ
３．１．２７．５、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．））を含有するＴＥ１mlに再
懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。最終濃
度４００μｇ／mlになるようにプロテイナーゼＫ溶液の
調製物（ＥＣ３．４．２１．１４、ベーリンガー・マン
ハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
ＧｍｂＨ））を加え、ＤＮＡ溶液を３７℃で２０分間イ
ンキュベートした。０．１mlの３Ｍ ＮａＣｌを加え、
等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１）混合物で２回抽出した。水溶液を
集め、２部のエタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿さ
せた。次にＤＮＡを、室温で１５００×ｇで５分間遠心
分離して集めた。ＤＮＡを７０％エタノールで１回洗浄
し、真空下で乾燥し、１mlのＴＥに再懸濁した。
【００５０】４．ＤＮＡ標識 プラスミドＤＮＡまたはアガロース精製したＤＮＡ断片
からＤＮＡプローブを作成し、ニックトランスレーショ
ンシステム（Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍ）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））を使用してα−32
Ｐ−ｄＣＴＰ（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃ
ｏｒｐ．））で標識した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ酵素を用いてγ−32Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム社（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．））でオリゴヌクレオチド
プローブをリン酸化した。標識プローブの各使用の前
に、ＤＮＡプローブを１００℃で５分間加熱変性させ、
氷で２分間急速に冷却した。
からＤＮＡプローブを作成し、ニックトランスレーショ
ンシステム（Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍ）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））を使用してα−32
Ｐ−ｄＣＴＰ（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃ
ｏｒｐ．））で標識した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ酵素を用いてγ−32Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム社（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．））でオリゴヌクレオチド
プローブをリン酸化した。標識プローブの各使用の前
に、ＤＮＡプローブを１００℃で５分間加熱変性させ、
氷で２分間急速に冷却した。
【００５１】５．ＤＮＡドット−ブロットハイブリダイ
ゼーション ０．４Ｍ ＮａＯＨ，１０mM ＥＤＴＡとともに総液量
０．４mlでＤＮＡ試料を１００℃で１０分間熱変性さ
せ、真空下でドット−ブロット装置（ミニフォールド
（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）、シュレイヒャー・アンド・シュ
ネル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｎｅｌｌ
Ｉｎｃ．））を用いて、バイオラッドゼータプローブＧ
Ｔ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ ＧＴ
ｍｅｍｂｒａｎｅ）（バイオラッド・ラボラトリーズ社
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．））またはニトロセルロース膜（ミニフォールド
（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）、シュレイヒャー・アンド・シュ
ネル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆Ｓｃｈｎｅｌｌ Ｉ
ｎｃ．））にのせた。ハイブリダイゼーションオーブン
中（ラボラトリー・プロダクツ・セールズ社（Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓａｌｅｓ，Ｉｎ
ｃ．））でハイブリダイゼーションを行なった。ゼータ
プローブＧＴ膜をビンに入れ、５mlのハイブリダイゼー
ション緩衝液（０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，pH７．２、
７％ＳＤＳ）で６５℃で２時間攪拌してプレハイブリダ
イゼーションした。次に溶液を５mlの新たに調製したハ
イブリダイゼーション緩衝液と交換した。標識ＤＮＡを
添加し、１６〜２４時間６５℃で攪拌しながらハイブリ
ダイゼーションを行なった。ハイブリダイズした膜を、
それぞれ４０mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 （pH７．２）と５％Ｓ
ＤＳを含有する緩衝液中で６５℃で３０分間２回洗浄し
た。次に膜を、それぞれ４０mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 （pH
７．２）と１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で６５℃で２
回洗浄した。ニトロセルロース膜を使用した時、ハイブ
リダイゼーションは同様の条件で行なった（ただし、ハ
イブリダイゼーション緩衝液の組成は、６×ＳＳＣ，５
×デンハルト溶液、１０mMリン酸カリウム（pH７．
２）、０．１％ＳＤＳおよび２５０μｇ／mlの変性サケ
精子である）。ハイブリダイズした膜を、２×ＳＳＣ−
０．１％ＳＤＳでそれぞれ６５℃で３０分間２回洗浄
し、次に０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳでそれぞれ６
５℃で３０分間２回洗浄した。オリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用した場合は、ハイブリダイゼーションと洗浄
の温度は５０℃に維持した。洗浄後、オートラジオグラ
フィーのために膜をコダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルム
（イーストマン・コダック社（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄ
ａｋ Ｃｏ．））に露光させた。
ゼーション ０．４Ｍ ＮａＯＨ，１０mM ＥＤＴＡとともに総液量
０．４mlでＤＮＡ試料を１００℃で１０分間熱変性さ
せ、真空下でドット−ブロット装置（ミニフォールド
（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）、シュレイヒャー・アンド・シュ
ネル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｎｅｌｌ
Ｉｎｃ．））を用いて、バイオラッドゼータプローブＧ
Ｔ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ ＧＴ
ｍｅｍｂｒａｎｅ）（バイオラッド・ラボラトリーズ社
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．））またはニトロセルロース膜（ミニフォールド
（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）、シュレイヒャー・アンド・シュ
ネル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆Ｓｃｈｎｅｌｌ Ｉ
ｎｃ．））にのせた。ハイブリダイゼーションオーブン
中（ラボラトリー・プロダクツ・セールズ社（Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓａｌｅｓ，Ｉｎ
ｃ．））でハイブリダイゼーションを行なった。ゼータ
プローブＧＴ膜をビンに入れ、５mlのハイブリダイゼー
ション緩衝液（０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，pH７．２、
７％ＳＤＳ）で６５℃で２時間攪拌してプレハイブリダ
イゼーションした。次に溶液を５mlの新たに調製したハ
イブリダイゼーション緩衝液と交換した。標識ＤＮＡを
添加し、１６〜２４時間６５℃で攪拌しながらハイブリ
ダイゼーションを行なった。ハイブリダイズした膜を、
それぞれ４０mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 （pH７．２）と５％Ｓ
ＤＳを含有する緩衝液中で６５℃で３０分間２回洗浄し
た。次に膜を、それぞれ４０mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 （pH
７．２）と１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で６５℃で２
回洗浄した。ニトロセルロース膜を使用した時、ハイブ
リダイゼーションは同様の条件で行なった（ただし、ハ
イブリダイゼーション緩衝液の組成は、６×ＳＳＣ，５
×デンハルト溶液、１０mMリン酸カリウム（pH７．
２）、０．１％ＳＤＳおよび２５０μｇ／mlの変性サケ
精子である）。ハイブリダイズした膜を、２×ＳＳＣ−
０．１％ＳＤＳでそれぞれ６５℃で３０分間２回洗浄
し、次に０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳでそれぞれ６
５℃で３０分間２回洗浄した。オリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用した場合は、ハイブリダイゼーションと洗浄
の温度は５０℃に維持した。洗浄後、オートラジオグラ
フィーのために膜をコダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルム
（イーストマン・コダック社（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄ
ａｋ Ｃｏ．））に露光させた。
【００５２】６．サザンＤＮＡハイブリダイゼーション フサリウム染色体ＤＮＡを、各数種の異なる制限酵素で
完全に消化し、０．２５μｇ／mlの臭化エチジウムを含
有するＴＡＥ緩衝液中の０．８％アガロースゲルで電気
泳動した。サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らが記載
したようにゲルを酸で処理して脱プリンをして、アルカ
リで変性し、中和し、バイオラッドモデル７８５真空ブ
ロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ７８５ Ｖａ
ｃｃｕｍＢｌｏｔｔｅｒ）（バイオラッドカタログ＃１
６５−５０００）を用いて、バイオラッドゼータプロー
ブＧＴ膜またはニトロセルロース膜に移した。ＤＮＡハ
イブリダイゼーションとオートラジオグラフィーは前述
のように行なった。
完全に消化し、０．２５μｇ／mlの臭化エチジウムを含
有するＴＡＥ緩衝液中の０．８％アガロースゲルで電気
泳動した。サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らが記載
したようにゲルを酸で処理して脱プリンをして、アルカ
リで変性し、中和し、バイオラッドモデル７８５真空ブ
ロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ７８５ Ｖａ
ｃｃｕｍＢｌｏｔｔｅｒ）（バイオラッドカタログ＃１
６５−５０００）を用いて、バイオラッドゼータプロー
ブＧＴ膜またはニトロセルロース膜に移した。ＤＮＡハ
イブリダイゼーションとオートラジオグラフィーは前述
のように行なった。
【００５３】７．ペニシリンＶアミドヒドロラーゼ酵素
測定法 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）株のコニディア（ｃｏｎｉｄｉａ）を、
１週令のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、ディフコ
ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ））プレートの表面を５mlの無菌蒸留水で洗浄して単
離した。コニディア溶液０．５mlを、１２５mlフラスコ
内のフサリウム栄養増殖培地２５mlに接種した。栄養培
養物をロータリーシェーカー（２５０rpm ）で２４℃で
７２時間増殖させ、陰性培養物の０．２mlを、１２５ml
フラスコ内の２５mlのＰＶＡ産生培地に接種した。培養
はロータリーシェーカーで２４℃で１４４時間行なっ
た。
測定法 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）株のコニディア（ｃｏｎｉｄｉａ）を、
１週令のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、ディフコ
ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ））プレートの表面を５mlの無菌蒸留水で洗浄して単
離した。コニディア溶液０．５mlを、１２５mlフラスコ
内のフサリウム栄養増殖培地２５mlに接種した。栄養培
養物をロータリーシェーカー（２５０rpm ）で２４℃で
７２時間増殖させ、陰性培養物の０．２mlを、１２５ml
フラスコ内の２５mlのＰＶＡ産生培地に接種した。培養
はロータリーシェーカーで２４℃で１４４時間行なっ
た。
【００５４】産生培養物をまず、５mMリン酸カリウム緩
衝液（pH７．５）で希釈した。適切に希釈した培養物１
mlを、２５mMリン酸カリウム（pH７．５）中の３％ペニ
シリンＶ１mlに加えた。反応混合物を３５℃で１５分間
振盪し、１mlの６％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）溶液を加えて反応を停止させた。混合物を１５００
×ｇで８分間遠心分離した。１部の１００％メタノール
中１％ｐ−ＤＡＢと６部の氷酢酸：水：１Ｎ ＮａＯＨ
混合物（４０：１９：１）を混合して作成した３mlのｐ
−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢ）使用
溶液に、清澄な上澄液１mlを加えた。混合物を室温で５
分間インキュベートし、波長４１５nmで光学密度を測定
した。１００μｇ／mlの６−ＡＰＡ １mlとｐ−ＤＡＢ
使用溶液３mlを含有する対照チューブの、４１５nmの光
学密度は０．２７であった。酵素活性（IU／ml）は、４
１５nmの光学密度の読みに希釈率を掛け、０．３４を掛
けて計算される。ペニシリンＶアミドヒドロラーゼ活性
は国際単位（IU）として表し、１単位は、上記測定条件
下で１分間につき１μモルのペニシリンＶの変換に等し
い。
衝液（pH７．５）で希釈した。適切に希釈した培養物１
mlを、２５mMリン酸カリウム（pH７．５）中の３％ペニ
シリンＶ１mlに加えた。反応混合物を３５℃で１５分間
振盪し、１mlの６％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）溶液を加えて反応を停止させた。混合物を１５００
×ｇで８分間遠心分離した。１部の１００％メタノール
中１％ｐ−ＤＡＢと６部の氷酢酸：水：１Ｎ ＮａＯＨ
混合物（４０：１９：１）を混合して作成した３mlのｐ
−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢ）使用
溶液に、清澄な上澄液１mlを加えた。混合物を室温で５
分間インキュベートし、波長４１５nmで光学密度を測定
した。１００μｇ／mlの６−ＡＰＡ １mlとｐ−ＤＡＢ
使用溶液３mlを含有する対照チューブの、４１５nmの光
学密度は０．２７であった。酵素活性（IU／ml）は、４
１５nmの光学密度の読みに希釈率を掛け、０．３４を掛
けて計算される。ペニシリンＶアミドヒドロラーゼ活性
は国際単位（IU）として表し、１単位は、上記測定条件
下で１分間につき１μモルのペニシリンＶの変換に等し
い。
【００５５】
【実施例】実施例１ ペニシリンＶアミダーゼアミノ酸配列 ＰＶＡ酵素の分泌された型を単離し、精製し性状解析し
た。これは分子量６５キロダルトンの糖蛋白である。精
製した酵素を臭化シアンで消化した。セファデックスＧ
−１００による臭化シアン消化ＰＶＡのゲル濾過クロマ
トグラフィーにより、６つの断片（Ａ，Ｂ１，Ｂ２，
Ｃ，Ｄ、およびＥ）が精製された。自動化エドマン（Ｅ
ｄｍａｎ）分解法（フンカピラーとフード（Ｈｕｎｋａ
ｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ），１９８３，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２１９：６５０−６５９）により、６つのペ
プチド断片と完全なＰＶＡ分子のＮ−末端アミノ酸配列
を決定した。得られたペプチド配列情報は図１に示す通
りである。実施例２ ペニシリンＶアミダーゼｃＤＮＡクローニング １．フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）４３５株からのｍＲＮＡの抽出 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）４３５株を、ＰＶＡ産生培地中で増殖さ
せ、再懸濁したイソシアン酸グアニン緩衝液で洗浄し、
超音波をかけて細胞を破砕した。ＣｓＣｌクッション
（グリシン（Ｇｌｉｃｉｎ）ら、１９７４，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１３：２６３３−２６３７）を介して、遠心分離
により総ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）
クロマトグラフィー（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ）ら、１９８９、分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版）、続いてシ
ョ糖密度勾配法により調製した。各分画のｍＲＮＡを、
インビトロ翻訳と免疫沈降法により測定した。
た。これは分子量６５キロダルトンの糖蛋白である。精
製した酵素を臭化シアンで消化した。セファデックスＧ
−１００による臭化シアン消化ＰＶＡのゲル濾過クロマ
トグラフィーにより、６つの断片（Ａ，Ｂ１，Ｂ２，
Ｃ，Ｄ、およびＥ）が精製された。自動化エドマン（Ｅ
ｄｍａｎ）分解法（フンカピラーとフード（Ｈｕｎｋａ
ｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ），１９８３，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２１９：６５０−６５９）により、６つのペ
プチド断片と完全なＰＶＡ分子のＮ−末端アミノ酸配列
を決定した。得られたペプチド配列情報は図１に示す通
りである。実施例２ ペニシリンＶアミダーゼｃＤＮＡクローニング １．フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）４３５株からのｍＲＮＡの抽出 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）４３５株を、ＰＶＡ産生培地中で増殖さ
せ、再懸濁したイソシアン酸グアニン緩衝液で洗浄し、
超音波をかけて細胞を破砕した。ＣｓＣｌクッション
（グリシン（Ｇｌｉｃｉｎ）ら、１９７４，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１３：２６３３−２６３７）を介して、遠心分離
により総ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）
クロマトグラフィー（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ）ら、１９８９、分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版）、続いてシ
ョ糖密度勾配法により調製した。各分画のｍＲＮＡを、
インビトロ翻訳と免疫沈降法により測定した。
【００５６】２．ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラリ
ーの調製 グブラー−ホフマン法（グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ）、１９８３，Ｇｅｎｅ
２５：２６３−２６９）により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）を調製した。最初の鎖は、３μｇ ｍＲＮＡ、５０
mMトリス−塩酸（pH７．５）、６５mM ＫＣｌ，３mM
ＭｇＣｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，０．５μｇオリゴ（ｄ
Ｔ）、２．５μｇアクチノマイシンＤ、１mMずつの４つ
のｄＮＴＰおよび２単位のマウス白血病ウイルス（ＭＬ
Ｖ）逆転写酵素を含有する、５０μｌの反応混合物中で
合成した。反応物を０℃で３分間インキュベートし、次
に２０℃で５分間および３７℃で１時間インキュベート
した。反応の最後に２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡと５μ
ｌの３Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、２倍量のエタノールで沈殿させ
た。２番目の鎖は、ＲＮａｓｅＨ，ＤＮＡポリメラー
ゼ、およびＤＮＡリガーゼを用いる、修復合成反応で調
製した。最初の鎖から得られたＤＮＡを、２０mMトリス
−塩酸（pH７．５），５mM ＭｇＣｌ2 ，１０mM硫酸ア
ンモニウム、１００mM ＫＣｌ，１５０μＭβ−ＮＡ
Ｄ，４０μＭずつの４つのｄＮＴＰ，５μｇのＢＳＡ、
１単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨ，２０単位のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、そして１単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを含有
する１００μｌの修復緩衝液に溶解した。混合物を１２
℃で１時間インキュベートし、次に２０℃で１時間イン
キュベートした。反応の最後に、１０μｌの３Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加え、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出
した。ＤＮＡを２倍量のエタノールで沈殿させた。末端
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）
とｄＣＴＰを用いて、ｃＤＮＡをＣテイルとした。Ｃテ
イルとしたｃＤＮＡ １ngをアニーリングし、Ｇテイル
としたプラスミドｐＵＣ１９の２５ngに結合させた。結
合したＤＮＡを用いて、大腸菌中で形質転換しｃＤＮＡ
ライブラリーを調製した。
ーの調製 グブラー−ホフマン法（グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ）、１９８３，Ｇｅｎｅ
２５：２６３−２６９）により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）を調製した。最初の鎖は、３μｇ ｍＲＮＡ、５０
mMトリス−塩酸（pH７．５）、６５mM ＫＣｌ，３mM
ＭｇＣｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，０．５μｇオリゴ（ｄ
Ｔ）、２．５μｇアクチノマイシンＤ、１mMずつの４つ
のｄＮＴＰおよび２単位のマウス白血病ウイルス（ＭＬ
Ｖ）逆転写酵素を含有する、５０μｌの反応混合物中で
合成した。反応物を０℃で３分間インキュベートし、次
に２０℃で５分間および３７℃で１時間インキュベート
した。反応の最後に２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡと５μ
ｌの３Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、２倍量のエタノールで沈殿させ
た。２番目の鎖は、ＲＮａｓｅＨ，ＤＮＡポリメラー
ゼ、およびＤＮＡリガーゼを用いる、修復合成反応で調
製した。最初の鎖から得られたＤＮＡを、２０mMトリス
−塩酸（pH７．５），５mM ＭｇＣｌ2 ，１０mM硫酸ア
ンモニウム、１００mM ＫＣｌ，１５０μＭβ−ＮＡ
Ｄ，４０μＭずつの４つのｄＮＴＰ，５μｇのＢＳＡ、
１単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨ，２０単位のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、そして１単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを含有
する１００μｌの修復緩衝液に溶解した。混合物を１２
℃で１時間インキュベートし、次に２０℃で１時間イン
キュベートした。反応の最後に、１０μｌの３Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加え、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出
した。ＤＮＡを２倍量のエタノールで沈殿させた。末端
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）
とｄＣＴＰを用いて、ｃＤＮＡをＣテイルとした。Ｃテ
イルとしたｃＤＮＡ １ngをアニーリングし、Ｇテイル
としたプラスミドｐＵＣ１９の２５ngに結合させた。結
合したＤＮＡを用いて、大腸菌中で形質転換しｃＤＮＡ
ライブラリーを調製した。
【００５７】３．オリゴヌクレオチドプローブの調製 ペプチドＣ（図１、配列番号５）からの、ＰＶＡ酵素の
Ｃ−末端の近くの７つのアミノ酸（配列番号８）から、
４つのヌクレオチドプローブ（図２、配列番号１１）の
セットを得た。 ４．ＰＶＡ ｃＤＮＡクローンの同定と全長ｃＤＮＡの
作成 ｃＤＮＡライブラリーのコロニーを、縮重オリゴヌクレ
オチドプローブ（図２、配列番号１１）でスクリーニン
グした。ハイブリダイゼーション緩衝液（６×ＮＥＴ／
１０×デンハルト／１％ＳＤＳ）中の32Ｐ末端標識プロ
ーブへの５０℃でハイブリダイゼーションさせて、コロ
ニーブロットをスクリーニングした。ハイブリダイズし
た膜を室温で２回、各２×ＮＥＴ−０．１％ＳＤＳで３
０分間洗浄し、０．５×ＮＥＴ−０．１％ＳＤＳで５０
℃で３０分間洗浄した。強くハイブリダイズするコロニ
ー（＃３６２）を選択してさらに試験した。これは５０
０塩基対の挿入体を含有し、これはライブラリーを研究
するためのプローブとして使用した。第２のクローン
（＃２５８５）は１．７kbの挿入体を含有し、このプロ
ーブに強くハイブリダイズした。ＰＶＡのＮ−末端アミ
ノ酸配列を挿入体の５′末端の翻訳物と比較すると、５
アミノ酸を除く成熟酵素の全コード配列がクローン化さ
れていた（図３）。部位特異的突然変異誘発により５′
末端にＰｓｔＩ制限部位を作成して、＃２５８５−Ｍを
作成した。合成リンカーを加えて＃２５８５−Ｍクロー
ンを全長ｃＤＮＡクローン２５８５−ＦＬに変換した
（図３と４）。
Ｃ−末端の近くの７つのアミノ酸（配列番号８）から、
４つのヌクレオチドプローブ（図２、配列番号１１）の
セットを得た。 ４．ＰＶＡ ｃＤＮＡクローンの同定と全長ｃＤＮＡの
作成 ｃＤＮＡライブラリーのコロニーを、縮重オリゴヌクレ
オチドプローブ（図２、配列番号１１）でスクリーニン
グした。ハイブリダイゼーション緩衝液（６×ＮＥＴ／
１０×デンハルト／１％ＳＤＳ）中の32Ｐ末端標識プロ
ーブへの５０℃でハイブリダイゼーションさせて、コロ
ニーブロットをスクリーニングした。ハイブリダイズし
た膜を室温で２回、各２×ＮＥＴ−０．１％ＳＤＳで３
０分間洗浄し、０．５×ＮＥＴ−０．１％ＳＤＳで５０
℃で３０分間洗浄した。強くハイブリダイズするコロニ
ー（＃３６２）を選択してさらに試験した。これは５０
０塩基対の挿入体を含有し、これはライブラリーを研究
するためのプローブとして使用した。第２のクローン
（＃２５８５）は１．７kbの挿入体を含有し、このプロ
ーブに強くハイブリダイズした。ＰＶＡのＮ−末端アミ
ノ酸配列を挿入体の５′末端の翻訳物と比較すると、５
アミノ酸を除く成熟酵素の全コード配列がクローン化さ
れていた（図３）。部位特異的突然変異誘発により５′
末端にＰｓｔＩ制限部位を作成して、＃２５８５−Ｍを
作成した。合成リンカーを加えて＃２５８５−Ｍクロー
ンを全長ｃＤＮＡクローン２５８５−ＦＬに変換した
（図３と４）。
【００５８】５．２５８５−ＦＬ ｃＤＮＡクローンの
ＤＮＡ配列解析 マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法（マクサムとギルバート（Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ）、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５６０−５６４）により、
ｃＤＮＡ挿入体２５８５−ＦＬの両鎖の配列を決定し
た。挿入体は、５５，０００ダルトンの蛋白をコードす
る１５２１塩基対（ｂｐ）のオープンリーディングフレ
ームを含有する（図６及び７）。完全なＰＶＡ分子およ
び臭化シアン消化ペプチド断片のＮ−末端からのすべて
のアミノ酸配列データは、この配列中に見いだされる。
２０量体オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１１）
に対応するこの領域（塩基対１３４８〜１３６８、配列
番号２０）は、図６で下線を引いてある。
ＤＮＡ配列解析 マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法（マクサムとギルバート（Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ）、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５６０−５６４）により、
ｃＤＮＡ挿入体２５８５−ＦＬの両鎖の配列を決定し
た。挿入体は、５５，０００ダルトンの蛋白をコードす
る１５２１塩基対（ｂｐ）のオープンリーディングフレ
ームを含有する（図６及び７）。完全なＰＶＡ分子およ
び臭化シアン消化ペプチド断片のＮ−末端からのすべて
のアミノ酸配列データは、この配列中に見いだされる。
２０量体オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１１）
に対応するこの領域（塩基対１３４８〜１３６８、配列
番号２０）は、図６で下線を引いてある。
【００５９】実施例３ ペニシリンＶアミダーゼゲノムＤＮＡクローニング １．ゲノムＰＶＡ遺伝子断片の同定 フサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）
４３５株からの高分子量染色体ＤＮＡを、いくつかの制
限酵素で消化し、ＴＡＥ緩衝液中の０．６％アガロース
ゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移した。２５８
５挿入体ＤＮＡから調製したプローブを、サザンブロッ
トにハイブリダイズして、ＰＶＡ遺伝子を含有する断片
のサイズを決定した。この遺伝子は約１２kbのＥｃｏＲ
Ｉ断片上にあった。
４３５株からの高分子量染色体ＤＮＡを、いくつかの制
限酵素で消化し、ＴＡＥ緩衝液中の０．６％アガロース
ゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移した。２５８
５挿入体ＤＮＡから調製したプローブを、サザンブロッ
トにハイブリダイズして、ＰＶＡ遺伝子を含有する断片
のサイズを決定した。この遺伝子は約１２kbのＥｃｏＲ
Ｉ断片上にあった。
【００６０】２．プラスミドｐＷＢ１９Ｎの作成 ｐＢＭ１１／Ｍ５（ＡＴＣＣ６７４３６）はｐＢＭ１１
（ＡＴＣＣ６７３６６）から得られ、ネオマイシン耐性
遺伝子中のＮｃｏＩ部位は、部位特異的突然変異誘発に
より除去されている。プラスミドｐＢＭ１１／Ｍ５ Ｄ
ＮＡをＨｉｎｄIII とＳｍａＩで消化した。ＨｉｎｄII
I 切断物の５′突出末端を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片を用いて平滑末端に変換した。このＤ
ＮＡ混合物を０．８％調整用アガロースゲルで電気泳動
にかけた。ネオマイシン耐性遺伝子を含有する１．３kb
断片をゲルから切り出し、１００Ｖで室温で１時間電気
溶出させた。得られた溶出液を集め、等量のＴＥ飽和フ
ェノールで３回抽出した。０．３Ｍ ＮａＣｌの存在下
でエタノール沈殿により水層からＤＮＡを回収した。Ｄ
ＮＡ断片の回収物をアガロースゲル電気泳動で解析し
た。ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（ヤニッシュ−ペロン
（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら、１９８５，Ｇｅ
ｎｅ，３３：１０３−１１９）をＢｓｐＨＩで切断し、
クレノウ断片で５′突出末端を平滑末端に変換した。ポ
リリンカー部位と複製開始点を含有する１．６kbの断片
（塩基対番号２６３９〜番号２６８６および番号１〜番
号１５２６）を単離し、結合緩衝液（５０mMトリス−塩
酸、pH７．６，１０mM ＭｇＣｌ2 ，１mM ＡＴＰ，１
mM ＤＴＴ，５％ポリエチレングリコール−８０００）
とＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、１．３kbネオマイ
シン耐性遺伝子断片に結合させた。
（ＡＴＣＣ６７３６６）から得られ、ネオマイシン耐性
遺伝子中のＮｃｏＩ部位は、部位特異的突然変異誘発に
より除去されている。プラスミドｐＢＭ１１／Ｍ５ Ｄ
ＮＡをＨｉｎｄIII とＳｍａＩで消化した。ＨｉｎｄII
I 切断物の５′突出末端を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片を用いて平滑末端に変換した。このＤ
ＮＡ混合物を０．８％調整用アガロースゲルで電気泳動
にかけた。ネオマイシン耐性遺伝子を含有する１．３kb
断片をゲルから切り出し、１００Ｖで室温で１時間電気
溶出させた。得られた溶出液を集め、等量のＴＥ飽和フ
ェノールで３回抽出した。０．３Ｍ ＮａＣｌの存在下
でエタノール沈殿により水層からＤＮＡを回収した。Ｄ
ＮＡ断片の回収物をアガロースゲル電気泳動で解析し
た。ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（ヤニッシュ−ペロン
（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら、１９８５，Ｇｅ
ｎｅ，３３：１０３−１１９）をＢｓｐＨＩで切断し、
クレノウ断片で５′突出末端を平滑末端に変換した。ポ
リリンカー部位と複製開始点を含有する１．６kbの断片
（塩基対番号２６３９〜番号２６８６および番号１〜番
号１５２６）を単離し、結合緩衝液（５０mMトリス−塩
酸、pH７．６，１０mM ＭｇＣｌ2 ，１mM ＡＴＰ，１
mM ＤＴＴ，５％ポリエチレングリコール−８０００）
とＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、１．３kbネオマイ
シン耐性遺伝子断片に結合させた。
【００６１】得られたプラスミド（ｐＷＢ１９Ｎと命
名）を、大腸菌ＤＨ５α細胞中に電気穿孔させた。ネオ
マイシン耐性コロニーを、ｐＷＢ１９Ｎ（クレノウで充
填したＨｉｎｄIII 部位とＢｓｐＨＩ部位の結合点に１
つの回復したＢｓｐＨＩ部位を有する）の存在について
スクリーニングした。コロニーはまた、アンピシリン感
受性とＸ−ｇａｌプレート上のβ−ガラクトシダーゼ活
性のα−相補性についてスクリーニングした。ｐＷＢ１
９Ｎの作成を図１０に記載する。
名）を、大腸菌ＤＨ５α細胞中に電気穿孔させた。ネオ
マイシン耐性コロニーを、ｐＷＢ１９Ｎ（クレノウで充
填したＨｉｎｄIII 部位とＢｓｐＨＩ部位の結合点に１
つの回復したＢｓｐＨＩ部位を有する）の存在について
スクリーニングした。コロニーはまた、アンピシリン感
受性とＸ−ｇａｌプレート上のβ−ガラクトシダーゼ活
性のα−相補性についてスクリーニングした。ｐＷＢ１
９Ｎの作成を図１０に記載する。
【００６２】３．ゲノムＰＶＡ遺伝子断片のクローニン
グ フサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）
４３５株からの高分子量染色体ＤＮＡの１００μｇを、
ＥｃｏＲＩで切断した。このＤＮＡをＴＡＥ緩衝液中の
０．６％アガロースゲルで電気泳動した。１１．５kb〜
１２kbのサイズのＤＮＡをゲルから切り出し、１００Ｖ
で室温で１時間電気溶出を行なった。得られた溶出液を
集め、等量のＴＥ飽和フェノールで３回抽出した。０．
３Ｍ ＮａＣｌの存在下でエタノール沈殿により水層か
らＤＮＡを回収した。次に約１２kbのＤＮＡ断片をｐＷ
Ｂ１９Ｎベクターにクローン化して、ｐＦ０２１（図
５）を作成した。ｐＦ０２１ ＤＮＡの制限解析によ
り、クローン化断片は全ＰＶＡ遺伝子を含有し、ＰＶＡ
コード配列の上流に追加の３．７kbそして下流に６．８
kbを含有することが判明した。
グ フサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）
４３５株からの高分子量染色体ＤＮＡの１００μｇを、
ＥｃｏＲＩで切断した。このＤＮＡをＴＡＥ緩衝液中の
０．６％アガロースゲルで電気泳動した。１１．５kb〜
１２kbのサイズのＤＮＡをゲルから切り出し、１００Ｖ
で室温で１時間電気溶出を行なった。得られた溶出液を
集め、等量のＴＥ飽和フェノールで３回抽出した。０．
３Ｍ ＮａＣｌの存在下でエタノール沈殿により水層か
らＤＮＡを回収した。次に約１２kbのＤＮＡ断片をｐＷ
Ｂ１９Ｎベクターにクローン化して、ｐＦ０２１（図
５）を作成した。ｐＦ０２１ ＤＮＡの制限解析によ
り、クローン化断片は全ＰＶＡ遺伝子を含有し、ＰＶＡ
コード配列の上流に追加の３．７kbそして下流に６．８
kbを含有することが判明した。
【００６３】４．ＤＮＡ配列解析 ゲノムクローンのコード配列もまた、マクサム−ギルバ
ート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（図７）により
配列決定した。ｃＤＮＡとゲノム配列は、ｃＤＮＡクロ
ーンで合成リンカーが挿入されている５′末端のコドン
を使用している以外は、同一であった。ゲノムクローン
では、追加の３１５塩基対の配列情報が５′末端で得ら
れた。このデータは、ＰＶＡ ｍＲＮＡの翻訳が図７の
塩基２４１で始まること、そして２５アミノ酸シグナル
配列を含有する「プレ−ＰＶＡ」が合成され、次に切断
されてＰＶＡ酵素の分泌型を形成することを示唆する。
転写開始部位はＳ１マッピング法により決定された（バ
ークとシャープ（Ｂｅｒｋ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ），１
９７７，Ｃｅｌｌ １２：７２１−７３２，；サムブル
ーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子クローニ
ング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、
第２版）。これは塩基１６２およびその近傍に存在す
る。この部位と塩基２４１の間には、ＡＴＧ翻訳開始シ
グナルの可能性のあるものはなかった。
ート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（図７）により
配列決定した。ｃＤＮＡとゲノム配列は、ｃＤＮＡクロ
ーンで合成リンカーが挿入されている５′末端のコドン
を使用している以外は、同一であった。ゲノムクローン
では、追加の３１５塩基対の配列情報が５′末端で得ら
れた。このデータは、ＰＶＡ ｍＲＮＡの翻訳が図７の
塩基２４１で始まること、そして２５アミノ酸シグナル
配列を含有する「プレ−ＰＶＡ」が合成され、次に切断
されてＰＶＡ酵素の分泌型を形成することを示唆する。
転写開始部位はＳ１マッピング法により決定された（バ
ークとシャープ（Ｂｅｒｋ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ），１
９７７，Ｃｅｌｌ １２：７２１−７３２，；サムブル
ーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子クローニ
ング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、
第２版）。これは塩基１６２およびその近傍に存在す
る。この部位と塩基２４１の間には、ＡＴＧ翻訳開始シ
グナルの可能性のあるものはなかった。
【００６４】実施例４ 異種宿主中のＰＶＡ遺伝子発現 １．プラスミドｐＳＪＣ６２の作成 プラスミドｐＥＳ２００（スタベン（Ｓｔａｂｅｎ）
ら、１９８９，Ｆｕｎｇｕｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｌｅｔｔ．
３６：７９０−８１）は、細菌ハイグロマイシンＢ耐性
遺伝子の転写を支配する、アスペルギルスニヅランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｔｒ
ｐＣプロモーター配列を有する。ｐＥＳ２００ ＤＮＡ
をＥｃｏＲＩとＣｌａＩ酵素で切断した；５′突出末端
をクレノウ断片で平滑末端に変換した。アガロースゲル
電気泳動で１２５０塩基対のｔｒｐＣプロモーター断片
を単離し、電気溶出により回収した。プラスミドｐＵＴ
７１５（ジェイン（Ｊａｉｎ）ら、１９９２，Ｍｏｌ．
Ｇｅ．Ｇｅｎｅｔ．２３４：４８９−４９３）は、スト
レプトアロテイチャスヒンヅスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）か
らのプロモーターのないフレオマイシン耐性遺伝子を有
するプロモータープローブベクターである。ｐＵＴ７１
５ ＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化し、１２５０塩基対のｔ
ｒｐＣプロモーター断片に結合させた。結合混合物を大
腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたプラスミドをｐＵ
Ｔ７１５／ｔｒｐＣと命名した。ｐＵＴ７１５／ｔｒｐ
Ｃ ＤＮＡをＢａｍＨＩとＢｇｌII酵素で消化した。ｔ
ｒｐＣプロモーターとフレオマイシン耐性遺伝子よりな
る２．４kbの断片を、アガロースゲル電気泳動により単
離した。ｐＷＢ１９Ｎ ＤＮＡをＢａｍＨＩ酵素で切断
し、２．４kb断片に結合させた。得られたプラスミドを
ｐＳＪＣ６２と命名した（図１１）。
ら、１９８９，Ｆｕｎｇｕｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｌｅｔｔ．
３６：７９０−８１）は、細菌ハイグロマイシンＢ耐性
遺伝子の転写を支配する、アスペルギルスニヅランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｔｒ
ｐＣプロモーター配列を有する。ｐＥＳ２００ ＤＮＡ
をＥｃｏＲＩとＣｌａＩ酵素で切断した；５′突出末端
をクレノウ断片で平滑末端に変換した。アガロースゲル
電気泳動で１２５０塩基対のｔｒｐＣプロモーター断片
を単離し、電気溶出により回収した。プラスミドｐＵＴ
７１５（ジェイン（Ｊａｉｎ）ら、１９９２，Ｍｏｌ．
Ｇｅ．Ｇｅｎｅｔ．２３４：４８９−４９３）は、スト
レプトアロテイチャスヒンヅスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）か
らのプロモーターのないフレオマイシン耐性遺伝子を有
するプロモータープローブベクターである。ｐＵＴ７１
５ ＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化し、１２５０塩基対のｔ
ｒｐＣプロモーター断片に結合させた。結合混合物を大
腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたプラスミドをｐＵ
Ｔ７１５／ｔｒｐＣと命名した。ｐＵＴ７１５／ｔｒｐ
Ｃ ＤＮＡをＢａｍＨＩとＢｇｌII酵素で消化した。ｔ
ｒｐＣプロモーターとフレオマイシン耐性遺伝子よりな
る２．４kbの断片を、アガロースゲル電気泳動により単
離した。ｐＷＢ１９Ｎ ＤＮＡをＢａｍＨＩ酵素で切断
し、２．４kb断片に結合させた。得られたプラスミドを
ｐＳＪＣ６２と命名した（図１１）。
【００６５】２．ｐＦＯ２３の作成 プラスミドｐＦＯ２１はフサリウムオキシスポラム
（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）４３５株のゲノムＤＮＡか
らの約１２kbのＥｃｏＲＩ断片の挿入体を有する。ｐＦ
Ｏ２１ ＤＮＡをＳａｌＩ酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼで再び環状化した。得られたプラスミドｐＦＯ
２３は、ｐＦＯ２１からの非コードフサリウムＤＮＡの
５．８kb欠失を有する（図５）。
（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）４３５株のゲノムＤＮＡか
らの約１２kbのＥｃｏＲＩ断片の挿入体を有する。ｐＦ
Ｏ２１ ＤＮＡをＳａｌＩ酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼで再び環状化した。得られたプラスミドｐＦＯ
２３は、ｐＦＯ２１からの非コードフサリウムＤＮＡの
５．８kb欠失を有する（図５）。
【００６６】３．ｐＢＭＦＸＰＶＡ６の作成 ｐＳＪＣ６２ ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩ酵素で切
断した。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｔ
ｒｐＣプロモーターとフレオマイシン耐性遺伝子よりな
る得られた２．４kb断片を単離した。ｐＦＯ２３ ＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩ酵素で消化した。ＤＮＡ混合
物をアガロースゲルで分離した。ＰＶＡ遺伝子を含有す
る７．９kb断片を単離し、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ）ｔｒｐＣプロモーターとフレオマイシン
耐性遺伝子よりなる２．４kb断片に結合させた。得られ
たプラスミドをｐＢＭＦＸＰＶＡ６と命名した（図１
２）。
断した。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｔ
ｒｐＣプロモーターとフレオマイシン耐性遺伝子よりな
る得られた２．４kb断片を単離した。ｐＦＯ２３ ＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩ酵素で消化した。ＤＮＡ混合
物をアガロースゲルで分離した。ＰＶＡ遺伝子を含有す
る７．９kb断片を単離し、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ）ｔｒｐＣプロモーターとフレオマイシン
耐性遺伝子よりなる２．４kb断片に結合させた。得られ
たプラスミドをｐＢＭＦＸＰＶＡ６と命名した（図１
２）。
【００６７】４．ｐＢＭＦＸＰＶＡ７の作成 ｐＢＭＦＸＰＶＡ６ ＤＮＡをＮｃｏＩとＸｂａＩ酵素
で切断した。粘着末端を、クレノウ断片で平滑末端に変
換した。ＤＮＡ混合物をアガロースゲルで分離し、ＰＶ
Ａ遺伝子を含有する４．３kb断片を単離した。ｐＢＭＦ
ＸＰＶＡ６ ＤＮＡをＸｂａＩで切断し、クレノウ断片
で処理した。線状化したｐＢＭＦＸＰＶＡ６ ＤＮＡを
ｐＢＭＦＸＰＶＡ７からの４．３kb ＰＶＡ遺伝子断片
に結合させた（図１３）。
で切断した。粘着末端を、クレノウ断片で平滑末端に変
換した。ＤＮＡ混合物をアガロースゲルで分離し、ＰＶ
Ａ遺伝子を含有する４．３kb断片を単離した。ｐＢＭＦ
ＸＰＶＡ６ ＤＮＡをＸｂａＩで切断し、クレノウ断片
で処理した。線状化したｐＢＭＦＸＰＶＡ６ ＤＮＡを
ｐＢＭＦＸＰＶＡ７からの４．３kb ＰＶＡ遺伝子断片
に結合させた（図１３）。
【００６８】５．異種宿主中でのＰＶＡ遺伝子の発現 アスペルギルスニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｔｒｐＣプロモーターにより制御
されるフレオマイシン耐性遺伝子を添加して、ｐＦＯ２
３（図５）から組換えプラスミドｐＢＭＦＸＰＶＡ６を
得た（図１２）。組換えプラスミドｐＢＭＦＸＰＶＡ７
は、ＰＶＡ遺伝子の２番目のコピーを添加してｐＢＭＦ
ＸＰＶＡ６から得られた（図１３）。これらの組換えプ
ラスミドを、ポリエチレングリコール介在プロトプロス
ト形質転換（ポウェルとキストラー（Ｐｏｗｅｌｌ ａ
ｎｄ Ｋｉｓｔｌｅｒ），１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１７２：３１６３−３１７１）により、ＰＶＡ
遺伝子の異種宿主（フサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）の異なる亜種）である、ＡＴＣＣ１
６３３２株（フサリウムオキシスポラム・リコペルシシ
種（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｃｉ））に導入した。フレオマイシン耐性形質転
換体のＤＮＡ解析により、形質転換ＤＮＡが宿主染色体
中に取り込まれていることが確認された。ここで、この
ポリエチレングリコール介在プロトプロスト形質転換プ
ロトコールではフサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）４３５株は形質転換されなかった。
ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｔｒｐＣプロモーターにより制御
されるフレオマイシン耐性遺伝子を添加して、ｐＦＯ２
３（図５）から組換えプラスミドｐＢＭＦＸＰＶＡ６を
得た（図１２）。組換えプラスミドｐＢＭＦＸＰＶＡ７
は、ＰＶＡ遺伝子の２番目のコピーを添加してｐＢＭＦ
ＸＰＶＡ６から得られた（図１３）。これらの組換えプ
ラスミドを、ポリエチレングリコール介在プロトプロス
ト形質転換（ポウェルとキストラー（Ｐｏｗｅｌｌ ａ
ｎｄ Ｋｉｓｔｌｅｒ），１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１７２：３１６３−３１７１）により、ＰＶＡ
遺伝子の異種宿主（フサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）の異なる亜種）である、ＡＴＣＣ１
６３３２株（フサリウムオキシスポラム・リコペルシシ
種（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｃｉ））に導入した。フレオマイシン耐性形質転
換体のＤＮＡ解析により、形質転換ＤＮＡが宿主染色体
中に取り込まれていることが確認された。ここで、この
ポリエチレングリコール介在プロトプロスト形質転換プ
ロトコールではフサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）４３５株は形質転換されなかった。
【００６９】次に形質転換体を振盪フラスコ中で発酵さ
せ、ＰＶＡ活性について測定した。フサリウムオキシス
ポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）４３５株は、２０IU
／mlを産生した。非形質転換ＡＴＣＣ１６３２２株は
１．０IU／ml産生し、ｐＢＭＦＸＰＶＡ６プラスミド
（１つのＰＶＡ遺伝子）を有する形質転換体は１０IU／
ml産生し、ｐＢＭＦＸＰＶＡ７（２つのＰＶＡ遺伝子）
を有する形質転換体は１３０IU／ml産生した（表３）。
全体として、異種宿主で発現されるＰＶＡ活性は、フサ
リウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）４．
３kb断片に対して５倍増加した。
せ、ＰＶＡ活性について測定した。フサリウムオキシス
ポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）４３５株は、２０IU
／mlを産生した。非形質転換ＡＴＣＣ１６３２２株は
１．０IU／ml産生し、ｐＢＭＦＸＰＶＡ６プラスミド
（１つのＰＶＡ遺伝子）を有する形質転換体は１０IU／
ml産生し、ｐＢＭＦＸＰＶＡ７（２つのＰＶＡ遺伝子）
を有する形質転換体は１３０IU／ml産生した（表３）。
全体として、異種宿主で発現されるＰＶＡ活性は、フサ
リウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）４．
３kb断片に対して５倍増加した。
【表３】 さらに、組換えＰＶＡの発現は、フェノキシアセテート
の存在下でフサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）４３５株と同じ程度に誘導される（表４）。
の存在下でフサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）４３５株と同じ程度に誘導される（表４）。
【００７０】
【表４】
【００７１】実施例５ 真菌発現ベクターの作成 ＰＶＡ遺伝子の発現は、フェノキシアセテートの添加に
より誘導可能である。フサリウムオキシスポラム（Ｆ．
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）中での外来遺伝子発現に使用する
ために、発現ベクターはＰＶＡ転写および翻訳制御領域
（制御領域と呼ぶ）から作成されるようである。以下の
作成体は、細胞内蛋白の発現のためのプラスミドｐＢＭ
ＰＶＡ−Ｐと分泌性蛋白の発現のためのプラスミドｐＢ
ＭＰＶＡ−Ｍを作成するのに使用された。
より誘導可能である。フサリウムオキシスポラム（Ｆ．
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）中での外来遺伝子発現に使用する
ために、発現ベクターはＰＶＡ転写および翻訳制御領域
（制御領域と呼ぶ）から作成されるようである。以下の
作成体は、細胞内蛋白の発現のためのプラスミドｐＢＭ
ＰＶＡ−Ｐと分泌性蛋白の発現のためのプラスミドｐＢ
ＭＰＶＡ−Ｍを作成するのに使用された。
【００７２】１．ｐＦ０２０の作成 ｐＦ０２０ ＤＮＡをＢａｍＨＩとＸｈｏＩ酵素で切断
した。ＤＮＡ混合物をアガロースゲルで分離した。ＰＶ
Ａ遺伝子の５′末端の上流に転写および翻訳制御配列を
含有する２．１kb断片を単離した。ｐＦ０２３をＸｈｏ
ＩとＨｉｎｄ1II 酵素で切断した。ＰＶＡ遺伝子の後半
を含有する１．５kb ＤＮＡ断片をゲル精製した。両断
片をＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩ部位でｐＵＣ１９に結合
させた。得られたプラスミドをｐＦＯ２１０と命名し
た。ｐＦ０２０の作成を図１４に模式的に示す。
した。ＤＮＡ混合物をアガロースゲルで分離した。ＰＶ
Ａ遺伝子の５′末端の上流に転写および翻訳制御配列を
含有する２．１kb断片を単離した。ｐＦ０２３をＸｈｏ
ＩとＨｉｎｄ1II 酵素で切断した。ＰＶＡ遺伝子の後半
を含有する１．５kb ＤＮＡ断片をゲル精製した。両断
片をＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩ部位でｐＵＣ１９に結合
させた。得られたプラスミドをｐＦＯ２１０と命名し
た。ｐＦ０２０の作成を図１４に模式的に示す。
【００７３】２．ｐＦ０２０−Ｐの作成 モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら（１９８４，Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌ．２：６３６−６３９）の部位特異的突
然変異誘発を用いて、ＰＶＡ遺伝子の翻訳開始部位にＭ
ｌｕＩ部位を作成した（配列番号２１の塩基対番号２４
１） ＡＴＧＣＧＣＧＴＣ（配列番号２４） 部位特異的突然変異誘発 ＡＴＡＣＧＣＧＴＣ（配列番号２５） ＭｌｕＩ部位
Ｔｅｃｈｎｏｌ．２：６３６−６３９）の部位特異的突
然変異誘発を用いて、ＰＶＡ遺伝子の翻訳開始部位にＭ
ｌｕＩ部位を作成した（配列番号２１の塩基対番号２４
１） ＡＴＧＣＧＣＧＴＣ（配列番号２４） 部位特異的突然変異誘発 ＡＴＡＣＧＣＧＴＣ（配列番号２５） ＭｌｕＩ部位
【００７４】ＭｌｕＩ部位の作成は、ＭｌｕＩとＢａｍ
ＨＩ切断によるＰＶＡ遺伝子のコード領域の除去と、Ｐ
ＶＡプロモーター支配下で発現される遺伝子のコード配
列による置換を可能にする。１５量体の突然変異原生オ
リゴヌクレオチド（ＧＧＣＡＣＴＡＴＡＣＧＣＧＴＣ配
列番号２６）を合成した。ｐＦ０２０−Ｐの作成は図１
５に模式的に示した。２μｇのｐＦ０２０をＸｍａＩで
消化し、続いて細菌性アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡ
Ｐ）で処理して、得られた断片Ｉの自己結合を防いだ。
２μｇのｐＦ０２０をＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し
て、突然変異標的領域（例えば、ＰＶＡ遺伝子の上流の
領域）を除去した。得られた５kbの断片（断片II）をゲ
ル精製した。等量の断片ＩとIIを２００倍モル過剰の１
５量体突然変異原生オリゴヌクレオチドに混合した。混
合物中のＤＮＡ断片を完全に変性させるために、混合物
を１００℃で３分間インキュベートした。変性後、混合
物を段階的に徐々に冷却し、変性したＤＮＡ断片を再度
アニーリングさせた。この再アニーリングの間、元々の
断片ＩとIIに加えて、２つの新しいＤＮＡ、ＤＮＡ−ａ
とＤＮＡ−ｂが作成された。１５量体の突然変異原生オ
リゴヌクレオチドは標的領域の２つの鎖の１つにのみ相
補的なため、図１３に示すようにこのオリゴヌクレオチ
ドは環状ＤＮＡの２つの分子種のうちの１つにのみハイ
ブリダイズしてヘテロ２本鎖を形成した。このＤＮＡを
クレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼそして４つのｄＮ
ＴＰでインキュベートした。この処理により、開いた環
状ＤＮＡが閉じた環状ＤＮＡに変換された。反応後、混
合物を大腸菌ＤＨ５αの形質転換に使用した。形質転換
体のプラスミドＤＮＡを、ＭｌｕＩ切断解析によりスク
リーニングした。プラスミドｐＦ０２０−Ｐを、Ｍｌｕ
Ｉ部位の作成についてスクリーニングした。
ＨＩ切断によるＰＶＡ遺伝子のコード領域の除去と、Ｐ
ＶＡプロモーター支配下で発現される遺伝子のコード配
列による置換を可能にする。１５量体の突然変異原生オ
リゴヌクレオチド（ＧＧＣＡＣＴＡＴＡＣＧＣＧＴＣ配
列番号２６）を合成した。ｐＦ０２０−Ｐの作成は図１
５に模式的に示した。２μｇのｐＦ０２０をＸｍａＩで
消化し、続いて細菌性アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡ
Ｐ）で処理して、得られた断片Ｉの自己結合を防いだ。
２μｇのｐＦ０２０をＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し
て、突然変異標的領域（例えば、ＰＶＡ遺伝子の上流の
領域）を除去した。得られた５kbの断片（断片II）をゲ
ル精製した。等量の断片ＩとIIを２００倍モル過剰の１
５量体突然変異原生オリゴヌクレオチドに混合した。混
合物中のＤＮＡ断片を完全に変性させるために、混合物
を１００℃で３分間インキュベートした。変性後、混合
物を段階的に徐々に冷却し、変性したＤＮＡ断片を再度
アニーリングさせた。この再アニーリングの間、元々の
断片ＩとIIに加えて、２つの新しいＤＮＡ、ＤＮＡ−ａ
とＤＮＡ−ｂが作成された。１５量体の突然変異原生オ
リゴヌクレオチドは標的領域の２つの鎖の１つにのみ相
補的なため、図１３に示すようにこのオリゴヌクレオチ
ドは環状ＤＮＡの２つの分子種のうちの１つにのみハイ
ブリダイズしてヘテロ２本鎖を形成した。このＤＮＡを
クレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼそして４つのｄＮ
ＴＰでインキュベートした。この処理により、開いた環
状ＤＮＡが閉じた環状ＤＮＡに変換された。反応後、混
合物を大腸菌ＤＨ５αの形質転換に使用した。形質転換
体のプラスミドＤＮＡを、ＭｌｕＩ切断解析によりスク
リーニングした。プラスミドｐＦ０２０−Ｐを、Ｍｌｕ
Ｉ部位の作成についてスクリーニングした。
【００７５】３．ｐＢＭＰＶＡ−Ｐの作成 ｐＦ０２０−Ｐはこのベクターの使用を妨害する２つの
ＢａｍＨＩ部位を有するため、ｐＵＣ１９ベクターの領
域からＢａｍＨＩ部位を除去する必要がある。ｐＦ０２
０−Ｐを制限量のＢａｍＨＩ酵素で処理して、部分切断
条件を作成し、次にＥｃｏＲＩで切断した。５′突出断
片をクレノウ断片で充填した。６．３kb断片をゲル精製
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合させ、ＤＨ５αに形質
転換させた。得られたプラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｐ（図
１６）は、ＰＶＡプロモーターの支配下でＭｌｕＩ／Ｂ
ａｍＨＩ部位で目的の遺伝子のコード配列を挿入するた
めの発現ベクターとして使用することができる。
ＢａｍＨＩ部位を有するため、ｐＵＣ１９ベクターの領
域からＢａｍＨＩ部位を除去する必要がある。ｐＦ０２
０−Ｐを制限量のＢａｍＨＩ酵素で処理して、部分切断
条件を作成し、次にＥｃｏＲＩで切断した。５′突出断
片をクレノウ断片で充填した。６．３kb断片をゲル精製
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合させ、ＤＨ５αに形質
転換させた。得られたプラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｐ（図
１６）は、ＰＶＡプロモーターの支配下でＭｌｕＩ／Ｂ
ａｍＨＩ部位で目的の遺伝子のコード配列を挿入するた
めの発現ベクターとして使用することができる。
【００７６】４．ｐＦ０２０−Ｍの作成 ＰＶＡ分泌シグナル配列と成熟ＰＶＡ蛋白の結合点に、
ＳｍａＩ部位を作成した（アミノ酸２４〜２５、配列番
号２２） ＡＡＣＡＡＡ／ＧＧＣＡＡＣ（配列番号２７） Ｎ Ｋ Ｇ Ｎ （配列番号２８） 部位特異的突然変異誘発 ＡＡＣＣＣＣ／ＧＧＧＡＡＣ（配列番号２９） ＳｍａＩ部位 ＳｍａＩ部位の作成は、ＰＶＡ分泌シグナル配列の後に
コード配列の挿入を可能にし、これにより発現された蛋
白の分泌が可能になる。２８量体の突然変異原生オリゴ
ヌクレオチド （ＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＡＴ
ＧＡＴＴ、配列番号３０）が合成された。
ＳｍａＩ部位を作成した（アミノ酸２４〜２５、配列番
号２２） ＡＡＣＡＡＡ／ＧＧＣＡＡＣ（配列番号２７） Ｎ Ｋ Ｇ Ｎ （配列番号２８） 部位特異的突然変異誘発 ＡＡＣＣＣＣ／ＧＧＧＡＡＣ（配列番号２９） ＳｍａＩ部位 ＳｍａＩ部位の作成は、ＰＶＡ分泌シグナル配列の後に
コード配列の挿入を可能にし、これにより発現された蛋
白の分泌が可能になる。２８量体の突然変異原生オリゴ
ヌクレオチド （ＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＡＴ
ＧＡＴＴ、配列番号３０）が合成された。
【００７７】ｐＦ０２０−Ｍの作成を図１５に示した。
この方法は、ｐＦ０２０−Ｐの作成と同様である。プラ
スミドｐＦ０２０をＸｍａＩで切断し、次にＢＡＰ処理
して断片Ｉを作成した。次にｐＦ０２０をＳｐｈＩとＨ
ｉｎｄIII で消化して、標的領域と除去し、６kb断片II
を作成した。ヘテロ２本鎖作成とＤＮＡ伸長の条件はｐ
Ｆ０２０−Ｐ作成と同様であった。形質転換体のプラス
ミドＤＮＡを、追加のＳｍａＩ部位の作成についてスク
リーニングした。
この方法は、ｐＦ０２０−Ｐの作成と同様である。プラ
スミドｐＦ０２０をＸｍａＩで切断し、次にＢＡＰ処理
して断片Ｉを作成した。次にｐＦ０２０をＳｐｈＩとＨ
ｉｎｄIII で消化して、標的領域と除去し、６kb断片II
を作成した。ヘテロ２本鎖作成とＤＮＡ伸長の条件はｐ
Ｆ０２０−Ｐ作成と同様であった。形質転換体のプラス
ミドＤＮＡを、追加のＳｍａＩ部位の作成についてスク
リーニングした。
【００７８】５．ｐＢＭＰＶＡ−Ｍの作成 プラスミドｐＦ０２０−Ｍは、このベクターの使用を妨
害する２つのＢａｍＨＩ部位と２つのＳｍａＩ部位を有
する。ｐＵＣ１９の領域から余分のＢａｍＨＩ部位とＳ
ｍａＩ部位を除去する必要がある。ｐＦ０２０−ＭをＢ
ａｍＨＩで部分的に切断し、次にＥｃｏＲＩで切断し
た。粘着末端をクレノウ断片で充填した。
害する２つのＢａｍＨＩ部位と２つのＳｍａＩ部位を有
する。ｐＵＣ１９の領域から余分のＢａｍＨＩ部位とＳ
ｍａＩ部位を除去する必要がある。ｐＦ０２０−ＭをＢ
ａｍＨＩで部分的に切断し、次にＥｃｏＲＩで切断し
た。粘着末端をクレノウ断片で充填した。
【００７９】６．３kb断片をゲル精製し、結合させ大腸
菌のＤＨ５α中に形質転換した。得られたプラスミドｐ
ＢＭＰＶＡ−Ｍ（図１８）は、ＰＶＡプロモーターの支
配下でＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ部位に目的の遺伝子のコー
ド配列を挿入するための、分泌性発現ベクターとして使
用することができる。
菌のＤＨ５α中に形質転換した。得られたプラスミドｐ
ＢＭＰＶＡ−Ｍ（図１８）は、ＰＶＡプロモーターの支
配下でＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ部位に目的の遺伝子のコー
ド配列を挿入するための、分泌性発現ベクターとして使
用することができる。
【００８０】実施例６ ＰＶＡ発現ベクターによるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子の発現 トリオゴノプシスバリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉ
ｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）からクローン化したＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼ遺伝子を、フサリウムＰＶＡ発現ベ
クターにより発現される外来遺伝子の例として使用し
た。 １．ｐＢＭＰＶＡ−ＰによるＤ−アミノ酸オキシダーゼ
遺伝子の発現 トリオゴノプシスバリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉ
ｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のＤ−アミノ酸オキシダー
ゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子は、ブリストル−マイアーズスク
イブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｉｂｂ）の科
学者らによりクローン化された。ＤＮＡ配列解析は、コ
ード配列の５′末端の近傍に３８塩基対のイントロンが
存在することを示した。オリゴヌクレオチド部位特異的
突然変異誘発法を用いて、イントロンを除去し、ＤＡＡ
Ｏ遺伝子の翻訳開始部位にＮｃｏＩ部位を作成した。従
ってＤＡＡＯコード配列と７００塩基対の３′非転写領
域を合わせたものは、２．１kb ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ
断片として精製することができる。
伝子の発現 トリオゴノプシスバリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉ
ｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）からクローン化したＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼ遺伝子を、フサリウムＰＶＡ発現ベ
クターにより発現される外来遺伝子の例として使用し
た。 １．ｐＢＭＰＶＡ−ＰによるＤ−アミノ酸オキシダーゼ
遺伝子の発現 トリオゴノプシスバリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉ
ｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のＤ−アミノ酸オキシダー
ゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子は、ブリストル−マイアーズスク
イブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｉｂｂ）の科
学者らによりクローン化された。ＤＮＡ配列解析は、コ
ード配列の５′末端の近傍に３８塩基対のイントロンが
存在することを示した。オリゴヌクレオチド部位特異的
突然変異誘発法を用いて、イントロンを除去し、ＤＡＡ
Ｏ遺伝子の翻訳開始部位にＮｃｏＩ部位を作成した。従
ってＤＡＡＯコード配列と７００塩基対の３′非転写領
域を合わせたものは、２．１kb ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ
断片として精製することができる。
【００８１】プラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｐ ＤＮＡをＭ
ｌｕＩ切断により処理し、粘着末端をクレノウ断片で充
填した。次にＤＮＡをＢａｍＨＩで切断した。ＰＶＡプ
ロモーター領域を含有する４．７kb断片をゲル精製し
た。ＤＡＡＯ遺伝子断片をＤＡＡＯ遺伝子の２．１kb
ＮｃｏＩ−クレノウ／ＢａｍＨＩ断片と結合させて、ｐ
ＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０１を作成した。ＮｄｅＩ切断
とプラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０１のクレノウ
充填により、３．４kbのＰＶＡプロモーター／ＤＡＡＯ
遺伝子融合断片が調製された。この断片をｐＳＪＣ６２
ＤＮＡとクレノウ充填したＸｂａＩ部位中に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０
２と命名した。全作成体の概略図は図１９に示す。
ｌｕＩ切断により処理し、粘着末端をクレノウ断片で充
填した。次にＤＮＡをＢａｍＨＩで切断した。ＰＶＡプ
ロモーター領域を含有する４．７kb断片をゲル精製し
た。ＤＡＡＯ遺伝子断片をＤＡＡＯ遺伝子の２．１kb
ＮｃｏＩ−クレノウ／ＢａｍＨＩ断片と結合させて、ｐ
ＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０１を作成した。ＮｄｅＩ切断
とプラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０１のクレノウ
充填により、３．４kbのＰＶＡプロモーター／ＤＡＡＯ
遺伝子融合断片が調製された。この断片をｐＳＪＣ６２
ＤＮＡとクレノウ充填したＸｂａＩ部位中に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０
２と命名した。全作成体の概略図は図１９に示す。
【００８２】ポリメラーゼグリコール介在プロトプロス
ト形質転換により、ｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０２ Ｄ
ＮＡをＡＴＣＣ１６３２２株中に導入した。形質転換体
をフレオマイシン耐性から選択した。いくつかの形質転
換体をＰＶＡ産生培地で増殖させ、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ活性について測定した。結果は、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ遺伝子がＡＴＣＣ１６３２２形質転換体中で
０．２−０．８IU／mlのレベルで発現されたことを示し
た。
ト形質転換により、ｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０２ Ｄ
ＮＡをＡＴＣＣ１６３２２株中に導入した。形質転換体
をフレオマイシン耐性から選択した。いくつかの形質転
換体をＰＶＡ産生培地で増殖させ、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ活性について測定した。結果は、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ遺伝子がＡＴＣＣ１６３２２形質転換体中で
０．２−０．８IU／mlのレベルで発現されたことを示し
た。
【００８３】２．ｐＢＭＰＶＡ−ＭによるＤ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子の発現 プラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｍ ＤＮＡをＳｍａＩとＢａ
ｍＨＩ酵素で切断した。ＰＶＡプロモーター領域とＰＶ
Ａ分泌性シグナル配列を含有する４．８kb断片を、ゲル
精製した。ＤＡＡＯ遺伝子断片をＮｃｏＩ切断とムング
豆（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理により調製し
て、５′粘着末端を除去し、ＤＡＡＯ遺伝子の正しいリ
ーディングフレームを維持し、次にＢａｍＨＩ消化して
２．１kb断片を作成した。４．８kb ＰＶＡプロモータ
ー／シグナル配列断片を２．１kb ＤＡＡＯ遺伝子断片
に結合させて、プラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０
３を作成した。ｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０３ ＤＮＡ
をＮｄｅＩで切断し、５′粘着末端をクレノウ断片で充
填した。３．５kb ＰＶＡプロモーター−シグナル配列
／ＤＡＡＯ遺伝子融合断片を精製し、クレノウ充填Ｘｂ
ａＩ部位でｐＳＪＣ６２ ＤＮＡに挿入した。得られた
プラスミドをｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０４と命名した
（図２０）。
オキシダーゼ遺伝子の発現 プラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｍ ＤＮＡをＳｍａＩとＢａ
ｍＨＩ酵素で切断した。ＰＶＡプロモーター領域とＰＶ
Ａ分泌性シグナル配列を含有する４．８kb断片を、ゲル
精製した。ＤＡＡＯ遺伝子断片をＮｃｏＩ切断とムング
豆（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理により調製し
て、５′粘着末端を除去し、ＤＡＡＯ遺伝子の正しいリ
ーディングフレームを維持し、次にＢａｍＨＩ消化して
２．１kb断片を作成した。４．８kb ＰＶＡプロモータ
ー／シグナル配列断片を２．１kb ＤＡＡＯ遺伝子断片
に結合させて、プラスミドｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０
３を作成した。ｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０３ ＤＮＡ
をＮｄｅＩで切断し、５′粘着末端をクレノウ断片で充
填した。３．５kb ＰＶＡプロモーター−シグナル配列
／ＤＡＡＯ遺伝子融合断片を精製し、クレノウ充填Ｘｂ
ａＩ部位でｐＳＪＣ６２ ＤＮＡに挿入した。得られた
プラスミドをｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０４と命名した
（図２０）。
【００８４】ｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０４ ＤＮＡを
ＡＴＣＣ１６３２２株中に形質転換させた。いくつかの
フレオマイシン耐性形質転換体を、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ活性について測定した。不幸にも、どの形質転換
体もＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示さなかった。ｐ
ＢＭＰＶＡ−ＭベクターによるＤ−アミノ酸オキシダー
ゼ遺伝子の発現の欠失は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵
素の細胞内性によるものかも知れない。細胞内蛋白をコ
ードする遺伝子は発現することができず、分泌性発現系
により細胞外に移することができないことは広く認識さ
れている（モデルとラッセル（Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｒ
ｕｓｓｅｌ）、１９９０，Ｃｅｌｌ ６１：７３９−７
４１）。たとえ遺伝子が細胞内で発現されても、ＰＶＡ
シグナル配列の結合がＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を
不活性化するかも知れない。従ってｐＢＭＰＶＡ−Ｍベ
クターは、やはり他の分泌性蛋白遺伝子の発現に有用で
ある。
ＡＴＣＣ１６３２２株中に形質転換させた。いくつかの
フレオマイシン耐性形質転換体を、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ活性について測定した。不幸にも、どの形質転換
体もＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示さなかった。ｐ
ＢＭＰＶＡ−ＭベクターによるＤ−アミノ酸オキシダー
ゼ遺伝子の発現の欠失は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵
素の細胞内性によるものかも知れない。細胞内蛋白をコ
ードする遺伝子は発現することができず、分泌性発現系
により細胞外に移することができないことは広く認識さ
れている（モデルとラッセル（Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｒ
ｕｓｓｅｌ）、１９９０，Ｃｅｌｌ ６１：７３９−７
４１）。たとえ遺伝子が細胞内で発現されても、ＰＶＡ
シグナル配列の結合がＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を
不活性化するかも知れない。従ってｐＢＭＰＶＡ−Ｍベ
クターは、やはり他の分泌性蛋白遺伝子の発現に有用で
ある。
【図１】完全なＰＶＡ酵素の６つのペプチド断片のアミ
ノ酸配列を示す。
ノ酸配列を示す。
【図２】オリゴヌクレオチドプローブを示す。
【図３】種々のＤＮＡとペプチド断片を示す。
【図４】２５８５−ＦＬの略図である。
【図５】ゲノムＰＶＡ遺伝子のクローニングの略図を示
す。
す。
【図６】ＰＶＡ ｃＤＮＡと対応するアミノ酸配列を示
す。
す。
【図７】ＰＶＡ ｃＤＮＡと対応するアミノ酸配列であ
る（図６の続き）。
る（図６の続き）。
【図８】ＰＶＡゲノムＤＮＡと対応するアミノ酸配列を
示す。
示す。
【図９】ＰＶＡゲノムＤＮＡと対応するアミノ酸配列
（図８の続き）。
（図８の続き）。
【図１０】ｐＷＢ１９Ｎの作成の略図を示す。
【図１１】ｐＳＪＣ６２の作成の略図を示す。
【図１２】ｐＢＭＦＸＰＶＡ６の作成の略図を示す。
【図１３】ｐＢＭＦＸＰＶＡ７の作成の略図を示す。
【図１４】ｐＦ０２０の作成の略図を示す。
【図１５】ｐＦ０２０−Ｐの作成の略図を示す。
【図１６】ｐＢＭＰＶＡ−Ｐの作成の略図を示す。
【図１７】ｐＦ０２０−Ｍの作成の略図を示す。
【図１８】ｐＢＭＰＶＡ−Ｍの作成の略図を示す。
【図１９】ｐＢＭＰＶＡ−Ｐ／ＤＡＡ０２の作成の略図
を示す。
を示す。
【図２０】ｐＢＭＰＶＡ−Ｍ／ＤＡＡ０４の作成の略図
を示す。
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 ウィリアム ブイ．バーネット，ジュニア アメリカ合衆国，ニューヨーク 13066, フェイエッテビル，リンドン ロード 49 (72)発明者 シーン エム．トンジ アメリカ合衆国，ニューヨーク 13152, スカニーテレス，ナイツブリッジ ロード 3845
Claims (71)
- 【請求項１】 配列番号１９または２２のアミノ酸配列
をコードする配列を有する、単離された核酸分子。 - 【請求項２】 配列番号１９または２２のアミノ酸配列
をコードする核酸配列に相補的な配列を有する、単離さ
れた核酸分子。 - 【請求項３】 配列番号１９または２２のアミノ酸配列
をコードする核酸配列に相補的な配列を有する核酸にハ
イブリダイズすることができる配列を有する、単離され
た核酸分子。 - 【請求項４】 ＤＮＡ分子である、請求項１記載の核酸
分子。 - 【請求項５】 ＤＮＡ分子である、請求項２記載の核酸
分子。 - 【請求項６】 ＤＮＡ分子である、請求項３記載の核酸
分子。 - 【請求項７】 配列番号１９のアミノ酸配列をコードす
る配列を有する、単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項８】 配列番号１９のアミノ酸配列をコードす
る核酸配列に相補的な配列を有する核酸にハイブリダイ
ズすることができる配列を有する、単離されたＤＮＡ分
子。 - 【請求項９】 配列番号２２のアミノ酸配列をコードす
る配列を有する、単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１０】 配列番号２２のアミノ酸配列をコード
する核酸配列に相補的な配列を有する核酸にハイブリダ
イズすることができる配列を有する、単離されたＤＮＡ
分子。 - 【請求項１１】 配列番号１８のヌクレオチド配列を有
する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１２】 配列番号２１のヌクレオチド配列を有
する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１３】 配列番号１１のヌクレオチド配列を有
する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１４】 配列番号２３のヌクレオチド配列を有
する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１５】 配列番号１４，１５，１６、または１
７のヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１６】 配列番号９または１０のヌクレオチド
配列を有する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１７】 配列番号２６または３０のヌクレオチ
ド配列を有する単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１８】 配列番号１，２，３，４，５，６，
８、または１２のアミノ酸配列を有する単離されたポリ
ペプチド。 - 【請求項１９】 配列番号１または１２のアミノ酸配列
を有する、請求項１８記載のポリペプチド。 - 【請求項２０】 配列番号１９または２２のアミノ酸配
列の一部をコードする核酸配列よりなる、発現ベクタ
ー。 - 【請求項２１】 配列番号１９のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列よりなる、請求項２０記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項２２】 配列番号２２のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列よりなる、請求項２０記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項２３】 さらに複製開始点、プロモーター、お
よび転写停止配列よりなる、請求項２０記載の発現ベク
ター。 - 【請求項２４】 さらに選択性マーカー配列よりなる、
請求項２３記載の発現ベクター。 - 【請求項２５】 選択性マーカーはフレオマイシン（ｐ
ｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）耐性である。請求項２４記載の発
現ベクター。 - 【請求項２６】 真菌染色体に取り込まれることができ
る、請求項２３記載の発現ベクター。 - 【請求項２７】 配列番号１８また２１のＤＮＡ配列を
有する、請求項２０記載の発現ベクター。 - 【請求項２８】 プラスミドである、請求項２０記載の
発現ベクター。 - 【請求項２９】 配列番号２３のＤＮＡ配列を有するプ
ロモーターよりなる発現ベクター。 - 【請求項３０】 さらに複製開始点、構造蛋白をコード
するＤＮＡ、および転写停止配列よりなる、請求項２９
記載の発現ベクター。 - 【請求項３１】 構造蛋白をコードするＤＮＡはＰＶＡ
をコードする、請求項３０記載の発現ベクター。 - 【請求項３２】 選択性マーカー配列よりなる、請求項
３０記載の発現ベクター。 - 【請求項３３】 選択性マーカーはフレオマイシン耐性
である。請求項３２記載の発現ベクター。 - 【請求項３４】 真菌染色体に取り込まれることができ
る、請求項３０記載の発現ベクター。 - 【請求項３５】 ｐＢＭＦＸＰＶＡ６という名称の発現
ベクター。 - 【請求項３６】 ｐＢＭＦＸＰＶＡ７という名称の発現
ベクター。 - 【請求項３７】 ｐＢＭＰＶＡ−Ｐという名称の発現ベ
クター。 - 【請求項３８】 ｐＢＭＰＶＡ−Ｍという名称の発現ベ
クター。 - 【請求項３９】 請求項２０記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４０】 請求項２３記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４１】 請求項２５記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４２】 請求項２６記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４３】 請求項２７記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４４】 請求項２８記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４５】 請求項２９記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４６】 請求項３０記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４７】 請求項３１記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４８】 請求項３２記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項４９】 請求項３３記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項５０】 請求項３４記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項５１】 請求項３５記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項５２】 請求項３６記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項５３】 請求項３７記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項５４】 請求項３８記載の発現ベクターを含有
する宿主細胞。 - 【請求項５５】 真核細胞性である、請求項３９記載の
宿主細胞。 - 【請求項５６】 真核細胞性である、請求項４５記載の
宿主細胞。 - 【請求項５７】 フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種で
ある、請求項３９記載の宿主細胞。 - 【請求項５８】 フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種で
ある、請求項４５記載の宿主細胞。 - 【請求項５９】 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である、請求項３９記
載の宿主細胞。 - 【請求項６０】 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である、請求項４５記
載の宿主細胞。 - 【請求項６１】 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である、請求項５１記
載の宿主細胞。 - 【請求項６２】 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である、請求項５２記
載の宿主細胞。 - 【請求項６３】 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である、請求項５３記
載の宿主細胞。 - 【請求項６４】 フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である、請求項５４記
載の宿主細胞。 - 【請求項６５】 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）ＡＴＣＣ６９７２０の生物学的に純粋な培養
物。 - 【請求項６６】 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）ＡＴＣＣ６９７２１の生物学的に純粋な培養
物。 - 【請求項６７】 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）ＡＴＣＣ６９７７２の生物学的に純粋な培養
物。 - 【請求項６８】 ポリペプチドが発現される条件下で請
求項３９記載の宿主細胞を培養することよりなる、配列
番号１９または２２のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの産生方法。 - 【請求項６９】 フェノキシアセテートの存在下で培養
することにより発現が誘導される、請求項６８記載の方
法。 - 【請求項７０】 ポリペプチドが発現される条件下で請
求項４５記載の宿主細胞を培養することよりなる、ポリ
ペプチドの産生方法。 - 【請求項７１】 フェノキシアセテートの存在下で培養
することにより発現が誘導される、請求項７０記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/363,475 US5516679A (en) | 1994-12-23 | 1994-12-23 | Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum |
| US363475 | 1994-12-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08266290A true JPH08266290A (ja) | 1996-10-15 |
Family
ID=23430378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7337297A Pending JPH08266290A (ja) | 1994-12-23 | 1995-12-25 | フサリウムオキシスポラムからのペニシリンｖアミドヒドロラーゼ遺伝子 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5516679A (ja) |
| EP (1) | EP0718402B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08266290A (ja) |
| KR (2) | KR100454831B1 (ja) |
| CN (1) | CN1100877C (ja) |
| AT (1) | ATE444369T1 (ja) |
| AU (1) | AU699051B2 (ja) |
| CA (1) | CA2163159A1 (ja) |
| DE (1) | DE69536009D1 (ja) |
| FI (1) | FI956234A (ja) |
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| WO2006053929A1 (es) * | 2004-03-16 | 2006-05-26 | Antibióticos, S.A.U. | Procedimiento para producir la enzima penicilina v acilasa de streptomyces lavendulae en microorganismos recombinantes. |
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