JPH06189769A

JPH06189769A - 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法

Info

Publication number: JPH06189769A
Application number: JP5215306A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Oi; 英之大井; Masami Miura; 正巳三浦; Shusei Uno; 修正宇野; Masako Chugenji; 雅子中元寺; Takashi Hiramatsu; 隆司平松; Takao Omura; 孝男大村
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1994-07-12
Also published as: US5683893A; DE69331434D1; ES2170751T3; CA2102043A1; KR100393297B1; EP0595334B1; CA2102043C; DE69331434T2; DK0595334T3; KR940009334A; EP0595334A2; EP0595334A3; TW343997B

Abstract

(57)【要約】【構成】天然型AOX2プロモーターの塩基配列（配列表
の配列番号１）を以下の少なくとも一つの態様をもって
変異させてなる、変異型AOX2プロモーター。（イ）塩基番号1187から上流の少なくとも塩基番号845
■960 領域を含有するオリゴヌクレオチドを欠失。（ロ）塩基番号1274■1314 領域にある塩基配列の一部
を置換。（ハ）塩基番号1274■1314 領域において、新たなオリ
ゴヌクレオチドを付加。当該プロモーターを担持するベクター、当該ベクターを
導入してなる形質転換体、及び当該形質転換体を培養し
て異種蛋白質を採取することを特徴とする異種蛋白質の
製造方法。【効果】本発明の変異型AOX2プロモーターは天然型AO
X2プロモーターと比べてプロモーター活性が格段に増強
されている。故に異種遺伝子を発現しうる発現ベクター
におけるプロモーターとして利用価値が極めて高い。ま
た本発明のベクターは種々の有用な異種蛋白質を宿主内
で効率よく発現、産生することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、異種蛋白遺伝子を発現
する上で好適に使用される変異型ＡＯＸ２プロモータ
ー、該プロモーターを担持するベクター、該ベクターを
導入してなる形質転換体、および該形質転換体を培養す
ることを特徴とする異種蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術の分野においては、遺
伝子の発現量及び目的蛋白質の産生量の増大を目的とし
て、従来から遺伝子発現システムの改良、開発が行われ
ている。メタノール資化性酵母を宿主とする発現系は、
このような異種蛋白遺伝子発現システムとして興味がも
たれている系である。

【０００３】メタノール資化性酵母はメタノールを単一
の炭素源、及びエネルギー源として増殖することが可能
な酵母である。それは、この酵母がメタノールの代謝機
構における第一番目の反応、即ちメタノールを酸化して
ホルムアルデヒドとする反応を触媒する酵素であるアル
コールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．Ｂ、以下ＡＯＸ
ともいう。）をコードする遺伝子を有していることによ
る。

【０００４】ピキア酵母(Pichia pastoris) はメタノー
ル資化性酵母の一つであり、これはＡＯＸ１遺伝子及び
ＡＯＸ２遺伝子の二種類のＡＯＸ系遺伝子を持ってい
る。それらの遺伝子はそれぞれ５’末端側の非翻訳領域
に独自のプロモーターをもつことが知られているが（Ａ
ＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター）、強い転
写活性を有するＡＯＸ１プロモーターに比べて、ＡＯＸ
２プロモーターの転写活性は極めて低く、実際に発現、
産生されているアルコールオキシダーゼはＡＯＸ１遺伝
子由来のものであるとされている [Molecular and Cell
ular Biology, Vol.9, 1316(1989)]。

【０００５】従来、ピキア酵母を用いた異種蛋白質の生
産には、転写活性の強いＡＯＸ１プロモーターが使用さ
れている。また最近、このＡＯＸ系遺伝子の調節領域を
用いて異種蛋白質を生産する方法が研究されている（Ye
ast, 5, 167-177(1989) 、特開平1-128790号、同2-1042
90号公報、ヨーロッパ公開公報347928等) が、更にその
発現量を増幅させるために、強力な転写活性を有するプ
ロモーターの開発が求められている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、異種
蛋白質を大量に産生する上で有用な高い転写活性を有す
るプロモーター、該プロモーターを担持したベクター、
及び該ベクターを導入した形質転換体を提供することで
ある。さらに本発明は、該形質転換体を培養することに
よる異種蛋白質の製造方法を確立することを目的とする
ものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、転写活性
の高いプロモーターを開発する目的で鋭意研究を重ねた
結果、ＡＯＸ２遺伝子の転写制御領域のある特定領域を
変異させて得られるＤＮＡ断片をプロモーターとして利
用することによって、その下流域に位置する異種蛋白遺
伝子を効率良く発現させうることを見出し、更に研究を
すすめて本発明を完成した。

【０００８】即ち本発明は、天然型ＡＯＸ２プロモータ
ーの塩基配列（配列表の配列番号１）を以下の少なくと
も一つの態様をもって変異させてなる、変異型ＡＯＸ２
プロモーターに関する。（イ）塩基番号１１８７から上流の少なくとも塩基番号
８４５〜９６０領域を含有するオリゴヌクレオチドを欠
失。（ロ）塩基番号１２７４〜１３１４領域にある塩基配列
の一部を置換。（ハ）塩基番号１２７４〜１３１４領域において、新た
なオリゴヌクレオチドを付加。

【０００９】また本発明は、この変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターを担持してなるベクター、該ベクターを導入して
なる形質転換体、及び該形質転換体を培養することを特
徴とする異種蛋白質の製造方法に関する。

【００１０】本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは、
上記（イ）〜（ハ）の変異態様のいずれか一つ、または
それらの変異を組合わせてなるものであってよい。具体
的には、以下の変異態様が挙げられる。

【００１１】なお以下特に断らない限り、塩基番号とい
う場合、天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列（塩基
配列表、配列番号１）における塩基番号を示すものとす
る。

【００１２】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列
（配列表の配列番号１）において、塩基番号１１８７か
ら上流（５’末端側）領域の少なくとも塩基番号８４５
〜９６０領域を含むオリゴヌクレオチドを欠失してな
る、変異型ＡＯＸ２プロモーター。欠失部位は、塩基番
号１１８７から上流域であって少なくとも塩基番号８４
５〜９６０領域を含んでいれば、特に制限されない。こ
の範囲において、欠失ヌクレオチド数はいくつでもよ
く、また欠失部位数は１か所でも数カ所でもよい。具体
的には、塩基番号７４９〜１１８７領域の４３９ｂｐを
欠失したもの（配列表、配列番号２）、塩基番号９６０
から上流を全て欠失したもの（配列表、配列番号３）、
及び塩基番号１１８７から上流を全て欠失したもの（配
列表、配列番号４）等が例示される。

【００１３】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列
において、塩基番号１２７４〜１３１４領域にある塩基
配列の一部が置換してなる、変異型ＡＯＸ２プロモータ
ー。置換部位は、塩基番号１２７４〜１３１４の領域内
であれば特に制限されない。この範囲において、置換さ
れる塩基数（ヌクレオチド数）は１つでもそれ以上でも
よく、また置換される部位は１カ所でも数カ所でもよ
い。好ましくは、塩基番号１２７４位に配位するチミン
（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換されたものが挙げられる
（配列表、配列番号５）。

【００１４】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列
において、塩基番号１１８７から上流領域の少なくとも
塩基番号８４５〜９６０領域を含むオリゴヌクレオチド
を欠失しており、かつ塩基番号１２７４〜１３１４の領
域内の一部のヌクレオチドが置換してなる、変異型ＡＯ
Ｘ２プロモーター。このタイプの変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターは、上記した及びの両方の変異からなり、上
記した条件を満たしていれば特に制限されない。例え
ば、塩基番号１２７４位のＴがＣに置換され、かつ塩基
番号１１８７から上流を全て欠失してなるＤＮＡ断片が
挙げられる（配列表、配列番号６）。

【００１５】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列
において、新たなヌクレオチドを、塩基番号１２７４〜
１３１４領域内に付加してなる変異型ＡＯＸ２プロモー
ター。付加部位は、１２７４〜１３１４領域内であれば
特に制限されない。その範囲において付加されるヌクレ
オチドはいくつでもよく、また付加される部位は１カ所
でも数カ所でもよい。具体的には、塩基番号１３１４位
と１３１５位のヌクレオチドとの間に、塩基番号１２９
６〜１３１４領域で示される１９ｂｐのオリゴヌクレオ
チド（塩基配列表、配列番号７）が重複して挿入されて
なるものが挙げられる（塩基配列表、配列番号８）。

【００１６】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列
において、塩基番号１１８７から上流領域の少なくとも
塩基番号８４５〜９６０領域を含むオリゴヌクレオチド
を欠失しており、かつ新たなオリゴヌクレオチドを塩基
番号１２７４〜１３１４領域内に付加してなる変異型Ａ
ＯＸ２プロモーター。このタイプの変異型ＡＯＸ２プロ
モーターは、上記した及びの両方の変異からなり、
上記の条件を満たしていれば特に制限されない。例え
ば、塩基番号１３１４位と１３１５位のヌクレオチドと
の間に、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドが重
複して挿入されており、かつ塩基番号１１８７から上流
を全て欠失してなるものが挙げられる（塩基配列表、配
列番号９）。

【００１７】尚、後記の配列表に記載した塩基配列は
（配列番号２、３、４、５、６、８、９）、本発明を分
かりやすく例示する目的で示したものであり、本発明の
変異型ＡＯＸ２プロモーターは、これらのものに限定さ
れない。

【００１８】また、本発明の変異型ＡＯＸ２プロモータ
ーは配列表の配列番号１０で示される塩基配列（Upstre
am Activation Sequence：以下ＵＡＳという。）を有し
ていることが要求される。

【００１９】本発明の（１）変異型ＡＯＸ２プロモータ
ー、（２）該プロモーターを担持してなるベクター、及
び（３）該ベクターを導入してなる形質転換体は、例え
ば次のようにして調製される。

【００２０】（１）変異型ＡＯＸ２プロモーター。本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは、天然型ＡＯＸ
２プロモーターを遺伝子工学的手法によって処理するこ
とによって調製することができる。具体的には、天然型
ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列のある部位を、欠失、
置換または新たなる塩基を付加処理することによって調
製される。この処理は、通常の遺伝子工学的手法による
ことができ、例えば部位指定削除法〔Site-directed de
letion,Nucl. Acids Res., 11, 1645(1983)〕、部位特
異的変異法〔Site-directed Mutagenesis 〕、制限酵素
処理、合成遺伝子の利用による方法、ＰＣＲ法などが挙
げられる。

【００２１】また、本発明で示す変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターの塩基配列に基づいて、化学的に合成することに
よっても得ることができる。

【００２２】更に、ＡＯＸ１遺伝子が遺伝子工学的に破
壊されており、残存するＡＯＸ２遺伝子のみからアルコ
ールオキシダーゼを発現、産生させるために、メタノー
ル資化能が低い菌株をメタノールを単一の炭素源とする
培地で継代培養を行うことにより変異させ、その結果メ
タノール資化能が上昇した菌株（Super High Grade Str
ain:ＳＨＧ株）から、本発明の変異型ＡＯＸ２プロモー
ターを調製することもできる。

【００２３】（２）(i) 組換えベクターの構築上記で得られた変異型ＡＯＸ２プロモーターは適当なプ
ラスミドベクターまたはファージベクターの中に挿入さ
れ、異種蛋白質を発現するためのベクターとして使用さ
れる。

【００２４】当該プロモーターの各種プラスミド、ファ
ージへの挿入は、ＤＮＡ組換えの一般方法、例えば Mol
ecular Cloning.(1989),(Cold Spring Harbor Lab.) に
記載の方法に従って行うことができる。

【００２５】(ii)組換え発現ベクターの構築上記で得られる組換えベクター中の、変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターの３’側下流域に翻訳開始コドンを介して、
所望の異種蛋白遺伝子を挿入することによって、変異型
ＡＯＸ２プロモーター支配下で異種蛋白遺伝子が発現す
る本発明の組換え発現ベクターを構築することができ
る。または、上記の組換えプラスミドベクターまたはフ
ァージベクターから、制限酵素によって本発明の変異型
ＡＯＸ２プロモーターを切り出し、異種蛋白遺伝子を構
造遺伝子領域にもつベクターのプロモーター領域に、制
限酵素とＤＮＡリガーゼなどを用いて組み込むことによ
ってもよい。

【００２６】詳しくは、本発明のベクターは異種蛋白質
を効率よく発現させるために、転写の下流方向順に必要
により(1) 変異型ＡＯＸ２プロモーター、(2) リポソー
ム結合部位、(3) 翻訳開始コドン、(4) シグナルペプチ
ドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(5) 異種蛋白質
をコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(6) 翻訳終始コド
ン、(7) ターミネーター、(8) 選択マーカー遺伝子、
(9) 宿主中で自己複製可能な自律性複製配列、(10)相同
領域等をふくむように構築される。

【００２７】構造遺伝子としては、所望の異種蛋白質
（例えば、ヒト血清アルブミン、プロウロキナーゼ、組
織プラスミノーゲンアクチベーター、Ｂ型肝炎表面抗
原、各種インターフェロン等）をコードする遺伝子であ
れば特に制限はなく、またいかなる方法で得られるもの
であってもよい。例えばｍＲＮＡから合成されたｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、これらを適
当に組み合わせて構築したＤＮＡなどが挙げられる。具
体的には、ＨＳＡ構造遺伝子、ＡＯＸ１構造遺伝子、Ａ
ＯＸ２構造遺伝子などが例示される。

【００２８】上記構造遺伝子の５’末端側に、翻訳開始
コドンとしてＡＴＧを配していてもよい。また、３’末
端側に翻訳終止コドンを配していてもよい。翻訳終止コ
ドンとしては、ＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧが例示さ
れる。これらそれぞれのコドンは、必要に応じてその各
領域において１つ以上組み合わて配列されてもよく、こ
れらに特に限定はない。

【００２９】ターミネーターとしては、目的とする異種
蛋白質をコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に
対応したものであれば特に制限はない。例えばＡＯＸ１
ターミネーターまたはＡＯＸ２ターミネーター等が挙げ
られる。

【００３０】選択マーカー遺伝子として、抗生物質耐性
遺伝子または栄養要求性遺伝子など例示される。一般に
宿主が細菌である場合、抗生物質耐性遺伝子を用いるこ
とができ、抗生物質耐性遺伝子としてはシクロヘキシミ
ド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイ
グロマイシン耐性遺伝子、Ｇ−４１８耐性遺伝子等が例
示される。また、宿主がそれ以外の例えば酵母等の場
合、栄養要求性遺伝子を用いることができ、栄養要求性
遺伝子としてはＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ
４等が例示される。これらの選択マーカーは、１種また
は２種以上組み合わせて該ベクターの適切な位置に含有
されることが好ましい。

【００３１】また、宿主染色体上に導入するための相同
領域として、具体的にはＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ
２、ＡＲＧ４、ＴＲＰ１等が例示される。

【００３２】また本発明のベクターは、本発明の変異型
ＡＯＸ２プロモーターを連結状に複数個、即ち直列状二
量体、三量体等として含有していてもよい。この場合、
該プロモーター間に翻訳開始コドンを有さないものが好
ましい。

【００３３】（３）形質転換体とその培養本発明の形質転換体は、上記で得られた組換え発現ベク
ターを適当な宿主細胞を導入することによって調製され
る。

【００３４】詳細には、上述（２）の組換え発現ベクタ
ーを公知の方法、例えばコンピテント細胞法(J. Mol. B
iol., 53, 154, 1970)、プロトプラストポリエチレン融
合法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978)
、リン酸カルシウム法 (Science, 221, 551, 1983)
、ＤＥＡＥデキストラン法 (Science, 215, 166, 198
2) 、電気パルス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,
7161, 1984）、インビトロパッケージング法（Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルスベ
クター法（Cell, 37, 1053, 1984）、またはマイクロイ
ンジェクション法（Exp. Cell. Res., 153, 347, 1984)
などによって宿主に導入することによって作製される。

【００３５】使用される宿主としては、大腸菌、枯草
菌、酵母などの微生物が挙げられるが、好ましくは酵
母、より好適にはピキア酵母である。具体的にはＧＴＳ
１１５（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）等が例示さ
れる。

【００３６】ベクターの宿主細胞中での存在様式は、染
色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれ
る。またはプラスミド状態で存在してもよい。宿主に導
入される外来遺伝子のコピー数は１コピーでも複数であ
ってもよい。

【００３７】このようにして得られた形質転換体は、目
的とする組換え異種蛋白質を産生させるためにその宿主
に応じて適切な公知培地中で培養することができる。培
地には該形質転換体の生育に必須な炭素源、窒素源、無
機物、ビタミン、薬剤などが含有される。

【００３８】培地の一例としては、形質転換体の宿主が
大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（J. E
xp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, Ne
w York, 1972. p.431)などが、また宿主が酵母の場合、
ＹＰＤ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto P
eptone, ２％ Glucose）、ＹＰＧ培地（１％ Bacto Yea
st Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glycerol ）、
ＹＰＭ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto P
eptone, ２％ Methanol)、ＹＰＤＭ培地（１％Bacto Ye
ast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Dextrose,２
％ Methanol)、０．１〜５％メタノールを含有したＹＮ
Ｂ液体培地〔０．７％ Yeast NitrogenBase(Difco
社）〕、及び０．０１〜５％メタノールを含有したＹＰ
培地〔１％ Bacto Yeast Extract(Difco社) , ２％ Pol
y Peptone(大五栄養社）〕、及びＳＭＭ培地 (２％ Met
hanol,０．５％ CH ₃COONH ₄-synthetic medium)など
が例示される。

【００３９】培養は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは
３０℃前後で２０〜３６０時間程度実施され、必要に応
じて通気、攪拌を加えることもできる。培養液のｐＨは
５〜８の範囲が好ましい。

【００４０】培養後、培養上清中または形質転換体中に
蓄積された目的の異種蛋白質は公知の方法で抽出、精製
される。例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾
過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法を組み合わせて分離精製することができる。

【００４１】なお、本発明において使用する多くの技
法、反応及び分析方法は当業者らに自体周知のものであ
る。また、酵素、プラスミド、宿主等は商業的に入手で
きるものである。

【００４２】

【実施例・実験例】本発明をより詳細に説明するため
に、以下に実施例及び実験例を挙げるが、本発明はこれ
らにより何ら限定されるものではない。

【００４３】以下の実施例及び実験例で使用した全ての
酵素は、特に断らない限り商業的供給源、例えば宝酒造
株式会社等から入手したものである。

【００４４】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用し
た。

【００４５】ピキアパストリス(Pichia pastoris) ＧＴ
Ｓ１１５、ＰＣ４１３０、ＰＣ４１０５およびプラスミ
ドｐＰＧＰ１はフィリップス・ペトリウム社から入手し
た。

【００４６】ベクターとしてプラスミドを使用した大腸
菌の形質転換法、プラークハイブリダイゼーション法、
及び電気泳動法は「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバーラボラトリー〔「Molecular Clon
ing 」Cold Spring Harbor Laboratory(1982) 〕に記載
されている方法により行った。

【００４７】実施例１ＡＯＸ２遺伝子のクローニン
グ、及び組換えベクターの取得ＡＯＸ２遺伝子付近の配列及び制限酵素地図は Creggら
Mol. Cell. Biol, 9,1316-1323(1989)及び Koutzら YE
AST, 5, 167-177(1989)によって報告されており、それ
らを参考にしてＡＯＸ２遺伝子のクローニングを計画し
た。ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を図１に示し
た。

【００４８】まず、ＰＣ４１３０株より Cameronらの方
法〔 Nucleic Acids Res., 4, 1429(1977)〕により染色
体ＤＮＡを抽出精製した。なお、ＰＣ４１３０株はＧＴ
Ｓ１１５（ＨＩＳ４）のＡＯＸ１遺伝子領域の一部を、
ｐＰＧＰ１プラスミド（ＡＯＸ１プロモーター支配下に
ＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプラスミド）をＮ
ｏｔＩで切断した断片と置換してなる遺伝子領域をもつ
ものである（図２）。この染色体ＤＮＡをＡＯＸ２プロ
モーター領域、ＡＯＸ２構造遺伝子及びＡＯＸ２ターミ
ネーター領域が完全に含まれるように制限酵素ＸｂａＩ
とＰｓｔＩで完全に消化を行った。得られたＤＮＡ断片
をエタノール沈澱し、遠心して乾燥後に滅菌水に溶か
し、ＥｃｏＲＩメチラーゼ（宝酒造製）を添加し反応さ
せた。ＴＥ飽和フェノール・クロロホルム抽出、続いて
クロロホルム抽出を行い、水層についてエタノール沈澱
を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶解した。ＤＮＡブラ
ンティングキット（宝酒造製）を用いてＤＮＡ断片の末
端を平滑化し、そこにＥｃｏＲＩリンカー d(pG-G-A-A-
T-T-C-C)（宝酒造製）をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造製）を使用してライゲーションした。再度エタ
ノール沈澱を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶かし、Ｅ
ｃｏＲＩを加え３７℃１時間インキュベーションした。
１％アガロース電気泳動で４〜５Kbに相当する領域を切
り出し、GENE CLEAN II(BIO 101 社製) による溶出精製
を行ってＤＮＡを回収し、滅菌水に溶かした。

【００４９】精製されたＤＮＡ断片をλgt10 arms (Pro
toclone ^TM System ：プロメガ社製) とライゲーション
し、Gigapack-GOLD3（ストラタジーン社製) を用いてイ
ンビトロパッケイジングを行った。その組換えファージ
をＡ₆₀₀＝２に調製しておいたE.coli C600hfl株に吸着
させ、ＮＺＹプレート（１％ＮＺアミン、０．５％塩化
ナトリウム、０．５％イーストエキストラクト、０．０
２％硫酸マグネシウム、１．５％寒天末）に、１プレー
トに約５００個ずつのプラークが生じるように蒔いた。
生じたプラークのうち、上記のＤＮＡ断片を含有してな
るクローン（ポジティブクローン）をコロニーハイブリ
ダイゼーション法にて選択、取得した。即ち、４枚のナ
イロンメンブランColony/Plaque Screen^TM（ＮＥＮ
製）を用いて、プラークをメンブランに移行させ、変成
・中和・固定処理を行った。プローブとして、Pichia p
astorisＩＦＯ１０１３株由来のＡＯＸ１構造遺伝子前
半分に当たる部分をＥｃｏＲＶとＢａｌIIとで消化し得
られた断片をランダムプライマーラベリングキット( 宝
酒造製) を用いて³²Ｐ標識して用いた。プレハイブリダ
イゼーションは１％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、0.5 M Na
H ₂PO₄(pH7.2) 、７％ＳＤＳ溶液中６５℃で５分間行
った。ハイブリダイゼーションは１％ＢＳＡ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、0.5 M NaH ₂PO₄(pH7.2) 、７％ＳＤＳ、³²Ｐ
−プローブ溶液中６５℃、一夜行った。その後 0.5 M N
aH₂PO₄ (pH7.2)溶液中で室温１０分間インキュベート
して洗浄し、更に0.5 % ＢＳＡ、１mMＥＤＴＡ、40 mM
NaH ₂PO₄(pH7.2) 、５％ＳＤＳ溶液中で３７℃３０分
間３回インキュベートした。フィルターを風乾し、Ｘ線
フィルム露光カセット中Ｘ線フィルムと合わせて−８０
℃１６時間放置し、オートラジオグラフィーを行った。
その結果、２個のポジティブクローンが得られた。その
内の１クローンについてファージの増殖を行い、ファー
ジＤＮＡを抽出した。該ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、
アガロース電気泳動で目的の断片（1.5Kb と2.9Kb)が生
じていることを確かめた。

【００５０】一方、選択マーカーとしてアンピシリン耐
性遺伝子を持つプラスミドｐＵＣ１９（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリー社製) をＥｃｏＲＩで切断し、アル
カリフォスファターゼ処理した断片を作製、回収した。
そのプラスミドのＥｃｏＲＩ切断部位に、先のファージ
から回収してＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡ断片とをライゲ
ーションしてプラスミドベクターを構築し、E.coli HB1
01に導入して形質転換体を作製した。その形質転換体を
４０μg/mLアンピシリン含有Ｌプレート（トリスベース
０．６２ｇ、ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラ
クト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水に溶解し、１Ｌに調
整した後に１５ｇの寒天末を加えてオートクレーブ滅菌
する。冷却後アンピシリンを添加し、プラスチックシャ
ーレに分注固化してプレートとする。）に蒔き、３７℃
一夜培養した。生じたコロニーをスクリーニング（ミニ
プレップして、ＥｃｏＲＩ消化断片を確認した。）し
て、１．５ｋｂと２．７ｋｂの断片がｐＵＣ１９に挿入
されたクローンが得られていることを確認した。そのク
ローンを４０μg/mLアンピシリン含有スーパーブロス(
バクトトリプトン１２ｇ、イーストエキストラクト２４
ｇ、グリセロール５ｍＬを水に溶解し、９００ｍＬとし
てオートクレーブ滅菌したＡ液、及びリン酸２水素カリ
ウム３．８１ｇ、リン酸１水素カリウム１２．５ｇを水
に溶解して１００ｍＬとしてオートクレーブ滅菌したＢ
液とを９：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した培養基）中、
３７℃、一夜振盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラ
スミドＤＮＡを大量に抽出精製した。ＡＯＸ２プロモー
ター領域を含むプラスミドをｐＭＭ０３０（図３参
照）、ＡＯＸ２構造遺伝子及びターミネーターを含むプ
ラスミドをｐＭＭ０３１（図４参照）と命名した。これ
らのプラスミドの各種制限酵素消化により生じる断片の
大きさは報告されているパターンと一致していた。

【００５１】実施例２ＡＯＸ２プロモーター領域の
塩基配列決定実施例１において得られたプラスミドベクターｐＭＭ０
３０をＥｃｏＲＩで消化した。得られた１．５ｋｂ断片
を回収し、そのＤＮＡ断片をＤＮＡブランティングキッ
ト（宝酒造製）で処理して、平滑末端を有するＤＮＡ断
片を得た。一方、プラスミドｐＵＣ１９をＸｂａＩ消
化、マングビーンヌクレアーゼ（宝酒造製）処理、及び
アルカリフォスファターゼ処理を施し、そのＸｂａＩ切
断部位に先に得られたＤＮＡ断片をライゲーションし
た。この操作によりＡＯＸ２プロモーター領域ＤＮＡが
それぞれｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にサブクローニング
されたプラスミドが得られた。これらのプラスミドをキ
ロシークエンス用デレーションキット（宝酒造製）を用
いて処理し、１５０〜３００ｂｐずつインサートサイズ
が異なるデレーションミュータントを５〜６クローン作
製した。これらのデレーションミュータントの塩基配列
をＭ１３ジデオキシシークエンスキット（宝酒造製）を
用いて決定した。その結果、ＡＯＸ２プロモーター領域
のＡＴＧから上流１．５ｋｂの全塩基配列が決定され
た。

【００５２】実施例３ＡＯＸ２プロモーターにより支
配されるＨＳＡ発現ベクターの構築ｐＰＧＰ１をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡブランティング
キット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。そこに
ＥｃｏＲＩリンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ｃ）（宝酒造製）をライゲーションした。ＳｐｈＩに
よる完全な消化及びＥｃｏＲＩによる部分消化を行い、
６．５ｋｂ断片を回収・精製した。ｐＵＣ１９をＥｃｏ
ＲＩ及びＳｐｈＩで消化し、アルカリフォスファターゼ
処理の後、前記断片をライゲーションし、ｐＵＣ１９に
ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現し、ＨＩＳ
４を選択マーカーに持つプラスミドｐＰＧ００１を得た
（図５参照）。ｐＰＧ００１をＥｃｏＲＩで部分消化
し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造製）を用いて
末端を平滑化した。一方、アプライドバイオシステム社
製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いてホスホアミダイ
ド法によってＧＧＧＡＴＣＣＣの配列を持つＢａｍＨＩ
リンカーを合成した。これをＴ４ポリヌクレオチオキナ
ーゼ（宝酒造製）によりリン酸化し、先に平滑化処理し
た断片とライゲーションした。ＡｓｕII及びＢａｍＨＩ
で消化し、７．１ｋｂ断片を精製した。一方、ｐＰＧＰ
１をＨｉｎｄIII で消化し、DNA ブランティングキット
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。そこにＢａｍ
ＨＩリンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ）
（宝酒造製）をライゲーションし、ＡｓｕII及びＢａｍ
ＨＩで消化し、１．９ｂｐ断片を精製した。前出の７．
１ｋｂ断片とライゲーションし、ｐＰＧ００２を得た
（図６参照）。

【００５３】ｐＭＭ０３０をＥａｅＩで消化し、１．５
ｋｂの断片を回収した。マングビーンーヌクレアーゼ
（宝酒造製）処理により末端を平滑化した。そこにアプ
ライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａ
を用いてホスホアミダイド法にてＣＴＴＣＧＡＡＧの配
列をもつＡｓｕIIリンカーを合成した。これをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）によりリン酸化し、
先に平滑化処理した断片とライゲーションした。それを
ＥｃｏＲＩ及びＡｓｕIIで消化し、1.5kb のＡＯＸ２プ
ロモーター領域断片を回収した。一方、ＡＯＸ１プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現し、ＨＩＳ４領域を持つプ
ラスミドｐＰＧ００２をＥｃｏＲＩおよびＡｓｕIIで消
化し、ＡＯＸ１プロモーター領域を除いた８．１ｋｂ断
片をアルカリフォスファターゼ処理を行った後に回収し
た。ＡＯＸ２プロモーター領域１．５断片とライゲーシ
ョンし、ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現す
るプラスミドｐＭＭ０４１を作製した（図６参照）。ｐ
ＭＭ０４１の制限酵素地図を図７に示す。

【００５４】実施例４上流領域を欠失したＡＯＸ２プ
ロモーター遺伝子のＰＣＲ法による増幅翻訳開始点ＡＴＧ上流領域の長さが８０３ｂｐ、６８４
ｂｐ、５６８ｂｐ、４６２ｂｐ、３４１ｂｐ、２７３ｂ
ｐ、２４８ｂｐ、２１４ｂｐのＡＯＸ２プロモーター断
片をその５’末端にＥｃｏＲＩサイト、３’末端にＡｓ
ｕIIサイトを付加してＰＣＲ法で増幅できるようにプラ
イマーの配列を設計し、３９２型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（アプライドバイオシステム社製）を用いてホ
スホアミダイド法にて合成し、ＮＡＰ１０カラム（ファ
ルマシア製）により精製した。それぞれの配列を表１に
示す。

【００５５】

【表１】

【００５６】正鎖のいずれかと逆鎖のプライマーＰＣＲ
−ＲＶを用いて、ピキアパストリスの染色体ＤＮＡに対
してＰＣＲを行った。ＰＣＲ装置には、パーキンエルマ
ーＤＮＡサーマルサイクラー（シータス製）を用い、試
薬は GeneAmp^TMＤＮＡアンプリフィケーションキット
（宝酒造製）を用いた。反応液に混在する低分子をウル
トラフリーＣ３ＴＫ（ミリポア製）により除去したもの
を精製ＰＣＲ産物とした。

【００５７】実施例５上流欠失型ＡＯＸ２プロモータ
ーにより支配されるＨＳＡ発現ベクターの構築ＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１をＥｃｏＲＩ及びＡｓ
ｕIIで二重消化してアガロースゲル電気泳動により天然
型ＡＯＸ２プロモーター分離、除去し、ベクター部分に
実施例４で得られたＥｃｏＲＩ及びＡｓｕIIで二重消化
した精製ＰＣＲ産物を挿入したプラスミドを作製した。
挿入されたＤＮＡ断片が上流領域を欠失したＡＯＸ２プ
ロモーター遺伝子であることを確認するために、ＡＬ
Ｆ．ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア製）を用いて、
蛍光標識プライマーによるダイデオキシ法で塩基配列の
決定を行った。蛍光プライマーはユニバーサルプライマ
ー（ファルマシア製）を、反応キットはオートリードシ
ーケンシングキット（ファルマシア製）を用いた。その
結果、作製したプラスミドはすべて当初の設計どおり、
上流領域を欠失したＡＯＸ２プロモーターにより支配さ
れるＨＳＡ発現ベクターであることが確認された。プラ
イマーＰＣＲ６０を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが
８０３ｂｐ（プロモーターの５’末の塩基番号は７２
６）のＨＳＡ発現ベクターをｐＨＯ０６０、プライマー
ＰＣＲ６３を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが６８４
ｂｐ（プロモーターの５’末の塩基番号は８４５）のＨ
ＳＡ発現ベクターをｐＨＯ０６３、プライマーＰＣＲ６
４を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが５６８ｂｐ（プ
ロモーターの５’末の塩基番号は９６１）のＨＳＡ発現
ベクターをｐＨＯ０６４、プライマーＰＣＲ６５を用い
て得たＡＴＧ上流領域の長さが４６２ｂｐ（プロモータ
ーの５’末の塩基番号は１０６７）のＨＳＡ発現ベクタ
ーをｐＨＯ０６５、プライマーＰＣＲ７１を用いて得た
ＡＴＧ上流領域の長さが３４１ｂｐ（プロモーターの
５’末の塩基番号は１１８８）のＨＳＡ発現ベクターを
ｐＹＩ０７１、プライマーＰＣＲ６６を用いて得たＡＴ
Ｇ上流領域の長さが２７３ｂｐ（プロモーターの５’末
の塩基番号は１２５６）のＨＳＡ発現ベクターをｐＨＯ
０６６、プライマーＰＣＲ６７を用いて得たＡＴＧ上流
領域の長さが２４８ｂｐ（プロモーターの５’末の塩基
番号は１２８１）のＨＳＡ発現ベクターをｐＨＯ０６
７、プライマーＰＣＲ６８を用いて得たＡＴＧ上流領域
の長さが２１４ｂｐ（プロモーターの５’末の塩基番号
は１３１５）のＨＳＡ発現ベクターをｐＨＯ０６８と命
名した（図８）。

【００５８】実施例６１コピーのＨＳＡ発現ベクター
により形質転換されたピキアパストリス株の作製ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキ
ストロース）に宿主株であるピキアパストリスＧＴＳ１
１５株を植菌し、３０℃で１日間培養した。遠心により
集菌し、滅菌水、ＳＥＤ溶液（１Ｍソルビトール、２５
ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭジチオスレイトール）及び１Ｍ
ソルビトールで洗浄した。ザイモリエース溶液（５０μ
ｇ／ｍｌザイモリエース、１Ｍソルビトール、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．
８）に懸濁し、３０℃で約２０分間インキュベートする
ことによりプロトプラスト化した。プロトプラストを集
め、１ＭソルビトールとＣａＳ溶液（１Ｍソルビトー
ル、１０ｍＭＣａＣｌ₂）で順次洗浄したのち、菌体を
同溶液に懸濁した。１０μｇのＨＳＡ発現ベクターのＳ
ｔｕＩ消化ＤＮＡ断片を菌体に添加し、さらに、ＰＥＧ
溶液（２０％ＰＥＧ３３５０、１０ｍＭＣａＣｌ₂、１
０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）を加え、約３０分間放
置した。この操作によりベクターはピキアパストリスの
染色体ｈｉｓ４遺伝子座に効率よく組み込まれる。遠心
により集めた菌体をＳＯＳ溶液（１Ｍソルビトール、１
０ｍＭＣａＣｌ₂、０．３×ＹＰＤ培地）に懸濁し、こ
れを４５℃に保温した再生用寒天（１Ｍソルビトール、
１．３５％イーストニトロゲンベース不含アミノ酸、２
％デキストロース、４００μｇ／ｍｌビオチン、１％寒
天）とともに再生用寒天プレート上に重層し、３日から
５日間、３０℃で培養した。生育した形質転換体を含む
上層寒天をかきとり、滅菌水中で寒天を破砕することに
より菌懸濁液を調製した。菌懸濁液を適当量の滅菌水で
希釈してＳＤ w/o a.a. 寒天培地（０．７％イーストニ
トロゲンベース不含アミノ酸、２％デキストロース、
１．５％寒天）に塗布した。３０℃で数日間培養後、生
じたコロニーを再度ＳＤ w/o a.a. 寒天培地に塗布し、
組換え体のクローンを得た。数クローンを２ｍｌのＹＰ
Ｄ培地に植菌し、３０℃で２日から３日間培養した。遠
心により集めた菌体を１．２Ｍソルビトールを用いて
洗浄した後、ザイモリエース溶液（５０ｍＭトリス塩
酸，ｐＨ７．５、１．２Ｍソルビトール、２０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０．４ｍｇ／ｍｌザイモ
リエース）に懸濁した。懸濁液を３０℃でインキュベー
トすることによりプロトプラスト化した。プロトプラス
トをＳＤＳ溶液（０．４％ＳＤＳ、８０ｍＭトリス塩
酸，ｐＨ７．５、４０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、６５
℃でインキュベートすることにより破壊した。この液に
５Ｍ酢酸カリウム溶液を加えて氷冷後、遠心した。上
清を分離し、これに２．５倍容量のエタノールを加え、
放置した。遠心後、ＤＮＡ沈澱物をＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス塩酸，ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）で溶
解し、これによりリボヌクレアーゼＡを加え、３７℃で
インキュベートした後、フェノール溶液と／クロロホル
ム抽出を行った。水層に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム溶液と２．５倍容量のエタノールを加え、生じた沈
澱をＴＥ緩衝液で溶解し、組換え体の染色体ＤＮＡ溶液
とした。組換え体の染色体ＤＮＡをＢｇｌIIで消化し、
アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動ゲルを臭化エチ
ジウム染色後、０．２Ｎ塩酸で酸処理を行った。ゲルを
アルカリ変性後（０．２ＮＮａＯＨ，０．６ＭＮａＣ
ｌ）、中和液（０．２Ｍトリス塩酸，ｐＨ７．４、
０．６ＭＮａＣｌ）で順次処理した。ゲル中のＤＮＡ
を６×ＳＳＣ〔２０×ＳＳＣ（０．３Ｍクエン酸３ナ
トリウム２水和物、３ＭＮａＣｌ）を２０／６倍に薄
めたもの〕中でキャピラリー法でナイロン膜に移行さ
せ、このナイロン膜をＨＳＡ遺伝子をプローブとしたサ
ザンハイブリダイゼーションに用いた。なお、ＨＳＡ遺
伝子プローブ（０．７ｋｂ）は発現ベクターｐＭＭ０４
１をＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ消化することにより調製し
た。プローブの標識、プレハイブリダイゼーション、ハ
イブリダイゼーション、洗浄、免疫学的検出などはノン
ラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（ＤＩＧ−
ＥＬＩＳＡ法）（ベーリンガー・マンハイム製）を用い
て行い、それらの操作はキットの添付説明書に従った。
４．５ｋｂの単一バンドが検出されたクローンを１コピ
ーのＨＳＡ発現ベクターが組み込まれた形質転換株とし
た。

【００５９】実施例７上流領域を欠失したＡＯＸ２プ
ロモーターの転写活性の比較各ベクターが１コピー導入された形質転換体を５０ｍｌ
のＹＰＤ培地、ＹＰＭ培地（１％酵母エキス、２％ペプ
トン、２％メタノール）、及びＹＰＤＭ培地（１％酵母
エキス、２％ペプトン、２％デキストロース、２％メタ
ノール）で２９．５℃、１４０ｒｐｍにて振盪培養し、
ＨＳＡ産生量の経時変化を測定することで、プロモータ
ーのメタノール誘導性および活性比較を行った。ｐＨＯ
０６４、ｐＨＯ０６５、ｐＹＩ０７１形質転換体におい
ては炭素源にメタノールを用いた場合、高いＨＳＡ産生
量が認められ、グルコースを炭素源にした時の産生量は
抑制された。また、メタノールおよびグルコースを共存
させたＹＰＤＭ培地の場合、グルコースを消費した後に
メタノールを消費してＨＳＡを産生した。一方、上流領
域の長いｐＨＯ０６３、ｐＨＯ０６０、ｐＭＭ０４１、
また短いｐＨＯ０６６、ｐＨＯ０６７、ｐＨＯ０６８形
質転換体においてはいずれの培地においても微弱なＨＳ
Ａ発現のみが観察された。これらの培養のすべてにおい
て増殖は良好で形質転換体の間での増殖度の差はなかっ
た。ＨＳＡ産生量の経時変化の結果を図９に示し、ＹＰ
Ｍ培地での１４４時間目のＨＳＡ産生量の比較を表２に
示す。

【００６０】

【表２】

【００６１】実施例８ＡＯＸ２プロモーターの活性と
ＨＳＡｍＲＮＡ量との相関プロモーターの上流の長さの違いによって、ＨＳＡ産生
量に顕著な差が認められた。そこで、産生量の差がプロ
モーターの転写活性によるものであるかをＨＳＡｍＲＮ
Ａ量を比較することにより検討した。ｐＭＭ０４１形質
転換体、ｐＨＯ０６３形質転換体、ｐＨＯ０６４形質転
換体、ｐＹＩ０７１形質転換体、及びｐＨＯ０６６形質
転換体をＹＰＭ培地で培養を行い、対数増殖後期にチオ
シアン酸グアニジン法によりｍＲＮＡの抽出を行った。
それぞれ５μｇのｍＲＮＡに対しＨＳＡ遺伝子断片をプ
ローブとしてノーザン解析を行い、ＨＳＡｍＲＮＡ量の
比較を行った結果を図１０に示した。ＨＳＡ産生量が高
かったｐＨＯ０６４形質転換体とｐＹＩ０７１形質転換
体が高いＨＳＡｍＲＮＡの発現を示した。一方、ＨＳＡ
産生量が低かったｐＭＭ０４１形質転換体、ｐＨＯ０６
３形質転換体、及びｐＨＯ０６６形質転換体のＨＳＡｍ
ＲＮＡの発現は非常に低いレベルであった。従って、Ｈ
ＳＡ産生は転写レベルで制御されている可能性が高いこ
とが示唆された。

【００６２】以上、実施例７及び実施例８の結果から、
ＡＯＸ２プロモーターの転写制御機構については次のこ
とが明らかになった。

【００６３】まず、ｐＨＯ０６３形質転換体で明らかに
なったように、塩基番号８４５より下流領域からなるＡ
ＯＸ２プロモーターでは転写活性が非常に弱かった。そ
して、ｐＨＯ０６４形質転換体で見られたように、塩基
番号９６１より下流領域からなるＡＯＸ２プロモーター
では転写活性が顕著に強くなった。このことから、塩基
番号８４５〜９６０にＡＯＸ２プロモーターの転写活性
を抑制する配列（上流転写抑制化調節配列：Upstream R
epression Sequence：ＵＲＳ、以下この領域をＵＲＳ１
という。）が存在することが示唆された。

【００６４】一方、ＵＲＳ１の欠失により、ＡＯＸ２プ
ロモーターは（隠されていた本来の）強い転写活性を発
現するようになるにもかかわらず、ｐＨＯ０６６形質転
換体で見られたように塩基番号１２５６より下流領域か
らなるＡＯＸ２プロモーター（ＵＲＳ１非存在）では微
弱な発現しか認められなかった。このことからＡＯＸ２
プロモーターには転写の促進に関与する配列（上流転写
活性化調節配列：Upstream Activation Sequence、以下
ＵＡＳという。）の存在が示唆された。ＵＡＳはｐＹＩ
０７１形質転換体とｐＨＯ０６６形質転換体で見られた
結果より、塩基番号１１８８〜１２５５の間に存在する
ことが示唆された。ＵＡＳはＡＯＸ２プロモーターの強
い発現には必須の配列である。

【００６５】実施例９ＵＡＳ領域の特定−１実施例７よりＡＯＸ２プロモーターのＵＡＳは塩基番号
１１８８〜１２５５の間に存在することが示唆された
が、さらにその配列を特定することを試みた。翻訳開始
点ＡＴＧ上流領域の長さが３４１ｂｐと２７３ｂｐの間
にあたる３２２ｂｐ、３０５ｂｐ、２９３ｂｐ、２８５
ｂｐのＡＯＸ２プロモーター断片を実施例４と同様にＰ
ＣＲ法で増幅させた。これらを用いたＨＳＡ発現ベクタ
ーを実施例５と同様の方法で構築し、それぞれｐＨＯ０
８０、ｐＨＯ０８１、ｐＨＯ０８２、ｐＨＯ０８３と命
名した（図１１）。これらのベクターを用いて、実施例
６と同様の方法で形質転換体を作製した。形質転換体を
実施例７と同様の方法でＹＰＭ培地を用いて７２時間ま
で培養したところ、ｐＹＩ０７１形質転換体のみが高い
ＨＳＡ産生量を示し、他は微弱な発現のみが観察された
（表３）。

【００６６】

【表３】

【００６７】このことから、ＡＯＸ２プロモーターのＵ
ＡＳ領域はＡＴＧから上流領域３４１ｂｐと３２３ｂｐ
の間（塩基番号１１８８〜１２０６）の領域を一部ある
いは全部含んで存在することが示唆された。

【００６８】実施例１０ＵＡＳ領域の特定−２ＡＯＸ２プロモーターの塩基番号１１８８〜１２１２に
わたる領域にＰＣＲ法を用いて４種の部分変異を導入
し、それらの変異がプロモーターの転写活性に及ぼす影
響について解析を行った。ＰＣＲ法を用いた部分変異導
入法は文献（Ito, W., et al, Gene, 102, 67-70, 199
1) 記載の方法に従った。鋳型プラスミドとしてはＨＳ
Ａ発現ベクターｐＨＯ０６５のＡＯＸ２プロモーター及
びＨＳＡ前半領域の約１．２ｋｂをＥｃｏＲＩとＰｓｔ
Ｉで切り出し、クローニングベクターｐＵＣ１９のＥｃ
ｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトにサブクローニングしたプラ
スミドｐＨＯ０７４を用いた。さらに、４種の部分変異
導入プライマーＵＡＳｐを合成した。その配列を図１２
に示す。また変異導入の操作手順を図１３に示す。

【００６９】まず、ＵＡＳｐとマルチクローニングサイ
トの３’側に相補的なプライマーＲＶ（宝酒造製）を用
いてＰＣＲ産物を調製した。さらに別の反応チューブで
マルチクローニングサイトの５’側に相補的なプライマ
ーＭ４（宝酒造製）とマルチクローニングサイトのＳｐ
ｈＩとＨｉｎｄIII を塩基置換により消失させたプライ
マーＭＵＴＦ３（宝酒造製）を用いてＰＣＲ産物を調製
した。後者のＰＣＲ産物はマルチクローニングサイトの
ＳｐｈＩとＨｉｎｄIII が消失する。両ＰＣＲ産物の低
分子を除去した後、等量混合し、熱変性後、徐冷してア
ニーリングを行い、ヘテロな２本鎖を形成させた。ポリ
メレース反応により２本鎖を完成させ、Ｍ４およびＲＶ
で第２のＰＣＲを行った。この場合、ＰＣＲ産物は理論
上目的のＵＡＳに変異が導入されたものと、マルチクロ
ーニングサイトのＳｐｈＩとＨｉｎｄIII が消失したも
のの２種類が生成する。従って、混合物をＥｃｏＲＩ−
ＳｐｈＩで消化し、低分子を除去した後、ｐＵＣ１９に
リクローニングをおこなえば、ＵＡＳに変異が導入され
たものだけを得ることができる。このようにして得た数
種のプラスミドのＡＯＸ２プロモーターの塩基配列を決
定したところ、部分変異導入が導入されたＡＯＸ２プロ
モーターが得られた。これらを持つプラスミドをｐＨＯ
０８４、ｐＨＯ０８５、ｐＨＯ０８６、ｐＨＯ０８７と
した。

【００７０】ｐＨＯ０８４〜０８７をＥｃｏＲＩ及びＰ
ｓｔＩで消化して４６２ｂｐのＡＯＸ２プロモーター及
びＨＳＡ遺伝子の５’側の約１．２ｂの断片を得た。こ
れとＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１をＥｃｏＲＩ及び
ＰｓｔＩで消化して得られる天然型ＡＯＸ２プロモータ
ー及びＨＳＡ遺伝子の５’側を含む約１１７０ｂｐを交
換することにより、部分変異を導入したプロモーター支
配下のＨＳＡ発現ベクターｐＨＯ０８８、ｐＨＯ０８
９、ｐＨＯ０９０、ｐＨＯ０９５を構築した（図１４参
照）。

【００７１】これらのベクターを用いて、実施例６と同
様の方法で形質転換を行い、１コピーのＨＳＡ発現ベク
ターが導入された形質転換体を作製した。形質転換体を
実施例７と同様の方法でＹＰＭ培地を用いて７２時間ま
で培養したところ、すべての部分変異導入ＡＯＸ２プロ
モーターの転写活性が、ＵＲＳ１を欠失しＵＡＳを完全
に含むと推定されるＡＯＸ２プロモーター（ｐＹＩ０７
１、ｐＨＯ０６５）の１／４０〜１／６に低下した（表
４）。従って、ＡＯＸ２プロモーターのＵＡＳは部分変
異を導入した塩基番号１１８８〜１２１２の配列５’−
ＣＣＡＡＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴ
−３’の一部またはすべてを含むことが示唆された。

【００７２】

【表４】

【００７３】実施例１１ＵＡＳ領域の特定−３塩基番号１１８８〜１２１２の近傍の配列がＵＡＳとし
て機能するならば、他方のアルコールオキシダーゼであ
るＡＯＸ１遺伝子のプロモーター領域にも相同性のある
配列が存在する可能性がある。そこで、ＡＯＸ２プロモ
ーターとＡＯＸ１プロモーターの塩基配列のホモロジー
検索を行ったところ、２箇所の相同配列を見出した（図
１５）。その結果から、ＡＯＸ２プロモーターのＵＡＳ
は塩基番号１１９２〜１２１６の中に含まれることが推
定された。そこで該当する配列５’−ＧＡＴＡＧＧＣＴ
ＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴ−３’の機能を調
べた。すなわち、ＡＯＸ２プロモーターのＵＡＳ候補配
列である塩基番号１１９２〜１２１６の２５ｂｐをその
両端にＥｃｏＲＩサイトを付加してＤＮＡ／ＲＮＡシン
セサイザー（Ｍｏｄｅｌ３９２，ＡＢＩ社製）で化学
合成した。その配列は、正鎖：５’−ＡＡＴＴＣＧＡＴ
ＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴＧ−
３’、逆鎖：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＧＣＧＡＣ
ＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＡＴＣＧ−３’である。合成
後、ＮＡＰ１０カラム（ファルマシア製）で精製した。
約５μｇの正鎖ヌクレオチドおよび逆鎖ヌクレオチドを
混合し、９５℃で５分間加熱し、徐冷して両鎖をアニー
リングした。実施例１０においてＵＡＳに部分変異を導
入したために転写活性が低下したＨＡＳ発現プラスミド
ｐＨＯ０９０をＥｃｏＲＩで消化し、線状化した断片
と、先のアニーリングした合成ＤＮＡ配列断片を連結し
た。これでＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。数
個の形質転換体よりプラスミドを調製し、制限酵素分析
およびＤＮＡシーケンシンングによりＥｃｏＲＩサイト
に目的のＵＡＳ候補配列が挿入されているプラスミドを
選択し、ＨＳＡ発現ベクターｐＨＯ０９０Ｆと命名し
た。このベクターおよび元のベクターｐＨＯ０９０を用
いて実施例６と同様の方法で形質転換を行い、１コピー
のｐＨＯ０９０Ｆが導入された形質転換体を作製した。
形質転換体を実施例７と同様の方法でＹＰＭ培地を用い
て７２時間まで培養したところ、元のベクターｐＨＯ０
９０の形質転換体は２ｍｇ／リットルのＨＳＡ産生量で
あったが、ｐＨＯ０９０Ｆ形質転換体は１０倍に増強さ
れ２０ｍｇ／リットルのＨＳＡ産生量を示した（表
５）。従って、塩基番号１１９２〜１２１６の配列５’
−ＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡ
Ｔ−３’はＡＯＸ２プロモーターの転写活性を増強する
機能があること、すなわちＵＡＳを含んでいることが示
された。

【００７４】

【表５】

【００７５】実施例１２塩基番号１２７４〜１３１４
領域に変異を生じたＡＯＸ２プロモーターの取得ＡＯＸ１遺伝子が欠失しているためにメタノール資化能
が低いピキアパストリス株をメタノールを単一炭素源と
する培地で継代培養を行うことにより、ＡＯＸ１遺伝子
を有する株と同程度に増殖が良好になった変異株を取得
することができる。増殖が良好になったのはＡＯＸ２プ
ロモーターに変異が生じその転写活性が上昇したのが原
因であることが明らかになっている（特願平３−６３５
９８号）。この方法を利用して、ＡＯＸ１欠失株からメ
タノール資化能が上昇した変異株の取得を行った。ＡＯ
Ｘ１欠失株であるＰＣ４１０５株をメタノールを単一炭
素源とするＹＰＭ培地で継代培養を続けた。この継代培
養液を１０⁷〜１０⁸細胞数／寒天培地の割合でＹＮＢ
w/o a.a. −ＭｅＯＨ寒天培地（０．６７％イーストニ
トロゲンベース不含アミノ酸、２％メタノール、１．５
％寒天）に蒔くとＡＯＸ１欠失株は著しく生育が遅い
が、変異株の生育は早く、３〜４日でコロニーを形成す
る。このようにして、２０〜４５世代継代後の菌体より
メタノール資化能が強くなった変異株を取得した。これ
らをＳＨＧ４１０５−４株、ＳＨＧ４１０５−８株と命
名した。

【００７６】取得した変異株のＡＯＸ２プロモーター領
域をＰＣＲ法でクローニングした。すなわち、変異株及
びＰＣ４１０５株の染色体ＤＮＡに対して、ＡＯＸ２プ
ロモーターの塩基番号７２６〜７４３にハイブリダイズ
して、５’末端にＢａｍＨＩサイトを付加した主鎖側プ
ライマー（５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＡＧＣＧＡ
ＧＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）、及び塩基番号１３８６〜
１３６９にハイブリダイズし、５’末端にＥｃｏＲＩサ
イトを付加した逆鎖側プライマー（５’−ＣＣＧＡＡＴ
ＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＣ−３’）を
用いてＰＣＲを行った。これにより増幅されたＡＯＸ２
プロモーター断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩサイトにクローニングした。

【００７７】次にクローニングベクター上のＡＯＸ２プ
ロモーター断片の塩基配列を決定した。まず、親株のＰ
Ｃ４１０５株ではＡＯＸ２プロモーターの塩基配列は完
全に保持されていた。ＳＨＧ４１０５−４株は塩基番号
１２７４のＴがＣに置換されていた。ＳＨＧ４１０５−
８株においては塩基番号１２７４のＴは保存されていた
が、塩基番号１２９６〜１３１４の配列がその両端の配
列“ＧＧＡＧＡ”を介して重複していた。

【００７８】実施例１３塩基番号１２７４〜１３１４
領域に変異を生じたＡＯＸ２プロモーターの転写活性クローニングした変異型ＡＯＸ２プロモーターの転写活
性を比較検討するために、これらのプロモーター支配下
でＨＳＡを発現するベクターを構築した。まず、変異型
ＡＯＸ２プロモーターの５’末端のＢａｍＨＩサイトを
ＥｃｏＲＩに変換した。次にＥｃｏＲＩ−ＳｓｐＩで変
異型ＡＯＸ２プロモーター断片を分離し、ＨＳＡ発現ベ
クターｐＭＭ０４１の天然型ＡＯＸ２プロモーターと交
換して、変異型ＡＯＸ２プロモーター支配下でＨＳＡを
発現するベクターｐＨＯ０５９（点変異）、ｐＨＯ０６
１（重複変異）を構築した（図１６）。

【００７９】構築したＨＳＡ発現ベクターをピキアパス
トリスＧＴＳ１１５株の染色体のｈｉｓ４遺伝子座に組
み込み、１コピーのベクターが導入された形質転換体を
作製した。構築したベクターはＡＯＸ２プロモーターの
長さが８０３ｂｐである。そこで、８０３ｂｐの天然型
の配列を有するｐＨＯ０６０、及び１５２８ｂｐの天然
型の配列を有するｐＭＭ０４１、１５２８ｂｐの長さを
持つが塩基番号１２７４のＴがＣに置換されているプロ
モーターをもつｐＭＭ０４２を対照として用いた。形質
転換体のＹＰＭ培地を用いた培養を行い、培養７２時間
後の上清のＨＳＡ産生量を測定した。天然型ＡＯＸ２プ
ロモーターで支配されたｐＭＭＯ４１形質転換体及び塩
基番号７２６より上流を欠失したｐＨＯ０６０形質転換
体ではプロモーター活性が非常に低くＨＳＡの発現は微
弱であった。しかし、塩基番号１２７４の点変異プロモ
ーターで支配されたｐＨＯ０５９形質転換体及び重複変
異プロモーターで支配されたｐＨＯ０６１形質転換体は
顕著なプロモーター活性を示し、ＨＳＡを高発現した
（表６）。

【００８０】

【表６】

【００８１】ＡＯＸ２プロモーターの転写制御機構に関
して、実施例８においてＵＲＳ１の存在によってＡＯＸ
２プロモーターの転写活性が抑制されることが示され
た。さらに加えて、実施例１２からＵＲＳ１が存在して
も塩基番号１２７４のＴからＣへの点変異や、塩基番号
１２９６から１３１４の重複変異が存在すればＡＯＸ２
プロモーターの活性が強くなることがｐＭＭ０４２、ｐ
ＨＯ０５９、ｐＨＯ０６１形質転換体で明らかになっ
た。よって、塩基番号１２７４〜１３１４に近傍にもＡ
ＯＸ２プロモーターの転写活性の抑制に関与する領域が
含まれていることが示唆された。これをＵＲＳ２と呼ぶ
ことにする。

【００８２】実施例１４ＵＲＳ１が欠失してかつＵＲ
Ｓ２に変異の生じたＡＯＸ２プロモーターの転写活性塩基配列１２７４の点変異ＡＯＸ２プロモーターを持つ
ＳＨＧ４１０５−４株、塩基番号１２９６〜１３１４の
重複変異をもつＳＨＧ４１０５−８株、及び天然型のＧ
ＴＳ１１５株の染色体ＤＮＡそれぞれに対して、プロモ
ーターの塩基番号１１８８〜１２０６にハイブリダイズ
し、５’末端にＥｃｏＲＩサイトを付加した主鎖側プラ
イマー（５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＧＧＣＴ
ＡＴＴＴＴＴＧ−３’）、及び塩基番号１５２９〜１５
０１にハイブリダイズし、５’末端にＡｓｕIIサイトを
付加した逆鎖側プライマー（５’−ＴＴＣＧＡＡＧＴＴ
ＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧ
ＡＴ−３’）を用いてＰＣＲを行った。これにより増幅
されたＤＮＡ断片は塩基番号１１８７より上流を欠失し
たプロモーター断片であるのでＵＲＳ１が欠失している
がＵＡＳは保存されている。これをＥｃｏＲＩ−Ａｓｕ
IIで消化後、ＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１の天然型
ＡＯＸ２プロモーターと交換して、ベクターｐＹＩ０７
０（点変異）、ｐＹＩ０７２（重複変異）、ｐＹＩ０７
１（天然型）を構築した（図１７）。構築したＨＳＡ発
現ベクターをピキアパストリスＧＴＳ１１５株の染色体
のｈｉｓ４遺伝子座に組み込み、１コピーのベクターが
導入された形質転換体を作製した。形質転換体プールの
ＹＰＭ培地を用いた培養を行い、培養７２時間後の上清
のＨＳＡ産生量を測定した。ｐＹＩ０７０形質転換体と
ｐＹＩ０７２形質転換体はｐＹＩ０７１形質転換体より
も高いＨＳＡ産生量を示した。すなわち、ＵＲＳ１が欠
失してかつＵＲＳ２が変異したプロモーターはＵＲＳ１
が欠失しているのみのプロモーターよりも高い転写活性
を有することが明らかになった（表７）。

【００８３】

【表７】

【００８４】さらにこれらのプロモーターのメタノール
誘導性及びグルコース抑制性について検討した。形質転
換体をＹＰＤ培地、ＹＰＭ培地、及びメタノールとグル
コースが共存するＹＰＤＭ培地で培養を行い、その増殖
度とＨＳＡ産生量の時間変化を９６時間まで経時的に測
定した。その結果、これらの変異型プロモーターはすべ
てメタノール誘導性およびグルコース抑制性であり、し
かもメタノールが存在してもグルコースがすべて消費さ
れるまではＨＳＡ発現は誘導されない性質を有していた
（図１８）。

【００８５】

【発明の効果】本発明により得られた変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターは天然型ＡＯＸ２プロモーターと比べてプロ
モーター活性が格段に増強されている。ゆえに本プロモ
ーターは、異種遺伝子を発現しうる発現ベクターにおけ
るプロモーターとして利用価値が極めて高い。また、本
発明のベクターは種々の有用な異種蛋白質を宿主内で効
率よく発現、産生することができる。

【００８６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１５２８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATAGGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528

【００８７】配列表配列番号：２配列の長さ：１０８９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AAGATAGGCT ATTTTTGTCG CATAAATTTT 780 TGTCTCGGAG TGAAAACCCC TTTTATGTGA ACAGATTACA GAAGCGTCCT ACCCTTCACC 840 GGTTGAGATG GGGAGAAAAT TAAGCGATGA GGAGACGATT ATTGGTATAA AAGAAGCAAC 900 CAAAATCCCT TATTGTCCTT TTCTGATCAG CATCAAAGAA TATTGTCTTA AAACGGGCTT 960 TTAACTACAT TGTTCTTACA CATTGCAAAC CTCTTCCTTC TATTTCGGAT CAACTGTATT 1020 GACTACATTG ATCTTTTTTA ACGAAGTTTA CGACTTACTA AATCCCCACA AACAAATCAA 1080 CTGAGAAAA 1089

【００８８】配列表配列番号：３配列の長さ：５６８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 60 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 120 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 180 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATAGGCTA 240 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 300 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 360 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 420 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 480 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 540 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 568

【００８９】配列表配列番号：４配列の長さ：３４１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CCAAGATAGG CTATTTTTGT CGCATAAATT TTTGTCTCGG AGTGAAAACC CCTTTTATGT 60 GAACAGATTA CAGAAGCGTC CTACCCTTCA CCGGTTGAGA TGGGGAGAAA ATTAAGCGAT 120 GAGGAGACGA TTATTGGTAT AAAAGAAGCA ACCAAAATCC CTTATTGTCC TTTTCTGATC 180 AGCATCAAAG AATATTGTCT TAAAACGGGC TTTTAACTAC ATTGTTCTTA CACATTGCAA 240 ACCTCTTCCT TCTATTTCGG ATCAACTGTA TTGACTACAT TGATCTTTTT TAACGAAGTT 300 TACGACTTAC TAAATCCCCA CAAACAAATC AACTGAGAAA A 341

【００９０】配列表配列番号：５配列の長さ：１５２８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATAGGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCCTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528

【００９１】配列表配列番号：６配列の長さ：３４１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CCAAGATAGG CTATTTTTGT CGCATAAATT TTTGTCTCGG AGTGAAAACC CCTTTTATGT 60 GAACAGATTA CAGAAGCGTC CTACCCCTCA CCGGTTGAGA TGGGGAGAAA ATTAAGCGAT 120 GAGGAGACGA TTATTGGTAT AAAAGAAGCA ACCAAAATCC CTTATTGTCC TTTTCTGATC 180 AGCATCAAAG AATATTGTCT TAAAACGGGC TTTTAACTAC ATTGTTCTTA CACATTGCAA 240 ACCTCTTCCT TCTATTTCGG ATCAACTGTA TTGACTACAT TGATCTTTTT TAACGAAGTT 300 TACGACTTAC TAAATCCCCA CAAACAAATC AACTGAGAAA A 341

【００９２】配列表配列番号：７配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸付加ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：insertion sequence 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AAATTAAGCG ATGAGGAGA 19

【００９３】配列表配列番号：８配列の長さ：１５４７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATAGGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGAAAATTA 1320 AGCGATGAGG AGACGATTAT TGGTATAAAA GAAGCAACCA AAATCCCTTA TTGTCCTTTT 1380 CTGATCAGCA TCAAAGAATA TTGTCTTAAA ACGGGCTTTT AACTACATTG TTCTTACACA 1440 TTGCAAACCT CTTCCTTCTA TTTCGGATCA ACTGTATTGA CTACATTGAT CTTTTTTAAC 1500 GAAGTTTACG ACTTACTAAA TCCCCACAAA CAAATCAACT GAGAAAA 1547

【００９４】配列表配列番号：９配列の長さ：３６０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CCAAGATAGG CTATTTTTGT CGCATAAATT TTTGTCTCGG AGTGAAAACC CCTTTTATGT 60 GAACAGATTA CAGAAGCGTC CTACCCTTCA CCGGTTGAGA TGGGGAGAAA ATTAAGCGAT 120 GAGGAGAAAA TTAAGCGATG AGGAGACGAT TATTGGTATA AAAGAAGCAA CCAAAATCCC 180 TTATTGTCCT TTTCTGATCA GCATCAAAGA ATATTGTCTT AAAACGGGCT TTTAACTACA 240 TTGTTCTTAC ACATTGCAAA CCTCTTCCTT CTATTTCGGA TCAACTGTAT TGACTACATT 300 GATCTTTTTT AACGAAGTTT ACGACTTACT AAATCCCCAC AAACAAATCA ACTGAGAAAA 360

【００９５】配列表配列番号：１０配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸プラスミドＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：upstream activation sequence 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GATAGGCTAT TTTTGTCGCA TAAAT 25

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＯＸ２遺伝子付近の染色体の制限酵素地図を
示す図である。なお、括弧内の数字は、Ｘｂａｌ認識部
位を０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図２】ＰＣ４１３０株のＡＯＸ１、ＡＯＸ２遺伝子領
域を示す図である。

【図３】プラスミドｐＭＭ０３０のＡＯＸ２遺伝子付近
の制限酵素地図を示す図である。なお、括弧内の数字
は、ＥｃｏＲＩ認識部位を０とした時の距離（×１００
塩基）を示す。

【図４】プラスミドｐＭＭ０３１のＡＯＸ２遺伝子付近
の制限酵素地図を示す図である。なお、括弧内の数字
は、ＥｃｏＲＩ認識部位を０とした時の距離（×１００
塩基）を示す。

【図５】ｐＰＧ００１の構築を説明する図である。

【図６】ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現す
るプラスミドベクターｐＭＭ０４１の構築を説明する図
である。

【図７】ＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１の制限酵素地
図を示す図である。なお、図中、ＡＯＸ２ｐはＡＯＸ２
プロモーターを、ＡＯＸ１ｔはＡＯＸ１ターミネーター
を、prepro ＨＳＡはプレプロＨＳＡ配列を、ＨＳＡは
ＨＳＡｃＤＮＡを、ＨＩＳ４はP. pastoris ＨＩＳ４遺
伝子を、Ａｍｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子を、ｐＵＣ
１９はｐＵＣ１９由来配列を、ｐＢＲ３２２はｐＢＲ３
２２由来配列を意味するものである。

【図８】上流欠失型ＡＯＸ２プロモーターにより支配さ
れるＨＳＡ発現ベクターを示す図である。

【図９】上流欠失型ＡＯＸ２プロモーターの転写活性の
比較及び誘導性を示す図である。各ベクター導入形質転
換体をＹＰＤ培地、ＹＰＭ培地及びＹＰＤＭ培地で培養
し、４８、７２、１４４時間目のＨＳＡ産生量を示し
た。

【図１０】４種類の上流欠失型ＡＯＸ２プロモーターに
関し、その支配下で発現されるＨＳＡｍＲＮＡの量（ノ
ーザン解析法）を電気泳動により比較した写真である。
レーン１：ｐＨＯ０６６形質転換体、レーン２：ｐＹＩ
０７１形質転換体、レーン３：ｐＨＯ０６４形質転換
体、レーン４：ｐＨＯ０６３形質転換体、レーン５：ｐ
ＭＭ０４１形質転換体。

【図１１】ＵＡＳ領域を特定するために用いたＨＳＡ発
現ベクターを示す図である。

【図１２】部分変異導入用プライマー（４種類）の塩基
配列を示す図である。最上段の塩基配列はＡＯＸ２プロ
モーターの配列を示す。４種のプライマーＵＡＳｐの名
称に続いて、その塩基配列を示した。* はＡＯＸ２プロ
モーターの配列と同じ塩基を示す。

【図１３】ＵＡＳ領域に変異を導入してなるＡＯＸ２プ
ロモーターをもつＨＳＡ発現ベクターの構築手順を示す
図である。

【図１４】ＵＡＳ領域に変異を導入したＡＯＸ２プロモ
ーター支配下のＨＳＡ発現ベクターを示す図である。

【図１５】ＡＯＸ２プロモーターとＡＯＸ１プロモータ
ーの相同配列を示す図である。

【図１６】塩基番号１２７４〜１３１４（配列表、配列
番号１）領域に変異を生じたＡＯＸ２プロモーター支配
下のＨＳＡ発現ベクターを示す図である。

【図１７】ＵＲＳ１が欠失してかつＵＲＳ２に変異の生
じたＡＯＸ２プロモーター支配下のＨＳＡ発現ベクター
を示す図である。

【図１８】ＵＲＳ１欠失ＡＯＸ２プロモーターおよびＵ
ＡＳ２変異ＡＯＸ２プロモーターのメタノール誘導性、
及びグルコース抑制性を検討した結果を示す図である。
図中Ａは、ｐＹＩ０７０形質転換体（７０−７）の増殖
度とＨＳＡ産生量の時間変化（〜９６時間）を、またＢ
はｐＹＩ０７１形質転換体（７１−７）の増殖度とＨＳ
Ａ産生量の時間変化（〜９６時間）を示す。図中の凡例
は、形質転換体／培地種／測定対象を表し、培地種のＤ
はＹＰＤ培地を、ＭはＹＰＭ培地を、ＤＭはＹＰＤＭ培
地を示す。また、測定対象のＨＳＡはＨＳＡ産生量を、
ＯＤは菌体増殖度（ＯＤ 540nm）を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成５年１２月２１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者中元寺雅子大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者平松隆司大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者大村孝男大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号株式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列
（配列表の配列番号１）を以下の少なくとも一つの態様
をもって変異させてなる、変異型ＡＯＸ２プロモータ
ー。（イ）塩基番号１１８７から上流の少なくとも塩基番号
８４５〜９６０領域を含むオリゴヌクレオチドを欠失。（ロ）塩基番号１２７４〜１３１４領域にある塩基配列
の一部を置換。（ハ）塩基番号１２７４〜１３１４領域において、新た
なオリゴヌクレオチドを付加。
【請求項２】請求項１記載の変異型ＡＯＸ２プロモー
ターを担持してなるベクター。
【請求項３】異種蛋白構造遺伝子が請求項１記載の変
異型ＡＯＸ２プロモーターの転写制御下にある、請求項
２記載のベクター。
【請求項４】請求項２または請求項３記載のベクター
を導入してなる形質転換体。
【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養して、
該培養物から異種蛋白質を採取することを特徴とする異
種蛋白質の製造方法。