CN114773440A - 蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入Foc4原生质体；利用同源重组方法将该基因从Foc4中敲除，获得敲除突变体ΔFoUpe2；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoUpe2原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFoUpe2‑com。与Foc4相比，ΔFoUpe2对SDS胁迫的敏感性显著升高；致病性试验表明，FoUpe2的缺失使Foc4的致病力显著升高；将该基因回补后，其致病力得到恢复。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌未知蛋白(Uncharacterized protein)FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
背景技术
香蕉枯萎病(Fusarium wilt of banana，FWB)，又称为巴拿马病(Panamadisease)或香蕉黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense,Foc)所引致的一种具有毁灭性的土传病害，严重威胁着全球香蕉产业的发展。分泌蛋白是Foc的重要致病因子，但目前对于大部分Foc分泌蛋白的功能并不清楚。
FoUpe2(Uncharacterized protein)是一个未知蛋白，不含已知结构域，在镰刀菌中具有高度保守性。关于FoUpe2在香蕉枯萎病菌中的具体功能尚不清楚。本专利有助于全面了解Foc4效应蛋白的组成与功能，为进一步丰富Foc4的致病分子机理提供理论基础。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
本发明的目的是公开一种香蕉枯萎病菌基因FoUpe2及其编码蛋白FoUpe2的新功能。基因FoUpe2为SEQ ID NO：1中第1位至第441位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白FoUpe2为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入Foc4原生质体；利用PEG介导的同源重组方法将该基因从Foc4中敲除，最终获得了敲除突变体ΔFoUpe2；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoUpe2原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，最终获得了回补突变体ΔFoUpe2-com。ΔFoUpe2在应对SDS胁迫上存在缺陷。致病性测定表明，敲除突变体ΔFoUpe2致病性显著升高，回补突变体ΔFoUpe2-com的致病性则恢复到野生型Foc4水平。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
进一步的，所述的蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌抗胁迫中的应用。
优选的，所述的胁迫为SDS胁迫。
本发明提供一种蛋白FoUpe2在香蕉抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用。
本发明提供一种蛋白FoUpe2在筛选和/或鉴定香蕉枯萎病菌拮抗菌中的应用。
一种提高香蕉枯萎病菌致病力的方法，所述方法是通过使香蕉枯萎病菌的编码蛋白FoUpe2的基因功能缺失或下调，来提高香蕉枯萎病菌的致病力。
所述的编码蛋白FoUpe2的基因功能下调为通过RNA干涉技术(RNAi)或者基因组编辑技术(CRISPR-Cas)来下调香蕉枯萎病菌内的FoUpe2活性，达到提高致病力的目的。
本发明提供一种蛋白FoUpe2在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用，所述的防治是通过过表达编码蛋白FoUpe2的基因实现的。
本发明提供一种蛋白FoUpe2作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含促进香蕉枯萎病菌中编码蛋白FoUpe2的基因的表达(例如该基因的促进剂或含有该基因的过表达载体等)。
促进香蕉枯萎病菌中FoUpe2基因表达的药剂(例如该基因的促进剂或含有该基因的过表达载体等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
其中，所述的蛋白FoUpe2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述编码蛋白FoUpe2的基因，其核苷酸序列为下列A、B之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。
含有上述FoUpe2基因的敲除载体、过表达载体和重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了一个香蕉枯萎病菌4号小种(Foc4)未知蛋白FoUpe2及其编码该蛋白FoUpe2基因的新功能。所述基因FoUpe2为SEQ ID NO：1中第1位至第441位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白FoUpe2为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；FoUpe2蛋白不含有已知结构域，Uniprot分析其亚细胞定位未知，其在香蕉枯萎病菌的生物学功能并不清楚。将潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(gfp)置换FoUpe2编码基因FoUpe2，得到Foc4敲除突变体ΔFoUpe2；试验证明，与Foc4相比，ΔFoUpe2对SDS胁迫的敏感性显著升高；致病性试验表明，FoUpe2的缺失使Foc4的致病力显著升高；将该基因回补后，其致病力得到恢复。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。
附图说明
图1是香蕉枯萎病菌基因FoUpe2敲除载体的构建示意图。
图2是潮霉素抗性转化子hph基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：2000DNA Marker；泳道1：Foc4基因组DNA；泳道2：pCT74质粒；泳道3-6：阳性候选转化子2、6、16、17。
图3是潮霉素抗性转化子目的基因FoUpe2的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：1000DNA Marker；泳道1：Foc4基因组DNA；泳道2：pCT74质粒；泳道3-6：阳性候选转化子2、6、16、17。
图4是以hph片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：Foc4；泳道2-3：转化子6、16。
图5是以FoUpe2片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：Foc4；泳道2-3：转化子6、16。
图6是筛选候选回补转化子的琼脂糖凝胶电泳；其中，M：2000DNA Marker；泳道1：Foc4；泳道2：清水；泳道3-6：候选回补转化子3、7、12、21。
图7是敲除突变体ΔFoUpe2菌落形态的观察及菌落直径的测定；其中，A：ΔFoUpe2的菌落形态；B：ΔFoUpe2菌落直径统计图；ΔFoUpe2-6-com是指ΔFoUpe2-6-com-7。
图8是ΔFoUpe2的产孢量测定；其中，ΔFoUpe2-6-com是指ΔFoUpe2-6-com-7。
图9是敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com对不同胁迫条件的分析；其中，A：在不同胁迫条件下的菌落形态；B：在不同胁迫条件下的菌落生长抑制率；ΔFoUpe2-6-com是指ΔFoUpe2-6-com-7。
图10是敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com的致病性分析；其中，ΔFoUpe2-6-com是指ΔFoUpe2-6-com-7。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1实验材料
1.1供试菌株及植物
供试菌株为香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4，Foc4)，供试植物为具有4～5片叶的巴西蕉(Cavendish，AAA)。
1.2宿主菌及质粒载体
宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株。克隆载体为pMD18-Tvector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的gfp和hph基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)。
2实验方法
2.1FoUpe2基因上下游同源片段的扩增
香蕉枯萎病菌FoUpe2基因敲除载体的构建如图1所示。选取FoUpe2基因的上游和下游长度大小分别为1487bp和1049bp(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段)，并设计引物(表1)。
表1 FoUpe2基因同源臂A片段和B片段的扩增引物
引物名称 引物序列5′-3′ 酶切位点
FoUpe2-AF GG<u>GGTACC</u>TCTTCAGGGGTAGGACTTG KpnI
FoUpe2-AR CCG<u>CTCGAG</u>TAGCTATAGTTACAAGGCTGCTT XhoI
FoUpe2-BF CG<u>GAATTC</u>AAGATAGCGAGAAGAAATGGGTAGA EcoRI
FoUpe2-BR TCCC<u>CCCGGG</u>ACCTTACGCTTCAGGCTCCG XmaI
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA Kit D3390)说明书提取Foc4基因组DNA；以Foc4基因组DNA为模板，用引物FoUpe2-AF/AR进行PCR扩增，获得FoUpe2基因的同源臂A片段(FoUpe2-A)；用引物FoUpe2-BF/BR进行PCR扩增，获得FoUpe2基因的同源臂B片段(FoUpe2-B)。
PCR反应体系为：
2×TSINGKE Master Mix 12.5μL
模板DNA 0.5μL
FoUpe2-AF/BF(10μmol/L) 0.5μL
FoUpe2-AR/BR(10μmol/L) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 11.0μL
Total 25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min30S，共30个循环；72℃反应10min。使用PCR纯化试剂盒(PCR Cycle Pure Kit D6492)，对PCR扩增产物进行回收。
2.2FoUpe2基因敲除载体的构建
参考pMD18-T Vector(pMD18-T Vector Cloning Kit 6011)试剂盒说明书，将FoUpe2-A和FoUpe2-B分别与pMD18-T Vector载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoUpe2-A和pMD18T-FoUpe2-B。具体为：取1μL pMD18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μL solution I，于16℃下连接3～4h。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃下水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃下150rpm培养1h；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下倒置培养8～12h。
挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用KpnI和XhoI分别对pMD18T-FoUpe2-A和pCT74载体进行双酶切，回收A片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将A片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；获得重组质粒pCT74-FoUpe2-A。按同样程序，用EcoRI和XmaI分别对pMD18T-FoUpe2-B和重组质粒pCT74-FoUpe2-A进行双酶切，回收B片段和重组质粒。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74-FoUpe2-A连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoUpe2-KO。
2.3FoUpe2回补片段的扩增
选取FoUpe2基因的上游长度为1592bp的启动子序列，下游长度为497bp的终止子序列，并设计引物(表2)。
表2 FoUpe2基因回补片段的扩增引物
引物名称 引物序列5′-3′ 酶切位点
FoUpe2-com-F CG<u>GAATTC</u>AGGGAGCACGGATTGGAATTA EcoRI
FoUpe2-com-R AAGGAAAAAA<u>GCGGCCGC</u>AGAGAAAGGCGGACTCCGTG NotI
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA Kit D3390)说明书，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoUpe2-com-F/R进行PCR扩增，获得FoUpe2基因的回补片段(FoUpe2-com)。
具体的PCR反应体系为：
模板DNA 1.0μL
FoUpe2-com-F(10μmol/L) 1.0μL
FoUpe2-com-R(10μmol/L) 1.0μL
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus) 5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L) 4.0μL
Ex Taq(5U/μL) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 37.5μL
Total 50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，57℃反应1min，72℃反应3min，共30个循环；72℃反应10min。用PCR纯化试剂盒(PCR Cycle Pure Kit D6492)，对PCR扩增产物进行清洁回收。
2.4FoUpe2基因回补载体的构建
用EcoRI和NotI分别对FoUpe2-com和pCTZN载体进行双酶切，回收FoUpe2-com片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将FoUpe2-com片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；获得重组质粒pCTZN-FoUpe2-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoUpe2-com。
2.5Foc4原生质体的制备
将Foc4接种到查氏培养基(FeSO4·7H2O 0.018g，KCl 0.5g，K2HPO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaNO3 3g，蔗糖30g，ddH2O定容至1L)中，于28℃下150rpm培养3d，经200目细胞筛过滤后，获得分生孢子液，于4℃下10000×g离心10min，弃上清，获得浓缩的分生孢子液，加入到CM培养基(葡萄糖10.0g，蛋白胨2.0g，水解酪蛋白1.0g，酵母浸粉1.0g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，定容至1L，调节pH至6.5，其中，20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分在“201710903818.8、一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用”中公开)中，使分生孢子液终浓度为1×106个/mL；于28℃下120rpm培养11～12h，用100目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下4000×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl2)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×107个/mL。
香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤制备得到。
2.6Foc4敲除突变体原生质体的转化
用XmaI对敲除载体pCT74-FoUpe2-KO进行单酶切，获得敲除载体线性化片段(即A-hph-gfp-B片段)。将200μL Foc4原生质体置于冰上解冻后加入约5μg的A-hph-gfp-B片段，轻弹混合均匀，冰上静置20min；或者，将pCTZN-FoUpe2-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；逐滴加入1mL PTC(40％PEG-4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl，pH7.5)，混匀后冰上放置15min；加入15mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去上清，留下5mL混合液，加入3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃下100rpm震荡培养16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素或200μg/mL博来霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2-3d；挑取潮霉素(或博来霉素)抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素(或200μg/mL博来霉素)的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养2～3d，挑取单菌落用于鉴定。
2.7Foc4敲除突变体的PCR验证分析
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA Kit D3390)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物hph-F/R(见表3)进行hph基因片段的PCR扩增；用引物FoUpe2-F/R(见表3)进行FoUpe2基因片段的PCR扩增分析。
表3 FoUpe2敲除突变体PCR验证分析所用引物
引物名称 引物序列5′-3′
hph-F 5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′
hph-R 5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′
FoUpe2-F 5′-GCTTTAAGGGCACTTCTTGCC-3′
FoUpe2-R 5′-CAGAGCGAGTGGCATAGTTCA-3′
PCR反应体系如下：
模板DNA 0.5μL
FoUpe2-F/hph-F(10μmol/L) 0.5μL
FoUpe2-R/hph-R(10μmol/L) 0.5μL
2×TSINGKE Master Mix 12.5μL
ddH<sub>2</sub>O 11μL
Total 25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到PCR扩增产物。
2.8FoUpe2回补突变体的PCR验证分析
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA Kit D3390)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoUpe2 probe-F/R(见表4)进行基因片段FoUpe2的PCR扩增。
表4 FoUpe2回补突变体PCR验证分析所用引物
引物名称 引物序列5′-3′
FoUpe2 probe-F 5′-TTAACAAGCAGAGCCACCGA-3′
FoUpe2 probe-R 5′-AACTTGGAGCACGCTTTTCC-3′
PCR反应体系如下：
模板DNA 0.5μL
FoUpe2 probe-F(10μmol/L) 0.5μL
FoUpe2 probe-R(10μmol/L) 0.5μL
2×TSINGKE Master Mix 12.5μL
ddH<sub>2</sub>O 11μL
Total 25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到PCR扩增产物。
2.9Foc4敲除突变体的Southern blot分析
Southern Blot检测参考《分子克隆》(第二版)方法，使用Southern blot检测试剂盒进行进行Southern blot杂交。用引物FoUpe2 probe-F/R(见表4)扩增目的基因探针，用hph-F/R(见表3)扩增hph基因探针。DNA探针的PCR扩增体系如下：
模板DNA 1.0μL
FoUpe2 probe-F/hph-F(10μmol/L) 1.0μL
FoUpe2 probe-R/hph-R(10μmol/L) 1.0μL
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus) 5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L) 4.0μL
Ex Taq(5U/μL) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 37.5μL
Total 50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到PCR扩增产物。
2.10Foc4敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com的表型观察
(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4、ΔFoUpe2和ΔFoUpe2-com分别接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。在5d时采用十字交叉法测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。
(2)分生孢子的获得。将香蕉枯萎病菌接种至查氏培养基，于28℃下120rpm培养，3d后统计产孢量。
2.11敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com抗胁迫分析
将Foc4、ΔFoUpe2和ΔFoUpe2-com分别接种至不同胁迫培养基(分别含1mol/LNaCl、1mol/L山梨醇、30mmol/L H2O2、0.05％SDS、100μg/mL荧光增白剂(卡尔科弗卢尔荧光增白剂，CFW)和200μg/mL CR(刚果红))中，于28℃下培养5d，以PDA培养基作为空白对照，采用十字交叉法测量菌落直径，计算不同胁迫条件下的菌落生长抑制率，每个处理设置3个重复。
2.12敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com的致病性分析
取4叶期的巴西蕉，分别用Foc4、ΔFoUpe2和ΔFoUpe2-com的分生孢子(1×105个/mL)悬浮液进行浸根40min，再移栽于营养土中；置于26℃的植物培养室内培养，于光/暗12h/12h交替培养，23d后观察香蕉苗叶片和球茎的发病情况。分别以Foc4野生菌株和无菌水作为阳性和阴性对照。
3结果与分析
3.1香蕉枯萎病菌FoUpe2基因敲除载体的构建
采用PCR扩增方法，以Foc4基因组DNA为模板分别克隆获得FoUpe2基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与pMD18-T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoUpe2-A和pMD18T-FoUpe2-B。将pMD18T-FoUpe2-A与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-FoUpe2-A；将其与pMD18T-FoUpe2-B质粒连接，经大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoUpe2-KO(图1)。
3.2敲除突变体ΔFoUpe2的筛选
3.2.1基因片段hph的PCR验证
利用同源重组方法，将基因敲除载体pCT74-FoUpe2-KO转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了20个潮霉素抗性转化子。经DNA的提取，利用hph基因特异性引物，对20个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，上述20个转化子均扩增到了hph基因，转化子2、6、16、17的验证结果如图2所示。
3.2.2基因片段FoUpe2的PCR验证
进一步利用FoUpe2基因特异性引物，对上述PCR扩增到hph基因的20个阳性转化子进行FoUpe2的PCR验证分析。结果表明，在20个转化子中，有4个转化子(转化子2、6、16、17)没有扩增到FoUpe2基因，进一步说明这4个转化子为阳性转化子(图3)。
3.2.3敲除突变体ΔFoUpe2的Southern blot验证
从扩增到hph基因、同时没有扩增到FoUpe2基因的4个阳性转化子中选择2个阳性转化子进行Southern blot验证。结果表明，以hph为探针进行杂交，2个候选阳性转化子(转化子6、16)的杂交条带大小正确且单一，并且Foc4没有杂交出条带(图4)。对以上已验证过含有hph标记基因且为单拷贝的2个阳性转化子(转化子6、16)继续进行Southern blot验证，以FoUpe2基因为探针。结果表明，2个转化子均未有杂交条带(图5)。上述试验进一步证明这2个转化子为阳性转化子。
3.3回补突变体的筛选
采用PCR扩增方法，克隆获得FoUpe2基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoUpe2-com。
利用随机插入的方法，将基因回补载体pCTZN-FoUpe2-com转化敲除突变体ΔFoUpe2(ΔFoUpe2-6)原生质体，获得了23个博来霉素抗性转化子。经香蕉枯萎病菌基因组DNA的提取，利用FoUpe2基因特异性引物，对上述转化子进行了PCR验证(图6)。结果表明，3个转化子可以扩增出目的基因，进一步说明这3个转化子为阳性转化子。
3.4敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com的菌落形态和生长速率测定
将Foc4、敲除突变体ΔFoUpe2(ΔFoUpe2-6、ΔFoUpe2-16)和回补突变体ΔFoUpe2-com(ΔFoUpe2-6-com-7)分别接种于PDA培养基中，在接种5d后进行了菌落形态观察及菌落直径测定。结果表明，与Foc4相比，ΔFoUpe2的生长速率无明显变化(图7)。
3.5敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com的产孢量分析
将Foc4、敲除突变体ΔFoUpe2(ΔFoUpe2-6、ΔFoUpe2-16)、回补突变体ΔFoUpe2-com(ΔFoUpe2-6-com-7)分别接种于查氏培养基，培养3d后进行产孢量分析。结果表明，敲除突变体ΔFoUpe2的产孢量与Foc4无明显差异(图8)。
3.6敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com对不同胁迫条件的分析
将Foc4、ΔFoUpe2(ΔFoUpe2-6、ΔFoUpe2-16)和ΔFoUpe2-com(ΔFoUpe2-6-com-7)分别接种在分别含1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.05％SDS、30mmol/L H2O2、100μg/mL荧光增白剂(CFW)和200μg/mL CR的PDA培养基中，于28℃下培养5d后对其菌落直径进行测定。结果表明，与Foc4相比，ΔFoUpe2对0.05％SDS的敏感性升高，对1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、200μg/mL CR、30mmol/L H2O2、100μg/mL荧光增白剂(CFW)的敏感性无明显差异，说明FoUpe2在Foc4应对SDS胁迫反应中具有重要作用(图9)。
3.7敲除突变体ΔFoUpe2和回补突变体ΔFoUpe2-com的致病性分析
利用伤根接种法，将Foc4、ΔFoUpe2(ΔFoUpe2-6)和ΔFoUpe2-com(ΔFoUpe2-6-com-7)分生孢子液分别接种巴西蕉，于23d后进行观察。结果表明，Foc4和ΔFoUpe2-com孢子液接种23d后，巴西蕉苗下部叶片出现黄化，叶片黄化面积约占叶面积的50～60％。纵剖发病巴西蕉苗球茎，可观察到黑褐色病变，褐变面积接近球茎面积的55％；而ΔFoUpe2-6孢子液接种23d后，巴西蕉下部叶片黄化面积约占叶面积的65～70％。纵剖发病巴西蕉苗，可观察到黑褐色病变，褐变面积约占球茎面积的65％。说明敲除FoUpe2基因后，香蕉枯萎病菌致病力明显上升(图10)。
因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2基因的碱基序列
<220>
<222> (1)..(87)
<223> 非编码区
<220>
<222> (88)..(267)
<223> 外显子1
<220>
<222> (268)..(339)
<223> 内含子1
<220>
<222> (340)..(441)
<223> 外显子2
<400> 1
ctcacatccc agagcgagtg gcatagttca tcccaagcca ccagagttgc tcctacttat 60
atcgaccatc ctattcaaga ctttaccatg aagttcactg cgtccctctt cgcgatccta 120
gccgccacat cggtcctcgc ccatggggtc tcgccggcgt cagagggcga tctcgacgcc 180
ttaacaagca gagccaccga gtggggcaag tgcaacggaa cctcctgcaa ggttaatggc 240
aagaactatg gatgcaccaa gggaaaggtg ataaataccc tggcctagag acccaacggt 300
taaggaacaa aacttgttgc tgacgtaagc tctggctagt gtactgttca gagtggcggt 360
ggcgatggaa aagcgtgctc caagttgggc ggttctatct gctgtcctgg cggaaggatg 420
aagggcaaga agtgccctta a 441
<210> 2
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2蛋白质的氨基酸序列
<400> 2
Met Lys Phe Thr Ala Ser Leu Phe Ala Ile Leu Ala Ala Thr Ser Val
1 5 10 15
Leu Ala His Gly Val Ser Pro Ala Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ala Leu
20 25 30
Thr Ser Arg Ala Thr Glu Trp Gly Lys Cys Asn Gly Thr Ser Cys Lys
35 40 45
Val Asn Gly Lys Asn Tyr Gly Cys Thr Lys Gly Lys Cys Thr Val Gln
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Asp Gly Lys Ala Cys Ser Lys Leu Gly Gly Ser Ile
65 70 75 80
Cys Cys Pro Gly Gly Arg Met Lys Gly Lys Lys Cys Pro
85 90
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-AF
<400> 3
ggggtacctc ttcaggggta ggacttg 27
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-AR
<400> 4
ccgctcgagt agctatagtt acaaggctgc tt 32
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-BF
<400> 5
cggaattcaa gatagcgaga agaaatgggt aga 33
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-BR
<400> 6
tccccccggg accttacgct tcaggctccg 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-com-F
<400> 7
cggaattcag ggagcacgga ttggaatta 29
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-com-R
<400> 8
aaggaaaaaa gcggccgcag agaaaggcgg actccgtg 38
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hph-F
<400> 9
tgctgctcca tacaagccaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hph-R
<400> 10
gacattgggg agttcagcga 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-F
<400> 11
gctttaaggg cacttcttgc c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2-R
<400> 12
cagagcgagt ggcatagttc a 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2 probe-F
<400> 13
ttaacaagca gagccaccga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoUpe2 probe-R
<400> 14
aacttggagc acgcttttcc 20

Claims (10)

1.蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于：
所述蛋白FoUpe2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述蛋白FoUpe2在调控香蕉枯萎病菌抗胁迫中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的胁迫为SDS胁迫。
4.权利要求1～3任一项中所述的蛋白FoUpe2在香蕉抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用。
5.权利要求1～3任一项中所述的蛋白FoUpe2在筛选和/或鉴定香蕉枯萎病菌拮抗菌中的应用。
6.权利要求1～3任一项中所述的蛋白FoUpe2作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，其特征在于：所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于：
编码蛋白FoUpe2的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
8.一种提高香蕉枯萎病菌致病力的方法，其特征在于：所述方法是通过使香蕉枯萎病菌的编码蛋白FoUpe2的基因功能缺失或下调，来提高香蕉枯萎病菌的致病力；所述蛋白FoUpe2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述的编码蛋白FoUpe2的基因功能下调为通过RNA干涉技术或者基因组编辑技术来下调香蕉枯萎病菌内的FoUpe2活性，达到提高致病力的目的。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
所述编码蛋白FoUpe2的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
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