JPH06256396A - アクレモニウム・クリソゲナムからのβ−チューブリン、その製造および使用 - Google Patents
アクレモニウム・クリソゲナムからのβ−チューブリン、その製造および使用Info
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- JPH06256396A JPH06256396A JP6036386A JP3638694A JPH06256396A JP H06256396 A JPH06256396 A JP H06256396A JP 6036386 A JP6036386 A JP 6036386A JP 3638694 A JP3638694 A JP 3638694A JP H06256396 A JPH06256396 A JP H06256396A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Acremonium chrysogenum（A. chrysogenum）
からのβ−チューブリン遺伝子、そのアミノ酸配列、お
よびその遺伝子のA. chrysogenumの形質転換のための使
用。 【効果】 β−チューブリン遺伝子とくにその変異体
を、任意の所望の異種遺伝子とともに同時形質転換する
ことにより、その異種遺伝子の安定かつ安全な発現が可
能になる。
からのβ−チューブリン遺伝子、そのアミノ酸配列、お
よびその遺伝子のA. chrysogenumの形質転換のための使
用。 【効果】 β−チューブリン遺伝子とくにその変異体
を、任意の所望の異種遺伝子とともに同時形質転換する
ことにより、その異種遺伝子の安定かつ安全な発現が可
能になる。
Description
【０００１】本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム
〔Acremonium chrysogenum（A. chrysogenum）〕からの
β−チューブリン、その遺伝子配列およびアミノ酸配列
ならびにA. chrysogenumの形質転換のための使用に関す
る。
〔Acremonium chrysogenum（A. chrysogenum）〕からの
β−チューブリン、その遺伝子配列およびアミノ酸配列
ならびにA. chrysogenumの形質転換のための使用に関す
る。
【０００２】真核生物には、３つの異なる型のチューブ
リン遺伝子が存在する。すなわち、α−、β−およびγ
−チューブリンの遺伝子である。チューブリンの遺伝子
は、真核生物の細胞サイクルに重要な役割を果たす一群
のチューブリン蛋白質をコードする。したがって、たと
えば、チューブリンポリペプチドにおける変異は、微小
管の形成に影響する可能性がある。この変異はまた、チ
ューブリンインヒビターに対する感受性を変化させるこ
とができる。したがって、強力な抗真菌剤であるベノミ
ールはβ−チューブリンに特異的に作用する。
リン遺伝子が存在する。すなわち、α−、β−およびγ
−チューブリンの遺伝子である。チューブリンの遺伝子
は、真核生物の細胞サイクルに重要な役割を果たす一群
のチューブリン蛋白質をコードする。したがって、たと
えば、チューブリンポリペプチドにおける変異は、微小
管の形成に影響する可能性がある。この変異はまた、チ
ューブリンインヒビターに対する感受性を変化させるこ
とができる。したがって、強力な抗真菌剤であるベノミ
ールはβ−チューブリンに特異的に作用する。
【０００３】β−チューブリン遺伝子の分子分析および
ベノミール抵抗性変異体の検討から、β−チューブリン
の遺伝子にはいずれも置換である４つの異なる点変異が
あって、抗真菌剤、ベノミールに対する抵抗性をまで得
ることが明らかにされている［要約：Osmani & Oakley
(1991) Cell Cycle and Tubulin Mutations in Filamen
tous Fungi, J.W. Bennett & L.L. Lasure (編) "More
Gene Manipulations in Fungi", pp.107-122, Academic
Press, San Diego］。最初の変異β−チューブリン遺
伝子は、ベノミ−ルに対して抵抗性を示すAspergillus
nidulans株から単離された。ある場合には、変異β−チ
ューブリン遺伝子は、たとえばNeurospora crassa［Orb
ach M.J., Porro E.B., Yanofsky C.(1986) Mol. Cell.
Biol. 6:231-243］またはAspergillus nidulans［May
G.S.ら(1987) Gene 55:231-343］の形質転換にも使用さ
れた。
ベノミール抵抗性変異体の検討から、β−チューブリン
の遺伝子にはいずれも置換である４つの異なる点変異が
あって、抗真菌剤、ベノミールに対する抵抗性をまで得
ることが明らかにされている［要約：Osmani & Oakley
(1991) Cell Cycle and Tubulin Mutations in Filamen
tous Fungi, J.W. Bennett & L.L. Lasure (編) "More
Gene Manipulations in Fungi", pp.107-122, Academic
Press, San Diego］。最初の変異β−チューブリン遺
伝子は、ベノミ−ルに対して抵抗性を示すAspergillus
nidulans株から単離された。ある場合には、変異β−チ
ューブリン遺伝子は、たとえばNeurospora crassa［Orb
ach M.J., Porro E.B., Yanofsky C.(1986) Mol. Cell.
Biol. 6:231-243］またはAspergillus nidulans［May
G.S.ら(1987) Gene 55:231-343］の形質転換にも使用さ
れた。
【０００４】Neurospora crassaからの変異β−チュー
ブリン遺伝子の同種内での形質転換への効果的な使用さ
れるのと同様に、それは他の真菌の形質転換にも効果的
に使用することが可能であった［Osmani & Oakley (199
1) Cell Cycle and TubulinMutations in Filamentous
Fungi, J.W. Bennett & L.L. Lasure(編) "More Gene M
anipulations in Fungi", pp.107-122, Academic Pres
s, San Diego］。対照株と異なり、形質転換された真菌
は、それらのベノミールに対する抵抗性によって認識で
きる。
ブリン遺伝子の同種内での形質転換への効果的な使用さ
れるのと同様に、それは他の真菌の形質転換にも効果的
に使用することが可能であった［Osmani & Oakley (199
1) Cell Cycle and TubulinMutations in Filamentous
Fungi, J.W. Bennett & L.L. Lasure(編) "More Gene M
anipulations in Fungi", pp.107-122, Academic Pres
s, San Diego］。対照株と異なり、形質転換された真菌
は、それらのベノミールに対する抵抗性によって認識で
きる。
【０００５】A. chrysogenumについてはこれまで、一つ
の同種形質転換系が報告されているのみである。この系
を用い、ナイトレートリダクターゼをコードする遺伝子
niaDが挿入される。しかしながら、形質転換が効果的に
実施できるためには、レシピエント株がniaD変異体でな
ければならない。
の同種形質転換系が報告されているのみである。この系
を用い、ナイトレートリダクターゼをコードする遺伝子
niaDが挿入される。しかしながら、形質転換が効果的に
実施できるためには、レシピエント株がniaD変異体でな
ければならない。
【０００６】したがって、所期の目的は、レシピエント
株に限定されないA. chrysogenumの形質転換系を見出す
ことであった。
株に限定されないA. chrysogenumの形質転換系を見出す
ことであった。
【０００７】驚くべきことに、A. chrysogenumからのβ
−チューブリン遺伝子は、それらがその野生型株であれ
変異体であれ、所望のA. chrysogenum株のいずれを形質
転換するのにも適していることが見出されたのである。
−チューブリン遺伝子は、それらがその野生型株であれ
変異体であれ、所望のA. chrysogenum株のいずれを形質
転換するのにも適していることが見出されたのである。
【０００８】本発明の主題の一つは、したがって、A. c
hrysogenumからの、とくに第２表ＡおよびＢによるアミ
ノ酸配列を有するβ−チューブリンである。
hrysogenumからの、とくに第２表ＡおよびＢによるアミ
ノ酸配列を有するβ−チューブリンである。
【０００９】本発明の他の主題はβ−チューブリンをコ
ードするＤＮＡ、またはその部分、とくに第２表Ａおよ
びＢによるＤＮＡ配列、とりわけβ−チューブリンの蛋
白質のコード部分をコードするＤＮＡをもつＤＮＡであ
る。
ードするＤＮＡ、またはその部分、とくに第２表Ａおよ
びＢによるＤＮＡ配列、とりわけβ−チューブリンの蛋
白質のコード部分をコードするＤＮＡをもつＤＮＡであ
る。
【００１０】本発明の他の主題は、第２表ＡおよびＢに
よるＤＮＡ配列の蛋白質コード領域またはその部分に、
緊縮条件下において、とくに６×ＳＳＣ緩衝液（ＮaＣl
−クエン酸塩緩衝液）中６８℃で、ハイブリダイズする
ＤＮＡである。とくに、本発明の主題は、第２表Ａによ
るアミノ酸配列の位置167にチロシンをコードし、した
がって人工的変異体に該当するＤＮＡである。この人工
的変異体は、A. chrysogenumを形質転換する場合にとく
に有利であることが証明された。
よるＤＮＡ配列の蛋白質コード領域またはその部分に、
緊縮条件下において、とくに６×ＳＳＣ緩衝液（ＮaＣl
−クエン酸塩緩衝液）中６８℃で、ハイブリダイズする
ＤＮＡである。とくに、本発明の主題は、第２表Ａによ
るアミノ酸配列の位置167にチロシンをコードし、した
がって人工的変異体に該当するＤＮＡである。この人工
的変異体は、A. chrysogenumを形質転換する場合にとく
に有利であることが証明された。
【００１１】さらに、β−チューブリンをコードするＤ
ＮＡ、またはその部分を含有するベクターおよび宿主細
胞が本発明の主題である。ベクターpＡＵＬ1も包含され
る。このベクターは、発現した場合にセファロスポリン
の生成を低下させることができるβ−ラクタマーゼ遺伝
子を含有しないので、セファロスポリンの生合成にとく
に有利である。
ＮＡ、またはその部分を含有するベクターおよび宿主細
胞が本発明の主題である。ベクターpＡＵＬ1も包含され
る。このベクターは、発現した場合にセファロスポリン
の生成を低下させることができるβ−ラクタマーゼ遺伝
子を含有しないので、セファロスポリンの生合成にとく
に有利である。
【００１２】β−チューブリンの製造方法およびA. chr
ysogenumを形質転換する方法も、本発明のさらに他の主
題である。
ysogenumを形質転換する方法も、本発明のさらに他の主
題である。
【００１３】β−チューブリンを製造するための組換え
ＤＮＡ法は、本技術分野の熟練者には一般的に知られて
いる方法によって行われる。発現ベクターとしては、任
意の既知のベクターが適当であり、宿主細胞としては、
真菌を含む任意の原核生物および真核生物宿主細胞たと
えば大腸菌、ＣＨＯ−もしくはＢＨＫ−細胞、または酵
母が、適当である。
ＤＮＡ法は、本技術分野の熟練者には一般的に知られて
いる方法によって行われる。発現ベクターとしては、任
意の既知のベクターが適当であり、宿主細胞としては、
真菌を含む任意の原核生物および真核生物宿主細胞たと
えば大腸菌、ＣＨＯ−もしくはＢＨＫ−細胞、または酵
母が、適当である。
【００１４】A. chrysogenumの形質転換に際しては、本
技術分野の熟練者には一般的に知られている方法によ
り、最初に、A. chrysognumからプロトプラストを調製
し、これらのプロトプラストをついでβ−チューブリン
をコードするＤＮＡ、またはこのＤＮＡのためのベクタ
ーと接触させ、ついで適当な培地中で再生させることが
好ましい。この場合、驚くべきことに、１１〜５０重量
％、とくに１１〜３０重量％、とりわけ１５〜２５重量
％のスクロース濃度を有する培地を使用することによっ
て、プロトプラストの再生率を有意に上昇させることが
可能であることが見出された。
技術分野の熟練者には一般的に知られている方法によ
り、最初に、A. chrysognumからプロトプラストを調製
し、これらのプロトプラストをついでβ−チューブリン
をコードするＤＮＡ、またはこのＤＮＡのためのベクタ
ーと接触させ、ついで適当な培地中で再生させることが
好ましい。この場合、驚くべきことに、１１〜５０重量
％、とくに１１〜３０重量％、とりわけ１５〜２５重量
％のスクロース濃度を有する培地を使用することによっ
て、プロトプラストの再生率を有意に上昇させることが
可能であることが見出された。
【００１５】本発明による形質転換方法はまた、任意の
所望の異種遺伝子を含有する他のベクターと同時形質転
換する場合にとくに有利に使用できる。この理由から、
A. chrysogenumは、任意の所望の異種蛋白質、たとえば
セファロスポリンの生合成に使用されるグルタリルアシ
ラーゼの製造のための宿主細胞として、とくに有利に使
用できる。本発明によるA. chrysogenumの同種形質転換
系は、様々な国で組換えＤＮＡ作業に課せられた制限に
関連した生物学的安全性の予防策としての役目も果たす
ものである。
所望の異種遺伝子を含有する他のベクターと同時形質転
換する場合にとくに有利に使用できる。この理由から、
A. chrysogenumは、任意の所望の異種蛋白質、たとえば
セファロスポリンの生合成に使用されるグルタリルアシ
ラーゼの製造のための宿主細胞として、とくに有利に使
用できる。本発明によるA. chrysogenumの同種形質転換
系は、様々な国で組換えＤＮＡ作業に課せられた制限に
関連した生物学的安全性の予防策としての役目も果たす
ものである。
【００１６】本発明を以下に、図面および実施例を用い
てさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定する
ものではない。実施例によって説明される実験工程は次
の通である。 １） A. chrysogenumからのβ−チューブリン遺伝子の
単離 ２） β−チューブリン遺伝子のＤＮＡ配列の決定 ３） β−チューブリン遺伝子のインビトロ変異誘発 ４） 変異β−チューブリン遺伝子によるA. chrysogen
umの形質転換 ５） β−ラクタマーゼ遺伝子を含まない形質転換ベク
ター、ｐＡＵＬ１の構築 ６） 突然変異β−チューブリン遺伝子を用いるA. chr
ysogenumの同時形質転換
てさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定する
ものではない。実施例によって説明される実験工程は次
の通である。 １） A. chrysogenumからのβ−チューブリン遺伝子の
単離 ２） β−チューブリン遺伝子のＤＮＡ配列の決定 ３） β−チューブリン遺伝子のインビトロ変異誘発 ４） 変異β−チューブリン遺伝子によるA. chrysogen
umの形質転換 ５） β−ラクタマーゼ遺伝子を含まない形質転換ベク
ター、ｐＡＵＬ１の構築 ６） 突然変異β−チューブリン遺伝子を用いるA. chr
ysogenumの同時形質転換
【００１７】表および図面について以下に説明する。 第１表：ＤＮＡ配列決定およびインビトロ変異誘発に用
いられるオリゴヌクレオチドの配列。インビトロ変異誘
発にはオリゴヌクレオチドＮo.375、ＰＣＲ法によるＤ
ＮＡフラグメントの増幅にはオリゴヌクレオチドＮo.34
1、375および376が用いられた。その他のオリゴヌクレ
オチドはすべて、ＤＮＡ配列決定におけるスターター分
子として使用された。
いられるオリゴヌクレオチドの配列。インビトロ変異誘
発にはオリゴヌクレオチドＮo.375、ＰＣＲ法によるＤ
ＮＡフラグメントの増幅にはオリゴヌクレオチドＮo.34
1、375および376が用いられた。その他のオリゴヌクレ
オチドはすべて、ＤＮＡ配列決定におけるスターター分
子として使用された。
【００１８】第２表：Ａ部およびＢ部：β−チューブリ
ン遺伝子領域のＤＮＡ配列。エクソンの誘導されたアミ
ノ酸配列を表示する。真菌性真核生物に典型的なコンセ
ンサス配列にはイントロン中に下線を付した。
ン遺伝子領域のＤＮＡ配列。エクソンの誘導されたアミ
ノ酸配列を表示する。真菌性真核生物に典型的なコンセ
ンサス配列にはイントロン中に下線を付した。
【００１９】第３表：各種真菌遺伝子のイントロンコン
センサス配列の比較。 略号：ＩＶＳ１〜４,イントロン１〜４；N.c.，Neurosp
ora crassa；A.n., Aspergillus nidulans；S.c.，Sacc
haromyces cerevisiae；h.e.，高級真核生物
センサス配列の比較。 略号：ＩＶＳ１〜４,イントロン１〜４；N.c.，Neurosp
ora crassa；A.n., Aspergillus nidulans；S.c.，Sacc
haromyces cerevisiae；h.e.，高級真核生物
【００２０】第４表：各種真核生物のβ−チューブリン
配列の比較。相同性値（％）は、A.chrysogenum配列に
関するものである。使用した配列に対する引用文献： １） 本研究 ２） Orbach M.J.ら(1986) ３） May G.S.ら(1987) ４） Neff N.F.ら(1983) Cell 33:211-219 ５） Youngblom J.ら(1984) Mol. Cell. Biol. 4：268
6-2696 ６） Silflow C.D.ら(1987) Devel. Genet. 8：435-46
0 ７） Valenzuela P.ら(1981) Nature 289：650-655
配列の比較。相同性値（％）は、A.chrysogenum配列に
関するものである。使用した配列に対する引用文献： １） 本研究 ２） Orbach M.J.ら(1986) ３） May G.S.ら(1987) ４） Neff N.F.ら(1983) Cell 33:211-219 ５） Youngblom J.ら(1984) Mol. Cell. Biol. 4：268
6-2696 ６） Silflow C.D.ら(1987) Devel. Genet. 8：435-46
0 ７） Valenzuela P.ら(1981) Nature 289：650-655
【００２１】第５表：インビトロ変異誘発に用いられた
オリゴヌクレオチド375の配列、およびそれから誘導さ
れたアミノ酸配列。比較のために野生型配列を示す。
オリゴヌクレオチド375の配列、およびそれから誘導さ
れたアミノ酸配列。比較のために野生型配列を示す。
【００２２】図１：A. chrysogenumのβ−チューブリン
遺伝子（斜線部）を有する組換え体クロ−ンＬ−Ｔ６の
制限酵素地図。矢印はβ−チューブリン遺伝子の転写の
方向を示す。配列決定部分は拡大して表示し、エクソン
（黒）およびイントロン（白）領域を指示する。矢印は
決定された部分配列を表示し、配列決定の戦略を提供す
る。 略号：Ｂ，ＢamＨＩ；Ｂa，ＢalＩ；Ｅ，ＥcoＲＩ；
Ｈ，Ｈinf III；Ｋ，ＫpnＩ;Ｍ，ＭluＩ；Ｍs，Ｍst
Ｉ；Ｎ，ＮcoＩ；Ｐ，Ｐvu II；Ｓ，ＳalＩ；Ｓn，Ｓna
Ｉ;Ｓp，ＳphＩ；Ｓt，ＳtuＩ；Ｘ，ＸbaＩ；Ｘm，Ｘma
III
遺伝子（斜線部）を有する組換え体クロ−ンＬ−Ｔ６の
制限酵素地図。矢印はβ−チューブリン遺伝子の転写の
方向を示す。配列決定部分は拡大して表示し、エクソン
（黒）およびイントロン（白）領域を指示する。矢印は
決定された部分配列を表示し、配列決定の戦略を提供す
る。 略号：Ｂ，ＢamＨＩ；Ｂa，ＢalＩ；Ｅ，ＥcoＲＩ；
Ｈ，Ｈinf III；Ｋ，ＫpnＩ;Ｍ，ＭluＩ；Ｍs，Ｍst
Ｉ；Ｎ，ＮcoＩ；Ｐ，Ｐvu II；Ｓ，ＳalＩ；Ｓn，Ｓna
Ｉ;Ｓp，ＳphＩ；Ｓt，ＳtuＩ；Ｘ，ＸbaＩ；Ｘm，Ｘma
III
【００２３】図２：Acremonium chrysogenumの形質転換
に適当なベクターｐＣＮ３の制限酵素地図。ＴのＡへの
ヌクレオチド置換（Ｔ→Ａ）により、野生型β−チュー
ブリン遺伝子（斜線部）のアミノ酸ヌクレオチドをイン
ビトロ突然変異に付した。β−ラクタマーゼの細菌遺伝
子（AmpR）およびβ−ガラクトシダーゼの遺伝子（Lac
Z）もプラスミド上に含有される。さらに、β−チュー
ブリン遺伝子内の以下のエンドヌクレアーゼの代表的制
限切断部位も指示した。 ＢalＩ，Ｂa；ＥcoＲＩ，Ｅ；ＰvuＩ；ＳacＩ；Ｓph
Ｉ，Ｓp；ＸbaＩ，Ｘ Acremonium chrysogenumから誘導されるプラスミドの部
分は酵素ＥcoＲＩおよびＸbaＩの切断部位の間に配置さ
れ、二重線で指示された。
に適当なベクターｐＣＮ３の制限酵素地図。ＴのＡへの
ヌクレオチド置換（Ｔ→Ａ）により、野生型β−チュー
ブリン遺伝子（斜線部）のアミノ酸ヌクレオチドをイン
ビトロ突然変異に付した。β−ラクタマーゼの細菌遺伝
子（AmpR）およびβ−ガラクトシダーゼの遺伝子（Lac
Z）もプラスミド上に含有される。さらに、β−チュー
ブリン遺伝子内の以下のエンドヌクレアーゼの代表的制
限切断部位も指示した。 ＢalＩ，Ｂa；ＥcoＲＩ，Ｅ；ＰvuＩ；ＳacＩ；Ｓph
Ｉ，Ｓp；ＸbaＩ，Ｘ Acremonium chrysogenumから誘導されるプラスミドの部
分は酵素ＥcoＲＩおよびＸbaＩの切断部位の間に配置さ
れ、二重線で指示された。
【００２４】図３：ＰＣＲ−増幅β−チューブリン遺伝
子フラグメントを直接的に配列決定したＤＮＡ配列決定
実験における代表的なオートラジオグラム。形質転換体
（Ｔ）の配列を、レシピエント株（ＷＴ）の場合と比較
して示した。２つの配列は、β−チューブリン遺伝子の
コドン167におけるＴのＡへの置換により識別できる。
子フラグメントを直接的に配列決定したＤＮＡ配列決定
実験における代表的なオートラジオグラム。形質転換体
（Ｔ）の配列を、レシピエント株（ＷＴ）の場合と比較
して示した。２つの配列は、β−チューブリン遺伝子の
コドン167におけるＴのＡへの置換により識別できる。
【００２５】図４：様々な真菌のβ−チューブリン遺伝
子の遺伝子構成の比較。
子の遺伝子構成の比較。
【００２６】図５：ベクターｐＡＵＬ１の構築。このベ
クター分子の構築には２つの出発プラスミドを使用し
た。細菌プラスミドｐＡＣＹＣ184のクロラムフェニコ
ール抵抗性遺伝子を細菌中での選択を可能にするために
用いた。最後に、ｐｃｂＣ遺伝子のプロモーターと融合
するハイグロマイシン遺伝子をベクターｐＭＷ１から誘
導する。 略号：ori、細菌性複製の起源；Ａ，Ａta II；Ｂ，Ｂam
ＨＩ；Ｅ，ＥcoＲＩ；Ｈc，Ｈinc II；Ｈd，Ｈind II
I；Ｎ，ＮcoＩ；Ｓ，Ｓa II
クター分子の構築には２つの出発プラスミドを使用し
た。細菌プラスミドｐＡＣＹＣ184のクロラムフェニコ
ール抵抗性遺伝子を細菌中での選択を可能にするために
用いた。最後に、ｐｃｂＣ遺伝子のプロモーターと融合
するハイグロマイシン遺伝子をベクターｐＭＷ１から誘
導する。 略号：ori、細菌性複製の起源；Ａ，Ａta II；Ｂ，Ｂam
ＨＩ；Ｅ，ＥcoＲＩ；Ｈc，Ｈinc II；Ｈd，Ｈind II
I；Ｎ，ＮcoＩ；Ｓ，Ｓa II
【００２７】優先権の根拠となるドイツ出願、Ｐ 43 04
312.7号の内容はまた、本出願の開示内容の部分とみな
されるべきである。
312.7号の内容はまた、本出願の開示内容の部分とみな
されるべきである。
【００２８】実施例 １．A. chrysogenumのβ−チューブリン遺伝子の単離 Acremonium chrysogenumゲノムＤＮＡからのラムダ遺伝
子バンクの構築：Kueckら(1989)によってAppl. Microbi
ol. Biotechnol. 31：358-365に記載されたA. chrysoge
numＨ780株遺伝子バンクをβ−チューブリン遺伝子の単
離に使用した。遺伝子バンクの製造は、特許出願 DE 39
12822 A1に詳細に記載されている。ラムダクローンか
ら、Frischaufら(1983) J. Mol. Biol. 170：827-842の
方法を改良してＤＮＡを単離した。プラスミドは大腸菌
からアルカリ溶解、ついでBirnboim & Doly(1979) Nuc
l. Acids Res. 7：1513-1522の方法によるＣsＣl−エチ
ジウムブロミド密度勾配遠心分離によって、単離した。
子バンクの構築：Kueckら(1989)によってAppl. Microbi
ol. Biotechnol. 31：358-365に記載されたA. chrysoge
numＨ780株遺伝子バンクをβ−チューブリン遺伝子の単
離に使用した。遺伝子バンクの製造は、特許出願 DE 39
12822 A1に詳細に記載されている。ラムダクローンか
ら、Frischaufら(1983) J. Mol. Biol. 170：827-842の
方法を改良してＤＮＡを単離した。プラスミドは大腸菌
からアルカリ溶解、ついでBirnboim & Doly(1979) Nuc
l. Acids Res. 7：1513-1522の方法によるＣsＣl−エチ
ジウムブロミド密度勾配遠心分離によって、単離した。
【００２９】β−チューブリン遺伝子を含有する組換え
体ラムダファージの同定のためのハイブリダイゼーショ
ン実験：β−チューブリン遺伝子を繋留するそれらの組
換え体ラムダファージの同定のためのハイブリダイゼー
ションプローブとしては、組換え体プラスミドｐβ５を
用いた。このプラスミドは、Aspergillus nidulansのβ
−チューブリン遺伝子を有する。５×１０3の組換え体
ファージを調べて、プラスミドｐβ５と明らかな相同性
をもつ２つの独立した構造的に異なるラムダクローンが
得られた。この２つのラムダクローンは、Ｌ−Ｔ６およ
びＬ−Ｃ５と命名された。
体ラムダファージの同定のためのハイブリダイゼーショ
ン実験：β−チューブリン遺伝子を繋留するそれらの組
換え体ラムダファージの同定のためのハイブリダイゼー
ションプローブとしては、組換え体プラスミドｐβ５を
用いた。このプラスミドは、Aspergillus nidulansのβ
−チューブリン遺伝子を有する。５×１０3の組換え体
ファージを調べて、プラスミドｐβ５と明らかな相同性
をもつ２つの独立した構造的に異なるラムダクローンが
得られた。この２つのラムダクローンは、Ｌ−Ｔ６およ
びＬ−Ｃ５と命名された。
【００３０】以下に述べる以後の検討は、クローンＬ−
Ｔ６を用いて行われた。その制限酵素地図を図１に再現
する。様々な制限酵素を使用して、酵素ＸbaＩ、ＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩについて方向性のある制限酵素地図を
構築することが可能であった（図１）。ハイブリダイゼ
ーションの結果は、β−チューブリン遺伝子はこのクロ
ーンＬ−Ｔ６の４.７kb−サイズのＥcoＲＩ-ＸbaＩフラ
グメント上に配置されていることを示した。この４.７k
b制限フラグメントをついで、ＥcoＲＩ−ＸbaＩ−制限
ベクター、pBluescript II KS＋（Stratagene, Heidelb
erg）にクローン化した。相当する組換え体プラスミド
は、7.7kbのサイズを有し、ｐＣＮ１と命名されている
（同じく図１参照）。
Ｔ６を用いて行われた。その制限酵素地図を図１に再現
する。様々な制限酵素を使用して、酵素ＸbaＩ、ＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩについて方向性のある制限酵素地図を
構築することが可能であった（図１）。ハイブリダイゼ
ーションの結果は、β−チューブリン遺伝子はこのクロ
ーンＬ−Ｔ６の４.７kb−サイズのＥcoＲＩ-ＸbaＩフラ
グメント上に配置されていることを示した。この４.７k
b制限フラグメントをついで、ＥcoＲＩ−ＸbaＩ−制限
ベクター、pBluescript II KS＋（Stratagene, Heidelb
erg）にクローン化した。相当する組換え体プラスミド
は、7.7kbのサイズを有し、ｐＣＮ１と命名されている
（同じく図１参照）。
【００３１】方法：サザンブロットおよびＤＮＡ/ＤＮ
Ａハイブリダイゼーション。変性および中和後、アガロ
ースゲル中で電気泳動によって分離されたＤＮＡをニト
ロセルロースフィルターもしくは Hybond N ナイロン膜
に移した［Southern(1975) J. Mol. Biol. 98：503-51
7］。
Ａハイブリダイゼーション。変性および中和後、アガロ
ースゲル中で電気泳動によって分離されたＤＮＡをニト
ロセルロースフィルターもしくは Hybond N ナイロン膜
に移した［Southern(1975) J. Mol. Biol. 98：503-51
7］。
【００３２】コロニーフィルターハイブリダイゼーショ
ンは Grundstein & Hogness (1975)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 72：3961-3965の方法によって実施した。つい
でＤＮＡを、Stratalinker（Stratagene）中でＵＶ照射
により膜に固定した。フィルターを、５×ＳＳＰＥ、
０.２％ＳＤＳ、１００μg／mlのニシン精子ＤＮＡおよ
び５０％ホルムアミド中３７℃で１〜２時間プレハイブ
リダイズしたのち、Feinberg & Vogelstein (1983) Ana
l. Biochem. 132：6-13の方法により（α-32Ｐ）ＡＴＰ
でのオリゴ標識で放射能標識したＤＮＡプローブを、プ
レハイブリダイズした緩衝液に添加して、ハイブリダイ
ゼーションを行った。３７℃で１６時間インキュベート
したのち、非特異的に結合したＤＮＡは、５×ＳＳＰ
Ｅ、０.２％ＳＤＳ中でフィルターを洗浄して除去し
た。次に、フィルターを、−２０℃で５時間〜７日間、
Fuji RX X-線フィルムおよびKodak X-Omatic Regular増
感スクリーンを用いて露出した。
ンは Grundstein & Hogness (1975)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 72：3961-3965の方法によって実施した。つい
でＤＮＡを、Stratalinker（Stratagene）中でＵＶ照射
により膜に固定した。フィルターを、５×ＳＳＰＥ、
０.２％ＳＤＳ、１００μg／mlのニシン精子ＤＮＡおよ
び５０％ホルムアミド中３７℃で１〜２時間プレハイブ
リダイズしたのち、Feinberg & Vogelstein (1983) Ana
l. Biochem. 132：6-13の方法により（α-32Ｐ）ＡＴＰ
でのオリゴ標識で放射能標識したＤＮＡプローブを、プ
レハイブリダイズした緩衝液に添加して、ハイブリダイ
ゼーションを行った。３７℃で１６時間インキュベート
したのち、非特異的に結合したＤＮＡは、５×ＳＳＰ
Ｅ、０.２％ＳＤＳ中でフィルターを洗浄して除去し
た。次に、フィルターを、−２０℃で５時間〜７日間、
Fuji RX X-線フィルムおよびKodak X-Omatic Regular増
感スクリーンを用いて露出した。
【００３３】方法：プラスミドｐＣＮ１の大腸菌クロ−
ニングおよび構築。クローンＬ−Ｔ６の４.７kb ＥcoＲ
Ｉ−ＸbaＩフラグメントは、１％濃度のアガロースゲル
から、プレパラティブ溶出［Silhavyら(1984) Experime
nts with gene fusions. Cold Spring Harbour Laborat
ory Press, New York pp.164-165］によって得た。５μ
gのＬ−Ｔ６フラグメントＤＮＡおよび１μgのＸbaＩ−
ＥcoＲＩ消化 pBluescript II KS＋（Stratagene, Heid
elberg）ＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Boehringer,
Mannheim）５酵素単位の存在下で４０μl容量の１×リ
ゲーション緩衝液中で、１４℃において一夜リゲートし
た。ついで、リゲーション混合物の1／20容量を大腸菌
ＸＬ１ blue株［Bullockら(1987) Biotechniques 5：37
6-379］への形質転換に使用した。コンピテント細胞の
調製およびエレクトロポレーションはBioradエレクトロ
ポレーション装置（Gene Pulser TM, キャパシタンス増
強装置、パルスコントローラー）を用い製造業者の説明
書に従って行った。
ニングおよび構築。クローンＬ−Ｔ６の４.７kb ＥcoＲ
Ｉ−ＸbaＩフラグメントは、１％濃度のアガロースゲル
から、プレパラティブ溶出［Silhavyら(1984) Experime
nts with gene fusions. Cold Spring Harbour Laborat
ory Press, New York pp.164-165］によって得た。５μ
gのＬ−Ｔ６フラグメントＤＮＡおよび１μgのＸbaＩ−
ＥcoＲＩ消化 pBluescript II KS＋（Stratagene, Heid
elberg）ＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Boehringer,
Mannheim）５酵素単位の存在下で４０μl容量の１×リ
ゲーション緩衝液中で、１４℃において一夜リゲートし
た。ついで、リゲーション混合物の1／20容量を大腸菌
ＸＬ１ blue株［Bullockら(1987) Biotechniques 5：37
6-379］への形質転換に使用した。コンピテント細胞の
調製およびエレクトロポレーションはBioradエレクトロ
ポレーション装置（Gene Pulser TM, キャパシタンス増
強装置、パルスコントローラー）を用い製造業者の説明
書に従って行った。
【００３４】大腸菌ＸＬ１ blue株（Bullockら、1987）
は５μg／mlのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地
（１％Bacto−Tryptone、０.５％酵母エキス、０.５％
ＮaＣl、pＨ７.２）中、培養液を２７０rpmで振盪しな
がら３７℃で増殖させる。選択培地にはさらに、８０μ
g／mlのアンピシリンを含有させる。
は５μg／mlのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地
（１％Bacto−Tryptone、０.５％酵母エキス、０.５％
ＮaＣl、pＨ７.２）中、培養液を２７０rpmで振盪しな
がら３７℃で増殖させる。選択培地にはさらに、８０μ
g／mlのアンピシリンを含有させる。
【００３５】２．A. chrysogenumからのβ−チューブリ
ン遺伝子のＤＮＡ配列決定 β−チューブリン遺伝子の同一性を正確に決定するた
め、A. chrysogenumからのβ−チューブリン遺伝子の全
配列決定を実施した。二重鎖ＤＮＡは、個々に合成され
たプライマー（＝オリゴヌクレオチド）をもっぱら用い
て配列決定を行った。出発配列はいわゆるＭ13配列決定
プライマーを用いて決定された。これらのオリゴヌクレ
オチドはクローニングベクターのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子と相同性を有する。このＤＮＡ配列決定の相当す
る戦略およびそれから得られた詳細な制限酵素地図は第
１表（下記）から明らかである。配列決定の結果（2206
bp）は第２表のＡ部およびＢ部に示す。一本鎖の配列
は、それから誘導される相当するアミノ酸配列への翻訳
である配列を与える。A. chrysogenumの中では、他の叢
生菌真菌の場合と同様に、アミノ酸コード配列（エクソ
ン）は数個のイントロンで中断されていることが明らか
である。この分析から、A. chrysogenumのβ−チューブ
リン遺伝子は447アミノ酸をコードしていると結論でき
る。イントロン配列に関する限りは、いわゆる典型的な
コンセンサス配列がすべてのイントロンの５′および
３′末端に確認できることは注目すべきことである（第
３表）。
ン遺伝子のＤＮＡ配列決定 β−チューブリン遺伝子の同一性を正確に決定するた
め、A. chrysogenumからのβ−チューブリン遺伝子の全
配列決定を実施した。二重鎖ＤＮＡは、個々に合成され
たプライマー（＝オリゴヌクレオチド）をもっぱら用い
て配列決定を行った。出発配列はいわゆるＭ13配列決定
プライマーを用いて決定された。これらのオリゴヌクレ
オチドはクローニングベクターのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子と相同性を有する。このＤＮＡ配列決定の相当す
る戦略およびそれから得られた詳細な制限酵素地図は第
１表（下記）から明らかである。配列決定の結果（2206
bp）は第２表のＡ部およびＢ部に示す。一本鎖の配列
は、それから誘導される相当するアミノ酸配列への翻訳
である配列を与える。A. chrysogenumの中では、他の叢
生菌真菌の場合と同様に、アミノ酸コード配列（エクソ
ン）は数個のイントロンで中断されていることが明らか
である。この分析から、A. chrysogenumのβ−チューブ
リン遺伝子は447アミノ酸をコードしていると結論でき
る。イントロン配列に関する限りは、いわゆる典型的な
コンセンサス配列がすべてのイントロンの５′および
３′末端に確認できることは注目すべきことである（第
３表）。
【００３６】遺伝子の同一性は異なる生物体からのβ−
チューブリン遺伝子のアミノ酸配列との比較結果からも
明らかにされた。６種の異なる配列を持つA. chrysogen
umのアミノ酸配列の比較を第４表に示す。配列の類似性
から本発明者らはA. chrysogenumのβ−チューブリン遺
伝子を単離したことが明瞭であると結論できる。
チューブリン遺伝子のアミノ酸配列との比較結果からも
明らかにされた。６種の異なる配列を持つA. chrysogen
umのアミノ酸配列の比較を第４表に示す。配列の類似性
から本発明者らはA. chrysogenumのβ−チューブリン遺
伝子を単離したことが明瞭であると結論できる。
【００３７】最後に、本発明者らは、β−チューブリン
遺伝子のイントロンを他の真菌からのイントロンの、い
わゆるコンセンサス配列と比較した（第３表）。これに
よれば、他の真核生物にも同様に見出される典型的なコ
ンセンサス配列がアクレモニウム属のイントロンの５′
末端に検出できる。４つのA. chrysogenumイントロンの
β−チューブリン遺伝子中における分布も興味がある
（図４）。他の真菌と比べると、これらイントロンの位
置は極めて保存性で、イントロンはたとえば Neurospor
a crassa（N.c.）またはAspergillus nidulans（A.n.）
でも、同様に、同一の位置に見出される。類似のイント
ロンの分布はまた、分裂酵母Schizosaccharomyces pomb
e（S.p.）にも認められる。β−チューブリン遺伝子中
にイントロンがないのは、パン酵母Saccharomyces cere
visiae（S.c.）のみである。
遺伝子のイントロンを他の真菌からのイントロンの、い
わゆるコンセンサス配列と比較した（第３表）。これに
よれば、他の真核生物にも同様に見出される典型的なコ
ンセンサス配列がアクレモニウム属のイントロンの５′
末端に検出できる。４つのA. chrysogenumイントロンの
β−チューブリン遺伝子中における分布も興味がある
（図４）。他の真菌と比べると、これらイントロンの位
置は極めて保存性で、イントロンはたとえば Neurospor
a crassa（N.c.）またはAspergillus nidulans（A.n.）
でも、同様に、同一の位置に見出される。類似のイント
ロンの分布はまた、分裂酵母Schizosaccharomyces pomb
e（S.p.）にも認められる。β−チューブリン遺伝子中
にイントロンがないのは、パン酵母Saccharomyces cere
visiae（S.c.）のみである。
【００３８】方法：ＤＮＡの配列決定 配列決定実験はＴ７−ポリメラーゼTM配列決定キットま
たはDeaza Ｇ／ＡシーケンシングTMミックス（Pharmaci
a, Freiburg）を用いて実施された。サンプルの電気泳
動による分離は、Bigginら(1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80：3963-3965の方法に従い、６％アクリルア
ミド−尿素イオン勾配ゲルを用いて行われた。
たはDeaza Ｇ／ＡシーケンシングTMミックス（Pharmaci
a, Freiburg）を用いて実施された。サンプルの電気泳
動による分離は、Bigginら(1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80：3963-3965の方法に従い、６％アクリルア
ミド−尿素イオン勾配ゲルを用いて行われた。
【００３９】 ３．β−チューブリン遺伝子のインビトロ突然変異 野生型配列中の１つのヌクレオチドを、１つのオリゴヌ
クレオチド中に塩基置換を含有しついでＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）による野生型配列の増幅に使用された
オリゴヌクレオチド対を構築することにより交換した。
得られたフラグメントを次に制限酵素処理ついでリゲー
ションにより、野生型遺伝子中にクローン化した。
クレオチド中に塩基置換を含有しついでＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）による野生型配列の増幅に使用された
オリゴヌクレオチド対を構築することにより交換した。
得られたフラグメントを次に制限酵素処理ついでリゲー
ションにより、野生型遺伝子中にクローン化した。
【００４０】以下の３つの制限フラグメントのその後の
リゲーションにより、完全な、インビトロ突然変異β−
チューブリン遺伝子を得ることができた。得られたプラ
スミドは「ｐＣＮ３」と命名されている。 a) 塩基置換を含みＰＣＲ増幅によって発生させた１５
５bp ＢalＩ−ＳphＩフラグメント。β−チューブリン
遺伝子の１５５bpフラグメントはオリゴヌクレオチド対
３７５×３７６を用いて増幅された。アミノ酸167のコ
ドンはこのフラグメント中に存在する。野生型配列と比
較した場合の塩基置換は、オリゴヌクレオチド375の合
成時に挿入された。この置換の結果、コドン167は増幅
過程で突然変異を起こす（第５表）。１５５bpフラグメ
ントは、そのそれぞれの末端に、ついでインビトロ組換
えを可能にするＢalＩおよびＳphＩ制限部位を含有す
る。 b) 野生型β−チューブリン遺伝子の３′末端および大
腸菌ベクターpBluescript II KS＋（Stratagene, Heide
lberg）の全原核生物配列を含む５.０kb ＳphＩ−Ｂal
Ｉ制限フラグメント。 c) 野生型β−チューブリン遺伝子の５′領域を含有す
る２.０kb ＢalＩ制限フラグメント。
リゲーションにより、完全な、インビトロ突然変異β−
チューブリン遺伝子を得ることができた。得られたプラ
スミドは「ｐＣＮ３」と命名されている。 a) 塩基置換を含みＰＣＲ増幅によって発生させた１５
５bp ＢalＩ−ＳphＩフラグメント。β−チューブリン
遺伝子の１５５bpフラグメントはオリゴヌクレオチド対
３７５×３７６を用いて増幅された。アミノ酸167のコ
ドンはこのフラグメント中に存在する。野生型配列と比
較した場合の塩基置換は、オリゴヌクレオチド375の合
成時に挿入された。この置換の結果、コドン167は増幅
過程で突然変異を起こす（第５表）。１５５bpフラグメ
ントは、そのそれぞれの末端に、ついでインビトロ組換
えを可能にするＢalＩおよびＳphＩ制限部位を含有す
る。 b) 野生型β−チューブリン遺伝子の３′末端および大
腸菌ベクターpBluescript II KS＋（Stratagene, Heide
lberg）の全原核生物配列を含む５.０kb ＳphＩ−Ｂal
Ｉ制限フラグメント。 c) 野生型β−チューブリン遺伝子の５′領域を含有す
る２.０kb ＢalＩ制限フラグメント。
【００４１】組換え体プラスミドｐＣＮ３はインビトロ
組換えで発生させた。このプラスミドは、７.１６kbの
サイズを有し、ベクターpBluescript KS II＋のＥcoＲ
Ｉ−ＸbaＩ制限切断部位に突然変異β−チューブリン遺
伝子（４.２kb ＥcoＲＩ−ＸbaＩフラグメント上）が挿
入されている。
組換えで発生させた。このプラスミドは、７.１６kbの
サイズを有し、ベクターpBluescript KS II＋のＥcoＲ
Ｉ−ＸbaＩ制限切断部位に突然変異β−チューブリン遺
伝子（４.２kb ＥcoＲＩ−ＸbaＩフラグメント上）が挿
入されている。
【００４２】プラスミドｐＣＮ３の制限酵素地図は図２
に再現する。制限エンドヌクレアーゼの代表的な切断部
位はその旨指示した。
に再現する。制限エンドヌクレアーゼの代表的な切断部
位はその旨指示した。
【００４３】インビトロ組換えの過程で配列に変化が起
こらなかったことをチェックするために、突然変異β−
チューブリン遺伝子を完全に配列決定した。配列は、第
１表に掲げたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてチ
ェックした。配列は第２表のデータの通りである。
こらなかったことをチェックするために、突然変異β−
チューブリン遺伝子を完全に配列決定した。配列は、第
１表に掲げたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてチ
ェックした。配列は第２表のデータの通りである。
【００４４】方法：インビトロ変異誘発 ０.３μgのオリゴヌクレオチドＤＮＡ、１×Replitherm
緩衝液（Biozym, Hameln）、０.３３mM ｄＮＰＳおよび
２酵素単位のReplitherm（Biozym，Hameln）を、各場合
とも、１０ngのプラスミドＤＮＡに添加した。増幅は、
各場合とも１分９２℃、２分６０℃および０.５分７２
℃で、４０サイクル実施した［Saikiら(1985) Science
230：1350-1354の方法を改良］。
緩衝液（Biozym, Hameln）、０.３３mM ｄＮＰＳおよび
２酵素単位のReplitherm（Biozym，Hameln）を、各場合
とも、１０ngのプラスミドＤＮＡに添加した。増幅は、
各場合とも１分９２℃、２分６０℃および０.５分７２
℃で、４０サイクル実施した［Saikiら(1985) Science
230：1350-1354の方法を改良］。
【００４５】４．変異β−チューブリン遺伝子によるA.
chrysogenumの形質転換 A. chrysogenumＡ３／２株の形質転換に関連して、様々
の濃度のスクロースを含むＣＣＭ培地上で、プロトプラ
ストの再生率を測定した。これから、高濃度のスクロー
スを含有する培地を用いた場合、再生する能力が明らか
に増強することがわかった。２０％スクロースを用いる
場合には、再生率は１％を超える。すなわち再生する能
力は、以前用いられた１０.８％スクロース含有ＣＣＭ
Ｓ培地に比べて約１０倍大きいことになる。プロトプラ
ストが再生する能力は形質転換率に必須の前提条件であ
ることから、上記培地の開発はA. chrysogenumＡ３／２
株の効率的な形質転換を保証するものとなった。
chrysogenumの形質転換 A. chrysogenumＡ３／２株の形質転換に関連して、様々
の濃度のスクロースを含むＣＣＭ培地上で、プロトプラ
ストの再生率を測定した。これから、高濃度のスクロー
スを含有する培地を用いた場合、再生する能力が明らか
に増強することがわかった。２０％スクロースを用いる
場合には、再生率は１％を超える。すなわち再生する能
力は、以前用いられた１０.８％スクロース含有ＣＣＭ
Ｓ培地に比べて約１０倍大きいことになる。プロトプラ
ストが再生する能力は形質転換率に必須の前提条件であ
ることから、上記培地の開発はA. chrysogenumＡ３／２
株の効率的な形質転換を保証するものとなった。
【００４６】本発明者らは、精製された変異β−チュー
ブリン遺伝子および組換え体プラスミドｐＣＮ３で形質
転換された両アクレモニウム属形質転換体を使用した。
形質転換の過程では、プロトプラストは最初は非選択培
地上で平板培養し、プロトプラストを１日再生させたの
ち、ついでプレートを選択寒天培地（１５μgベノミー
ル／mlの重層培地）で覆う。一般に、推定される形質転
換体は５〜８日後に肉眼で認識できるようになる。次の
移植工程において、真菌コロニーは再度選択培地に移
し、ついで適当な再生後に分子分析に使用した。効率的
なＤＮＡ形質転換の実現は、生理的テスト（選択培地上
での増殖試験）および分子分析（サザンハイブリダイゼ
ーション）によって証明された。出発株に比べて、ベノ
ミール抵抗性形質転換体は明らかに異なる生育挙動を示
す。出発株に比べて、すべての形質転換体において、増
殖は明白に証明される。出発株は、培地中のベノミール
の濃度が３μgでも、きわめて低速度でしか増殖しな
い。
ブリン遺伝子および組換え体プラスミドｐＣＮ３で形質
転換された両アクレモニウム属形質転換体を使用した。
形質転換の過程では、プロトプラストは最初は非選択培
地上で平板培養し、プロトプラストを１日再生させたの
ち、ついでプレートを選択寒天培地（１５μgベノミー
ル／mlの重層培地）で覆う。一般に、推定される形質転
換体は５〜８日後に肉眼で認識できるようになる。次の
移植工程において、真菌コロニーは再度選択培地に移
し、ついで適当な再生後に分子分析に使用した。効率的
なＤＮＡ形質転換の実現は、生理的テスト（選択培地上
での増殖試験）および分子分析（サザンハイブリダイゼ
ーション）によって証明された。出発株に比べて、ベノ
ミール抵抗性形質転換体は明らかに異なる生育挙動を示
す。出発株に比べて、すべての形質転換体において、増
殖は明白に証明される。出発株は、培地中のベノミール
の濃度が３μgでも、きわめて低速度でしか増殖しな
い。
【００４７】さらに、形質転換体については配列分析に
よって分子的特性を調べた。この目的では、β−チュー
ブリン遺伝子のフラグメントをＰＣＲ増幅技術によって
合成した。このためには、Acremonium chrysogenum形質
転換体のＤＮＡを単離し、ついでオリゴヌクレオチドス
ターター分子Ｎo.341および376を用い（第１表）、ＰＣ
Ｒ増幅で増幅した。最後に、直接ＤＮＡ配列決定を、い
わゆる連鎖停止反応を用いて実施した。対照として、Ac
remonium chrysogenumのレシピエント株のＤＮＡを平行
して配列決定した。図３に代表的な結果を示す。コンポ
ーネント配列中において、形質転換体（Ｔ）β−チュー
ブリン遺伝子内の塩基置換をレシピエント株（ＷＴ）の
場合と比較して示す。
よって分子的特性を調べた。この目的では、β−チュー
ブリン遺伝子のフラグメントをＰＣＲ増幅技術によって
合成した。このためには、Acremonium chrysogenum形質
転換体のＤＮＡを単離し、ついでオリゴヌクレオチドス
ターター分子Ｎo.341および376を用い（第１表）、ＰＣ
Ｒ増幅で増幅した。最後に、直接ＤＮＡ配列決定を、い
わゆる連鎖停止反応を用いて実施した。対照として、Ac
remonium chrysogenumのレシピエント株のＤＮＡを平行
して配列決定した。図３に代表的な結果を示す。コンポ
ーネント配列中において、形質転換体（Ｔ）β−チュー
ブリン遺伝子内の塩基置換をレシピエント株（ＷＴ）の
場合と比較して示す。
【００４８】方法：ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントの直
接ＤＮＡ配列決定 真菌株（レシピエント株およびベノミール抵抗性形質転
換体）の総ＤＮＡを既述のようにして単離した。これに
続いてβ−チューブリン遺伝子のコンポーネントフラグ
メントを、オリゴヌクレオチドＮo.341および376を用い
て増幅した［Saikiら(1985) Science 230：1350-135
4］。ＤＮＡフラグメントをついでエタノールで沈殿さ
せ、緩衝溶液中に取ったのち、連鎖停止反応法［Sanger
ら(1977)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74：5463-546
7］による直接配列決定に使用した。配列決定反応生成
物を次に変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、つい
でオートラジオグラフィーに用いた。
接ＤＮＡ配列決定 真菌株（レシピエント株およびベノミール抵抗性形質転
換体）の総ＤＮＡを既述のようにして単離した。これに
続いてβ−チューブリン遺伝子のコンポーネントフラグ
メントを、オリゴヌクレオチドＮo.341および376を用い
て増幅した［Saikiら(1985) Science 230：1350-135
4］。ＤＮＡフラグメントをついでエタノールで沈殿さ
せ、緩衝溶液中に取ったのち、連鎖停止反応法［Sanger
ら(1977)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74：5463-546
7］による直接配列決定に使用した。配列決定反応生成
物を次に変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、つい
でオートラジオグラフィーに用いた。
【００４９】方法：A. chrysogenumの形質転換 Skatrudら(1987) Curr. Genet. 12：337-348の方法の改
良。A. chrysogenum（ATCC14553）を２７℃で培養す
る。液体培養物をＣＣＭ培地（０.３％スクロース、０.
０５％ＮaＣl、０.０５％Ｋ2ＨＰＯ4、０.０５％ＭgＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ、０.００１％ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.５％
トリプティック・ソイ・ブロス、０.１％酵母エキス、
０.１％肉エキス、０.１５％デキストリン、pH７.０）
中２００rpmで振盪した。それぞれ１００mlのＣＣＭを
含む２つの５００mlエルレンマイヤーフラスコに４〜６
日齢の菌糸体を接種する。３６〜４８時間培養したの
ち、菌糸体を濾過し、０.８Ｍ ＫＣlで洗浄する。５０m
M ＤＴＴ含有プロトプラスト緩衝液（ＰＢ）２０ml中
で、約３ｇの菌糸体を、２７℃で１５分間インキュベー
トする。１０分間１５,０００rpmで遠心分離後（SS3
4）、ペレットをNovozyme １０mg／mlを含有するＰＢ
２０ml中に再懸濁し、２７℃、１００rpmで４５〜６０
分間インキュベートする。プロトプラストをガラスフリ
ット（孔径２、Schott）を通して菌糸体から分離し、２
５００rpmで３分間ペレット化し、１０mlのＰＢで洗浄
し、もう一度遠心分離し、プロトプラストタイターを１
×１０9／ml形質転換緩衝液（ＴＢ）に調整する。２０
μg（約１０〜２０μl）のプラスミドＤＮＡを１×１０
8のプロトプラストと混合し、氷上で１０分間インキュ
ベートする。２００μlのＰＥＧ（ＴＢ中２５％ＰＥ
Ｇ）を加え、バッチを混合し室温で２０分間インキュベ
ートする。バッチの半分を５mlの上層寒天（０.８％寒
天含有ＣＣＭＳ、約５０℃）に加えて混合後、ＣＣＭＳ
平板上に重層する。水またはＰＢを用いるＤＮＡを含ま
ない対照の希釈は胞子数および再生率の測定に役立つ。
２４〜４８時間インキュベートしたのち、平板を５mlの
選択寒天（０.８Ｍ ＮaＣl、０.８％寒天、１５μg／ml
のベノミール）で覆う。形質転換体は５〜１２日後に現
れる。形質転換体は選択培地（ＣＣＭＳ＋１０μg／ml
のベノミール）上で培養した。形質転換体ＤＮＡのサザ
ンハイブリダイゼーションは１の項の記載と同様に、放
射能標識プローブを用いて行った。
良。A. chrysogenum（ATCC14553）を２７℃で培養す
る。液体培養物をＣＣＭ培地（０.３％スクロース、０.
０５％ＮaＣl、０.０５％Ｋ2ＨＰＯ4、０.０５％ＭgＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ、０.００１％ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.５％
トリプティック・ソイ・ブロス、０.１％酵母エキス、
０.１％肉エキス、０.１５％デキストリン、pH７.０）
中２００rpmで振盪した。それぞれ１００mlのＣＣＭを
含む２つの５００mlエルレンマイヤーフラスコに４〜６
日齢の菌糸体を接種する。３６〜４８時間培養したの
ち、菌糸体を濾過し、０.８Ｍ ＫＣlで洗浄する。５０m
M ＤＴＴ含有プロトプラスト緩衝液（ＰＢ）２０ml中
で、約３ｇの菌糸体を、２７℃で１５分間インキュベー
トする。１０分間１５,０００rpmで遠心分離後（SS3
4）、ペレットをNovozyme １０mg／mlを含有するＰＢ
２０ml中に再懸濁し、２７℃、１００rpmで４５〜６０
分間インキュベートする。プロトプラストをガラスフリ
ット（孔径２、Schott）を通して菌糸体から分離し、２
５００rpmで３分間ペレット化し、１０mlのＰＢで洗浄
し、もう一度遠心分離し、プロトプラストタイターを１
×１０9／ml形質転換緩衝液（ＴＢ）に調整する。２０
μg（約１０〜２０μl）のプラスミドＤＮＡを１×１０
8のプロトプラストと混合し、氷上で１０分間インキュ
ベートする。２００μlのＰＥＧ（ＴＢ中２５％ＰＥ
Ｇ）を加え、バッチを混合し室温で２０分間インキュベ
ートする。バッチの半分を５mlの上層寒天（０.８％寒
天含有ＣＣＭＳ、約５０℃）に加えて混合後、ＣＣＭＳ
平板上に重層する。水またはＰＢを用いるＤＮＡを含ま
ない対照の希釈は胞子数および再生率の測定に役立つ。
２４〜４８時間インキュベートしたのち、平板を５mlの
選択寒天（０.８Ｍ ＮaＣl、０.８％寒天、１５μg／ml
のベノミール）で覆う。形質転換体は５〜１２日後に現
れる。形質転換体は選択培地（ＣＣＭＳ＋１０μg／ml
のベノミール）上で培養した。形質転換体ＤＮＡのサザ
ンハイブリダイゼーションは１の項の記載と同様に、放
射能標識プローブを用いて行った。
【００５０】５．β−ラクタマーゼ遺伝子を含有しない
形質転換ベクターｐＡＵＬ１の構築 β−ラクタマーゼ遺伝子を含まないベクターは、A. chr
ysogenumを形質転換する場合に興味がある。これは、セ
ファロスポリンの生合成に形質転換によって影響を与え
ようとする場合にとくに重要である。細菌性β−ラクタ
マーゼが必ず発現するとはいえないが、真核生物A. chr
ysogenum中での原核生物遺伝子の発現が最低であったと
してもセファロスポリンの分解を招くことは十分考えら
れる。
形質転換ベクターｐＡＵＬ１の構築 β−ラクタマーゼ遺伝子を含まないベクターは、A. chr
ysogenumを形質転換する場合に興味がある。これは、セ
ファロスポリンの生合成に形質転換によって影響を与え
ようとする場合にとくに重要である。細菌性β−ラクタ
マーゼが必ず発現するとはいえないが、真核生物A. chr
ysogenum中での原核生物遺伝子の発現が最低であったと
してもセファロスポリンの分解を招くことは十分考えら
れる。
【００５１】既知のベクターｐＭＷ１から出発して、本
発明者らはβ−ラクタマーゼ遺伝子を含まないベクター
を構築した。この目的においては、大腸菌内での選択の
ための遺伝子としてクロラムフェニコール遺伝子を含有
するベクターｐＡＵＬ１を構築した（図５）。図５の制
限酵素地図から明らかなように、ベクターｐＡＵＬ１は
細菌プラスミドｐＡＣＹＣ184をベースに構築した。ベ
クターｐＡＵＬ１はさらに、ｐｃｂＣプロモーターの制
御下にあって、A. chrysogenum中で選択に必要なハイグ
ロマイシン抵抗性遺伝子を含有する。A. chrysogenumプ
ロトプラストは、ｐＡＵＬ１構築体で形質転換し、つい
でハイグロマイシン培地上で選択した。本発明者らは、
実際、ベクターｐＭＷ１の場合と同様に、５に記載の方
法を用いて、A. chrysogenum形質転換体を単離できた。
しかしながら、形質転換頻度はベクターｐＭＷ１で得ら
れた値よりファクターで１０低い。サザンハイブリダイ
ゼーション法を用いて、すべてのアクレモニウム属形質
転換体がベクターＤＮＡを含有したことを、オートラジ
オグラフ上に示すことができた。ｐＭＷ１について既に
示したように、複雑なハイブリダイゼーションパターン
が得られた。この結果は、ベクターの組換えおよび増幅
が形質転換体内で起こったことを指示する。ほとんどす
べての形質転換体において、３.５kbフラグメントがオ
ートラジオグラム中に明瞭に認めることができる。この
フラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブとし
てプラスミドｐＭＷ１を用いた場合に期待通り検出でき
る内因性ｐｃｂＣ遺伝子コピーを含有する。
発明者らはβ−ラクタマーゼ遺伝子を含まないベクター
を構築した。この目的においては、大腸菌内での選択の
ための遺伝子としてクロラムフェニコール遺伝子を含有
するベクターｐＡＵＬ１を構築した（図５）。図５の制
限酵素地図から明らかなように、ベクターｐＡＵＬ１は
細菌プラスミドｐＡＣＹＣ184をベースに構築した。ベ
クターｐＡＵＬ１はさらに、ｐｃｂＣプロモーターの制
御下にあって、A. chrysogenum中で選択に必要なハイグ
ロマイシン抵抗性遺伝子を含有する。A. chrysogenumプ
ロトプラストは、ｐＡＵＬ１構築体で形質転換し、つい
でハイグロマイシン培地上で選択した。本発明者らは、
実際、ベクターｐＭＷ１の場合と同様に、５に記載の方
法を用いて、A. chrysogenum形質転換体を単離できた。
しかしながら、形質転換頻度はベクターｐＭＷ１で得ら
れた値よりファクターで１０低い。サザンハイブリダイ
ゼーション法を用いて、すべてのアクレモニウム属形質
転換体がベクターＤＮＡを含有したことを、オートラジ
オグラフ上に示すことができた。ｐＭＷ１について既に
示したように、複雑なハイブリダイゼーションパターン
が得られた。この結果は、ベクターの組換えおよび増幅
が形質転換体内で起こったことを指示する。ほとんどす
べての形質転換体において、３.５kbフラグメントがオ
ートラジオグラム中に明瞭に認めることができる。この
フラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブとし
てプラスミドｐＭＷ１を用いた場合に期待通り検出でき
る内因性ｐｃｂＣ遺伝子コピーを含有する。
【００５２】方法：プラスミドの構築およびアクレモニ
ウム属の形質転換 ベクターｐＡＵＬ１の構築には以下の２つの出発プラス
ミド、すなわち、１．ｐＡＣＹＣ184［Chang & Cohen(1
976) J. Bacteriol. 143：1141-1156］および２．ｐＭ
Ｗ１（Kueckら、1989）を用いた。１のプラスミド５μg
を、酵素ＳalＩおよびＢamＨＩを用いて加水分解した。
この制限の結果、５′ｐｃｂＣプロモーターとともにｈ
ｐｈ遺伝子を含む１.５kb ＢamＨＩ−ＳalＩ制限フラグ
メントが得られえる。フラグメントをゲル電気泳動で精
製し、標品として単離した。ついで、フラグメントをＢ
amＨＩ−＋ＳalＩ−制限ベクターｐＡＣＹＣ184にリゲ
ートした。組換え体プラスミドの同定のための続く大腸
菌形質転換およびコロニーフィルターハイブリダイゼー
ションは、１に記載の方法に従って実施する。ベクター
ｐＡＵＬ１は図５に示す。
ウム属の形質転換 ベクターｐＡＵＬ１の構築には以下の２つの出発プラス
ミド、すなわち、１．ｐＡＣＹＣ184［Chang & Cohen(1
976) J. Bacteriol. 143：1141-1156］および２．ｐＭ
Ｗ１（Kueckら、1989）を用いた。１のプラスミド５μg
を、酵素ＳalＩおよびＢamＨＩを用いて加水分解した。
この制限の結果、５′ｐｃｂＣプロモーターとともにｈ
ｐｈ遺伝子を含む１.５kb ＢamＨＩ−ＳalＩ制限フラグ
メントが得られえる。フラグメントをゲル電気泳動で精
製し、標品として単離した。ついで、フラグメントをＢ
amＨＩ−＋ＳalＩ−制限ベクターｐＡＣＹＣ184にリゲ
ートした。組換え体プラスミドの同定のための続く大腸
菌形質転換およびコロニーフィルターハイブリダイゼー
ションは、１に記載の方法に従って実施する。ベクター
ｐＡＵＬ１は図５に示す。
【００５３】６．突然変異β−チューブリン遺伝子を用
いるA. chrysogenumの同時形質転換 A. chrysogenumの同時形質転換においては、ベクターｐ
ＣＮ３を、ベクターｐＭＷ１またはｐＡＵＬ１とともに
A. chrysogenumに形質転換した。ついで、ベノミールま
たはハイグロマイシンを含む選択培地上での分析ならび
にそれに続くサザンハイブリダイゼーションにより、７
０〜８０％の形質転換体は両ＤＮＡ分子を取り込んだこ
とを明瞭に示している。これは、ベクターｐＣＮ３が、
同時形質転換における使用に適していることの証明する
ものである。また、任意の所望のＤＮＡが、ベクターｐ
ＣＮ３を用いてA. chrysogenumに形質転換できることを
示している。
いるA. chrysogenumの同時形質転換 A. chrysogenumの同時形質転換においては、ベクターｐ
ＣＮ３を、ベクターｐＭＷ１またはｐＡＵＬ１とともに
A. chrysogenumに形質転換した。ついで、ベノミールま
たはハイグロマイシンを含む選択培地上での分析ならび
にそれに続くサザンハイブリダイゼーションにより、７
０〜８０％の形質転換体は両ＤＮＡ分子を取り込んだこ
とを明瞭に示している。これは、ベクターｐＣＮ３が、
同時形質転換における使用に適していることの証明する
ものである。また、任意の所望のＤＮＡが、ベクターｐ
ＣＮ３を用いてA. chrysogenumに形質転換できることを
示している。
【００５４】同時形質転換の方法：４に記載したA. chr
ysogenumを形質転換する方法を、ＤＮＡ形質転換に使用
した。このためには、ｐＣＮ３プラスミドＤＮＡをプラ
スミドｐＭＷ１またはｐＡＵＬ１と１：１の重量比で混
合した。ついで、ベノミール含有選択培地上で、選択を
行った。次に、ハイグロマイシンＢを添加したハイグロ
マイシン含有培地上で、生理的テストを続けた。分子分
析は放射能標識ベクタープローブを用いるサザンハイブ
リダイゼーションによって実施した。４に記載の方法を
用いた。
ysogenumを形質転換する方法を、ＤＮＡ形質転換に使用
した。このためには、ｐＣＮ３プラスミドＤＮＡをプラ
スミドｐＭＷ１またはｐＡＵＬ１と１：１の重量比で混
合した。ついで、ベノミール含有選択培地上で、選択を
行った。次に、ハイグロマイシンＢを添加したハイグロ
マイシン含有培地上で、生理的テストを続けた。分子分
析は放射能標識ベクタープローブを用いるサザンハイブ
リダイゼーションによって実施した。４に記載の方法を
用いた。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
【表８】
【００６３】
【表９】
【００６４】
【表１０】
【００６５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２３塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： CTCGTTGAAG TAGACGCTCA TGC
【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：２４塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： GCCAAGGGCC ACTACACTGA GGGT
【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：２２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： CAGGAATGTT GTTGCTCGAC GC
【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： TACGACATCT GCATGCGTAC C
【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： TGACCTGCTC TGCCATCTTG
【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： GGAGTAGGTG GCCATCATGC
【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： GATGGCCACC TACTCCGTCG
【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： GGGTACGCAT GCAGATGTCG
【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： TGAGGGCATG GACGAGATGG
【００７４】配列番号：１０ 配列の長さ：１９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： TGATGGAGAA GAGTGTGTG
【００７５】配列番号：１１ 配列の長さ：１９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： CCACCACACA CTCTTCTCC
【００７６】配列番号：１２ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： CCATCTCGTC CATGCCCTCA
【００７７】配列番号：１３ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： ATCATCAGCC AGATTGG
【００７８】配列番号：１４ 配列の長さ：１８塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： GGAACAAGAC AATAGAGC
【００７９】配列番号：１５ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： CGTTCTATTT ATTTCAATTC G
【００８０】配列番号：１６ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源：合成 配列： GTAAAACGAC GGCCAGT
【００８１】配列番号：１７ 配列の長さ：２２０６塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源： ライブラリー：ゲノム 配列の特徴：β−チューブリン遺伝子 配列： 1 CGCAATTTGT CCCACATCAT CAGCCCATTG GTCATCACCC CCCCTCAGGTA 51 52 CCAACCAGTGA ACACCTTACTG TAAAGGCTCC CGCTGTCAGG CCCAGCAGCA 103 104 GCTCCAGCAC TCACCGCAAG AGGCCGGGGTC CCGTGGCGGTG AGGACGGGACC 156 157 AATTTCCATC CAGCACCTCA CCCACCTCTC CCCCAGCAAA AATCCAACCA 206 207 TCCACCACACA CTCTTCTCCAT CACTCACACCC GACCACCCCC CATCTCCACG 259 260 GAACTCAAGC TCTGTTGCTC AGCACAGCTC TCGAGGCCCTC GCTCTAGCTAC 311 312 CGATCACGTCC TTTTCCCTTC AATAATCCTC AAA ATG CGT GAG ATT 357 MET Arg Glu Ile 1 358 gtgagtcctc caacggacgc ccaacgcgtc cctcgcggtgc ccctgatttac c 410 411 ccgccgacgg gcgtcgagca acaacattcc tgcccgacac actacccaca 460 461 gttcgagatg gatcaagaac gtgctgacca tgg accttttttt tgttcttgtg 513 514 atatag GTT CAC CTC CAG ACC GGC CAG TGC gtaagttact 553 Val His Leu Gln Thr Gly Gln Cys 10 554 tctttccgga cacg tttgcggtgt gggaggacac agctgatgga 597 598 cgtgatggaa tag GGC AAC CAG ATT GGT GCT GCT TTC TGG CAG ACC 643 Gly Asn Gln Ile Gly Ala Ala Phe Trp Gln Thr 20 644 ATC TCT GGC GAG CAT GGC CTC GAC AGC AAC GGT GTC TAC AAC 685 Ile Ser Gly Glu His Gly Leu Asp Ser Asn Gly Val Tyr Asn 30 686 GGC AGC TCT GAG CTC CAA CTC GAG CGC ATG AGC GTC TAC TTC 727 Gly Ser Ser Glu Leu Gln Leu Glu Arg MET Ser Val Tyr Phe 40 50 728 AAC GAC gtacgtggatgaactagctaca actgtactgctcgagcagtca 776 Asn Glu 777 atgctagtgt gggtcctaac aagctgtgca g GCC TCT GGC AAC AAG TAT 825 Ala Ser Gly Asn Lys Tyr 826 GTC CCT CGC GCC GTC CTC GTC GAT CTT GAG CCC GGT ACC ATG 867 Val Pro Arg Ala Val Leu Val Asp Leu Glu Pro Gly Thr MET 60 70 868 GAC GCT GTT CGT GCG GGT CCT TTC GGC CAG CTC TTC CGC CCC 909 Asp Ala Val Arg Ala Gly Pro Phe Gly Gln Leu Phe Arg Pro 80 910 GAC AAC TTC GTC TTC GGC CAG TCC GGT GCT GGC AAC AAC TGG 951 Asp Asn Phe Val Phe Gly Gln Ser Gly Ala Gly Asn Asn Trp 90 100 952 GCC AAG GGC CAC TAC ATC GAG GGT GCC GAG CTC GTC GAC AAC 993 Ala Lys Gly His Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu Val Asp Asn 110 994 GTC CTC GAT GTC GTC CGC CGC GAG GCC GAG GGC TGC GAC TGC 1035 Val Leu Asp Val Val Arg Arg Glu Ala Glu Gly Cys Asp Cys 120 1036 CTC CAG GGC TTC CAG ATC ACC CAC TCC CTG GGT GGT GGC ACT 1077 Leu Gln Gly Phe Gln Ile Thr His Ser Leu Gly Gly Gly Thr 130 140 1078 GGT GCC GGT ATG GGC ACC CTG CTC ATC TCC AAG ATC CGC GAG 1119 Gly Ala Gly MET Gly Thr Leu Leu Ile Ser Lys Ile Arg Glu 150 1120 GAG TTC CCC GAC CGC ATG ATG GCC ACC TTC TCC GTC GTC CCC 1161 Glu Phe Pro Asp Arg MET MET Ala Thr Phe Ser Val Val Pro 160 170 1162 TCC CCC AAG GTC TCC GAT ACC GTC GTC GAG CCC TAC AAC GCC 1203 Ser Pro Lys Val Ser Asp Thr Val Val Glu Pro Tyr Asn Ala 180 1204 ACC CTC TCC GTG CAC CAG CTC GTT GAG CAC TCC GAC GAG ACC 1245 Thr Leu Ser Val His Gln Leu Val Glu His Ser Asp Glu Thr 190 1246 TTC TGT ATC GAC AAC GAG GCC CTC TAC GAC ATC TGC ATG CGT 1287 Phe Cys Ile Asp Asn Glu Ala Leu Tyr Asp Ile Cys MET Arg 200 210 1288 ACC CTC AAG CTG TCT AAC CCC TCC TAC GGC GAC CTG AAC TAC 1329 Thr Leu Lys Leu Ser Asn Pro Ser Tyr Gly Asp Leu Asn Tyr 220 1330 CTC GTC TCC GCT GTC ATG TCT GGT GTC ACC ACC TGC CTC CGC 1371 Leu Val Ser Ala Val MET Ser Gly Val Thr Thr Cys Leu Arg 230 240 1372 TTC CCC GGT CAG CTG AAC TCT GAC CTG CGC AAG CTG GCT GTC 1413 Phe Pro Gly Gln Leu Asn Ser Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val 250 1414 AAC ATG GTT CCC TTC CCT CGT CTG CAC TTC TTC ATG GTC GGC 1455 Asn MET Val Pro Phe Pro Arg Leu His Phe Phe MET Val Gly 260 1456 TTC GCC CCC CTG ACC AGC CGT GGT GCC CAC TCC TTC CGC GCC 1497 Phe Ala Pro Leu Thr Ser Arg Gly Ala His Ser Phe Arg Ala 270 280 1498 GTC AGC GTC CCC GAG CTC ACC CAG CAG ATG TTC GAC CCC AAG 1539 Val Ser Val Pro Glu Leu Thr Gln Gln MET Phe Asp Pro Lys 290 1540 AAC ATG ATG GCT GCC TCC GAC TTC CGC AAC GGC CGC TAC CTG 1581 Asn MET MET Ala Ala Ser Asp Phe Arg Asn Gly Arg Tyr Leu 300 310 1582 ACC TGC TCT GCC ATC TTC CGT GGC AAG GTC GCC gta agttataaag 1627 Thr Cys Ser Ala Ile Phe Arg Gly Lys Val Ala 320 1628 atacgccgag ctctattgtc ttgttccatc tgaagctaac atggaaacag 1677 1678 ATG AAG GAG GTC GAG GAC CAG ATG CGC AAC GTC CAG 1713 MET Lys Glu Val Glu Asp Gln MET Arg Asn Val Gln 330 1714 AGC AAG AAC TCG TCC TAC TTC GTC GAG TGG ATC CCC AAC AAC 1755 Ser Lys Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile Pro Asn Asn 340 1756 ATC CAG ACC GCT CTC TGC GCC ATT CCT CCC CGT GGC CTC AAG 1797 Ile Gln Thr Ala Leu Cys Ala Ile Pro Pro Arg Gly Leu Lys 350 360 1798 ATG TCC TCC ACC TTC ATC GGC AAC TCC ACC TCC ATC CAG GAG 1839 MET Ser Ser Thr Phe Ile Gly Asn Ser Thr Ser Ile Gln Glu 370 1840 CTG TTC AAG CGT GTC GGT GAG CAG TTC ACT GCC ATG TTC CGT 1881 Leu Phe Lys Arg Val Gly Glu Gln Phe Thr Ala MET Phe Arg 380 390 1882 CGC AAG GCT TTC CTG CAT TGG TAC ACT GGT GAG GGC ATG GAC 1923 Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Gly MET Asp 400 1924 GAG ATG GAG TTT ACC GAG GCC GAG TCC AAC ATG AAC GAC CTC 1965 Glu MET Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn MET Asn Asp Leu 410 1966 GTC TCC GAG TAC CAG CAG TAC CAG GAT GCT GGC ATC GAC GAG 2007 Val Ser Glu Tyr Gln Gln Tyr Gln Asp Ala Gly Ile Asp Glu 420 430 2008 GAG GAG GAG GAA TAC GAG GAG GAG CTC CCC CTC GAG GGT GAG 2049 Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Leu Pro Leu Glu Gly Glu 440 2050 GAA TAA AAAAAAAAGC TCGCCACCAG AGGCTTGCCG TATACACGGT 2095 Glu TER 2096 CCGGCGCGTC GTTCCCGCCA ACTGTGGTAA CCTTTTGAAG TTT GCAGCCTGTT 2148 2149 GCGTTCTATT TATTTCAATT CGGGGTTGTG GAGGTAATTG TGAGAATGGG 2198 2199 GTTCTAGA 2206
【００８２】配列番号：１８ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：コード領域にアミノ酸をもつ核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 起源： 生物名：Acremonium chrysogenum 直接の起源： ライブラリー：ゲノム 配列の特徴：配列番号７との比較のための野生型配列
【図面の簡単な説明】
【図１】A. chrysogenumのβ−チューブリン遺伝子（斜
線部）を有する組換えクローンＬ−Ｔ６の制限酵素地
図。
線部）を有する組換えクローンＬ−Ｔ６の制限酵素地
図。
【図２】Acremonium chrysogenumの形質転換に適当なベ
クターｐＣＮ３の制限酵素地図。
クターｐＣＮ３の制限酵素地図。
【図３】ＰＣＲ−増幅β−チューブリン遺伝子フラグメ
ントの直接配列決定によるＤＮＡ配列決定実験における
代表的なオートラジオグラム。
ントの直接配列決定によるＤＮＡ配列決定実験における
代表的なオートラジオグラム。
【図４】様々な真菌のβ−チューブリン遺伝子の遺伝子
構成の比較図。
構成の比較図。
【図５】ベクターｐＡＵＬ１の構築図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (18)
- 【請求項１】 Acremonium chrysogenum（A. chrysogen
um）からのβ−チューブリン。 - 【請求項２】 第２表ＡおよびＢによるアミノ酸配列を
有する請求項１に記載のβ−チューブリン。 - 【請求項３】 請求項１または２の一つに記載のβ−チ
ューブリンをコードするＤＮＡまたはその部分。 - 【請求項４】 第２表ＡおよびＢによる核酸配列を有す
る請求項３に記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 第２表ＡおよびＢによる蛋白質コード領
域からなる請求項４に記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 第２表ＡおよびＢによるＤＮＡ配列の蛋
白質コード領域に緊縮条件下においてハイブリダイズす
るβ−チューブリンもしくはその部分をコードするＤＮ
Ａまたはその部分。 - 【請求項７】 アミノ酸番号１６７はチロシンである請
求項３に記載のＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項３〜７の少なくとも一つに記載の
ＤＮＡを含有するベクター。 - 【請求項９】 図５によるベクターpＡＵＬ1である請求
項８に記載のベクター。 - 【請求項１０】 請求項３〜７の少なくとも一つに記載
のＤＮＡもしくは請求項８または９に記載のベクターを
含有する宿主細胞。 - 【請求項１１】 請求項１または２に記載のβ−チュー
ブリンを製造する方法において、ａ）請求項１０に記載
の宿主細胞を培養し、ついでｂ）β−チューブリンを単
離する方法。 - 【請求項１２】 請求項３〜７の少なくとも一つに記載
のＤＮＡもしくは請求項８または９の一つに記載のベク
ターをA. chrysogenumに接触させるA. chrysogenumを形
質転換する方法。 - 【請求項１３】 形質転換の前にA. chrysogenumのプロ
トプラストを調製し、形質転換されたプロトプラストを
適当な培地中で再生させる請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 培地は１１〜５０重量％のスクロース
を含有する請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項３〜７の少なくとも一つに記載
のＤＮＡもしくは請求項８または９の一つに記載のベク
ターを、同時形質転換すべきＤＮＡとともにA. chrysog
enumに接触させるA. chrysogenumを同時形質転換する方
法。 - 【請求項１６】 使用されるＤＮＡまたはベクターはも
っぱらA. chrysogenumに相同なＤＮＡ配列から構成され
る請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項３〜７の少なくとも一つに記載
のＤＮＡもしくは請求項８または９の一つに記載のベク
ターと、所望の異種蛋白質をコードするＤＮＡを同時形
質転換したA. chrysogenumを使用する、A. chrysogenum
において異種蛋白質を製造する方法。 - 【請求項１８】 請求項３〜７の少なくとも一つに記載
のＤＮＡもしくは請求項８または９の一つに記載のベク
ターの、A. chrysogenumを形質転換するための使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4304312 | 1993-02-12 | ||
| DE4304312:7 | 1993-02-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06256396A true JPH06256396A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=6480351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6036386A Pending JPH06256396A (ja) | 1993-02-12 | 1994-02-10 | アクレモニウム・クリソゲナムからのβ−チューブリン、その製造および使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0610842A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06256396A (ja) |
| KR (1) | KR940019728A (ja) |
| CA (1) | CA2115507A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5602004A (en) * | 1994-07-20 | 1997-02-11 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Thermophilic fungal expression system |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192157A (ja) * | 1991-05-27 | 1993-08-03 | Takeda Chem Ind Ltd | 変異型β−チュブリンをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片およびその用途 |
-
1994
- 1994-02-07 EP EP94101794A patent/EP0610842A3/de not_active Withdrawn
- 1994-02-10 JP JP6036386A patent/JPH06256396A/ja active Pending
- 1994-02-11 CA CA002115507A patent/CA2115507A1/en not_active Abandoned
- 1994-02-12 KR KR1019940002499A patent/KR940019728A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0610842A3 (de) | 1995-07-26 |
| EP0610842A2 (de) | 1994-08-17 |
| CA2115507A1 (en) | 1994-08-13 |
| KR940019728A (ko) | 1994-09-14 |
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