JP3276050B2 - オーレオバシジン感受性関連遺伝子 - Google Patents
オーレオバシジン感受性関連遺伝子Info
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- JP3276050B2 JP3276050B2 JP27992195A JP27992195A JP3276050B2 JP 3276050 B2 JP3276050 B2 JP 3276050B2 JP 27992195 A JP27992195 A JP 27992195A JP 27992195 A JP27992195 A JP 27992195A JP 3276050 B2 JP3276050 B2 JP 3276050B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、アスペルギルス属
を始めとする糸状菌より得られる抗真菌剤オーレオバシ
ジンの感受性に関連する蛋白質、及び蛋白質をコードす
る遺伝子、すなわち糸状菌由来のオーレオバシジン感受
性関連遺伝子に関する。
を始めとする糸状菌より得られる抗真菌剤オーレオバシ
ジンの感受性に関連する蛋白質、及び蛋白質をコードす
る遺伝子、すなわち糸状菌由来のオーレオバシジン感受
性関連遺伝子に関する。
【0002】
【従来の技術】オーレオバシジン〔特開平2−1382
96号、同3−22995号、同3−220199号、
同5−279384号、同6−65291号、ジャーナ
ル オブ アンチバイオチクス(J. Antibiotics)、第
44巻、第9号、第919〜924頁、同第44巻、第
9号、第925〜933頁、同第44巻、第11号、第
1187〜1198頁(1991)〕は、オーレオバシ
ジウム プルランス(Aureobasidium pullulans) No.R
106株の発酵生産物として得られる、環状のデプシペ
プチドであり、他の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。
更に、オーレオバシジンの中で代表的な化合物であるオ
ーレオバシジンAは、病原性真菌であるカンジダ アル
ビカンス(Candida albicans、以下、C.アルビカンス
と略記する)を始めとする種々のカンジダ属酵母、クリ
プトコッカス ネオホルマンス(Cryptococcus neoform
ans)、ヒストプラズマ カプスラタム(Histoplasma ca
psulatum) 、ブラストマイセス デルマチチジス(Blas
tomyces dermatitidis) 、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、ペニシリウム(Penicillium)属真菌に対して、強
い抗真菌活性を有する(特開平2−138296号)
が、毒性が非常に弱く、優れた選択毒性を有する抗真菌
剤として期待されている。従来の毒性の弱い抗真菌剤は
すべて静菌的な作用しか示さず、臨床上問題となってい
たが、オーレオバシジンの作用は殺菌的である。これら
の点から、オーレオバシジンの選択毒性の機構の解明が
待たれているが、現在のところ全く知られていない。
96号、同3−22995号、同3−220199号、
同5−279384号、同6−65291号、ジャーナ
ル オブ アンチバイオチクス(J. Antibiotics)、第
44巻、第9号、第919〜924頁、同第44巻、第
9号、第925〜933頁、同第44巻、第11号、第
1187〜1198頁(1991)〕は、オーレオバシ
ジウム プルランス(Aureobasidium pullulans) No.R
106株の発酵生産物として得られる、環状のデプシペ
プチドであり、他の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。
更に、オーレオバシジンの中で代表的な化合物であるオ
ーレオバシジンAは、病原性真菌であるカンジダ アル
ビカンス(Candida albicans、以下、C.アルビカンス
と略記する)を始めとする種々のカンジダ属酵母、クリ
プトコッカス ネオホルマンス(Cryptococcus neoform
ans)、ヒストプラズマ カプスラタム(Histoplasma ca
psulatum) 、ブラストマイセス デルマチチジス(Blas
tomyces dermatitidis) 、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、ペニシリウム(Penicillium)属真菌に対して、強
い抗真菌活性を有する(特開平2−138296号)
が、毒性が非常に弱く、優れた選択毒性を有する抗真菌
剤として期待されている。従来の毒性の弱い抗真菌剤は
すべて静菌的な作用しか示さず、臨床上問題となってい
たが、オーレオバシジンの作用は殺菌的である。これら
の点から、オーレオバシジンの選択毒性の機構の解明が
待たれているが、現在のところ全く知られていない。
【0003】本発明者らは、既にカナダ国特許出願公開
公報第2124034号に記載のようにサッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae、以下、S.
セレビシエと略記する)、及びシゾサッカロミセス ポ
ンベ(Schizosaccharomycespombe 、以下、Schiz
o.ポンベと略記する)がオーレオバシジンに感受性を
示すことを見出し、S.セレビシエ、及びSchiz
o.ポンベの感受性細胞に変異処理を施すことにより耐
性細胞に変え、その耐性細胞よりオーレオバシジン耐性
を付与する遺伝子(耐性遺伝子)、更に感受性細胞より
対応するオーレオバシジン感受性を付与する遺伝子(感
受性遺伝子)の単離に成功した。更にオーレオバシジン
感受性関連遺伝子又はその一部をプローブとして用いる
ことにより、C.アルビカンスよりオーレオバシジン感
受性関連遺伝子を単離した。しかしながら、真菌類の内
でもアスペルギルス属を含む糸状菌類からはオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子は見出されていなかった。
公報第2124034号に記載のようにサッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae、以下、S.
セレビシエと略記する)、及びシゾサッカロミセス ポ
ンベ(Schizosaccharomycespombe 、以下、Schiz
o.ポンベと略記する)がオーレオバシジンに感受性を
示すことを見出し、S.セレビシエ、及びSchiz
o.ポンベの感受性細胞に変異処理を施すことにより耐
性細胞に変え、その耐性細胞よりオーレオバシジン耐性
を付与する遺伝子(耐性遺伝子)、更に感受性細胞より
対応するオーレオバシジン感受性を付与する遺伝子(感
受性遺伝子)の単離に成功した。更にオーレオバシジン
感受性関連遺伝子又はその一部をプローブとして用いる
ことにより、C.アルビカンスよりオーレオバシジン感
受性関連遺伝子を単離した。しかしながら、真菌類の内
でもアスペルギルス属を含む糸状菌類からはオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子は見出されていなかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】糸状菌としてはアスペ
ルギルス属、ペニシリウム属などの多くの種類が存在し
ており、酒類、醤油及び味噌の醸造やチーズの熟成など
の食品製造に古くから広く利用されているものや、酵素
剤や抗生物質の生産にとって重要なものが多い。一方、
糸状菌には有用菌ばかりでなく、植物病原菌のように有
害な菌や、ヒトに対しても深在性真菌症のような重篤な
病気を引き起こすものも存在する。近年の遺伝子操作工
学の進展により、有用菌株の育種だけでなく、異種蛋白
質の生産などの新しい利用法も可能となってきた。ま
た、糸状菌の生命現象の解析も進められている。本発明
の目的は、アスペルギルス属を始めとする糸状菌より糸
状菌の遺伝子操作や生命現象の解析に有用なオーレオバ
シジンの感受性に関連する蛋白質をコードする遺伝子又
はその機能的誘導体を見出すことにある。すなわち、本
発明はオーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又は
その機能的誘導体をコードする遺伝子を明らかにし、該
遺伝子のクローニング方法、該遺伝子のコードするオー
レオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はその機能的
誘導体を提供すること、更に該遺伝子のアンチセンスD
NA及びアンチセンスRNAを提供すること、該遺伝子
にハイブリダイズ可能な核酸プローブ、及びその核酸プ
ローブを用いた該遺伝子の検出方法を提供すること、該
遺伝子を用いるオーレオバシジンの感受性に関連する蛋
白質又はその機能的誘導体の製造方法を提供することを
目的とする。
ルギルス属、ペニシリウム属などの多くの種類が存在し
ており、酒類、醤油及び味噌の醸造やチーズの熟成など
の食品製造に古くから広く利用されているものや、酵素
剤や抗生物質の生産にとって重要なものが多い。一方、
糸状菌には有用菌ばかりでなく、植物病原菌のように有
害な菌や、ヒトに対しても深在性真菌症のような重篤な
病気を引き起こすものも存在する。近年の遺伝子操作工
学の進展により、有用菌株の育種だけでなく、異種蛋白
質の生産などの新しい利用法も可能となってきた。ま
た、糸状菌の生命現象の解析も進められている。本発明
の目的は、アスペルギルス属を始めとする糸状菌より糸
状菌の遺伝子操作や生命現象の解析に有用なオーレオバ
シジンの感受性に関連する蛋白質をコードする遺伝子又
はその機能的誘導体を見出すことにある。すなわち、本
発明はオーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又は
その機能的誘導体をコードする遺伝子を明らかにし、該
遺伝子のクローニング方法、該遺伝子のコードするオー
レオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はその機能的
誘導体を提供すること、更に該遺伝子のアンチセンスD
NA及びアンチセンスRNAを提供すること、該遺伝子
にハイブリダイズ可能な核酸プローブ、及びその核酸プ
ローブを用いた該遺伝子の検出方法を提供すること、該
遺伝子を用いるオーレオバシジンの感受性に関連する蛋
白質又はその機能的誘導体の製造方法を提供することを
目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第1の発明は、配列表の配列番号2、に示される
アミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号1に示される
塩基配列を有する蛋白質、若しくは該配列の275位に
相当する部位以外に1〜数個のアミノ酸残基の置換、挿
入及び欠失の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有す
る蛋白質であって、当該蛋白質を発現する宿主にオーレ
オバシジンに対する耐性を付与する蛋白質をコードする
遺伝子に関する。第2の発明は、上記第1の発明の遺伝
子のクローニング方法に関し、本発明の第1の発明の塩
基配列を有する遺伝子の全部又はその一部をプローブと
して用いることを特徴とする。第3の発明は、第1の発
明の塩基配列の15塩基以上の配列よりなる核酸プロー
ブに関する。第4の発明は塩基配列を有する第1の発明
の遺伝子の全長のアンチセンスDNAに関する。第5の
発明は、上記遺伝子の全長のアンチセンスRNAに関す
る。第6の発明は第1の発明の遺伝子を含有させた組換
体プラスミドに関し、第7の発明は第6の発明のプラス
ミドを導入させた形質転換体に関する。第8の発明は上
記の形質転換体を使用した宿主にオーレオバシジンに対
する耐性を付与する蛋白質の製造方法に関する。第9の
発明は、上記の宿主にオーレオバシジンに対する耐性を
付与する蛋白質に関する。第10の発明は第3の発明の
核酸プローブを用いる、ハイブリダイゼーションによる
第1の発明の関連遺伝子の検出方法に関する。
発明の第1の発明は、配列表の配列番号2、に示される
アミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号1に示される
塩基配列を有する蛋白質、若しくは該配列の275位に
相当する部位以外に1〜数個のアミノ酸残基の置換、挿
入及び欠失の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有す
る蛋白質であって、当該蛋白質を発現する宿主にオーレ
オバシジンに対する耐性を付与する蛋白質をコードする
遺伝子に関する。第2の発明は、上記第1の発明の遺伝
子のクローニング方法に関し、本発明の第1の発明の塩
基配列を有する遺伝子の全部又はその一部をプローブと
して用いることを特徴とする。第3の発明は、第1の発
明の塩基配列の15塩基以上の配列よりなる核酸プロー
ブに関する。第4の発明は塩基配列を有する第1の発明
の遺伝子の全長のアンチセンスDNAに関する。第5の
発明は、上記遺伝子の全長のアンチセンスRNAに関す
る。第6の発明は第1の発明の遺伝子を含有させた組換
体プラスミドに関し、第7の発明は第6の発明のプラス
ミドを導入させた形質転換体に関する。第8の発明は上
記の形質転換体を使用した宿主にオーレオバシジンに対
する耐性を付与する蛋白質の製造方法に関する。第9の
発明は、上記の宿主にオーレオバシジンに対する耐性を
付与する蛋白質に関する。第10の発明は第3の発明の
核酸プローブを用いる、ハイブリダイゼーションによる
第1の発明の関連遺伝子の検出方法に関する。
【0006】本発明者らは、アスペルギルス ニドラン
ス(Aspergillus nidulans、以下、A.ニドランスと略
記する)、アスペルギルス フミガタス(Aspergillus
fumigatus 、以下、A.フミガタスと略記する)等の糸
状菌がオーレオバシジンに感受性を示すことを見出し
た。そして、A.ニドランスの感受性細胞に変異処理を
施すことにより耐性細胞に変え、その耐性細胞より対応
するオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子(耐性遺伝
子)の単離に成功した。更に、本発明者らは該遺伝子の
コードする蛋白質の存在を明らかにした。更に、該遺伝
子のDNA断片をプローブとして用いることによって、
オーレオバシジンに感受性のA.ニドランス及びA.フ
ミガタスより、新たにオーレオバシジン感受性に関連す
る遺伝子を発見することに成功した。更に、この遺伝子
を検出することにより、その細胞が原因となって生じて
いる疾患、例えば真菌によって引き起こされている真菌
症の診断が可能であること、更にその細胞に特有のオー
レオバシジン感受性関連遺伝子の発現を阻害するアンチ
センスDNA又はアンチセンスRNAはその細胞が原因
となって生じている疾患の治療薬、例えば真菌による真
菌症に対する抗真菌剤となることを見出し、本発明を完
成した。
ス(Aspergillus nidulans、以下、A.ニドランスと略
記する)、アスペルギルス フミガタス(Aspergillus
fumigatus 、以下、A.フミガタスと略記する)等の糸
状菌がオーレオバシジンに感受性を示すことを見出し
た。そして、A.ニドランスの感受性細胞に変異処理を
施すことにより耐性細胞に変え、その耐性細胞より対応
するオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子(耐性遺伝
子)の単離に成功した。更に、本発明者らは該遺伝子の
コードする蛋白質の存在を明らかにした。更に、該遺伝
子のDNA断片をプローブとして用いることによって、
オーレオバシジンに感受性のA.ニドランス及びA.フ
ミガタスより、新たにオーレオバシジン感受性に関連す
る遺伝子を発見することに成功した。更に、この遺伝子
を検出することにより、その細胞が原因となって生じて
いる疾患、例えば真菌によって引き起こされている真菌
症の診断が可能であること、更にその細胞に特有のオー
レオバシジン感受性関連遺伝子の発現を阻害するアンチ
センスDNA又はアンチセンスRNAはその細胞が原因
となって生じている疾患の治療薬、例えば真菌による真
菌症に対する抗真菌剤となることを見出し、本発明を完
成した。
【0007】
【発明の実施の形態】本発明におけるオーレオバシジン
感受性に関連する蛋白質とは、オーレオバシジンに対し
て感受性を示す糸状菌に含有される蛋白質であり、その
蛋白質はオーレオバシジンに対して感受性又は耐性を示
すために必要とされる。オーレオバシジン感受性関連遺
伝子とは、これらのオーレオバシジン感受性に関連する
蛋白質をコードする遺伝子であり、感受性遺伝子及び耐
性遺伝子が含まれる。これらオーレオバシジン感受性に
関連する蛋白質又は遺伝子はその分子の構造的変化や、
量的変化によってその分子をもつ生物のオーレオバシジ
ンに対する感受性は変化する。
感受性に関連する蛋白質とは、オーレオバシジンに対し
て感受性を示す糸状菌に含有される蛋白質であり、その
蛋白質はオーレオバシジンに対して感受性又は耐性を示
すために必要とされる。オーレオバシジン感受性関連遺
伝子とは、これらのオーレオバシジン感受性に関連する
蛋白質をコードする遺伝子であり、感受性遺伝子及び耐
性遺伝子が含まれる。これらオーレオバシジン感受性に
関連する蛋白質又は遺伝子はその分子の構造的変化や、
量的変化によってその分子をもつ生物のオーレオバシジ
ンに対する感受性は変化する。
【0008】本発明のオーレオバシジン感受性に関連す
る蛋白質又は遺伝子の機能的誘導体とは、オーレオバシ
ジン感受性に関連する蛋白質又はDNAの生物学的活性
と実質上、類似の生物学的活性をもつものであり、断片
や変異体、変性変異体、類似体、相同体、化学的誘導体
を含む。変異体とは全蛋白質、又はそれ由来の断片にお
いて構造的及び/又は機能的に、実質上類似のものを示
している。すなわち、もし2つの分子が本質的に類似の
活性をもっているならば、それらはたとえ一方の分子の
構造が、他方の分子にみられなくとも、又はたとえ2つ
の分子のアミノ酸配列が同一でなくとも、変異体である
と考えられる。機能的誘導体にはアミノ酸残基の置換、
挿入、及び欠失の少なくとも一つを含むアミノ酸配列を
示し、類似の生物活性を有する蛋白質、及びそれをコー
ドする遺伝子も含まれる。オーレオバシジン感受性に関
連する蛋白質へのアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失は
遺伝子の部位特異的変異誘発により実施することができ
る。単離したオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質
をコードするDNAを、ヌクレオチドの置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つによって修飾するのは容易であ
り、オーレオバシジン感受性に関連する蛋白質及びその
機能的誘導体をコードしている新規なDNAを得ること
ができる。
る蛋白質又は遺伝子の機能的誘導体とは、オーレオバシ
ジン感受性に関連する蛋白質又はDNAの生物学的活性
と実質上、類似の生物学的活性をもつものであり、断片
や変異体、変性変異体、類似体、相同体、化学的誘導体
を含む。変異体とは全蛋白質、又はそれ由来の断片にお
いて構造的及び/又は機能的に、実質上類似のものを示
している。すなわち、もし2つの分子が本質的に類似の
活性をもっているならば、それらはたとえ一方の分子の
構造が、他方の分子にみられなくとも、又はたとえ2つ
の分子のアミノ酸配列が同一でなくとも、変異体である
と考えられる。機能的誘導体にはアミノ酸残基の置換、
挿入、及び欠失の少なくとも一つを含むアミノ酸配列を
示し、類似の生物活性を有する蛋白質、及びそれをコー
ドする遺伝子も含まれる。オーレオバシジン感受性に関
連する蛋白質へのアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失は
遺伝子の部位特異的変異誘発により実施することができ
る。単離したオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質
をコードするDNAを、ヌクレオチドの置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つによって修飾するのは容易であ
り、オーレオバシジン感受性に関連する蛋白質及びその
機能的誘導体をコードしている新規なDNAを得ること
ができる。
【0009】アミノ酸残基の置換、挿入、及び欠失に関
し、1又は複数のアミノ酸残基の変換は遺伝子工学的に
作成可能なものであり、生物活性を破壊することなく行
われたものが選抜されうる。更に、特定の位置の残基で
の突然変異を適切に行うためには標的コドンに無作為な
変異誘発を行い、発現された変異体を所望の活性につい
てスクリーニングすればよい。挿入には、オーレオバシ
ジン感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体又は
それらのフラグメントと他の蛋白質又はポリペプチドと
がオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質又はその機
能的誘導体又はそれらのフラグメントのアミノ末端及び
/又はカルボキシ末端において、ペプチド結合を介して
結合している融合蛋白質を含む。更に、アミノ酸残基を
欠失させる方法として、ギャップド デュプレックス
(gapped duplex)法によりアミノ酸配列の任意のアミノ
酸コドンを終止コドンに置換することにより、置換した
アミノ酸残基よりカルボキシ末端側を欠失させることが
できる。別の方法としては、コードするDNAをアミノ
酸配列のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端に対応す
る部分より分解するディレーション法〔ジーン(Gene)
、第33巻、第103〜119頁、(1985)〕に
より欠失する方法や、開始コドン及び/又は終止コドン
を含むプライマーを用いたPCR法により任意の長さの
アミノ末端及び/又はカルボキシ末端を欠失させた蛋白
質をコードするDNAを得ることができる。なお、部位
特異的変異誘発はオリゴヌクレオチドを用いたギャップ
ド デュプレックス法〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー(Methods in Enzymology)、第154巻、第350
〜367頁(1987)〕や、オリゴヌクレオチドを用
いたウラシルDNA法〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー、第154巻、第367〜382頁(198
7)〕、亜硝酸法〔プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ USA(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第79
巻、第7258〜7262頁(1982)〕、更にカセ
ット変異法〔ジーン、第34巻、第315〜323頁
(1985)〕が知られている。
し、1又は複数のアミノ酸残基の変換は遺伝子工学的に
作成可能なものであり、生物活性を破壊することなく行
われたものが選抜されうる。更に、特定の位置の残基で
の突然変異を適切に行うためには標的コドンに無作為な
変異誘発を行い、発現された変異体を所望の活性につい
てスクリーニングすればよい。挿入には、オーレオバシ
ジン感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体又は
それらのフラグメントと他の蛋白質又はポリペプチドと
がオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質又はその機
能的誘導体又はそれらのフラグメントのアミノ末端及び
/又はカルボキシ末端において、ペプチド結合を介して
結合している融合蛋白質を含む。更に、アミノ酸残基を
欠失させる方法として、ギャップド デュプレックス
(gapped duplex)法によりアミノ酸配列の任意のアミノ
酸コドンを終止コドンに置換することにより、置換した
アミノ酸残基よりカルボキシ末端側を欠失させることが
できる。別の方法としては、コードするDNAをアミノ
酸配列のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端に対応す
る部分より分解するディレーション法〔ジーン(Gene)
、第33巻、第103〜119頁、(1985)〕に
より欠失する方法や、開始コドン及び/又は終止コドン
を含むプライマーを用いたPCR法により任意の長さの
アミノ末端及び/又はカルボキシ末端を欠失させた蛋白
質をコードするDNAを得ることができる。なお、部位
特異的変異誘発はオリゴヌクレオチドを用いたギャップ
ド デュプレックス法〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー(Methods in Enzymology)、第154巻、第350
〜367頁(1987)〕や、オリゴヌクレオチドを用
いたウラシルDNA法〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー、第154巻、第367〜382頁(198
7)〕、亜硝酸法〔プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ USA(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第79
巻、第7258〜7262頁(1982)〕、更にカセ
ット変異法〔ジーン、第34巻、第315〜323頁
(1985)〕が知られている。
【0010】本発明の第1の発明は、アスペルギルス属
を始めとする糸状菌より得られるオーレオバシジン感受
性関連遺伝子又はその機能的誘導体である。本遺伝子を
単離するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細
胞より変異処理により耐性株を誘導し、この耐性株の染
色体DNA又はcDNAからDNAライブラリーを作製
し、このライブラリーの中から耐性を付与する遺伝子
(耐性遺伝子)をクローニングする。また、感受性株の
DNAライブラリーを作製し、このライブラリーの中
に、耐性遺伝子とハイブリダイズするDNA分子を単
離、クローニングすれば、感受性遺伝子を単離すること
ができる。変異処理の方法としては、エチルメタンスル
ホネート(EMS)、N−メチル−N′−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン(NTG)などの薬剤処理による方
法、紫外線又は放射線により処理する方法などがある。
耐性を獲得した変異体を選択するためには、変異処理し
た細胞を適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養
培地で、適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を
選択することができる。変異処理の方法、条件により、
得られる耐性株は異なる可能性がある。また、選択の
際、オーレオバシジンの濃度を変えることにより耐性度
の異なる株を分離したり、温度を変化させることにより
温度感受性耐性株を分離することができる。オーレオバ
シジンに対する耐性の機構は複数存在するため、これら
の種々の耐性株を遺伝学的に分類していくことにより、
複数の耐性遺伝子を単離することができる。
を始めとする糸状菌より得られるオーレオバシジン感受
性関連遺伝子又はその機能的誘導体である。本遺伝子を
単離するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細
胞より変異処理により耐性株を誘導し、この耐性株の染
色体DNA又はcDNAからDNAライブラリーを作製
し、このライブラリーの中から耐性を付与する遺伝子
(耐性遺伝子)をクローニングする。また、感受性株の
DNAライブラリーを作製し、このライブラリーの中
に、耐性遺伝子とハイブリダイズするDNA分子を単
離、クローニングすれば、感受性遺伝子を単離すること
ができる。変異処理の方法としては、エチルメタンスル
ホネート(EMS)、N−メチル−N′−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン(NTG)などの薬剤処理による方
法、紫外線又は放射線により処理する方法などがある。
耐性を獲得した変異体を選択するためには、変異処理し
た細胞を適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養
培地で、適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を
選択することができる。変異処理の方法、条件により、
得られる耐性株は異なる可能性がある。また、選択の
際、オーレオバシジンの濃度を変えることにより耐性度
の異なる株を分離したり、温度を変化させることにより
温度感受性耐性株を分離することができる。オーレオバ
シジンに対する耐性の機構は複数存在するため、これら
の種々の耐性株を遺伝学的に分類していくことにより、
複数の耐性遺伝子を単離することができる。
【0011】本発明のアスペルギルス属糸状菌のオーレ
オバシジン感受性関連遺伝子はA.ニドランスの耐性変
異株より単離したanaur1R 、及び感受性株より単離した
anaur1S 、及びA.フミガタスの感受性株より単離した
afaur1S がある。なお、添付図面の図1にアスペルギル
ス属糸状菌由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子の
anaur1R のゲノムDNAの制限酵素地図を、図2にanau
r1S のcDNAの制限酵素地図を、図3にafaur1S のc
DNAの制限酵素地図をそれぞれ示す。
オバシジン感受性関連遺伝子はA.ニドランスの耐性変
異株より単離したanaur1R 、及び感受性株より単離した
anaur1S 、及びA.フミガタスの感受性株より単離した
afaur1S がある。なお、添付図面の図1にアスペルギル
ス属糸状菌由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子の
anaur1R のゲノムDNAの制限酵素地図を、図2にanau
r1S のcDNAの制限酵素地図を、図3にafaur1S のc
DNAの制限酵素地図をそれぞれ示す。
【0012】オーレオバシジンに感受性であるA.ニド
ランスを紫外線により変異処理し、得られた耐性菌のゲ
ノムライブラリーを作製し、その中から耐性遺伝子 (an
aur1R ) を含有する、図1の制限酵素地図を有するDN
A断片を単離した。本遺伝子の塩基配列は配列表の配列
番号1のとおりである。この塩基配列より予想される本
遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配
列番号2のとおりである。この耐性遺伝子を用いたハイ
ブリダイゼーションにより、感受性株のcDNAライブ
ラリーより感受性遺伝子(anaur1S ) を含有する、図2
の制限酵素地図を有するcDNA断片を単離した。この
感受性遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号3のとおり
であり、この塩基配列より予想される本遺伝子のコード
する蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号4のとお
りである。配列番号3と配列番号1の比較によりゲノム
DNAには配列番号1の1508番目から1563番目
までのイントロン(介在配列)が1箇所存在しているこ
とが明らかとなった。更に、配列番号1の1965番目
の塩基がGからTへの突然変異が起こり、配列番号4と
配列番号2の比較によりアミノ酸レベルで275番目の
アミノ酸がグリシンからバリンへ変化し、これが耐性の
原因となっていることが明らかとなった。本発明の糸状
菌由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子の一部を化
学的、物理的方法により変異させた遺伝子も本発明の第
1の発明に含まれる。
ランスを紫外線により変異処理し、得られた耐性菌のゲ
ノムライブラリーを作製し、その中から耐性遺伝子 (an
aur1R ) を含有する、図1の制限酵素地図を有するDN
A断片を単離した。本遺伝子の塩基配列は配列表の配列
番号1のとおりである。この塩基配列より予想される本
遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配
列番号2のとおりである。この耐性遺伝子を用いたハイ
ブリダイゼーションにより、感受性株のcDNAライブ
ラリーより感受性遺伝子(anaur1S ) を含有する、図2
の制限酵素地図を有するcDNA断片を単離した。この
感受性遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号3のとおり
であり、この塩基配列より予想される本遺伝子のコード
する蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号4のとお
りである。配列番号3と配列番号1の比較によりゲノム
DNAには配列番号1の1508番目から1563番目
までのイントロン(介在配列)が1箇所存在しているこ
とが明らかとなった。更に、配列番号1の1965番目
の塩基がGからTへの突然変異が起こり、配列番号4と
配列番号2の比較によりアミノ酸レベルで275番目の
アミノ酸がグリシンからバリンへ変化し、これが耐性の
原因となっていることが明らかとなった。本発明の糸状
菌由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子の一部を化
学的、物理的方法により変異させた遺伝子も本発明の第
1の発明に含まれる。
【0013】本発明の第2の発明は、アスペルギルス属
を始めとする糸状菌由来のオーレオバシジン感受性関連
遺伝子又はその機能的誘導体のクローニング方法に関
し、本発明の第1の発明の糸状菌由来のオーレオバシジ
ン感受性関連遺伝子又はその機能的誘導体又はそれらの
一部をプローブとして用いることを特徴とする。すなわ
ち、上記のようにして得られた遺伝子の一部(15オリ
ゴヌクレオチド以上)又は全部を用いて、ハイブリダイ
ゼーション法、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクシ
ョン(PCR)法により探索すれば、同様の機能を有す
る蛋白質をコードする遺伝子を単離することができる。
を始めとする糸状菌由来のオーレオバシジン感受性関連
遺伝子又はその機能的誘導体のクローニング方法に関
し、本発明の第1の発明の糸状菌由来のオーレオバシジ
ン感受性関連遺伝子又はその機能的誘導体又はそれらの
一部をプローブとして用いることを特徴とする。すなわ
ち、上記のようにして得られた遺伝子の一部(15オリ
ゴヌクレオチド以上)又は全部を用いて、ハイブリダイ
ゼーション法、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクシ
ョン(PCR)法により探索すれば、同様の機能を有す
る蛋白質をコードする遺伝子を単離することができる。
【0014】本発明者らは上記のプローブとして用いる
のに好適な領域を検討するために、本発明のanaur1S 遺
伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番
号4)、及びafaur1S 遺伝子がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列(配列表配列番号5)を、本発明者らが既に単
離している、カナダ国特許出願公開公報2124034
号記載のS.セレビシエ由来のオーレオバシジン感受性
遺伝子(scaur1S )がコードする蛋白質のアミノ酸配列
(配列表配列番号6)、Schizo.ポンベ由来のオ
ーレオバシジン感受性遺伝子(spaur1S )がコードする
蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番号7)、及C.ア
ルビカンス由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子
(caaur1)がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表
配列番号8)と比較したところ、全体ではホモロジーは
ない。しかしながら、これら異種のオーレオバシジン感
受性関連遺伝子間で特有の保存配列が存在していること
が初めて明らかとなった。この保存配列はホモロジーが
80%以上と極めて保存性が高く、またプローブとして
用いるのに十分なアミノ酸8残基以上の長さを持ってい
る。図4は配列表の配列番号4〜8でそれぞれ表される
アミノ酸配列を比較した図であり、図中に示す本発明者
らがボックス(Box)配列と命名した3種類の配列(Box-
1〜3)はこの保存配列を示している。これに基づいて
配列表の配列番号9〜11でそれぞれ示されるBox
1、2、又は3のアミノ酸配列より作成したプライマー
若しくはプローブを使用することにより、糸状菌由来の
オーレオバシジン感受性関連遺伝子又はその機能的誘導
体をクローニングすることができる。なお図4における
5段の塩基配列は、上段から下段に向かって順番にそれ
ぞれ配列表の配列番号4(最上段)、配列番号5(第2
段)、配列番号6(第3段)、配列番号7(第4段)、
配列番号8(最下段)に相当する。
のに好適な領域を検討するために、本発明のanaur1S 遺
伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番
号4)、及びafaur1S 遺伝子がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列(配列表配列番号5)を、本発明者らが既に単
離している、カナダ国特許出願公開公報2124034
号記載のS.セレビシエ由来のオーレオバシジン感受性
遺伝子(scaur1S )がコードする蛋白質のアミノ酸配列
(配列表配列番号6)、Schizo.ポンベ由来のオ
ーレオバシジン感受性遺伝子(spaur1S )がコードする
蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番号7)、及C.ア
ルビカンス由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子
(caaur1)がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表
配列番号8)と比較したところ、全体ではホモロジーは
ない。しかしながら、これら異種のオーレオバシジン感
受性関連遺伝子間で特有の保存配列が存在していること
が初めて明らかとなった。この保存配列はホモロジーが
80%以上と極めて保存性が高く、またプローブとして
用いるのに十分なアミノ酸8残基以上の長さを持ってい
る。図4は配列表の配列番号4〜8でそれぞれ表される
アミノ酸配列を比較した図であり、図中に示す本発明者
らがボックス(Box)配列と命名した3種類の配列(Box-
1〜3)はこの保存配列を示している。これに基づいて
配列表の配列番号9〜11でそれぞれ示されるBox
1、2、又は3のアミノ酸配列より作成したプライマー
若しくはプローブを使用することにより、糸状菌由来の
オーレオバシジン感受性関連遺伝子又はその機能的誘導
体をクローニングすることができる。なお図4における
5段の塩基配列は、上段から下段に向かって順番にそれ
ぞれ配列表の配列番号4(最上段)、配列番号5(第2
段)、配列番号6(第3段)、配列番号7(第4段)、
配列番号8(最下段)に相当する。
【0015】目的のオーレオバシジン感受性に関連する
蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子をハイ
ブリダイゼーションにより得る方法としては、例えば以
下の方法が適用できる。まず目的の遺伝子源から得た染
色体DNA、あるいはmRNAより逆転写酵素により作
製したcDNAを常法に従いプラスミドやファージベク
ターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製す
る。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育した
コロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの
膜に移し取り、変性処理によりDNAを膜に固定する。
この膜をあらかじめ32Pなどで標識したプローブ(使用
するプローブとしては、配列表の配列番号4に記載した
アミノ酸配列、又はその一部をコードする遺伝子であれ
ばよく、例えば、配列表の配列番号3に記載した遺伝
子、又はその一部を使用することができる。好適には配
列表の配列番号9〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配
列、又は一部をコードする15塩基以上の塩基配列を使
用することができる)を含む溶液中で保温し、膜上のD
NAとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例
えばDNAを固定化した膜を、6×SSC、1%ラウリ
ル硫酸ナトリウム、100μg/mlのサケ精子DN
A、5×デンハルツ(ウシ血清アルブミン、ポリビニル
ピロリドン、フィコールをそれぞれ0.1%の濃度で含
む)を含む溶液中で65℃で20時間、プローブとハイ
ブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション
後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー
等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同
定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単
一になるまで繰返す。こうして得られたクローンの中に
は、目的の蛋白質をコードする遺伝子が挿入されてい
る。
蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子をハイ
ブリダイゼーションにより得る方法としては、例えば以
下の方法が適用できる。まず目的の遺伝子源から得た染
色体DNA、あるいはmRNAより逆転写酵素により作
製したcDNAを常法に従いプラスミドやファージベク
ターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製す
る。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育した
コロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの
膜に移し取り、変性処理によりDNAを膜に固定する。
この膜をあらかじめ32Pなどで標識したプローブ(使用
するプローブとしては、配列表の配列番号4に記載した
アミノ酸配列、又はその一部をコードする遺伝子であれ
ばよく、例えば、配列表の配列番号3に記載した遺伝
子、又はその一部を使用することができる。好適には配
列表の配列番号9〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配
列、又は一部をコードする15塩基以上の塩基配列を使
用することができる)を含む溶液中で保温し、膜上のD
NAとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例
えばDNAを固定化した膜を、6×SSC、1%ラウリ
ル硫酸ナトリウム、100μg/mlのサケ精子DN
A、5×デンハルツ(ウシ血清アルブミン、ポリビニル
ピロリドン、フィコールをそれぞれ0.1%の濃度で含
む)を含む溶液中で65℃で20時間、プローブとハイ
ブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション
後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー
等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同
定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単
一になるまで繰返す。こうして得られたクローンの中に
は、目的の蛋白質をコードする遺伝子が挿入されてい
る。
【0016】得られた遺伝子は、例えば次のように塩基
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のオーレオバシジ
ン感受性に関連する蛋白質及びその機能的誘導体をコー
ドする遺伝子であるかを確認する。塩基配列の決定は、
ハイブリダイゼーションにより得られたクローンの場
合、組換体が大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プ
ラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により
切断し挿入断片を取り出し、M13ファージベクター等
にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を
決定する。組換体がファージの場合も基本的に同様のス
テップにより塩基配列を決定することができる。これら
培養から塩基配列決定までの基本的な実験法について
は、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル〔Molecular Cloning,A Laboratory
Manual、1982年、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー発行、T.マニアティス(T. Maniatis)ほか
著〕等に記載されている。
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のオーレオバシジ
ン感受性に関連する蛋白質及びその機能的誘導体をコー
ドする遺伝子であるかを確認する。塩基配列の決定は、
ハイブリダイゼーションにより得られたクローンの場
合、組換体が大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プ
ラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により
切断し挿入断片を取り出し、M13ファージベクター等
にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を
決定する。組換体がファージの場合も基本的に同様のス
テップにより塩基配列を決定することができる。これら
培養から塩基配列決定までの基本的な実験法について
は、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル〔Molecular Cloning,A Laboratory
Manual、1982年、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー発行、T.マニアティス(T. Maniatis)ほか
著〕等に記載されている。
【0017】得られた遺伝子が目的のオーレオバシジン
感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体をコード
する遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された
塩基配列を配列表の配列番号4に記載したアミノ酸配列
と比較してその遺伝子構造及びアミノ酸配列を知ること
ができる。また、得られた遺伝子がオーレオバシジン感
受性又は耐性を保持しているかどうかを調べるために、
得られた遺伝子を感受性細胞に形質転換し、得られた形
質転換細胞のオーレオバシジンに対する感受性を測定す
ることにより、遺伝子の活性を明らかにすることができ
る。又は、オーレオバシジン感受性関連遺伝子を破壊又
は変異させることにより、その活性をもたない細胞へ得
られた遺伝子を形質転換することによっても、活性を測
定することができる。上記の形質転換される遺伝子は形
質転換される細胞内で発現可能とするために、遺伝子上
流及び/又は下流に発現のために必要な配列(プロモー
ター、ターミネーターなど)を含んだ状態が望ましい。
感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体をコード
する遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された
塩基配列を配列表の配列番号4に記載したアミノ酸配列
と比較してその遺伝子構造及びアミノ酸配列を知ること
ができる。また、得られた遺伝子がオーレオバシジン感
受性又は耐性を保持しているかどうかを調べるために、
得られた遺伝子を感受性細胞に形質転換し、得られた形
質転換細胞のオーレオバシジンに対する感受性を測定す
ることにより、遺伝子の活性を明らかにすることができ
る。又は、オーレオバシジン感受性関連遺伝子を破壊又
は変異させることにより、その活性をもたない細胞へ得
られた遺伝子を形質転換することによっても、活性を測
定することができる。上記の形質転換される遺伝子は形
質転換される細胞内で発現可能とするために、遺伝子上
流及び/又は下流に発現のために必要な配列(プロモー
ター、ターミネーターなど)を含んだ状態が望ましい。
【0018】得られた遺伝子がオーレオバシジン感受性
に関連する蛋白質又はその機能的誘導体をコードする領
域のすべてを含まない場合には、得られた遺伝子を基に
して合成DNAプライマーを作製し、PCRにより足り
ない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプロー
ブとして、更にDNAライブラリー又はcDNAライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、本発明のオー
レオバシジン感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘
導体をコードする遺伝子にハイブリダイズするオーレオ
バシジン感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体
の全コード領域の塩基配列を決定することができる。例
えば、図2のPstI−EcoRI断片(921bp)
のDNA断片をプローブとして病原性真菌であるA.フ
ミガタスのcDNAライブラリーをスクリーニングする
ことにより、anaur1S 遺伝子と同様の機能を有するA.
フミガタスの遺伝子(afaur1S )を含有する図3の制限
酵素地図を有するcDNA分子が得られた。本遺伝子の
塩基配列は配列表の配列番号12のとおりであり、この
塩基配列より予想される本遺伝子のコードする蛋白質の
アミノ酸配列は配列表の配列番号5のとおりである。an
aur1S 遺伝子とafaur1S 遺伝子とを比較すると、アミノ
酸レベルで87%のホモロジーがあった。更に、anaur1
S 遺伝子のDNA断片をプローブとして、アスペルギル
ス ニガー(Aspergillus niger 、以下、A.ニガーと
略記する)、及びアスペルギルス オリゼー(Aspergil
lus oryzae、以下、A.オリゼーと略記する)より調製
したゲノムDNAを用いてサザンブロット解析を行った
結果、A.ニガーやA.オリゼーにも同様のオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子が存在することが明らかとなっ
た。アスペルギルス属以外の糸状菌、例えばペニシリウ
ム属などからも同様の方法によりオーレオバシジン感受
性関連遺伝子を単離することができる。
に関連する蛋白質又はその機能的誘導体をコードする領
域のすべてを含まない場合には、得られた遺伝子を基に
して合成DNAプライマーを作製し、PCRにより足り
ない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプロー
ブとして、更にDNAライブラリー又はcDNAライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、本発明のオー
レオバシジン感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘
導体をコードする遺伝子にハイブリダイズするオーレオ
バシジン感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体
の全コード領域の塩基配列を決定することができる。例
えば、図2のPstI−EcoRI断片(921bp)
のDNA断片をプローブとして病原性真菌であるA.フ
ミガタスのcDNAライブラリーをスクリーニングする
ことにより、anaur1S 遺伝子と同様の機能を有するA.
フミガタスの遺伝子(afaur1S )を含有する図3の制限
酵素地図を有するcDNA分子が得られた。本遺伝子の
塩基配列は配列表の配列番号12のとおりであり、この
塩基配列より予想される本遺伝子のコードする蛋白質の
アミノ酸配列は配列表の配列番号5のとおりである。an
aur1S 遺伝子とafaur1S 遺伝子とを比較すると、アミノ
酸レベルで87%のホモロジーがあった。更に、anaur1
S 遺伝子のDNA断片をプローブとして、アスペルギル
ス ニガー(Aspergillus niger 、以下、A.ニガーと
略記する)、及びアスペルギルス オリゼー(Aspergil
lus oryzae、以下、A.オリゼーと略記する)より調製
したゲノムDNAを用いてサザンブロット解析を行った
結果、A.ニガーやA.オリゼーにも同様のオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子が存在することが明らかとなっ
た。アスペルギルス属以外の糸状菌、例えばペニシリウ
ム属などからも同様の方法によりオーレオバシジン感受
性関連遺伝子を単離することができる。
【0019】本発明の第3の発明は、上記の核酸プロー
ブであり、オーレオバシジン感受性関連遺伝子、例え
ば、図1、図2又は図3に示した制限酵素地図を有する
DNA断片と選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以
上のオリゴヌクレオチドである。この核酸プローブはイ
ン シトゥ(in situ)ハイブリダイゼーション、上記遺
伝子を発現する組織の確認、各種生体組織における遺伝
子やmRNAの存在の確認などに利用可能である。該核
酸プローブは上記遺伝子又は遺伝子断片を適当なベクタ
ーにつなぎ、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液から
フェノール等により抽出、そしてベクターとつないだ部
位を認識する制限酵素で切断、電気泳動後、ゲノムより
切り出せば調製できる。また、該核酸プローブは配列表
の配列番号1、3、12のそれぞれの塩基配列に基づ
き、DNA合成機による化学合成やPCRによる遺伝子
増幅技術によっても調製できる。該核酸プローブとして
の使用に好適な配列としては、配列表の配列番号9〜1
1でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又はその一部をコ
ードする15塩基以上の塩基配列が挙げられる。該核酸
プローブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位
体や蛍光で標識することもできる。
ブであり、オーレオバシジン感受性関連遺伝子、例え
ば、図1、図2又は図3に示した制限酵素地図を有する
DNA断片と選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以
上のオリゴヌクレオチドである。この核酸プローブはイ
ン シトゥ(in situ)ハイブリダイゼーション、上記遺
伝子を発現する組織の確認、各種生体組織における遺伝
子やmRNAの存在の確認などに利用可能である。該核
酸プローブは上記遺伝子又は遺伝子断片を適当なベクタ
ーにつなぎ、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液から
フェノール等により抽出、そしてベクターとつないだ部
位を認識する制限酵素で切断、電気泳動後、ゲノムより
切り出せば調製できる。また、該核酸プローブは配列表
の配列番号1、3、12のそれぞれの塩基配列に基づ
き、DNA合成機による化学合成やPCRによる遺伝子
増幅技術によっても調製できる。該核酸プローブとして
の使用に好適な配列としては、配列表の配列番号9〜1
1でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又はその一部をコ
ードする15塩基以上の塩基配列が挙げられる。該核酸
プローブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位
体や蛍光で標識することもできる。
【0020】本発明の第4の発明は、上記の糸状菌由来
のオーレオバシジン感受性関連遺伝子のアンチセンスD
NAであり、本発明の第5の発明はアンチセンスRNA
である。これらのアンチセンスDNA又はアンチセンス
RNAを細胞に導入することによりオーレオバシジン感
受性関連遺伝子の発現を制御することが可能である。導
入するアンチセンスDNAとしては、例えば、配列表の
配列番号1、3、12の各オーレオバシジン感受性関連
遺伝子の、それぞれの対応するアンチセンスDNA又は
その一部を用いることができる。該アンチセンスDNA
の例を配列表の配列番号13に示す。これは配列表の配
列番号1のオーレオバシジン感受性関連遺伝子のアンチ
センスDNAの配列を示すものである。アンチセンスD
NAとしては、例えば、これらのアンチセンスDNAの
一部を適当に切断して得た断片を用いてもよいし、これ
らのアンチセンスDNA配列に基づいて合成したDNA
を用いてもよい。導入するアンチセンスRNAとして
は、例えば、配列表の配列番号1、3、12の各オーレ
オバシジン感受性関連遺伝子の、それぞれの対応するア
ンチセンスRNA又はその一部を用いることができる。
該アンチセンスRNAの例を配列表の配列番号14に示
す。これは配列表の配列番号1のオーレオバシジン感受
性関連遺伝子のアンチセンスRNAの配列を示すもので
ある。アンチセンスRNAとしては、例えば、これらの
アンチセンスRNAの一部を適当に切断して得た断片を
用いてもよいし、これらのアンチセンスRNA配列に基
づいて合成したRNAや、例えば、配列表の配列番号
1、3のオーレオバシジン感受性関連遺伝子の、それぞ
れの対応するアンチセンスRNA又はその一部を用い
て、イン ビトロ転写系でRNAポリメラーゼを作用さ
せて作製したRNAを用いてもよい。また、アンチセン
スDNA及びアンチセンスRNAは、生体内で分解され
にくいように、更に、細胞膜を通過できるように化学的
な修飾を施しておくことができる。mRNAを不活化で
きるような物質、例えば、リボザイム(ribozyme) を結
合させてもよい。このようにして調製したアンチセンス
DNA及びアンチセンスRNAは、真菌症を始めとする
オーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はその機
能的誘導体をコードするmRNA量が増大している各種
疾患の治療に使用することができる。
のオーレオバシジン感受性関連遺伝子のアンチセンスD
NAであり、本発明の第5の発明はアンチセンスRNA
である。これらのアンチセンスDNA又はアンチセンス
RNAを細胞に導入することによりオーレオバシジン感
受性関連遺伝子の発現を制御することが可能である。導
入するアンチセンスDNAとしては、例えば、配列表の
配列番号1、3、12の各オーレオバシジン感受性関連
遺伝子の、それぞれの対応するアンチセンスDNA又は
その一部を用いることができる。該アンチセンスDNA
の例を配列表の配列番号13に示す。これは配列表の配
列番号1のオーレオバシジン感受性関連遺伝子のアンチ
センスDNAの配列を示すものである。アンチセンスD
NAとしては、例えば、これらのアンチセンスDNAの
一部を適当に切断して得た断片を用いてもよいし、これ
らのアンチセンスDNA配列に基づいて合成したDNA
を用いてもよい。導入するアンチセンスRNAとして
は、例えば、配列表の配列番号1、3、12の各オーレ
オバシジン感受性関連遺伝子の、それぞれの対応するア
ンチセンスRNA又はその一部を用いることができる。
該アンチセンスRNAの例を配列表の配列番号14に示
す。これは配列表の配列番号1のオーレオバシジン感受
性関連遺伝子のアンチセンスRNAの配列を示すもので
ある。アンチセンスRNAとしては、例えば、これらの
アンチセンスRNAの一部を適当に切断して得た断片を
用いてもよいし、これらのアンチセンスRNA配列に基
づいて合成したRNAや、例えば、配列表の配列番号
1、3のオーレオバシジン感受性関連遺伝子の、それぞ
れの対応するアンチセンスRNA又はその一部を用い
て、イン ビトロ転写系でRNAポリメラーゼを作用さ
せて作製したRNAを用いてもよい。また、アンチセン
スDNA及びアンチセンスRNAは、生体内で分解され
にくいように、更に、細胞膜を通過できるように化学的
な修飾を施しておくことができる。mRNAを不活化で
きるような物質、例えば、リボザイム(ribozyme) を結
合させてもよい。このようにして調製したアンチセンス
DNA及びアンチセンスRNAは、真菌症を始めとする
オーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はその機
能的誘導体をコードするmRNA量が増大している各種
疾患の治療に使用することができる。
【0021】本発明の第6の発明は、本発明の第1の発
明である糸状菌由来のオーレオバシジンの感受性に関連
する蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子を
適当なベクターに組込んだ、組換体プラスミドである。
例えば、酵母の適当なベクターにオーレオバシジン耐性
遺伝子を組込んだプラスミドは、オーレオバシジンを用
いた薬剤耐性により容易に形質転換体を選択できるた
め、選択マーカー遺伝子として有用性が高い。また、組
換体プラスミドは大腸菌などに安定に保持させることが
可能であり、その際、ベクターとして使用可能なものと
して、pUC118、pWH5、pAU−PS、Tra
plex119、pTV118等がある。
明である糸状菌由来のオーレオバシジンの感受性に関連
する蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子を
適当なベクターに組込んだ、組換体プラスミドである。
例えば、酵母の適当なベクターにオーレオバシジン耐性
遺伝子を組込んだプラスミドは、オーレオバシジンを用
いた薬剤耐性により容易に形質転換体を選択できるた
め、選択マーカー遺伝子として有用性が高い。また、組
換体プラスミドは大腸菌などに安定に保持させることが
可能であり、その際、ベクターとして使用可能なものと
して、pUC118、pWH5、pAU−PS、Tra
plex119、pTV118等がある。
【0022】また、本発明の第1の発明である糸状菌由
来のオーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はそ
の機能的誘導体をコードする遺伝子を適当なベクターに
つなぎ、糸状菌を形質転換することができる。pDHG
25等〔ジーン、第98巻、第61〜67頁(199
1)〕のプラスミドをベクターとして使用すれば、導入
したDNAは糸状菌内でプラスミド状態で存在しうる。
更にpSa23等〔アグリカルチュラル アンド バイ
オロジカル ケミストリー(Agricultural and Biologi
cal Chemistry)、第51巻、第2549〜2555頁
(1987)〕のプラスミドをベクターとして使用すれ
ば、糸状菌内の染色体内に組込まれた状態で安定に維持
できる。また、本発明の遺伝子を必要に応じて適当な制
限酵素などで蛋白質に翻訳される領域(open reading f
rame、ORF)にだけ切り縮めた後、適当なベクターにつな
ぎ、発現用組換体プラスミドとすることができる。発現
用プラスミドとしては、宿主が大腸菌の時はpTV11
8等のプラスミド、宿主が酵母の時は、pYE2等のプ
ラスミド、宿主が哺乳類細胞の時は、pMAMneo等
のプラスミド、宿主が糸状菌の時は、pTAex3等の
プラスミドをベクターとして使用すればよい。
来のオーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はそ
の機能的誘導体をコードする遺伝子を適当なベクターに
つなぎ、糸状菌を形質転換することができる。pDHG
25等〔ジーン、第98巻、第61〜67頁(199
1)〕のプラスミドをベクターとして使用すれば、導入
したDNAは糸状菌内でプラスミド状態で存在しうる。
更にpSa23等〔アグリカルチュラル アンド バイ
オロジカル ケミストリー(Agricultural and Biologi
cal Chemistry)、第51巻、第2549〜2555頁
(1987)〕のプラスミドをベクターとして使用すれ
ば、糸状菌内の染色体内に組込まれた状態で安定に維持
できる。また、本発明の遺伝子を必要に応じて適当な制
限酵素などで蛋白質に翻訳される領域(open reading f
rame、ORF)にだけ切り縮めた後、適当なベクターにつな
ぎ、発現用組換体プラスミドとすることができる。発現
用プラスミドとしては、宿主が大腸菌の時はpTV11
8等のプラスミド、宿主が酵母の時は、pYE2等のプ
ラスミド、宿主が哺乳類細胞の時は、pMAMneo等
のプラスミド、宿主が糸状菌の時は、pTAex3等の
プラスミドをベクターとして使用すればよい。
【0023】本発明の第7の発明は、上記の組換体プラ
スミドを適当な宿主に導入した形質転換体である。宿主
としては、大腸菌、酵母、哺乳類細胞が使用可能であ
る。anaur1S 遺伝子を組込んだプラスミドpANAR1
で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia co
li JM109/pANAR1 と命名、表示され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−518
0として寄託されている。
スミドを適当な宿主に導入した形質転換体である。宿主
としては、大腸菌、酵母、哺乳類細胞が使用可能であ
る。anaur1S 遺伝子を組込んだプラスミドpANAR1
で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia co
li JM109/pANAR1 と命名、表示され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−518
0として寄託されている。
【0024】本発明の第8の発明は、オーレオバシジン
の感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体の製造
方法であり、該蛋白質又はその機能的誘導体をコードす
る遺伝子を含有させた、本発明の第6の発明の組換体プ
ラスミドを導入した発現用形質転換体を適当な栄養培地
で培養し、該蛋白質を発現させ、その細胞又は培地より
該蛋白質を回収、精製すればよい。該蛋白質をコードす
る遺伝子を発現させるために、宿主として大腸菌、酵
母、哺乳類細胞が使用される。
の感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体の製造
方法であり、該蛋白質又はその機能的誘導体をコードす
る遺伝子を含有させた、本発明の第6の発明の組換体プ
ラスミドを導入した発現用形質転換体を適当な栄養培地
で培養し、該蛋白質を発現させ、その細胞又は培地より
該蛋白質を回収、精製すればよい。該蛋白質をコードす
る遺伝子を発現させるために、宿主として大腸菌、酵
母、哺乳類細胞が使用される。
【0025】本発明の第9の発明は、オーレオバシジン
の感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体であ
り、上記のanaur1R 、anaur1S 、及びafaur1S 遺伝子の
コードする配列番号2、4、及び5に示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質が挙げられる。当然これらの蛋白質
は、化学的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿入及び欠
失の少なくとも一つがなされていても良い。配列番号
2、4、及び5のアミノ酸配列を有する蛋白質やそのア
ミノ酸配列の一部の領域のペプチド断片などを抗原とし
て使用すれば、オーレオバシジンの感受性に関連する蛋
白質に対する抗体の作成も可能である。
の感受性に関連する蛋白質又はその機能的誘導体であ
り、上記のanaur1R 、anaur1S 、及びafaur1S 遺伝子の
コードする配列番号2、4、及び5に示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質が挙げられる。当然これらの蛋白質
は、化学的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿入及び欠
失の少なくとも一つがなされていても良い。配列番号
2、4、及び5のアミノ酸配列を有する蛋白質やそのア
ミノ酸配列の一部の領域のペプチド断片などを抗原とし
て使用すれば、オーレオバシジンの感受性に関連する蛋
白質に対する抗体の作成も可能である。
【0026】本発明の第10の発明は、配列表の配列番
号4で表されるオーレオバシジン感受性を付与する蛋白
質の少なくとも275番目のアミノ酸Glyが他のアミ
ノ酸に置換されたオーレオバシジン耐性付与蛋白質に関
し、更に、その他のアミノ酸残基が生物活性を低下させ
ることなく化学的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿
入、及び欠失の少なくとも一つがなされている機能的誘
導体をも含む。本発明のオーレオバシジン耐性付与蛋白
質は好適には配列表の配列番号3及び配列番号12で表
されるオーレオバシジン感受性付与蛋白質をコードする
DNAを用いることにより遺伝子工学的に作製すること
ができ、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細胞に変換
させる活性を測定することにより、その生物活性を測定
することができる。
号4で表されるオーレオバシジン感受性を付与する蛋白
質の少なくとも275番目のアミノ酸Glyが他のアミ
ノ酸に置換されたオーレオバシジン耐性付与蛋白質に関
し、更に、その他のアミノ酸残基が生物活性を低下させ
ることなく化学的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿
入、及び欠失の少なくとも一つがなされている機能的誘
導体をも含む。本発明のオーレオバシジン耐性付与蛋白
質は好適には配列表の配列番号3及び配列番号12で表
されるオーレオバシジン感受性付与蛋白質をコードする
DNAを用いることにより遺伝子工学的に作製すること
ができ、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細胞に変換
させる活性を測定することにより、その生物活性を測定
することができる。
【0027】本発明の第11の発明は、第10の発明の
オーレオバシジン耐性付与蛋白質をコードするDNAに
関し、これらのDNAをヌクレオチドの置換、挿入及び
欠失の少なくとも一つによって修飾したDNAも含む。
これらの修飾は容易に遺伝子の部位特異的変異誘発によ
り実施可能である。これらの修飾を受けたDNAは変異
体蛋白質を生産するために用いられる。
オーレオバシジン耐性付与蛋白質をコードするDNAに
関し、これらのDNAをヌクレオチドの置換、挿入及び
欠失の少なくとも一つによって修飾したDNAも含む。
これらの修飾は容易に遺伝子の部位特異的変異誘発によ
り実施可能である。これらの修飾を受けたDNAは変異
体蛋白質を生産するために用いられる。
【0028】本発明の第12の発明は核酸プローブを用
いる、ハイブリダイゼーションによるオーレオバシジン
感受性関連遺伝子の検出方法に関し、核酸プローブとし
ては、配列表の配列番号1、3、12及びこれらDNA
断片と選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以上のオ
リゴヌクレオチドが挙げられる。好適には配列表の配列
番号9〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又はそ
の一部をコードする15塩基以上の塩基配列が挙げられ
る。これらの核酸プローブを用いて目的の生物より抽
出、精製されたDNA、又はRNAのサザンハイブリダ
イゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションによ
り、目的の生物のオーレオバシジン感受性関連遺伝子を
検出することができる。また、イン シトゥ ハイブリ
ダイゼーションにより、上記遺伝子を発現する組織の確
認、各種生体組織における遺伝子やmRNAの存在の確
認などに利用可能である。該核酸プローブは上記遺伝子
又は遺伝子断片を適当なベクターにつなぎ、細菌に導入
し、複製させ、菌体破砕液からフェノール等により抽
出、そしてベクターとつないだ部位を認識する制限酵素
で切断、電気泳動後、ゲルより切り出せば調製できる。
また、該核酸プローブは配列表の配列番号1、3、12
のそれぞれの塩基配列に基づき、DNA合成機による化
学合成やPCRによる遺伝子増幅技術によっても調製で
きる。該核酸プローブは使用時の検出感度を上げるため
に放射性同位体や蛍光で標識することもできる。
いる、ハイブリダイゼーションによるオーレオバシジン
感受性関連遺伝子の検出方法に関し、核酸プローブとし
ては、配列表の配列番号1、3、12及びこれらDNA
断片と選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以上のオ
リゴヌクレオチドが挙げられる。好適には配列表の配列
番号9〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又はそ
の一部をコードする15塩基以上の塩基配列が挙げられ
る。これらの核酸プローブを用いて目的の生物より抽
出、精製されたDNA、又はRNAのサザンハイブリダ
イゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションによ
り、目的の生物のオーレオバシジン感受性関連遺伝子を
検出することができる。また、イン シトゥ ハイブリ
ダイゼーションにより、上記遺伝子を発現する組織の確
認、各種生体組織における遺伝子やmRNAの存在の確
認などに利用可能である。該核酸プローブは上記遺伝子
又は遺伝子断片を適当なベクターにつなぎ、細菌に導入
し、複製させ、菌体破砕液からフェノール等により抽
出、そしてベクターとつないだ部位を認識する制限酵素
で切断、電気泳動後、ゲルより切り出せば調製できる。
また、該核酸プローブは配列表の配列番号1、3、12
のそれぞれの塩基配列に基づき、DNA合成機による化
学合成やPCRによる遺伝子増幅技術によっても調製で
きる。該核酸プローブは使用時の検出感度を上げるため
に放射性同位体や蛍光で標識することもできる。
【0029】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により限定されない。
明するが、本発明はこれら実施例により限定されない。
【0030】実施例1 A.ニドランス由来のオーレオ
バシジン感受性関連遺伝子anaur1のクローニング 1−a)A.ニドランスのオーレオバシジン耐性変異株
の分離 オーレオバシジンに対して5μg/mlで感受性を示す
A.ニドランスFGSC89株をSDスラント(1%ポ
リペプトンS、2%グルコース、2%寒天)へ植菌し、
30℃、7日間培養した。5mlの0.8%NaClを
含む0.1%ツイーン80(Tween 80)溶液に懸濁
後、ガラスフィルター(3G3タイプ)でろ過し、ろ液
を分生子懸濁液とした。分生子懸濁液を5分間の紫外線
照射により突然変異処理を施した。この条件で生存率は
約25%だった。30分以上の間、光遮断後、SDプレ
ートへまき、30℃、4日間培養した。生じた分生子を
ガラスフィルターで回収し、更に、5μg/mlのオー
レオバシジンを含むCz+bi培地〔4.9%ツアペッ
ク ソリュウション アガー{ CZAPEK SOLUTION AGAR
(ディフコ、Difco)}、200μg/mlアルギニン、
0.02μg/mlビオチン〕へまき、30℃で培養し
た。2〜3日後に8個のオーレオバシジン耐性コロニー
を得た。これらの細胞は80μg/mlのオーレオバシ
ジンに対しても耐性を示したが、アンホテリシンB、シ
クロヘキシミド、クロトリマゾールに対しては親株と同
じ感受性を持つことから多剤耐性変異ではなく、オーレ
オバシジンに特異的な耐性であると推定される。
バシジン感受性関連遺伝子anaur1のクローニング 1−a)A.ニドランスのオーレオバシジン耐性変異株
の分離 オーレオバシジンに対して5μg/mlで感受性を示す
A.ニドランスFGSC89株をSDスラント(1%ポ
リペプトンS、2%グルコース、2%寒天)へ植菌し、
30℃、7日間培養した。5mlの0.8%NaClを
含む0.1%ツイーン80(Tween 80)溶液に懸濁
後、ガラスフィルター(3G3タイプ)でろ過し、ろ液
を分生子懸濁液とした。分生子懸濁液を5分間の紫外線
照射により突然変異処理を施した。この条件で生存率は
約25%だった。30分以上の間、光遮断後、SDプレ
ートへまき、30℃、4日間培養した。生じた分生子を
ガラスフィルターで回収し、更に、5μg/mlのオー
レオバシジンを含むCz+bi培地〔4.9%ツアペッ
ク ソリュウション アガー{ CZAPEK SOLUTION AGAR
(ディフコ、Difco)}、200μg/mlアルギニン、
0.02μg/mlビオチン〕へまき、30℃で培養し
た。2〜3日後に8個のオーレオバシジン耐性コロニー
を得た。これらの細胞は80μg/mlのオーレオバシ
ジンに対しても耐性を示したが、アンホテリシンB、シ
クロヘキシミド、クロトリマゾールに対しては親株と同
じ感受性を持つことから多剤耐性変異ではなく、オーレ
オバシジンに特異的な耐性であると推定される。
【0031】1−b)オーレオバシジン耐性株のゲノム
ライブラリーの作製 オーレオバシジン耐性株の中で特に耐性度の高い株R1
からゲノムDNAを以下の方法により抽出、精製した。
すなわち、PD培地〔2.4%ポテトデキストロースブ
ロス{ POTATO DEXTROSE BROTH(ディフコ)}〕で30
℃、2日間振とう培養した菌糸をガラスフィルター(3
G1タイプ)により集菌し、蒸留水で洗浄した。菌体を
脱水し、プロトプラスト化溶液〔20mg/ml ヤタ
ラーゼ(大関酒造社製)、0.8M NaCl、10m
Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0〕20mlに懸
濁した。30℃でゆっくりかくはんしながら一晩、プロ
トプラストを形成させた。ガラスフィルター(3G2タ
イプ)でのろ過により、ろ液中にプロトプラストを回収
し、2000rpm、5分間の遠心により集菌した。
0.8M NaClで2回洗浄後、プロトプラストを2
mlのTE溶液〔10mMトリス(Tris) −HCl、p
H8.0、0.1mM EDTA〕に懸濁した後、溶菌
溶液(2%SDS、0.1M NaCl、10mM E
DTA、50mMトリス−HCl、pH7.0)を2m
l加えてゆっくりかくはんした。室温で15分間保温
後、3500rpm、10分間遠心して、上清を回収し
た。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール
(25/24/1)を等量加え、ゆっくりチューブを上
下にかくはんした後、3000rpm、5分間遠心し
て、上層を回収した。−20℃エタノールを2.5倍量
加えて、−80℃に10分間放置した後、3500rp
m、15分間遠心し、沈殿したDNAを乾燥させた。
0.5mlのTE溶液と2.5μlとRNaseA(2
0mg/ml)溶液を加え、37℃、30分間保温し
た。0.5mlのフェノール/クロロホルム/イソアミ
ルアルコールを加え、ゆっくりかくはんし10000r
pm、5分間遠心し、上層を回収した。この操作をもう
1回繰返した。0.5mlのクロロホルム/イソアミル
アルコール(24/1)を加え、ゆっくりかくはんし1
0000rpm、5分間遠心し、上清を回収した。0.
05mlの5M NaClと0.5mlのイソプロピル
アルコールを加え、−80℃に10分間放置後、100
00rpm、15分間の遠心によりDNAを回収した。
精製したゲノムDNA8μgを制限酵素BamHIの4
ユニットで37℃、15分間処理による部分分解後、フ
ェノール/クロロホルムにより除蛋白し、エタノール沈
殿した。部分分解DNAを0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、3〜15kb領域のDNAを抽出、精製し
た。得られたDNAとBamHIで完全分解したpDH
G25ベクター〔ジーン、第98巻、第61〜67頁
(1991)〕をDNAライゲーションキット(宝酒造
社製)により連結させた後、大腸菌HB101を形質転
換し、耐性株のゲノムライブラリーを作製した。このゲ
ノムライブラリーを含有させた大腸菌を100μg/m
lアンピシリンを含むLB培地(1%バクトトリプト
ン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%塩化ナト
リウム)50ml中で37℃、一夜培養後、大腸菌から
プラスミドを回収、精製した。
ライブラリーの作製 オーレオバシジン耐性株の中で特に耐性度の高い株R1
からゲノムDNAを以下の方法により抽出、精製した。
すなわち、PD培地〔2.4%ポテトデキストロースブ
ロス{ POTATO DEXTROSE BROTH(ディフコ)}〕で30
℃、2日間振とう培養した菌糸をガラスフィルター(3
G1タイプ)により集菌し、蒸留水で洗浄した。菌体を
脱水し、プロトプラスト化溶液〔20mg/ml ヤタ
ラーゼ(大関酒造社製)、0.8M NaCl、10m
Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0〕20mlに懸
濁した。30℃でゆっくりかくはんしながら一晩、プロ
トプラストを形成させた。ガラスフィルター(3G2タ
イプ)でのろ過により、ろ液中にプロトプラストを回収
し、2000rpm、5分間の遠心により集菌した。
0.8M NaClで2回洗浄後、プロトプラストを2
mlのTE溶液〔10mMトリス(Tris) −HCl、p
H8.0、0.1mM EDTA〕に懸濁した後、溶菌
溶液(2%SDS、0.1M NaCl、10mM E
DTA、50mMトリス−HCl、pH7.0)を2m
l加えてゆっくりかくはんした。室温で15分間保温
後、3500rpm、10分間遠心して、上清を回収し
た。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール
(25/24/1)を等量加え、ゆっくりチューブを上
下にかくはんした後、3000rpm、5分間遠心し
て、上層を回収した。−20℃エタノールを2.5倍量
加えて、−80℃に10分間放置した後、3500rp
m、15分間遠心し、沈殿したDNAを乾燥させた。
0.5mlのTE溶液と2.5μlとRNaseA(2
0mg/ml)溶液を加え、37℃、30分間保温し
た。0.5mlのフェノール/クロロホルム/イソアミ
ルアルコールを加え、ゆっくりかくはんし10000r
pm、5分間遠心し、上層を回収した。この操作をもう
1回繰返した。0.5mlのクロロホルム/イソアミル
アルコール(24/1)を加え、ゆっくりかくはんし1
0000rpm、5分間遠心し、上清を回収した。0.
05mlの5M NaClと0.5mlのイソプロピル
アルコールを加え、−80℃に10分間放置後、100
00rpm、15分間の遠心によりDNAを回収した。
精製したゲノムDNA8μgを制限酵素BamHIの4
ユニットで37℃、15分間処理による部分分解後、フ
ェノール/クロロホルムにより除蛋白し、エタノール沈
殿した。部分分解DNAを0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、3〜15kb領域のDNAを抽出、精製し
た。得られたDNAとBamHIで完全分解したpDH
G25ベクター〔ジーン、第98巻、第61〜67頁
(1991)〕をDNAライゲーションキット(宝酒造
社製)により連結させた後、大腸菌HB101を形質転
換し、耐性株のゲノムライブラリーを作製した。このゲ
ノムライブラリーを含有させた大腸菌を100μg/m
lアンピシリンを含むLB培地(1%バクトトリプト
ン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%塩化ナト
リウム)50ml中で37℃、一夜培養後、大腸菌から
プラスミドを回収、精製した。
【0032】1−c)オーレオバシジン耐性遺伝子anau
r1R の発現及びクローニング 上記のようにして調製したオーレオバシジン耐性株のゲ
ノムライブラリー由来のプラスミドを以下の方法により
A.ニドランスFGSC89株に形質転換した。すなわ
ち、A.ニドランスをPD培地で30℃、2日間振とう
培養後、菌糸をガラスフィルター(3G1タイプ)でろ
過することにより回収し、滅菌水で洗浄した。十分に脱
水後、菌体を10mlのプロトプラスト化溶液に懸濁し
た。30℃でゆっくり振とうしながら約3時間反応させ
た。ガラスフィルター3G3でろ過したろ液中のプロト
プラストを2000rpm、5分間の遠心により回収
し、0.8M NaClで2回洗浄した。プロトプラス
トを2×108 /mlとなるようにSol1(0.8M
NaCl、10mM CaCl2 、10mMトリス−
HCl、pH8.0)に懸濁した後、0.2容量のSo
l2〔40%(W/V)PEG4000、50mM C
aCl2 、50mMトリス−HCl、pH8.0〕を加
えよく混合した。0.2mlのプロトプラスト懸濁液を
分注し、10μgのゲノムライブラリー由来のプラスミ
ドを加え、よく混合した。氷中で30分間放置後1ml
のSol2を加えよく混合した。室温で15分間放置
し、8.5mlのSol1を加え、よく混合後、200
0rpm、5分間の遠心によりプロトプラストを回収し
た。0.2mlのSol1を加え5μg/mlオーレオ
バシジンAを含む最小培地(4.9%ツアペック ソリ
ュウション アガー、0.8M NaCl、0.02μ
g/mlビオチン)の中央にのせた後、45℃に保温し
た軟寒天培地(3.5%ツアペック−ドックス ブロ
ス、0.8M NaCl、0.02μg/mlビオチ
ン、0.5%寒天)5mlを重層した。30℃、3〜5
日間培養した。このプレート上で増殖したコロニーはオ
ーレオバシジン耐性遺伝子を含むプラスミドを持ってい
ると考えられる。約70個のコロニーがオーレオバシジ
ン含有培地上に生じた。このコロニーをCz+bi培地
20mlへ植菌し、30℃、2日間培養し、増殖した細
胞より実施例1−b)に述べたDNAの抽出精製法に従
って、回収、精製した。このDNAで大腸菌HB101
を形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含むL
B培地へ塗布した。生じた大腸菌コロニーからプラスミ
ドDNAを調製した。このプラスミドは12kbのDN
Aを含んでおり、pR1−1と命名した。pR1−1中
の12kbDNAの制限酵素地図を図5に示す。更に耐
性遺伝子領域を限定するため、制限酵素により12kb
DNA断片を種々の大きさよりなる断片とした後、その
DNA断片をpDHG25ベクターへクローニングし
た。種々のDNAを含むプラスミドを正常細胞A.ニド
ランスFGSC89株へ形質転換しオーレオバシジン耐
性を獲得するかどうかを確認した。その結果、Bgl I
I 5.8kb断片にオーレオバシジン耐性を付与する活
性が存在していた。このことから、この断片にanaur1R
遺伝子が存在することが明らかとなった。このオーレオ
バシジン耐性遺伝子anaur1R を含有するDNA断片の制
限酵素地図は図1に示すとおりである。この断片をpU
C118ベクターへサブクローニングしpUR1と命名
した。このプラスミドを用いてDNA塩基配列を決定し
た。その塩基配列は配列表の配列番号1に示すとおりで
あり、この塩基配列よりanaur1R 遺伝子は1ヵ所のイン
トロンを含む2つのエキソン領域よりなる遺伝子であっ
た。この遺伝子は配列表の配列番号2に示したアミノ酸
配列を有する蛋白質をコードしていることが明らかとな
った。
r1R の発現及びクローニング 上記のようにして調製したオーレオバシジン耐性株のゲ
ノムライブラリー由来のプラスミドを以下の方法により
A.ニドランスFGSC89株に形質転換した。すなわ
ち、A.ニドランスをPD培地で30℃、2日間振とう
培養後、菌糸をガラスフィルター(3G1タイプ)でろ
過することにより回収し、滅菌水で洗浄した。十分に脱
水後、菌体を10mlのプロトプラスト化溶液に懸濁し
た。30℃でゆっくり振とうしながら約3時間反応させ
た。ガラスフィルター3G3でろ過したろ液中のプロト
プラストを2000rpm、5分間の遠心により回収
し、0.8M NaClで2回洗浄した。プロトプラス
トを2×108 /mlとなるようにSol1(0.8M
NaCl、10mM CaCl2 、10mMトリス−
HCl、pH8.0)に懸濁した後、0.2容量のSo
l2〔40%(W/V)PEG4000、50mM C
aCl2 、50mMトリス−HCl、pH8.0〕を加
えよく混合した。0.2mlのプロトプラスト懸濁液を
分注し、10μgのゲノムライブラリー由来のプラスミ
ドを加え、よく混合した。氷中で30分間放置後1ml
のSol2を加えよく混合した。室温で15分間放置
し、8.5mlのSol1を加え、よく混合後、200
0rpm、5分間の遠心によりプロトプラストを回収し
た。0.2mlのSol1を加え5μg/mlオーレオ
バシジンAを含む最小培地(4.9%ツアペック ソリ
ュウション アガー、0.8M NaCl、0.02μ
g/mlビオチン)の中央にのせた後、45℃に保温し
た軟寒天培地(3.5%ツアペック−ドックス ブロ
ス、0.8M NaCl、0.02μg/mlビオチ
ン、0.5%寒天)5mlを重層した。30℃、3〜5
日間培養した。このプレート上で増殖したコロニーはオ
ーレオバシジン耐性遺伝子を含むプラスミドを持ってい
ると考えられる。約70個のコロニーがオーレオバシジ
ン含有培地上に生じた。このコロニーをCz+bi培地
20mlへ植菌し、30℃、2日間培養し、増殖した細
胞より実施例1−b)に述べたDNAの抽出精製法に従
って、回収、精製した。このDNAで大腸菌HB101
を形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含むL
B培地へ塗布した。生じた大腸菌コロニーからプラスミ
ドDNAを調製した。このプラスミドは12kbのDN
Aを含んでおり、pR1−1と命名した。pR1−1中
の12kbDNAの制限酵素地図を図5に示す。更に耐
性遺伝子領域を限定するため、制限酵素により12kb
DNA断片を種々の大きさよりなる断片とした後、その
DNA断片をpDHG25ベクターへクローニングし
た。種々のDNAを含むプラスミドを正常細胞A.ニド
ランスFGSC89株へ形質転換しオーレオバシジン耐
性を獲得するかどうかを確認した。その結果、Bgl I
I 5.8kb断片にオーレオバシジン耐性を付与する活
性が存在していた。このことから、この断片にanaur1R
遺伝子が存在することが明らかとなった。このオーレオ
バシジン耐性遺伝子anaur1R を含有するDNA断片の制
限酵素地図は図1に示すとおりである。この断片をpU
C118ベクターへサブクローニングしpUR1と命名
した。このプラスミドを用いてDNA塩基配列を決定し
た。その塩基配列は配列表の配列番号1に示すとおりで
あり、この塩基配列よりanaur1R 遺伝子は1ヵ所のイン
トロンを含む2つのエキソン領域よりなる遺伝子であっ
た。この遺伝子は配列表の配列番号2に示したアミノ酸
配列を有する蛋白質をコードしていることが明らかとな
った。
【0033】1−d)オーレオバシジン感受性遺伝子an
aur1S のクローニング 正常細胞A.ニドランスのポリ(A)+ RNAよりオー
レオバシジン感受性遺伝子のcDNAを得るため、初め
にA.ニドランスFGSC89株から全RNAを抽出し
た。すなわち、上記の菌を200mlPD培地で培養
後、ガラスフィルター(3G1タイプ)により集菌し、
十分に脱水した後、菌体を液体窒素により急速凍結し
た。乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した後、RNA
エクストラクションキット(RNA extraction kit 、
ファルマシア社製)により2.6mgの全RNAを回
収、精製した。この全RNA1mgからオリゴテックス
−dT30<スーパー>( Oligotex −dT30、宝酒
造社製)を用いることにより、12.8μgのポリ
(A)+ RNAを調製した。ポリ(A)+ RNA5μg
を用いて、タカラ(Takara) cDNA合成キット(宝酒
造社製)によりcDNAを合成した。合成されたcDN
AとラムダファージベクターλSHloxTM(ノヴァジ
ェン社製)と連結した後、ファージメーカーシステム、
ファージパック エクストラクト〔 Phage MakerTM Sys
tem 、(ノヴァジェン社製)〕によりインビトロパッケ
ージングを行いcDNAライブラリーを構築した。cD
NAライブラリーを宿主大腸菌ER1647株に接種
し、トップアガロース(0.7%アガロースを含むLB
培地)と混合後、LBプレート上に重層し、37℃一夜
培養することにより、プラークを形成させた。生じたプ
ラークをナイロンメンブレン(Hybond−N、アマシャム
社製)へ移し、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブとして、実施例1−c)で得られたpUR
1プラスミドをPstIとSalIにより切断すること
により得られた、2.6kbのDNA断片を用いた。こ
のDNA断片をランダムプライマーDNAラベリングキ
ット(宝酒造社製)と〔α−32P〕dCTPで標識しハ
イブリダイゼーションのプローブとして用いた。4×1
05 個のプラークをスクリーニングした結果、プローブ
とハイブリダイズする8個のファージクローンを得た。
次に、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングに
より、これらのファージからcDNAを含む領域を自動
的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌
を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、cD
NAの長さを比較し、最長の2.9kbのcDNAを含
むpS15を選び、cDNAをpUC118へサブクロ
ーニング後、塩基配列を決定した。このプラスミドをp
ANAR1と命名し、pANAR1で形質転換された大
腸菌JM109は Escherichia coli JM109/pANAR1と命
名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP−5180として寄託されてい
る。このcDNAの制限酵素地図は図2に示すとおりで
ある。そのDNA塩基配列は配列表の配列番号3に示す
とおりであり、この塩基配列よりanaur1S 遺伝子は配列
表の配列番号4に示したアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードしており、耐性遺伝子anaurlR と比較すると、配
列表配列番号3の1218番目の塩基のGが突然変異に
よりTに変換しており、アミノ酸レベルでは275番目
のアミノ酸がグリシンからバリンに変化していることが
明らかとなった。更に、ゲノムDNAには56bpのイ
ントロンが1ヵ所存在していることが明らかとなった。
ゲノムDNAとcDNAの関係を図5に示す。
aur1S のクローニング 正常細胞A.ニドランスのポリ(A)+ RNAよりオー
レオバシジン感受性遺伝子のcDNAを得るため、初め
にA.ニドランスFGSC89株から全RNAを抽出し
た。すなわち、上記の菌を200mlPD培地で培養
後、ガラスフィルター(3G1タイプ)により集菌し、
十分に脱水した後、菌体を液体窒素により急速凍結し
た。乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した後、RNA
エクストラクションキット(RNA extraction kit 、
ファルマシア社製)により2.6mgの全RNAを回
収、精製した。この全RNA1mgからオリゴテックス
−dT30<スーパー>( Oligotex −dT30、宝酒
造社製)を用いることにより、12.8μgのポリ
(A)+ RNAを調製した。ポリ(A)+ RNA5μg
を用いて、タカラ(Takara) cDNA合成キット(宝酒
造社製)によりcDNAを合成した。合成されたcDN
AとラムダファージベクターλSHloxTM(ノヴァジ
ェン社製)と連結した後、ファージメーカーシステム、
ファージパック エクストラクト〔 Phage MakerTM Sys
tem 、(ノヴァジェン社製)〕によりインビトロパッケ
ージングを行いcDNAライブラリーを構築した。cD
NAライブラリーを宿主大腸菌ER1647株に接種
し、トップアガロース(0.7%アガロースを含むLB
培地)と混合後、LBプレート上に重層し、37℃一夜
培養することにより、プラークを形成させた。生じたプ
ラークをナイロンメンブレン(Hybond−N、アマシャム
社製)へ移し、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブとして、実施例1−c)で得られたpUR
1プラスミドをPstIとSalIにより切断すること
により得られた、2.6kbのDNA断片を用いた。こ
のDNA断片をランダムプライマーDNAラベリングキ
ット(宝酒造社製)と〔α−32P〕dCTPで標識しハ
イブリダイゼーションのプローブとして用いた。4×1
05 個のプラークをスクリーニングした結果、プローブ
とハイブリダイズする8個のファージクローンを得た。
次に、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングに
より、これらのファージからcDNAを含む領域を自動
的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌
を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、cD
NAの長さを比較し、最長の2.9kbのcDNAを含
むpS15を選び、cDNAをpUC118へサブクロ
ーニング後、塩基配列を決定した。このプラスミドをp
ANAR1と命名し、pANAR1で形質転換された大
腸菌JM109は Escherichia coli JM109/pANAR1と命
名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP−5180として寄託されてい
る。このcDNAの制限酵素地図は図2に示すとおりで
ある。そのDNA塩基配列は配列表の配列番号3に示す
とおりであり、この塩基配列よりanaur1S 遺伝子は配列
表の配列番号4に示したアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードしており、耐性遺伝子anaurlR と比較すると、配
列表配列番号3の1218番目の塩基のGが突然変異に
よりTに変換しており、アミノ酸レベルでは275番目
のアミノ酸がグリシンからバリンに変化していることが
明らかとなった。更に、ゲノムDNAには56bpのイ
ントロンが1ヵ所存在していることが明らかとなった。
ゲノムDNAとcDNAの関係を図5に示す。
【0034】実施例2 A.フミガタスの有するafaur1
S 遺伝子の確認及びクローニング 2−a)ノーザンハイブリダイゼーションによるafaur1
S 遺伝子の検出 A.フミガタスTIMM1776株より実施例1−d)
と同様の方法によりポリ(A)+ RNAを抽出、精製し
た。A.フミガタスとA.ニドランスのポリ(A)+ R
NA(1μg)をホルムアルデヒドを含む1.2%アガ
ロースゲルでの電気泳動により分離後、ナイロンメンブ
レンへ移し、固定後、〔α−32P〕dCTPで標識され
たanaur1S 遺伝子のcDNAのHindIII 断片741
bpをプローブとして用いて、ハイブリダイゼーション
を行った。ハイブリダイゼーションの条件は60℃で一
夜、ハイブリダイズを行った後、60℃、0.5×SS
C、0.1%SDSで洗浄を行った。図5において、レ
ーン1はA.ニドランス、レーン2はA.フミガタスよ
り得られたポリ(A)+ RNAについてノーザンハイブ
リダイゼーションを行った結果である。図6から明らか
なようにハイブリダイゼーション後のオートラジオグラ
フィーにより、A.フミガタスにもA.ニドランスと同
じ大きさのオーレオバシジン感受性遺伝子が存在するこ
とが明らかとなった。しかし、バンドはA.フミガタス
では非常に弱いため、A.ニドランスとA.フミガタス
のオーレオバシジン感受性遺伝子は相同性は高くないこ
とが明らかとなった。
S 遺伝子の確認及びクローニング 2−a)ノーザンハイブリダイゼーションによるafaur1
S 遺伝子の検出 A.フミガタスTIMM1776株より実施例1−d)
と同様の方法によりポリ(A)+ RNAを抽出、精製し
た。A.フミガタスとA.ニドランスのポリ(A)+ R
NA(1μg)をホルムアルデヒドを含む1.2%アガ
ロースゲルでの電気泳動により分離後、ナイロンメンブ
レンへ移し、固定後、〔α−32P〕dCTPで標識され
たanaur1S 遺伝子のcDNAのHindIII 断片741
bpをプローブとして用いて、ハイブリダイゼーション
を行った。ハイブリダイゼーションの条件は60℃で一
夜、ハイブリダイズを行った後、60℃、0.5×SS
C、0.1%SDSで洗浄を行った。図5において、レ
ーン1はA.ニドランス、レーン2はA.フミガタスよ
り得られたポリ(A)+ RNAについてノーザンハイブ
リダイゼーションを行った結果である。図6から明らか
なようにハイブリダイゼーション後のオートラジオグラ
フィーにより、A.フミガタスにもA.ニドランスと同
じ大きさのオーレオバシジン感受性遺伝子が存在するこ
とが明らかとなった。しかし、バンドはA.フミガタス
では非常に弱いため、A.ニドランスとA.フミガタス
のオーレオバシジン感受性遺伝子は相同性は高くないこ
とが明らかとなった。
【0035】2−b)A.フミガタスの有するafaur1S
遺伝子のクローニング 実施例2−a)で精製したA.フミガタスのポリ(A)
+ RNAを用いて実施例1−d)で示したcDNAライ
ブラリー作製の方法に従ってA.フミガタスのcDNA
ライブラリーを作製した。A.ニドランスcDNAのP
stI−EcoRI断片(921bp)をプローブとし
て、上記のライブラリーを、実施例2−a)と同じハイ
ブリダイゼーション条件によりスクリーニングした。そ
の結果8個のファージクローンを得た。その中で最長の
長さである2.9kbのcDNAを含むファージクロー
ンより実施例1−d)で示した方法により、プラスミド
状態でcDNAを回収し、cDNAをpUC118へサ
ブクローニングし、DNA塩基配列を決定した。その塩
基配列は配列表の配列番号12のとおりであり、この塩
基配列より、この遺伝子は配列表の配列番号5に示した
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。A.フ
ミガタスTIMM1776株のafaur1S 蛋白質とA.ニ
ドランスFGSC89株のanaur1S 蛋白質のアミノ酸配
列を比較すると87%のホモロジーがあり、相同性が高
かった。
遺伝子のクローニング 実施例2−a)で精製したA.フミガタスのポリ(A)
+ RNAを用いて実施例1−d)で示したcDNAライ
ブラリー作製の方法に従ってA.フミガタスのcDNA
ライブラリーを作製した。A.ニドランスcDNAのP
stI−EcoRI断片(921bp)をプローブとし
て、上記のライブラリーを、実施例2−a)と同じハイ
ブリダイゼーション条件によりスクリーニングした。そ
の結果8個のファージクローンを得た。その中で最長の
長さである2.9kbのcDNAを含むファージクロー
ンより実施例1−d)で示した方法により、プラスミド
状態でcDNAを回収し、cDNAをpUC118へサ
ブクローニングし、DNA塩基配列を決定した。その塩
基配列は配列表の配列番号12のとおりであり、この塩
基配列より、この遺伝子は配列表の配列番号5に示した
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。A.フ
ミガタスTIMM1776株のafaur1S 蛋白質とA.ニ
ドランスFGSC89株のanaur1S 蛋白質のアミノ酸配
列を比較すると87%のホモロジーがあり、相同性が高
かった。
【0036】実施例3 A.ニガーとA.オリゼーの有
するオーレオバシジン感受性関連遺伝子の確認 A.フミガタスTIMM1776株とA.ニガーFGS
C805株とA.オリゼーIFO5710株より、実施
例1−b)で示した方法に従ってゲノムDNAを抽出、
精製した。更に、酵母S.セレビシエDKD−5D株及
びSchizo.ポンベJY745株よりP.フィリッ
プセン(P. Philippsen) らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第194巻、第169〜175頁
(1991)〕に従ってゲノムDNAを抽出、精製し
た。A.ニドランス、A.フミガタス、A.ニガー、
A.オリゼー、S.セレビシエとSchizo.ポンベ
のゲノムDNA5μgを制限酵素PstIで切断し、
0.8%アガロースゲルによる電気泳動により分離後、
ナイロンメンブレンへ移し、固定後、〔α−32P〕dC
TPで標識されたanaur1S 遺伝子のcDNAのPstI
−EcoRI断片をプローブとして、サザンハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件
は実施例2−a)で示した条件で行った。ハイブリダイ
ゼーションのオートラジオグラムを図7に示す。図7か
ら明らかなように、A.ニガーやA.オリゼーにもオー
レオバシジン感受性関連遺伝子が存在することが明らか
となった。更にA.ニドランスのDNAの酵母S.セレ
ビシエやSchizo.ポンベのオーレオバシジン感受
性遺伝子とハイブリダイズしないことが明らかとなっ
た。図7において、レーン1はA.ニドランス、レーン
2はA.フミガタス、レーン3はA.ニガー、レーン4
はA.オリゼー、レーン5はS.セレビシエ、レーン6
はSchizo.ポンベのゲノムDNAについてサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果である。
するオーレオバシジン感受性関連遺伝子の確認 A.フミガタスTIMM1776株とA.ニガーFGS
C805株とA.オリゼーIFO5710株より、実施
例1−b)で示した方法に従ってゲノムDNAを抽出、
精製した。更に、酵母S.セレビシエDKD−5D株及
びSchizo.ポンベJY745株よりP.フィリッ
プセン(P. Philippsen) らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第194巻、第169〜175頁
(1991)〕に従ってゲノムDNAを抽出、精製し
た。A.ニドランス、A.フミガタス、A.ニガー、
A.オリゼー、S.セレビシエとSchizo.ポンベ
のゲノムDNA5μgを制限酵素PstIで切断し、
0.8%アガロースゲルによる電気泳動により分離後、
ナイロンメンブレンへ移し、固定後、〔α−32P〕dC
TPで標識されたanaur1S 遺伝子のcDNAのPstI
−EcoRI断片をプローブとして、サザンハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件
は実施例2−a)で示した条件で行った。ハイブリダイ
ゼーションのオートラジオグラムを図7に示す。図7か
ら明らかなように、A.ニガーやA.オリゼーにもオー
レオバシジン感受性関連遺伝子が存在することが明らか
となった。更にA.ニドランスのDNAの酵母S.セレ
ビシエやSchizo.ポンベのオーレオバシジン感受
性遺伝子とハイブリダイズしないことが明らかとなっ
た。図7において、レーン1はA.ニドランス、レーン
2はA.フミガタス、レーン3はA.ニガー、レーン4
はA.オリゼー、レーン5はS.セレビシエ、レーン6
はSchizo.ポンベのゲノムDNAについてサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果である。
【0037】
【発明の効果】本発明により、アスペルギルス属より得
られたオーレオバシジン感受性に関連する新規な蛋白質
及び該蛋白質をコードする遺伝子、オーレオバシジン感
受性関連遺伝子が提供された。これらは該遺伝子を有す
る生物が原因で起こる、真菌症を始めとする疾患の診
断、治療に有用である。更に、本発明により、該遺伝子
のアンチセンスDNA及びアンチセンスRNA、該遺伝
子にハイブリダイズ可能な核酸プローブ、その核酸プロ
ーブを用いた該遺伝子の検出方法、該遺伝子を導入させ
た形質転換体を用いたオーレオバシジン感受性に関連す
る蛋白質の製造方法が提供された。これらも真菌症など
の疾患の診断、治療に有用である。
られたオーレオバシジン感受性に関連する新規な蛋白質
及び該蛋白質をコードする遺伝子、オーレオバシジン感
受性関連遺伝子が提供された。これらは該遺伝子を有す
る生物が原因で起こる、真菌症を始めとする疾患の診
断、治療に有用である。更に、本発明により、該遺伝子
のアンチセンスDNA及びアンチセンスRNA、該遺伝
子にハイブリダイズ可能な核酸プローブ、その核酸プロ
ーブを用いた該遺伝子の検出方法、該遺伝子を導入させ
た形質転換体を用いたオーレオバシジン感受性に関連す
る蛋白質の製造方法が提供された。これらも真菌症など
の疾患の診断、治療に有用である。
【0038】
【0039】配列番号:1 配列の長さ:4140 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列: AGATCTGTGG CTTCCGGTTG GCTACTTGTA ACCAACTGAT GGTCAGATGG ATCTGCCGTC 60 TGTTTTGATT TGAATTTTCC CTGCTCATTC TGATTCTGTG AGAGGCTGCA TTCATTATCA 120 CATCTCATAC CCGGCGCCTG CGACTTCGGT CACCTCTGCG GTCTGGCGGT TACCGGGGTC 180 CGTCTGAGAC TCGTCAGTCA GCCATTCGAG TATGCGAACT CTGACTTTGC TCACCTAAGA 240 GTTTGCACGA GATGCCGAAA TCCTCCTCGA GTAGAGTTTG CAAGGCTTGA ACCTTGGTCC 300 TTGAAGCCCG AAAGTGGCTC AGTAGTGGGA TCGATAGTCT GGTTGTTGAA GATTTTCTCC 360 TCCACCTTAC CTATGGCCGC TGGCCTTCTC CACCTTTCAG GCTTTCAGGC ACCCTCGGCT 420 CGGATTCTGT ATCGTCCGGT ACCGAAGCTA GTCCTAGCTA GTCAAAGCTA GTCCAAGCTA 480 GTCTCGTCAA GGTTTGGCGC AGCGCGGTTC CGTGTAAAGT ACAAATTTGA AATACGAATA 540 CGCAGTACTC GCAGCCGGCA CTTCCGCTCA GCCCAGGCTC AGAGGCTAAG GGTGTTGGCG 600 CTTCCTCATC ATCTTCTTCT CGTCGACCTT TTCCTCTTTC TCTCCCTATC GGTGCTTCTC 660 TCCAACCTCA TTCTCAGTCG TTCGCCCATC AGGTTTATAC TCCGGCTCCG TGGCCATCTG 720 CCTCCCTCAC GACCTCCTCG TTCCAGGTTT TCCTCTCGAC TGCTGCGCCC TTGCACTTCG 780 CCTTGCATCA GTGAAACCCC CTGCAACGTG ACGGCTCAAA GACATCCTCG TTTGGCCGCT 840 GGAGACCGGA GCGTGCGCTT CGTTTCGTCT TCTTCGAACC GATCTCAATT TCCCCGCTCG 900 GGTTGACGCC GTCAGCACCC TGCTCGTTGC CTAACGGCTT GTTATTCAAG ACCCCTTTTC 960 TGCCGCTTCC GCGACCGATT TATTCGTCGC CTTCCAACTC TTGTACAATC GGGGGGAAAG 1020 AAAGCAGACG GAGTTCGATC TGGAGGAATT ATAGCTGAGT CTTGCCCGCA AGACTCGCCG 1080 CAACCATGAA TCAAACACTT CCCACGTGGA AGGACCGCAC GCAGAACCAG TTTGGAAAGC 1140 TTCAGATCCA GGTTCCATGG CGGTCCATCC AACTGCTCGT CCCGCATCGC ATGCGGCGGA 1200 AGTTAAGGTC CAAATTGCGC AGTAGAGCGT CTCCTACCTC GTCAATAGCC TCTTTACAGA 1260 CGTCGTTATC GCCTGCAGAC ACACTACGAT CGCTCCAAAG CCACCGATGG ACGGTTTACG 1320 ACTTCCAATA TCTGCTTCTG TTGATCGTGG GCATCTTCTC TTTGACCGTT ATCGAGTCGC 1380 CCGGGCCTTT GGGCAAAACG GCCATTTTCT CCATGCTCCT ATTCTCTCTC CTGATCCCTA 1440 TGACCCGCCA GTTCTTCCTC CCGTTTCTGC CGATTGCCGG ATGGCTTCTG TTTTTCTACG 1500 CCTGCCAGTG AGTTAAAAAC AACCCGCTAC CAGACCCCGT GCAGCAGTTA CTCACATATG 1560 CAGGTTCATC CCAAGCGATT GGCGCCCTGC GATTTGGGTT CGTGTCTTGC CTGCACTGGA 1620 GAATATTCTC TACGGCGCAA ACATCAGCAA CATCCTATCC GCTCACCAGA ACGTTGTGCT 1680 TGACGTGCTG GCGTGGCTAC CCTACGGTAT CTGCCACTAT GGCGCTCCGT TTGTGTGCTC 1740 GTTGATCATG TTCATCTTCG GTCCGCCCGG CACTGTTCCC CTTTTCGCGC GCACTTTCGG 1800 CTATATCAGT ATGACTGCGG TTACTATTCA GCTGTTTTTC CCTTGCTCTC CACCTTGGTA 1860 TGAGAATCGC TATGGTCTAG CTCCGGCAGA CTACTCCATC CAAGGTGATC CCGCAGGGCT 1920 TGCCCGCATT GACAAGCTTT TCGGCATCGA CCTTTACACG TCTGTTTTCC ATCAGTCGCC 1980 TGTTGTGTTC GGCGCTTTTC CGTCGCTGCA TGCTGCCGAC TCAACCCTGG CCGCACTTTT 2040 CATGAGTCAT GTTTTCCCCC GCATGAAGCC CGTCTTCGTG ACCTATACTC TATGGATGTG 2100 GTGGGCAACA ATGTACCTCT CACATCACTA TGCGGTCGAT TTGGTTGCGG GTGGTCTCCT 2160 GGCCGCCATT GCTTTCTACT TCGCCAAGAC CCGATTCCTT CCCCGTGTCC AGCTCGACAA 2220 GACCTTCCGT TGGGACTACG ACTATGTGGA ATTCGGCGAG TCTGCCCTGG AGTATGGGTA 2280 TGGTGCAGCT GGCTATGATG GAGACTTCAA TCTCGACAGC GATGAATGGA CTGTTGGTTC 2340 TTCATCCTCC GTCTCCTCAG GCTCCTTGAG TCCCGTTGAC GATCATTACT CATGGGAAAC 2400 CGAGGCACTG ACCTCCCCAC ATACTGATAT TGAGTCCGGC AGGCATACTT TCAGCCCTTG 2460 AGTAGCCACA AACCAAACTC GATACCTGCA TATAGCGATC TCGCTCCTCC TCCACTGCAT 2520 CTATTTACGA GACGGCGTTA GAACATTTCA CGACATTCTG GCTTTATTGC ATCGAGCACA 2580 TTTCGACACA TATATCTTTA ATACCCTTTC TTCGGTGTCC CAGATCATCG GTTCGACCTT 2640 AATGTACCTC GGTCCGAATC CGCCTGGGAT ACTGTTTCTC TTTCCGCCGC ACTTCACTGT 2700 ACATTGCTTG ACATTGCGAA ACCGGGTTGG GCTCGAACGT GGGATGGGTT ATCGCTCATC 2760 GCTACACGCC GTTGCTCCAT CATAATGTTA ATGGACACAA TGGGGCTACG CATCCTGGTG 2820 TTTAGTCCTG GAAGACCATC CGATAACCCC CGTCGGTAAC ACTCGCTTGT CTCGTGTCCA 2880 CCCAGACACT ACTTCAATTC TCACTTCTAT CGTCCGCTAT TACCTTGACC TGGTCGAACC 2940 CATCCTTATT ATTCGTTTCG ACTATGCTAT ATATTTATTT TTACCATTCG TGTCGATCGC 3000 TCATACTCTT GGCGCTTGGG ACTGGAAGCA TTTATATTGG AAAAAATCAC GGAATGGGGC 3060 GCCTTTTCTT CTTGCACTTC ACTCGCTGTG CATAGACGGT TTTACATTTC TGCTTTGCAA 3120 TGCATCACGA ACTCTGCATT AGCATATAGA AAGAGGGGAA GGATGGACCT TCTTCTTGAT 3180 TGCTCGCATG GTTTATCCAT TCGCTCAAAG TGGATTACGT CCACATATTA CCCGGGGGCT 3240 ATACACATGG CTACTGTGTT GCTTTCTGAC ATTCGCCGGA CGTGCAAGGT TGGGAGGAGA 3300 GTCTGACGCT GACGGGGCTT GTTGAAGGAT GTTCACGCGT CCCGATTTGA CCCGGCTTCG 3360 ACTAACCTCA GATTCTCGAC TTGTTGGACG GTGACTTGAC TTGCTTGCTA TGGTCTGACG 3420 CTCTCACACC TACCTATCAC ATCCTCCTCA CCTCACAAAT TCCGCTCATG GACACTATCC 3480 TCTTCTTTTC GTTTCCCTTG GATAGTGTGT GTGTGTGTGT GGTTGGGGCA AATTATCCAT 3540 AGCAGCAGTA TTATTAGTTA TAATCCGGTA GTGTTATGAT TTATGAAGGC AACTTGTATA 3600 CTATTGCCAC TTTGTCCATA TCTCTTGCTT GTAATAGAAC TGACATCGCG ACGCTTCGGC 3660 CACGATGCAT ATAAAAACTC TAGTCAACAC GATATTAACA AGCGAAACCA TTACGCTGTA 3720 AACTATTCAG GATCGCCGCG GGCCCATCTG GGACTTGACT GTACTAAATA TGTCCTAAAG 3780 CAAGCAGACT AAATATTTAA CGTGGGATAT TATTCATATA CGCATATGTA TACATAGTCA 3840 TAACAAGCCA AGGGGTGGGT AGGGGTGGGT AATTATTATT TTTTTTCGTC GATACAAGTA 3900 TCCATCCTTA AATGTCCGTG GTCTACTCTT CATAAATCTT AACCCGCTCC GCATACTCCT 3960 TTATCCTCGA GACAAAAGTG TCTTCAATTT CATCGCCACG GCCACCAGCA ACGCGGAGGA 4020 TAAGGTCGTT GAGAGAGGCG CGGCCGAGAA TGTCGACATG GTCGCCTTCA TATTGTTAGC 4080 ATGCGACGTC AGACTGGAAC CAGGAAGGGA AAGGAGAGAG GTACCTGTAT TTGGACCACC 4140
【0040】配列番号:2 配列の長さ:439 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Asn Gln Thr Leu Pro Thr Trp Lys Asp Arg Thr Gln Asn Gln 1 5 10 15 Phe Gly Lys Leu Gln Ile Gln Val Pro Trp Arg Ser Ile Gln Leu 20 25 30 Leu Val Pro His Arg Met Arg Arg Lys Leu Arg Ser Lys Leu Arg 35 40 45 Ser Arg Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr Ser 50 55 60 Leu Ser Pro Ala Asp Thr Leu Arg Ser Leu Gln Ser His Arg Trp 65 70 75 Thr Val Tyr Asp Phe Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Val Gly Ile 80 85 90 Phe Ser Leu Thr Val Ile Glu Ser Pro Gly Pro Leu Gly Lys Thr 95 100 105 Ala Ile Phe Ser Met Leu Leu Phe Ser Leu Leu Ile Pro Met Thr 110 115 120 Arg Gln Phe Phe Leu Pro Phe Leu Pro Ile Ala Gly Trp Leu Leu 125 130 135 Phe Phe Tyr Ala Cys Gln Phe Ile Pro Ser Asp Trp Arg Pro Ala 140 145 150 Ile Trp Val Arg Val Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly 155 160 165 Ala Asn Ile Ser Asn Ile Leu Ser Ala His Gln Asn Val Val Leu 170 175 180 Asp Val Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Cys His Tyr Gly Ala 185 190 195 Pro Phe Val Cys Ser Leu Ile Met Phe Ile Phe Gly Pro Pro Gly 200 205 210 Thr Val Pro Leu Phe Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Ile Ser Met Thr 215 220 225 Ala Val Thr Ile Gln Leu Phe Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr 230 235 240 Glu Asn Arg Tyr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Ser Ile Gln Gly 245 250 255 Asp Pro Ala Gly Leu Ala Arg Ile Asp Lys Leu Phe Gly Ile Asp 260 265 270 Leu Tyr Thr Ser Val Phe His Gln Ser Pro Val Val Phe Gly Ala 275 280 285 Phe Pro Ser Leu His Ala Ala Asp Ser Thr Leu Ala Ala Leu Phe 290 295 300 Met Ser His Val Phe Pro Arg Met Lys Pro Val Phe Val Thr Tyr 305 310 315 Thr Leu Trp Met Trp Trp Ala Thr Met Tyr Leu Ser His His Tyr 320 325 330 Ala Val Asp Leu Val Ala Gly Gly Leu Leu Ala Ala Ile Ala Phe 335 340 345 Tyr Phe Ala Lys Thr Arg Phe Leu Pro Arg Val Gln Leu Asp Lys 350 355 360 Thr Phe Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Val Glu Phe Gly Glu Ser Ala 365 370 375 Leu Glu Tyr Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Asn 380 385 390 Leu Asp Ser Asp Glu Trp Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser 395 400 405 Ser Gly Ser Leu Ser Pro Val Asp Asp His Tyr Ser Trp Glu Thr 410 415 420 Glu Ala Leu Thr Ser Pro His Thr Asp Ile Glu Ser Gly Arg His 425 430 435 Thr Phe Ser Pro
【0041】配列番号:3 配列の長さ:2856 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列: GGTTTATACT CCGGCTCCGT GGCCATCTGC CTCCCTCACG ACCTCCTCGT TCCAGGTTTT 60 CCTCTCGACT GCTGCGCCCT TGCACTTCGC CTTGCATCAG TGAAACCCCC TGCAACGTGA 120 CGGCTCAAAG ACATCCTCGT TTGGCCGCTG GAGACCGGAG CGTGCGCTTC GTTTCGTCTT 180 CTTCGAACCG ATCTCAATTT CCCCGCTCGG GTTGACGCCG TCAGCACCCT GCTCGTTGCC 240 TAACGGCTTG TTATTCAAGA CCCCTTTTCT GCCGCTTCCG CGACCGATTT ATTCGTCGCC 300 TTCCAACTCT TGTACAATCG GGGGGAAAGA AAGCAGACGG AGTTCGATCT GGAGGAATTA 360 TAGCTGAGTC TTGCCCGCAA GACTCGCCGC AACCATGAAT CAAACACTTC CCACGTGGAA 420 GGACCGCACG CAGAACCAGT TTGGAAAGCT TCAGATCCAG GTTCCATGGC GGTCCATCCA 480 ACTGCTCGTC CCGCATCGCA TGCGGCGGAA GTTAAGGTCC AAATTGCGCA GTAGAGCGTC 540 TCCTACCTCG TCAATAGCCT CTTTACAGAC GTCGTTATCG CCTGCAGACA CACTACGATC 600 GCTCCAAAGC CACCGATGGA CGGTTTACGA CTTCCAATAT CTGCTTCTGT TGATCGTGGG 660 CATCTTCTCT TTGACCGTTA TCGAGTCGCC CGGGCCTTTG GGCAAAACGG CCATTTTCTC 720 CATGCTCCTA TTCTCTCTCC TGATCCCTAT GACCCGCCAG TTCTTCCTCC CGTTTCTGCC 780 GATTGCCGGA TGGCTTCTGT TTTTCTACGC CTGCCAGTTC ATCCCAAGCG ATTGGCGCCC 840 TGCGATTTGG GTTCGTGTCT TGCCTGCACT GGAGAATATT CTCTACGGCG CAAACATCAG 900 CAACATCCTA TCCGCTCACC AGAACGTTGT GCTTGACGTG CTGGCGTGGC TACCCTACGG 960 TATCTGCCAC TATGGCGCTC CGTTTGTGTG CTCGTTGATC ATGTTCATCT TCGGTCCGCC 1020 CGGCACTGTT CCCCTTTTCG CGCGCACTTT CGGCTATATC AGTATGACTG CGGTTACTAT 1080 TCAGCTGTTT TTCCCTTGCT CTCCACCTTG GTATGAGAAT CGCTATGGTC TAGCTCCGGC 1140 AGACTACTCC ATCCAAGGTG ATCCCGCAGG GCTTGCCCGC ATTGACAAGC TTTTCGGCAT 1200 CGACCTTTAC ACGTCTGGTT TCCATCAGTC GCCTGTTGTG TTCGGCGCTT TTCCGTCGCT 1260 GCATGCTGCC GACTCAACCC TGGCCGCACT TTTCATGAGT CATGTTTTCC CCCGCATGAA 1320 GCCCGTCTTC GTGACCTATA CTCTATGGAT GTGGTGGGCA ACAATGTACC TCTCACATCA 1380 CTATGCGGTC GATTTGGTTG CGGGTGGTCT CCTGGCCGCC ATTGCTTTCT ACTTCGCCAA 1440 GACCCGATTC CTTCCCCGTG TCCAGCTCGA CAAGACCTTC CGTTGGGACT ACGACTATGT 1500 GGAATTCGGC GAGTCTGCCC TGGAGTATGG GTATGGTGCA GCTGGCTATG ATGGAGACTT 1560 CAATCTCGAC AGCGATGAAT GGACTGTTGG TTCTTCATCC TCCGTCTCCT CAGGCTCCTT 1620 GAGTCCCGTT GACGATCATT ACTCATGGGA AACCGAGGCA CTGACCTCCC CACATACTGA 1680 TATTGAGTCC GGCAGGCATA CTTTCAGCCC TTGAGTAGCC ACAAACCAAA CTCGATACCT 1740 GCATATAGCG ATCTCGCTCC TCCTCCACTG CATCTATTTA CGAGACGGCG TTAGAACATT 1800 TCACGACATT CTGGCTTTAT TGCATCGAGC ACATTTCGAC ACATATATCT TTAATACCCT 1860 TTCTTCGGTG TCCCAGATCA TCGGTTCGAC CTTAATGTAC CTCGGTCCGA ATCCGCCTGG 1920 GATACTGTTT CTCTTTCCGC CGCACTTCAC TGTACATTGC TTGACATTGC GAAACCGGGT 1980 TGGGCTCGAA CGTGGGATGG GTTATCGCTC ATCGCTACAC GCCGTTGCTC CATCATAATG 2040 TTAATGGACA CAATGGGGCT ACGCATCCTG GTGTTTAGTC CTGGAAGACC ATCCGATAAC 2100 CCCCGTCGGT AACACTCGCT TGTCTCGTGT CCACCCAGAC ACTACTTCAA TTCTCACTTC 2160 TATCGTCCGC TATTACCTTG ACCTGGTCGA ACCCATCCTT ATTATTCGTT TCGACTATGC 2220 TATATATTTA TTTTTACCAT TCGTGTCGAT CGCTCATACT CTTGGCGCTT GGGACTGGAA 2280 GCATTTATAT TGGAAAAAAT CACGGAATGG GGCGCCTTTT CTTCTTGCAC TTCACTCGCT 2340 GTGCATAGAC GGTTTTACAT TTCTGCTTTG CAATGCATCA CGAACTCTGC ATTAGCATAT 2400 AGAAAGAGGG GAAGGATGGA CCTTCTTCTT GATTGCTCGC ATGGTTTATC CATTCGCTCA 2460 AAGTGGATTA CGTCCACATA TTACCCGGGG GCTATACACA TGGCTACTGT GTTGCTTTCT 2520 GACATTCGCC GGACGTGCAA GGTTGGGAGG AGAGTCTGAC GCTGACGGGG CTTGTTGAAG 2580 GATGTTCACG CGTCCCGATT TGACCCGGCT TCGACTAACC TCAGATTCTC GACTTGTTGG 2640 ACGGTGACTT GACTTGCTTG CTATGGTCTG ACGCTCTCAC ACCTACCTAT CACATCCTCC 2700 TCACCTCACA AATTCCGCTC ATGGACACTA TCCTCTTCTT TTCGTTTCCC TTGGATAGTG 2760 TGTGTGTGTG TGTGGTTGGG GCAAATTATC CATAGCAGCA GTATTATTAG TTATAATCCG 2820 GTAGTGTTAT GATTTATGAA GGCAACTTGT ATACTA 2856
【0042】配列番号:4 配列の長さ:439 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Asn Gln Thr Leu Pro Thr Trp Lys Asp Arg Thr Gln Asn Gln 1 5 10 15 Phe Gly Lys Leu Gln Ile Gln Val Pro Trp Arg Ser Ile Gln Leu 20 25 30 Leu Val Pro His Arg Met Arg Arg Lys Leu Arg Ser Lys Leu Arg 35 40 45 Ser Arg Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr Ser 50 55 60 Leu Ser Pro Ala Asp Thr Leu Arg Ser Leu Gln Ser His Arg Trp 65 70 75 Thr Val Tyr Asp Phe Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Val Gly Ile 80 85 90 Phe Ser Leu Thr Val Ile Glu Ser Pro Gly Pro Leu Gly Lys Thr 95 100 105 Ala Ile Phe Ser Met Leu Leu Phe Ser Leu Leu Ile Pro Met Thr 110 115 120 Arg Gln Phe Phe Leu Pro Phe Leu Pro Ile Ala Gly Trp Leu Leu 125 130 135 Phe Phe Tyr Ala Cys Gln Phe Ile Pro Ser Asp Trp Arg Pro Ala 140 145 150 Ile Trp Val Arg Val Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly 155 160 165 Ala Asn Ile Ser Asn Ile Leu Ser Ala His Gln Asn Val Val Leu 170 175 180 Asp Val Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Cys His Tyr Gly Ala 185 190 195 Pro Phe Val Cys Ser Leu Ile Met Phe Ile Phe Gly Pro Pro Gly 200 205 210 Thr Val Pro Leu Phe Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Ile Ser Met Thr 215 220 225 Ala Val Thr Ile Gln Leu Phe Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr 230 235 240 Glu Asn Arg Tyr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Ser Ile Gln Gly 245 250 255 Asp Pro Ala Gly Leu Ala Arg Ile Asp Lys Leu Phe Gly Ile Asp 260 265 270 Leu Tyr Thr Ser Gly Phe His Gln Ser Pro Val Val Phe Gly Ala 275 280 285 Phe Pro Ser Leu His Ala Ala Asp Ser Thr Leu Ala Ala Leu Phe 290 295 300 Met Ser His Val Phe Pro Arg Met Lys Pro Val Phe Val Thr Tyr 305 310 315 Thr Leu Trp Met Trp Trp Ala Thr Met Tyr Leu Ser His His Tyr 320 325 330 Ala Val Asp Leu Val Ala Gly Gly Leu Leu Ala Ala Ile Ala Phe 335 340 345 Tyr Phe Ala Lys Thr Arg Phe Leu Pro Arg Val Gln Leu Asp Lys 350 355 360 Thr Phe Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Val Glu Phe Gly Glu Ser Ala 365 370 375 Leu Glu Tyr Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Asn 380 385 390 Leu Asp Ser Asp Glu Trp Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser 395 400 405 Ser Gly Ser Leu Ser Pro Val Asp Asp His Tyr Ser Trp Glu Thr 410 415 420 Glu Ala Leu Thr Ser Pro His Thr Asp Ile Glu Ser Gly Arg His 425 430 435 Thr Phe Ser Pro
【0043】配列番号:5 配列の長さ:436 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Asn Thr Thr Leu Pro Ser Trp Lys Asp Arg Thr Gln Asn Gln 1 5 10 15 Phe Gly Lys Leu Gln Ile Gln Val Pro Trp Arg Thr Ile Gln Leu 20 25 30 Leu Val Pro His Arg Met Arg Arg Lys Ile Arg Ser Lys Leu Arg 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Thr Ser Ser Ile Ser Ser Leu Gln Thr Ser 50 55 60 Phe Ser Pro Val Asp Thr Leu Arg Ser Leu Gln Ser His Arg Trp 65 70 75 Thr Leu Tyr Asp Phe Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Val Gly Ile 80 85 90 Phe Ser Leu Ser Val Met Glu Ser Pro Gly Pro Leu Ala Lys Thr 95 100 105 Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Val Ser Leu Leu Leu Pro Ile Thr 110 115 120 Arg Gln Phe Phe Leu Pro Phe Leu Pro Ile Ala Gly Trp Leu Ile 125 130 135 Phe Phe Tyr Ala Cys Gln Phe Ile Pro Ser Asp Trp Arg Pro Ala 140 145 150 Ile Trp Val Arg Val Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly 155 160 165 Ala Asn Ile Ser Asn Ile Leu Ser Ala His Gln Asn Val Val Leu 170 175 180 Asp Val Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Cys His Tyr Gly Ala 185 190 195 Pro Phe Val Cys Ser Ala Ile Met Phe Ile Phe Gly Pro Pro Gly 200 205 210 Thr Val Pro Leu Phe Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Ile Ser Met Ala 215 220 225 Ala Val Thr Ile Gln Leu Phe Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr 230 235 240 Glu Asn Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Ser Met Pro Gly 245 250 255 Asn Pro Ala Gly Leu Ala Arg Ile Asp Glu Leu Phe Gly Ile Asp 260 265 270 Leu Tyr Thr Ser Gly Phe Arg Gln Ser Pro Val Val Phe Gly Ala 275 280 285 Phe Pro Ser Leu His Ala Ala Asp Ser Thr Leu Ala Ala Leu Phe 290 295 300 Met Ser Gln Val Phe Pro Arg Leu Lys Pro Leu Phe Val Ile Tyr 305 310 315 Thr Leu Trp Met Trp Trp Ala Thr Met Tyr Leu Ser His His Tyr 320 325 330 Ala Val Asp Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Ala Thr Val Ala Phe 335 340 345 Tyr Phe Ala Lys Thr Arg Phe Met Pro Arg Val Gln Asn Asp Lys 350 355 360 Met Phe Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Val Glu Tyr Gly Asp Ser Ala 365 370 375 Leu Asp Tyr Gly Tyr Gly Pro Ala Ser Phe Glu Gly Glu Phe Asn 380 385 390 Leu Asp Ser Asp Glu Trp Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Ile Ser 395 400 405 Ser Gly Ser Leu Ser Pro Val Asp Asp His Tyr Ser Trp Glu Gly 410 415 420 Glu Thr Leu Ala Ser Pro Ala Thr Asp Ile Glu Ser Gly Arg His 425 430 435 Phe
【0044】配列番号:6 配列の長さ:401 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro 1 5 10 15 Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln 20 25 30 Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp 35 40 45 Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile 50 55 60 Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe 65 70 75 Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe 80 85 90 Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser 95 100 105 Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val 110 115 120 Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp 125 130 135 Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp 140 145 150 Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Phe Gly Ala Pro Phe Val Val Ala 155 160 165 Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr 170 175 180 Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln 185 190 195 Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly 200 205 210 Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu 215 220 225 Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala 230 235 240 Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His 245 250 255 Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe 260 265 270 Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp 275 280 285 Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met 290 295 300 Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr 305 310 315 Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser 320 325 330 Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu 335 340 345 Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu 350 355 360 Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser 365 370 375 Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala 380 385 390 Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala 395 400
【0045】配列番号:7 配列の長さ:422 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Ser Ala Leu Ser Thr Leu Lys Lys Arg Leu Ala Ala Cys Asn 1 5 10 15 Arg Ala Ser Gln Tyr Lys Leu Glu Thr Ser Leu Asn Pro Met Pro 20 25 30 Thr Phe Arg Leu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Ser Trp Thr His Leu 35 40 45 Gln Tyr Val Phe Leu Ala Gly Asn Leu Ile Phe Ala Cys Ile Val 50 55 60 Ile Glu Ser Pro Gly Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Ala Cys Leu 65 70 75 Leu Ala Ile Ala Leu Thr Val Pro Leu Thr Arg Gln Ile Phe Phe 80 85 90 Pro Ala Ile Val Ile Ile Thr Trp Ala Ile Leu Phe Tyr Ser Cys 95 100 105 Arg Phe Ile Pro Glu Arg Trp Arg Pro Pro Ile Trp Val Arg Val 110 115 120 Leu Pro Thr Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly Ser Asn Leu Ser Ser 125 130 135 Leu Leu Ser Lys Thr Thr His Ser Ile Leu Asp Ile Leu Ala Trp 140 145 150 Val Pro Tyr Gly Val Met His Tyr Ser Ala Pro Phe Ile Ile Ser 155 160 165 Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ala Pro Pro Gly Thr Leu Pro Val Trp 170 175 180 Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Leu Ile Gln 185 190 195 Met Ala Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr Glu Asn Met Tyr Gly 200 205 210 Leu Glu Pro Ala Thr Tyr Ala Val Arg Gly Ser Pro Gly Gly Leu 215 220 225 Ala Arg Ile Asp Ala Leu Phe Gly Thr Ser Ile Tyr Thr Asp Gly 230 235 240 Phe Ser Asn Ser Pro Val Val Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His 245 250 255 Ala Gly Trp Ala Met Leu Glu Ala Leu Phe Leu Ser His Val Phe 260 265 270 Pro Arg Tyr Arg Phe Cys Phe Tyr Gly Tyr Val Leu Trp Leu Cys 275 280 285 Trp Cys Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Val 290 295 300 Gly Gly Met Cys Leu Ala Ile Ile Cys Phe Val Phe Ala Gln Lys 305 310 315 Leu Arg Leu Pro Gln Leu Gln Thr Gly Lys Ile Leu Arg Trp Glu 320 325 330 Tyr Glu Phe Val Ile His Gly His Gly Leu Ser Glu Lys Thr Ser 335 340 345 Asn Ser Leu Ala Arg Thr Gly Ser Pro Tyr Leu Leu Gly Arg Asp 350 355 360 Ser Phe Thr Gln Asn Pro Asn Ala Val Ala Phe Met Ser Gly Leu 365 370 375 Asn Asn Met Glu Leu Ala Asn Thr Asp His Glu Trp Ser Val Gly 380 385 390 Ser Ser Ser Pro Glu Pro Leu Pro Ser Pro Ala Ala Asp Leu Ile 395 400 405 Asp Arg Pro Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ile Phe Asp Ala Ser His 410 415 420 Leu Pro
【0046】配列番号:8 配列の長さ:471 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Ala Ser Ser Ile Leu Arg Ser Lys Ile Ile Gln Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Gln Leu Phe His Tyr Tyr Phe Leu Ser Glu Lys Ala Pro Gly Ser 20 25 30 Thr Val Ser Asp Leu Asn Phe Asp Thr Asn Ile Gln Thr Ser Leu 35 40 45 Arg Lys Leu Lys His His His Trp Thr Val Gly Glu Ile Phe His 50 55 60 Tyr Gly Phe Leu Val Ser Ile Leu Phe Phe Val Phe Val Val Phe 65 70 75 Pro Ala Ser Phe Phe Ile Lys Leu Pro Ile Ile Leu Ala Phe Ala 80 85 90 Thr Cys Phe Leu Ile Pro Leu Thr Ser Gln Phe Phe Leu Pro Ala 95 100 105 Leu Pro Val Phe Thr Trp Leu Ala Leu Tyr Phe Thr Cys Ala Lys 110 115 120 Ile Pro Gln Glu Trp Lys Pro Ala Ile Thr Val Lys Val Leu Pro 125 130 135 Ala Met Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asn Val Leu 140 145 150 Ala Thr Ile Thr Thr Gly Val Leu Asp Ile Leu Ala Trp Leu Pro 155 160 165 Tyr Gly Ile Ile His Phe Ser Phe Pro Phe Val Leu Ala Ala Ile 170 175 180 Ile Phe Leu Phe Gly Pro Pro Thr Ala Leu Arg Ser Phe Gly Phe 185 190 195 Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Leu Gly Val Leu Ile Gln Met Ala 200 205 210 Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Asn Leu His Gly Leu Glu 215 220 225 Pro Ala Asn Tyr Ser Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu Gly Arg 230 235 240 Ile Asp Lys Leu Leu Gly Val Asp Met Tyr Thr Thr Gly Phe Ser 245 250 255 Asn Ser Ser Ile Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His Ser Gly 260 265 270 Cys Cys Ile Met Glu Val Leu Phe Leu Cys Trp Leu Phe Pro Arg 275 280 285 Phe Lys Phe Val Trp Val Thr Tyr Ala Ser Trp Leu Trp Trp Ser 290 295 300 Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Ile Gly Gly 305 310 315 Ala Met Leu Ser Leu Thr Val Phe Glu Phe Thr Lys Tyr Lys Tyr 320 325 330 Leu Pro Lys Asn Lys Glu Gly Leu Phe Cys Arg Trp Ser Tyr Thr 335 340 345 Glu Ile Glu Lys Ile Asp Ile Gln Glu Ile Asp Pro Leu Ser Tyr 350 355 360 Asn Tyr Ile Pro Val Asn Ser Asn Asp Asn Glu Ser Arg Leu Tyr 365 370 375 Thr Arg Val Tyr Gln Glu Ser Gln Val Ser Pro Pro Gln Arg Ala 380 385 390 Glu Thr Pro Glu Ala Phe Glu Met Ser Asn Phe Ser Arg Ser Arg 395 400 405 Gln Ser Ser Lys Thr Gln Val Pro Leu Ser Asn Leu Thr Asn Asn 410 415 420 Asp Gln Val Ser Gly Ile Asn Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly 425 430 435 Asp Glu Ile Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Phe Glu Asp Glu Pro 440 445 450 Gln Gly Ser Thr Tyr Ala Ala Ser Ser Ala Thr Ser Val Asp Asp 455 460 465 Leu Asp Ser Lys Arg Asn 470
【0047】配列番号:9 配列の長さ:10 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列の特徴:3番目のXaa は、Val 又はIle である。 7番目のXaa は、Leu 又はVal である。
【0048】配列番号:10 配列の長さ:8 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド
【0049】配列番号:11 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列の特徴:5番目のXaa は、Ser 又はThr である。 9番目のXaa は、Ala 又はPhe である。 配列: Thr Met Tyr Leu Xaa His His Tyr Xaa Val Asp Leu 1 5 10
【0050】配列番号:12 配列の長さ:2935 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列: ATTTTCTTCC CCATAACAAC TCTTCTCGCC CTTCCTCCGG CTCCGTGGCC AAATTGTTTT 60 ATGCAGCGCC TCCTAGCGAT TTAACCTCGT TCTCGTTGCC CTTGCCTGTC CGCCTTGCGT 120 CAGTACGACC CTTGCAACGT GACCTTCCCC AGAGTATCCT CGTTTGGCCG CTGGAGACCG 180 GAGCTTGCAC CCTCATAAAC TAGCTCTTCG AAATCAATTC TCCGTTCTCC AGAGATTATC 240 GGATCGAATC TCTCCGCTGT CGACACCTTT CGTCTCTCGG TGATCCTCGC CCTTGGAGTC 300 TCGTCACGTT GACGCCTTGA ACCCCTGGCC GCCAACTCCA CATAGGAGAC CACACTTCAT 360 TCTTCCCCCG CCATAATTGC AGCACCCTCC GTCTCCCTTC GAGCTCCTCC TGGATCATCA 420 AGTCCGAAAG GATTAGACTC GTCGCAGCGA TGAATACCAC CCTTCCATCC TGGAAGGATC 480 GGACGCAAAA CCAGTTCGGC AAGCTCCAGA TCCAAGTCCC ATGGCGCACC ATACAACTTC 540 TCGTGCCGCA CCGTATGCGA CGGAAGATTC GGTCCAAGCT GCGCAGTCGG ATCTCGCCTA 600 CCTCATCGAT ATCCTCGTTG CAGACGTCAT TCTCACCTGT CGATACACTC AGGTCGCTGC 660 AAAGTCATAG ATGGACGCTC TATGACTTTC AGTATCTTTT GCTGCTGATT GTCGGCATAT 720 TCTCGCTGAG CGTTATGGAA TCACCTGGAC CATTGGCAAA GACCGCCGCG TTTACGCTAC 780 TTCTCGTCTC TCTCCTTCTC CCGATTACGC GCCAGTTCTT CTTGCCATTC CTCCCGATTG 840 CAGGATGGCT TATATTTTTC TACGCTTGCC AGTTCATCCC GAGCGACTGG CGCCCTGCAA 900 TCTGGGTTCG CGTGCTGCCG GCTCTGGAAA ACATTCTCTA CGGTGCTAAT ATCAGTAACA 960 TCCTTTCCGC TCACCAAAAT GTGGTGCTTG ACGTTTTGGC GTGGCTTCCC TACGGAATCT 1020 GCCATTATGG CGCGCCATTT GTGTGCTCAG CGATCATGTT CATCTTTGGT CCTCCCGGCA 1080 CCGTCCCCCT TTTCGCTCGA ACTTTTGGAT ACATCAGCAT GGCTGCAGTC ACCATTCAGC 1140 TGTTTTTCCC CTGCTCTCCT CCGTGGTACG AAAATCTGTA TGGTTTGGCT CCGGCTGATT 1200 ACTCCATGCC GGGTAATCCT GCGGGCCTTG CTCGCATCGA TGAGCTTTTT GGGATAGACT 1260 TGTACACATC GGGCTTCAGA CAATCTCCCG TCGTGTTTGG CGCATTTCCT TCCCTACATG 1320 CCGCTGATTC GACACTTGCA GCTCTATTTA TGAGCCAAGT GTTCCCACGG TTGAAGCCCT 1380 TGTTTGTCAT CTATACTCTC TGGATGTGGT GGGCTACAAT GTATCTTTCG CACCACTACG 1440 CTGTTGATCT GGTCGGTGGT GGCCTCTTGG CAACTGTCGC GTTCTACTTT GCTAAAACGC 1500 GGTTCATGCC TCGCGTCCAG AATGATAAGA TGTTCCGCTG GGACTACGAT TATGTTGAGT 1560 ACGGCGATTC CGCACTCGAC TATGGGTACG GTCCAGCCAG CTTCGAAGGC GAATTCAACC 1620 TTGATAGCGA TGAGTGGACC GTTGGTTCTT CGTCATCCAT TTCGTCCGGC TCCCTCAGTC 1680 CAGTTGACGA CCACTACTCT TGGGAGGGCG AGACTCTTGC CTCTCCTGCC ACCGACATCG 1740 AGTCTGGAAG GCATTTCTGA TCCTGCTCAA TGAGCCTTGA TACGTACTAC ACTGTGTACG 1800 TGCTACTGCA TTGACTAATG AGACGGCGTT TTCAAACAAA TTTTAACGAC ATGCTTGGTT 1860 ATCGCATTGA GCTGATTTCG ACACATATAT ATGTTTAATA CGTTTTGGGG ACACTCCAGG 1920 GATTCATGAC GGTTGCTTCA TATCCCGACC TGGGGATGGA TTGACCTGGT TGTGCCCAAT 1980 TTTCTTCTGC CTAACGTTTT GATTATACAT GCATTTTTCA CGAAACCAGC CGGCCCGCCA 2040 TGATCGTGAC CTCAATTTGA GCTCGAATCT TCCTGGGGCC TCCAGCGATA ATTCTTAATG 2100 CTCGTTCCGA GGGTGCCACA TCGGACATTC GCTTGTACAA CTTTTGCAGA ACGAACATTT 2160 TCACCGATTC CAACTTGAGT CATTCGCTTA CTACTTTCAA CTGGTCGAGA AACTTCGCTT 2220 CTTTTCAGCT CGGCTAGGTG CATAAATATT TTACATTCGT GTCGATCGCT CACATTTCAC 2280 GGCGCCTGGA AACTTGGGGG TTTCGATTTC ATTGGAAAGG ATAAACAACA TGGGCTGGGC 2340 GCCTTTTACA CGCACTACAT TCGCTTAGAA AAGTTCTGAT GCTTTTAATG ATTCTTGCAT 2400 TGGCATATAG AAAGGGGTCC TCCAGACTCG CTACTGTGGT CCTCTCTCAA CCCCACACTC 2460 GCTTGCTTTT AACAGTGGAC ACCCCGTGGA GCTACGTCTC CATCAAATAT TTGGCATCAA 2520 CCGGAATCGA TGCCAGGAGG ACTGAGCTTA CTCACGGTGA CCGTCGGGTA AAAGGCGTTC 2580 ATACAGAACA TCTCCTCTAT CCTCCTGTCC CATCTCGATT CTCTGGCTGC TGGACGCAAC 2640 ACACCTCGCT GCACGTTTTC GACTTCCTAA TACGACCTAA TATCATTCTC GGTTTTCTTT 2700 GCTCTGGCTC GCGGCCGCCA TTTATATGGC GTGTCGGCTC GAGTCTGAAG TGAACTTTTT 2760 TCTCCTTTCT GGCCTCCACA ACTTTCCGAT CCCTAGCAGC TTCCCGTGCA CAGCGAGGTG 2820 TTGTTGGATG ATTGTTCCAT AGCATTATCA TTATTCCTAA TCCGGTAGCG TTATGATTTA 2880 TGAAGAACAG TGATGTACAT TATTATGCGG TGATCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2935
【0051】配列番号:13 配列の長さ:2856 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA アンチセンス:YES 配列: TAGTATACAA GTTGCCTTCA TAAATCATAA CACTACCGGA TTATAACTAA TAATACTGCT 60 GCTATGGATA ATTTGCCCCA ACCACACACA CACACACACT ATCCAAGGGA AACGAAAAGA 120 AGAGGATAGT GTCCATGAGC GGAATTTGTG AGGTGAGGAG GATGTGATAG GTAGGTGTGA 180 GAGCGTCAGA CCATAGCAAG CAAGTCAAGT CACCGTCCAA CAAGTCGAGA ATCTGAGGTT 240 AGTCGAAGCC GGGTCAAATC GGGACGCGTG AACATCCTTC AACAAGCCCC GTCAGCGTCA 300 GACTCTCCTC CCAACCTTGC ACGTCCGGCG AATGTCAGAA AGCAACACAG TAGCCATGTG 360 TATAGCCCCC GGGTAATATG TGGACGTAAT CCACTTTGAG CGAATGGATA AACCATGCGA 420 GCAATCAAGA AGAAGGTCCA TCCTTCCCCT CTTTCTATAT GCTAATGCAG AGTTCGTGAT 480 GCATTGCAAA GCAGAAATGT AAAACCGTCT ATGCACAGCG AGTGAAGTGC AAGAAGAAAA 540 GGCGCCCCAT TCCGTGATTT TTTCCAATAT AAATGCTTCC AGTCCCAAGC GCCAAGAGTA 600 TGAGCGATCG ACACGAATGG TAAAAATAAA TATATAGCAT AGTCGAAACG AATAATAAGG 660 ATGGGTTCGA CCAGGTCAAG GTAATAGCGG ACGATAGAAG TGAGAATTGA AGTAGTGTCT 720 GGGTGGACAC GAGACAAGCG AGTGTTACCG ACGGGGGTTA TCGGATGGTC TTCCAGGACT 780 AAACACCAGG ATGCGTAGCC CCATTGTGTC CATTAACATT ATGATGGAGC AACGGCGTGT 840 AGCGATGAGC GATAACCCAT CCCACGTTCG AGCCCAACCC GGTTTCGCAA TGTCAAGCAA 900 TGTACAGTGA AGTGCGGCGG AAAGAGAAAC AGTATCCCAG GCGGATTCGG ACCGAGGTAC 960 ATTAAGGTCG AACCGATGAT CTGGGACACC GAAGAAAGGG TATTAAAGAT ATATGTGTCG 1020 AAATGTGCTC GATGCAATAA AGCCAGAATG TCGTGAAATG TTCTAACGCC GTCTCGTAAA 1080 TAGATGCAGT GGAGGAGGAG CGAGATCGCT ATATGCAGGT ATCGAGTTTG GTTTGTGGCT 1140 ACTCAAGGGC TGAAAGTATG CCTGCCGGAC TCAATATCAG TATGTGGGGA GGTCAGTGCC 1200 TCGGTTTCCC ATGAGTAATG ATCGTCAACG GGACTCAAGG AGCCTGAGGA GACGGAGGAT 1260 GAAGAACCAA CAGTCCATTC ATCGCTGTCG AGATTGAAGT CTCCATCATA GCCAGCTGCA 1320 CCATACCCAT ACTCCAGGGC AGACTCGCCG AATTCCACAT AGTCGTAGTC CCAACGGAAG 1380 GTCTTGTCGA GCTGGACACG GGGAAGGAAT CGGGTCTTGG CGAAGTAGAA AGCAATGGCG 1440 GCCAGGAGAC CACCCGCAAC CAAATCGACC GCATAGTGAT GTGAGAGGTA CATTGTTGCC 1500 CACCACATCC ATAGAGTATA GGTCACGAAG ACGGGCTTCA TGCGGGGGAA AACATGACTC 1560 ATGAAAAGTG CGGCCAGGGT TGAGTCGGCA GCATGCAGCG ACGGAAAAGC GCCGAACACA 1620 ACAGGCGACT GATGGAAAAC AGACGTGTAA AGGTCGATGC CGAAAAGCTT GTCAATGCGG 1680 GCAAGCCCTG CGGGATCACC TTGGATGGAG TAGTCTGCCG GAGCTAGACC ATAGCGATTC 1740 TCATACCAAG GTGGAGAGCA AGGGAAAAAC AGCTGAATAG TAACCGCAGT CATACTGATA 1800 TAGCCGAAAG TGCGCGCGAA AAGGGGAACA GTGCCGGGCG GACCGAAGAT GAACATGATC 1860 AACGAGCACA CAAACGGAGC GCCATAGTGG CAGATACCGT AGGGTAGCCA CGCCAGCACG 1920 TCAAGCACAA CGTTCTGGTG AGCGGATAGG ATGTTGCTGA TGTTTGCGCC GTAGAGAATA 1980 TTCTCCAGTG CAGGCAAGAC ACGAACCCAA ATCGCAGGGC GCCAATCGCT TGGGATGAAC 2040 TGGCAGGCGT AGAAAAACAG AAGCCATCCG GCAATCGGCA GAAACGGGAG GAAGAACTGG 2100 CGGGTCATAG GGATCAGGAG AGAGAATAGG AGCATGGAGA AAATGGCCGT TTTGCCCAAA 2160 GGCCCGGGCG ACTCGATAAC GGTCAAAGAG AAGATGCCCA CGATCAACAG AAGCAGATAT 2220 TGGAAGTCGT AAACCGTCCA TCGGTGGCTT TGGAGCGATC GTAGTGTGTC TGCAGGCGAT 2280 AACGACGTCT GTAAAGAGGC TATTGACGAG GTAGGAGACG CTCTACTGCG CAATTTGGAC 2340 CTTAACTTCC GCCGCATGCG ATGCGGGACG AGCAGTTGGA TGGACCGCCA TGGAACCTGG 2400 ATCTGAAGCT TTCCAAACTG GTTCTGCGTG CGGTCCTTCC ACGTGGGAAG TGTTTGATTC 2460 ATGGTTGCGG CGAGTCTTGC GGGCAAGACT CAGCTATAAT TCCTCCAGAT CGAACTCCGT 2520 CTGCTTTCTT TCCCCCCGAT TGTACAAGAG TTGGAAGGCG ACGAATAAAT CGGTCGCGGA 2580 AGCGGCAGAA AAGGGGTCTT GAATAACAAG CCGTTAGGCA ACGAGCAGGG TGCTGACGGC 2640 GTCAACCCGA GCGGGGAAAT TGAGATCGGT TCGAAGAAGA CGAAACGAAG CGCACGCTCC 2700 GGTCTCCAGC GGCCAAACGA GGATGTCTTT GAGCCGTCAC GTTGCAGGGG GTTTCACTGA 2760 TGCAAGGCGA AGTGCAAGGG CGCAGCAGTC GAGAGGAAAA CCTGGAACGA GGAGGTCGTG 2820 AGGGAGGCAG ATGGCCACGG AGCCGGAGTA TAAACC 2856
【0052】配列番号:14 配列の長さ:2856 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:mRNA アンチセンス:YES 配列: UAGUAUACAA GUUGCCUUCA UAAAUCAUAA CACUACCGGA UUAUAACUAA UAAUACUGCU 60 GCUAUGGAUA AUUUGCCCCA ACCACACACA CACACACACU AUCCAAGGGA AACGAAAAGA 120 AGAGGAUAGU GUCCAUGAGC GGAAUUUGUG AGGUGAGGAG GAUGUGAUAG GUAGGUGUGA 180 GAGCGUCAGA CCAUAGCAAG CAAGUCAAGU CACCGUCCAA CAAGUCGAGA AUCUGAGGUU 240 AGUCGAAGCC GGGUCAAAUC GGGACGCGUG AACAUCCUUC AACAAGCCCC GUCAGCGUCA 300 GACUCUCCUC CCAACCUUGC ACGUCCGGCG AAUGUCAGAA AGCAACACAG UAGCCAUGUG 360 UAUAGCCCCC GGGUAAUAUG UGGACGUAAU CCACUUUGAG CGAAUGGAUA AACCAUGCGA 420 GCAAUCAAGA AGAAGGUCCA UCCUUCCCCU CUUUCUAUAU GCUAAUGCAG AGUUCGUGAU 480 GCAUUGCAAA GCAGAAAUGU AAAACCGUCU AUGCACAGCG AGUGAAGUGC AAGAAGAAAA 540 GGCGCCCCAU UCCGUGAUUU UUUCCAAUAU AAAUGCUUCC AGUCCCAAGC GCCAAGAGUA 600 UGAGCGAUCG ACACGAAUGG UAAAAAUAAA UAUAUAGCAU AGUCGAAACG AAUAAUAAGG 660 AUGGGUUCGA CCAGGUCAAG GUAAUAGCGG ACGAUAGAAG UGAGAAUUGA AGUAGUGUCU 720 GGGUGGACAC GAGACAAGCG AGUGUUACCG ACGGGGGUUA UCGGAUGGUC UUCCAGGACU 780 AAACACCAGG AUGCGUAGCC CCAUUGUGUC CAUUAACAUU AUGAUGGAGC AACGGCGUGU 840 AGCGAUGAGC GAUAACCCAU CCCACGUUCG AGCCCAACCC GGUUUCGCAA UGUCAAGCAA 900 UGUACAGUGA AGUGCGGCGG AAAGAGAAAC AGUAUCCCAG GCGGAUUCGG ACCGAGGUAC 960 AUUAAGGUCG AACCGAUGAU CUGGGACACC GAAGAAAGGG UAUUAAAGAU AUAUGUGUCG 1020 AAAUGUGCUC GAUGCAAUAA AGCCAGAAUG UCGUGAAAUG UUCUAACGCC GUCUCGUAAA 1080 UAGAUGCAGU GGAGGAGGAG CGAGAUCGCU AUAUGCAGGU AUCGAGUUUG GUUUGUGGCU 1140 ACUCAAGGGC UGAAAGUAUG CCUGCCGGAC UCAAUAUCAG UAUGUGGGGA GGUCAGUGCC 1200 UCGGUUUCCC AUGAGUAAUG AUCGUCAACG GGACUCAAGG AGCCUGAGGA GACGGAGGAU 1260 GAAGAACCAA CAGUCCAUUC AUCGCUGUCG AGAUUGAAGU CUCCAUCAUA GCCAGCUGCA 1320 CCAUACCCAU ACUCCAGGGC AGACUCGCCG AAUUCCACAU AGUCGUAGUC CCAACGGAAG 1380 GUCUUGUCGA GCUGGACACG GGGAAGGAAU CGGGUCUUGG CGAAGUAGAA AGCAAUGGCG 1440 GCCAGGAGAC CACCCGCAAC CAAAUCGACC GCAUAGUGAU GUGAGAGGUA CAUUGUUGCC 1500 CACCACAUCC AUAGAGUAUA GGUCACGAAG ACGGGCUUCA UGCGGGGGAA AACAUGACUC 1560 AUGAAAAGUG CGGCCAGGGU UGAGUCGGCA GCAUGCAGCG ACGGAAAAGC GCCGAACACA 1620 ACAGGCGACU GAUGGAAAAC AGACGUGUAA AGGUCGAUGC CGAAAAGCUU GUCAAUGCGG 1680 GCAAGCCCUG CGGGAUCACC UUGGAUGGAG UAGUCUGCCG GAGCUAGACC AUAGCGAUUC 1740 UCAUACCAAG GUGGAGAGCA AGGGAAAAAC AGCUGAAUAG UAACCGCAGU CAUACUGAUA 1800 UAGCCGAAAG UGCGCGCGAA AAGGGGAACA GUGCCGGGCG GACCGAAGAU GAACAUGAUC 1860 AACGAGCACA CAAACGGAGC GCCAUAGUGG CAGAUACCGU AGGGUAGCCA CGCCAGCACG 1920 UCAAGCACAA CGUUCUGGUG AGCGGAUAGG AUGUUGCUGA UGUUUGCGCC GUAGAGAAUA 1980 UUCUCCAGUG CAGGCAAGAC ACGAACCCAA AUCGCAGGGC GCCAAUCGCU UGGGAUGAAC 2040 UGGCAGGCGU AGAAAAACAG AAGCCAUCCG GCAAUCGGCA GAAACGGGAG GAAGAACUGG 2100 CGGGUCAUAG GGAUCAGGAG AGAGAAUAGG AGCAUGGAGA AAAUGGCCGU UUUGCCCAAA 2160 GGCCCGGGCG ACUCGAUAAC GGUCAAAGAG AAGAUGCCCA CGAUCAACAG AAGCAGAUAU 2220 UGGAAGUCGU AAACCGUCCA UCGGUGGCUU UGGAGCGAUC GUAGUGUGUC UGCAGGCGAU 2280 AACGACGUCU GUAAAGAGGC UAUUGACGAG GUAGGAGACG CUCUACUGCG CAAUUUGGAC 2340 CUUAACUUCC GCCGCAUGCG AUGCGGGACG AGCAGUUGGA UGGACCGCCA UGGAACCUGG 2400 AUCUGAAGCU UUCCAAACUG GUUCUGCGUG CGGUCCUUCC ACGUGGGAAG UGUUUGAUUC 2460 AUGGUUGCGG CGAGUCUUGC GGGCAAGACU CAGCUAUAAU UCCUCCAGAU CGAACUCCGU 2520 CUGCUUUCUU UCCCCCCGAU UGUACAAGAG UUGGAAGGCG ACGAAUAAAU CGGUCGCGGA 2580 AGCGGCAGAA AAGGGGUCUU GAAUAACAAG CCGUUAGGCA ACGAGCAGGG UGCUGACGGC 2640 GUCAACCCGA GCGGGGAAAU UGAGAUCGGU UCGAAGAAGA CGAAACGAAG CGCACGCUCC 2700 GGUCUCCAGC GGCCAAACGA GGAUGUCUUU GAGCCGUCAC GUUGCAGGGG GUUUCACUGA 2760 UGCAAGGCGA AGUGCAAGGG CGCAGCAGUC GAGAGGAAAA CCUGGAACGA GGAGGUCGUG 2820 AGGGAGGCAG AUGGCCACGG AGCCGGAGUA UAAACC 2856
【図1】オーレオバシジン感受性関連遺伝子anaurlR の
ゲノムDNAの制限酵素地図を示す図である。
ゲノムDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図2】オーレオバシジン感受性関連遺伝子anaurlS の
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図3】オーレオバシジン感受性関連遺伝子afaurlS の
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図4】オーレオバシジン感受性関連遺伝子がコードす
る蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す図である。
る蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図5】オーレオバシジン感受性関連遺伝子anaurlのゲ
ノムDNAとcDNAと蛋白質との関係を示す図であ
る。
ノムDNAとcDNAと蛋白質との関係を示す図であ
る。
【図6】A.ニドランスとA.フミガタスのオーレオバ
シジン感受性遺伝子のノーザンハイブリダイゼーション
の結果を示す図である。
シジン感受性遺伝子のノーザンハイブリダイゼーション
の結果を示す図である。
【図7】A.ニガーや、A.オリゼーのオーレオバシジ
ン感受性関連遺伝子の検出を示すサザンハイブリダイゼ
ーションの結果を示す図である。
ン感受性関連遺伝子の検出を示すサザンハイブリダイゼ
ーションの結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI // A61K 38/00 C12R 1:66) A61P 35/00 C12N 15/00 ZNAA (C12N 15/09 A61K 37/02 C12R 1:66) C12R 1:66) (56)参考文献 特許3054026(JP,B2) 欧州特許出願公開644262(EP,A 1) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/31 C07K 14/38 C12Q 1/68 BIOSIS(DIALOG) CA(STN) WPI(DIALOG)
Claims (12)
- 【請求項1】 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質、若しくは該配列の275位に相当
する部位以外に1〜数個のアミノ酸残基の置換、挿入及
び欠失の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する蛋
白質であって、当該蛋白質を発現する宿主にオーレオバ
シジンに対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝
子。 - 【請求項2】 配列表の配列番号1に示される塩基配列
を有する請求項1記載の遺伝子。 - 【請求項3】 請求項2記載の遺伝子に下記条件におい
てハイブリダイズし、かつ当該蛋白質を発現する宿主に
オーレオバシジンに対する耐性を付与する蛋白質をコー
ドする遺伝子; 6×SSC、1% ラウリル硫酸ナトリウム、100μ
g/ サケ精子DNA、5×デンハルツ(ウシ血清アル
ブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ
0.1%の濃度で含む)を含む溶液中、65℃で20時
間インキュベートする。 - 【請求項4】 配列表の配列番号1に示される塩基配列
の15塩基以上の配列よりなる核酸プローブ。 - 【請求項5】 請求項2記載の遺伝子、又は請求項4記
載の核酸プローブをプローブとして用いることを特徴と
する、当該蛋白質を発現する宿主にオーレオバシジンに
対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子のクロ
ーニング方法。 - 【請求項6】 請求項2記載の遺伝子の全長のアンチセ
ンスDNA。 - 【請求項7】 請求項2記載の遺伝子の全長のアンチセ
ンスRNA。 - 【請求項8】 請求項1記載の遺伝子を含有させた組換
体プラスミド。 - 【請求項9】 請求項8記載の組換体プラスミドを導入
させた形質転換体。 - 【請求項10】 請求項9記載の形質転換体を培養し、
該培養物から宿主にオーレオバシジンに対する耐性を付
与する蛋白質を採取することを特徴とする、宿主にオー
レオバシジンに対する耐性を付与する蛋白質の製造方
法。 - 【請求項11】 請求項1記載の遺伝子がコードする、
当該蛋白質を発現する宿主にオーレオバシジンに対する
耐性を付与する蛋白質。 - 【請求項12】 請求項2記載の遺伝子、又は請求項4
記載の核酸プローブをプローブとして用いることを特徴
とする、当該蛋白質を発現する宿主にオーレオバシジン
に対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子の検
出方法。
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