CN113278055B - 分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入稻瘟菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从稻瘟菌中敲除，获得敲除突变体ΔMoupe2；试验证明，相比稻瘟菌野生型，敲除突变体ΔMoupe2的分生孢子萌发和附着胞发育减缓，对细胞壁胁迫和渗透胁迫等更加敏感；致病性试验表明，MoUPE2的缺失显著降低了稻瘟菌的致病力；将该基因回补后，其致病力则恢复到野生型水平。本发明证实MoUPE2是稻瘟菌分生孢子萌发、附着胞发育，以及致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种稻瘟菌经典分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，其种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量约占全国粮食总产量的一半。由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上一种毁灭性的真菌病害，每年造成的粮食损失足够养活超过六千万人口。稻瘟菌对水稻的致病具有一个完备的侵染循环，主要包括的步骤有以下四个过程：依次为分生孢子附着到寄主叶片的表面、叶片表面形成侵染所需的附着胞、附着胞形成侵入钉穿透寄主表皮、侵染菌丝在寄主细胞内进一步扩展等。充分挖掘稻瘟菌致病相关基因并开展其功能研究，有助于全面了解稻瘟菌的致病分子机理，并为稻瘟菌的防控提供理论基础。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用。

本发明公开了一种稻瘟菌基因MoUPE2及其编码蛋白MoUPE2的新功能。基因MoUPE2为SEQ ID NO：1中第1位至第1056位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白MoUPE2为SEQ IDNO：2所示的蛋白质。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入稻瘟菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从稻瘟菌中敲除，获得敲除突变体ΔMoupe2；通过构建基因回补载体，将其导入ΔMoupe2原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔMoupe2-com。该基因的敲除突变体的分生孢子萌发和附着胞发育减缓，对细胞壁和渗透胁迫更加敏感。致病性测定表明，敲除突变体ΔMoupe2致病性显著降低；回补突变体ΔMoupe2-com的致病性则恢复到野生型水平。上述试验证明，稻瘟菌MoUPE2为稻瘟菌的致病相关基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用。

进一步的，所述的分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌生长发育中的应用。

进一步的，所述的分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌分生孢子萌发中的应用。

进一步的，所述的分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌附着孢形成中的应用。

进一步的，所述的分泌蛋白MoUPE2在维持稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。

进一步的，所述的分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌抗高渗透压胁迫中的应用。

优选的，所述的高渗透压胁迫为NaCl和/或山梨醇高渗透压胁迫。

本发明提供一种分泌蛋白MoUPE2在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用，所述的防治是通过阻断或抑制编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达来实现的。

本发明提供一种分泌蛋白MoUPE2作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由稻瘟菌导致的稻瘟病。

本发明再提供一种治疗由稻瘟菌导致的植物稻瘟病的方法，包含阻断或抑制稻瘟菌中编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。

阻断或抑制稻瘟菌中编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由稻瘟菌导致的植物稻瘟病。

其中，所述的分泌蛋白MoUPE2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物；

编码分泌蛋白MoUPE2的基因，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有控制稻瘟菌致病力功能的类似物；

含有上述编码分泌蛋白MoUPE2的基因的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供一个稻瘟菌未表征蛋白MoUPE2(Uncharacterized protein，MoUPE2)及其编码基因MoUPE2的新功能。MoUPE2蛋白在稻瘟菌中的生物学功能并不清楚。将潮霉素磷酸转移酶基因(HPH)和荧光蛋白基因(SGFP)置换蛋白MoUPE2的编码基因MoUPE2，得到稻瘟菌敲除突变体ΔMoupe2；试验证明，相比稻瘟菌野生型，敲除突变体ΔMoupe2分生孢子萌发和附着胞发育减缓，对细胞壁胁迫和渗透胁迫等更加敏感；致病性试验表明，MoUPE2的缺失显著降低了稻瘟菌的致病力；将该基因回补后，其致病力得到恢复。本发明证实MoUPE2是稻瘟菌分生孢子萌发、附着胞发育，以及致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是稻瘟菌MoUPE2基因敲除载体的构建示意图。

图2是部分潮霉素抗性转化子HPH基因的PCR扩增；其中，M：DL 5000Marker；1：阳性对照(稻瘟菌野生型)；2：阴性对照(ddH₂O)；3～6，含潮霉素抗性的转化子ΔMoupe2-1、ΔMoupe2-3、ΔMoupe2-8、ΔMoupe2-10。

图3是部分潮霉素抗性转化子目的基因MoUPE2的PCR扩增；其中，M：DL5000Marker；1：阳性对照(稻瘟菌野生型)；2：阴性对照(ddH₂O)；3～6，含潮霉素抗性的转化子ΔMoupe2-1、ΔMoupe2-3、ΔMoupe2-8、ΔMoupe2-10。

图4是以MoUPE2片段为探针的稻瘟菌敲除转化子的Southern blot分析；其中，1：稻瘟菌野生型；2～4，候选阳性转化子ΔMoupe2-1、ΔMoupe2-3、ΔMoupe2-8。

图5是以HPH片段为探针的稻瘟菌敲除转化子的Southern blot分析；其中，1：稻瘟菌野生型，2～4：候选阳性转化子ΔMoupe2-1、ΔMoupe2-3、ΔMoupe2-8。

图6是部分博来霉素抗性转化子的MoUPE2基因的PCR分析；其中，M：DL5000Marker；1：阳性对照(稻瘟菌野生型)；2：阴性对照(ddH₂O)；3～4，博来霉素抗性转化子ΔMoupe2-com-1、ΔMoupe2-com-2。

图7是稻瘟菌敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com的分生孢子萌发观察。

图8是敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com对不同胁迫条件的分析。

图9是稻瘟菌敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com对水稻的致病性测定。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及植物

供试菌株为稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)广东省优势小种ZC₁₃，供试水稻为感病籼稻品系CO39。

1.2宿主菌及质粒载体

克隆载体为pMD18-T vector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和HPH基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)。

2、实验方法

2.1稻瘟菌MoUPE2基因上下游同源片段的扩增

稻瘟菌MoUPE2基因敲除载体的构建如图1所示。在MoUPE2基因的上游和下游各选取长度大小约为1500bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段)，并设计引物(表1)。

表1 MoUPE2基因同源臂A片段和B片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			MoUPE2-AF	CC<u>GGGCCC</u>TGAAAGCACTAGCTGGGGAA	Apa I
MoUPE2-AR	CC<u>CTCGAG</u>GTCACATAGGGTCAAAGAAGG	Xho I
			MoUPE2-BF	CG<u>GAATTC</u>AGGTCTAGATCTAGGATTGGA	EcoR I
MoUPE2-BR	GG<u>ACTAGT</u>CTGTGTTTGGTTACATCGCA	Spe I

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取稻瘟菌基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物MoUPE2-AF和MoUPE2-AR进行PCR扩增，获得MoUPE2基因的同源臂A片段(MoUPE2-A)；用引物MoUPE2-BF和MoUPE2-BR进行PCR扩增，获得MoUPE2基因的同源臂B片段(MoUPE2-B)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	0.5μL
		MoUPE2-AF/BF(10μmol/L)	0.5μL
MoUPE2-AR/BR(10μmol/L)	0.5μL
		2×TSINGKE Master Mix	12.5μL
ddH<sub>2</sub>O	11.0μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.2 MoUPE2基因敲除载体的构建

参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将MoUPE2-A和MoUPE2-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-MoUPE2-A和pMD18T-MoUPE2-B。具体为：取1μL pMD18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μLsolution I，于16℃下连接过夜。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃下水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃下150rpm振荡培养45min；再于4000rpm下离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8～12h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用EcoR I和Spe I分别对pMD18T-MoUPE2-B和pCT74载体进行双酶切，回收B片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCT74-MoUPE2-B。按同样程序，用Apa I和Xho I双酶切pMD18T-MoUPE2-A和重组质粒pCT74-MoUPE2-B，回收A片段和重组质粒。用T4 DNA连接酶将A片段与pCT74-MoUPE2-B连接，转化大肠杆菌DH5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-MoUPE2-KO。

2.3 MoUPE2回补片段的扩增

在MoUPE2基因的上游选取长度为1500bp的启动子序列，下游选取长度为500bp的终止子序列，并设计引物(表2)。

表2 MoUPE2基因回补片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			Com-MoUPE2-F	GG<u>ACTAGT</u>GGTTGTATCCCGTGGCTGG	Spe I
Com-MoUPE2-R	ATAAGAAT<u>GCGGCCGC</u>GGATCCTCGGCAAGGTGAGA	Not I

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取稻瘟菌基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物Com-MoUPE2-F和Com-MoUPE2-R进行PCR扩增，获得MoUPE2基因的回补片段(MoUPE2-com)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		Com-MoUPE2-F(10μmol/L)	1.0μL
Com-MoUPE2-R(10μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		ExTaq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	37.75μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，55℃反应30s，72℃反应4min，共35个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.4MoUPE2基因回补载体的构建

用Spe I和Not I分别对MoUPE2-com和pCTZN载体进行双酶切，回收MoUPE2-com片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将MoUPE2-com片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCTZN-MoUPE2-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-MoUPE2-com。

2.5稻瘟菌原生质体的制备

在见里培养基(酵母浸膏5.0g，可溶性淀粉0g，琼脂粉17.0g，蒸馏水定容至1L)平板上活化稻瘟病菌，28℃倒置培养约10d左右；用灭菌镊子镊取见里培养基上的菌丝碎片，移至50mL的YPS培养基(酵母提取物6g，水解酪蛋白6g，蔗糖10g，蒸馏水定容至1L)中，于28℃下120rpm振荡培养2d；将上述培养物用200目细胞筛过滤，得到含少量培养液的菌丝，将其倒入灭菌的研钵中，研碎，取适量菌丝碎片转移至盛有200mL/瓶的YPS培养基中，于28℃下120rpm振荡培养1d；用200目细胞筛过滤菌丝，接着用无菌水冲洗2次，再用灭菌的0.8mol/L NaCl溶液冲洗1次，用灭菌镊子将菌丝夹至灭菌培养皿中(下放四层滤纸)，再覆盖2～3层的灭菌滤纸，用镊子轻压滤纸；将菌丝转移至事先称重的灭菌EP管中，再次称重，获得湿菌丝的重量；向EP管中加入适量10mg/mL溶壁酶酶液，酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，于30℃下80～110rpm，振荡消解1h左右；用灭菌Kimwipe无尘纸过滤收集消解液，装于预冷的2mL EP管中，于4℃下3500rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于2mL预冷的STC(含1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM CaCl₂)；于4℃下5000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于1mL STC，暂时冰上保存，待计数后稀释成合适浓度；用血球计数板计算原生质体浓度；加入适量预冷的STC，并使原生质体终浓度控制在1×10^7-8个/mL，按200μL/管分装。

稻瘟菌敲除突变体原生质体，参照上述稻瘟菌原生质体的制备步骤制备得到。

2.6稻瘟菌原生质体的转化

用Xho I对敲除载体pCT74-MoUPE2-KO进行单酶切，获得敲除载体线性化片段。将5μg的敲除载体线性化片段与200μL原生质体混匀；或者，将pCTZN-MoUPE2-com质粒与200μL稻瘟菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴20min；逐滴加入1mL PTC转化缓冲液(60％PEG4000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5)，边混匀边加，混匀后于室温下放置20min；于4℃下5000rpm离心10min；弃上清，用1mL的再生液体培养基(酵母提取物6.0g，水解酪蛋白6.0g，蔗糖200.0g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，转移至灭菌50mL的康宁管中，再加入3mL再生液体培养基，于28℃下100rpm，轻摇复苏培养16～18h；将4mL复苏原生质体加入15mL降温到45℃左右的再生固体培养基(再生液体培养基中含1.5％琼脂粉和200μg/mL潮霉素)中，混匀倒板，凝固的平板于28℃下黑暗下，倒置培养约4天左右；挑取含潮霉素抗性的转化子单菌落用于鉴定。

2.7稻瘟菌敲除突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物HPH-F/HPH-R进行HPH基因片段的PCR扩增；用引物MoUPE2-F/MoUPE2-R进行MoUPE2基因片段的PCR扩增分析。

HPH-F：5′-TTCTGCGGGCGATTTGTGTA-3′，

HPH-R：5′-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′；

MoUPE2-F：5′-GCTGTTTCGCTGCTTTGGTT-3′，

MoUPE2-R：5′-TGAACAGGATGGGTGCGTTT-3′，

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		MoUPE2-F/HPH-F(10μmol/L)	0.5μL
MoUPE2-R/HPH-R(10μmol/L)	0.5μL
		2×TSINGKE Master Mix	12.5μL
ddH<sub>2</sub>O	11μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.8MoUPE2回补突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物MoUPE2-F/MoUPE2-R进行基因片段MoUPE2的PCR扩增。

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		MoUPE2-F/HPH-F(10μmol/L)	0.5μL
MoUPE2-R/HPH-R(10μmol/L)	0.5μL
		2×TSINGKE Master Mix	12.5μL
ddH<sub>2</sub>O	11μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.9稻瘟菌敲除突变体的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(RocheLOT28309220)说明书，进行Southern blot杂交。用引物MoUPE2-F/MoUPE2-R扩增目的基因探针，用HPH-F/HPH-R扩增hph基因探针。

MoUPE2-F：5′-GCTGTTTCGCTGCTTTGGTT-3′，

MoUPE2-R：5′-TGAACAGGATGGGTGCGTTT-3′，

HPH-F：5′-TTCTGCGGGCGATTTGTGTA-3′，

HPH-R：5′-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

模板DNA	1.0μL
		MoUPE2-F/HPH-F(10μmol/L)	1.0μL
MoUPE2-R/HPH-R(10μmol/L)	1.0μL
		10×Ex Taq Buffer	10.0μL
PCR DIG Labeling Mix	10.0μL
		Ex Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	补足至100μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.10稻瘟菌敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将稻瘟菌野生型、敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com分别接种于见里培养基上，于28℃黑暗条件下培养。分别在第2d、4d、6d、8d、10d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。

(2)分生孢子的产生与萌发观察。用无菌水(2mL～3mL/皿)湿润活化好的稻瘟菌(野生型、敲除突变体ΔMoupe2或回补突变体ΔMoupe2-com)菌落表面，用消毒过的小勺捣碎稻瘟菌菌丝，用移液枪将菌丝液转移到西红柿燕麦培养基(生燕麦40g，用双蒸水煮沸1h，过滤后加入150mL西红柿汁，0.06g碳酸钙，2.5％～3％琼脂粉，用双蒸水定容至1L)上，每皿约500μL菌丝液，用玻璃棒将菌丝液涂匀平板；于28℃下光照24h，倒置培养4～7d；用移液枪移取5mL无菌水加到西红柿燕麦培养基上，用勺子刮扫菌落；用灭菌的200目细胞筛或4层无尘纸过滤收集孢子液。将收集的孢子液加入0.25％的吐温-20，于4℃下5000rpm离心10min，浓缩孢子液至1×10⁶个/mL；用移液枪吸取20μL孢子液转移到载玻片上；保湿，于28℃下黑暗培养，分别在2h，4h，6h，8h，10h，12h取样，进行拍照观察分生孢子的萌发。

2.11敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com的抗胁迫能力分析

(1)氧化胁迫分析

将稻瘟菌野生型、敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com分别接种在含有20mmol/L H₂O₂的见里培养基上，于28℃培养箱倒置培养10d后，观察敲除突变体ΔMoupe2、回补突变体ΔMoupe2-com和野生型菌株的菌落生长情况。

(2)细胞壁完整性分析

将稻瘟菌野生型、敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com分别接种在含有400μg/mL刚果红和0.2mg/mL CFW(荧光增白剂)的见里培养基上，于28℃培养箱倒置培养10d后，观察敲除突变体ΔMoupe2、回补突变体ΔMoupe2-com和野生型菌株的菌落生长情况。

(3)高渗透压胁迫分析

将稻瘟菌野生型、敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com分别接种在含有1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇和0.02％SDS的见里培养基上，于28℃培养箱倒置培养10d后，观察敲除突变体ΔMoupe2、回补突变体ΔMoupe2-com和野生型菌株的菌落生长情况。

2.12敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com的致病性分析

分别取稻瘟菌野生型、敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com的浓度为2×10⁵个/mL分生孢子液(含0.05％吐温-20)，喷雾接种四叶期水稻幼苗，于28℃下12h光照/12h黑暗并保湿，5d后进行调查水稻叶片的发病情况。

3结果与分析

3.1稻瘟菌MoUPE2基因敲除载体的构建

采用PCR扩增方法，分别克隆获得MoUPE2基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-MoUPE2-A和pMD18T-MoUPE2-B。将pMD18T-MoUPE2-B与pCT74质粒分别双酶切后连接，获得重组质粒pCT74-MoUPE2-B；将其与pMD18T-MoUPE2-A进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-MoUPE2-KO(图1)。

3.2敲除突变体ΔMoupe2的筛选

3.2.1 HPH基因的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除载体转化稻瘟菌原生质体，获得了12个潮霉素阳性转化子。经DNA的提取，利用HPH基因特异性引物，对12个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，上述4个转化子均扩增到了HPH基因(图2)。

3.2.2基因片段MoUPE2的PCR验证

进一步利用MoUPE2基因特异性引物，对上述PCR扩增到HPH基因的4个阳性转化子进行MoUPE2的PCR验证分析。结果表明，4个转化子均没有扩增到MoUPE2基因，进一步说明这4个转化子为阳性转化子(图3)。

3.2.3敲除突变体ΔMoupe2的Southern blot验证

选取扩增到HPH基因、同时没有扩增到MoUPE2基因的4个阳性转化子中的3个阳性转化子进行了Southern blot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，3个转化子均未有杂交条带(图4)。以HPH为探针进行杂交，3个转化子均有单拷贝条带出现(图5)。上述试验进一步证明这3个转化子为阳性转化子。

3.3回补突变体ΔMoupe2-com的鉴定与表型分析

利用随机插入的方法，将基因回补载体pCTZN-MoUPE2-com转化稻瘟菌敲除突变体ΔMoupe2(ΔMoupe2-1)的原生质体，获得了3个博来霉素阳性转化子。经基因组DNA的提取，利用MoUPE2基因特异性引物，对这些阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，有2个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这2个转化含有MoUPE2基因；证实这2个转化子为阳性转化子(图6)。对回补突变体ΔMoUPE2-com进行菌落形态观察和产孢量分析，结果表明，回补突变体的菌落形态和产孢量均恢复至野生型水平。

3.4敲除突变体ΔMoupe2的菌落形态和生长速率测定

将敲除突变体ΔMoupe2接种于见里培养基中，分别在不同时间对其生长情况进行了观察。结果表明，与稻瘟菌野生型相比，ΔMoupe2的菌落形态没有明显区别，但生长速率显著小于稻瘟菌野生型。

3.5敲除突变体ΔMoupe2的产孢量分析

将敲除突变体ΔMoupe2接种于西红柿燕麦培养基，培养7d后进行产孢量分析。结果表明，敲除突变体ΔMoupe2的产孢量与稻瘟菌野生型相比没有显著差异。

3.6敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com分生孢子的萌发观察

将新鲜收集的稻瘟菌野生型、敲除突变体ΔMoupe2(ΔMoupe2-1和ΔMoupe2-3)、回补突变体ΔMoupe2-com(ΔMoupe2-com-1)孢子液浓缩至1×10⁶个/mL，用移液枪吸取20μL孢子液转移到载玻片上，于28℃下黑暗培养，分别在2h，4h，6h，8h，10h，12h取样，进行观察拍照。结果表明，稻瘟菌野生型的分生孢子在2h后开始萌发并开始产生芽管，在6h时芽管顶端开始膨大并产生附着胞，8h时附着胞的颜色较深；而ΔMoupe2敲除突变体的分生孢子在第2h开始萌发，4h时开始形成芽管，8h时芽管顶端开始膨大，10h时才产生附着胞(图7)，说明MoUPE2的敲除，使得稻瘟菌附着胞形成的延迟。

3.7敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com对不同胁迫条件的分析

将敲除突变体ΔMoupe2(ΔMoupe2-1和ΔMoupe2-3)、回补突变体ΔMoupe2-com(ΔMoupe2-com-1)分别接种于含20mmol/L H₂O₂、400μg/mL刚果红、0.2mg/mL CFW、1mol/LNaCl、1mol/L山梨醇、0.02％SDS的见里培养基中，对其菌落生长抑制率进行测定(图8)。结果表明，(1)在氧化胁迫条件下，与野生型和回补突变体相比，ΔMoupe2敲除突变体的菌落生长抑制率没有显著差异。(2)在分别含400μg/mL刚果红和0.2mg/mL CFW的见里培养基中，与野生型和回补突变体相比，敲除突变体ΔMoupe2的菌落生长抑制率均显著大于野生型和回补突变体，说明MoUPE2的敲除影响了稻瘟菌的细胞壁完整性。(3)在含0.02％SDS的见里培养基中，敲除突变体ΔMoupe2的菌落生长抑制率与野生型和回补突变体相比没有显著性差异，但在含1mol/L NaCl和1mol/L山梨醇的见里培养基中，敲除突变体ΔMoupe2的菌落生长抑制率显著大于野生型和回补突变体，说明MoUPE2可能影响对稻瘟菌抵抗高渗透压胁迫的能力。

3.8敲除突变体ΔMoupe2和回补突变体ΔMoupe2-com的致病性分析

将稻瘟菌野生型菌株、ΔMoupe2敲除突变体(ΔMoupe2-1和ΔMoupe2-3)和回补突变体ΔMoupe2-com(ΔMoupe2-com-1)的分生孢子液(2×10⁵个/mL)喷洒在活体水稻叶片上，观察水稻的发病情况并进行病情指数统计。观察结果显示，在水稻叶片上，与稻瘟菌野生型相比，ΔMoupe2的病斑数量较少，ΔMoupe2-com的致病力基本恢复到野生型水平(图9)。进一步对病情指数进行了统计，结果表明回补突变体ΔMoupe2-com与稻瘟菌野生型的病情指数相似，说明回补突变体ΔMoupe2-com致病力恢复到野生型水平；同时，ΔMoupe2的病情指数显著低于野生型和回补突变体，说明敲除MoUPE2基因后，稻瘟菌致病力明显下降。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由稻瘟菌所导致的稻瘟病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是稻瘟病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 分泌蛋白MoUPE2在调控稻瘟菌致病力中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2基因的碱基序列

<220>

<222> (1)..(211)

<223> 非编码区

<220>

<222> (212)..(369)

<223> 外显子1

<220>

<222> (370)..(513)

<223> 内含子1

<220>

<222> (514)..(629)

<223> 外显子2

<220>

<222> (630)..(721)

<223> 内含子2

<220>

<222> (722)..(1056)

<223> 外显子3

<400> 1

cttgctttac ttagactcgg gcagggtgtg tagacgtggg caatcgcggg agtttacaaa 60

tacgtaccgt cgccgcctgc tgtttcgctg ctttggtttg aagattcccc atcaagcttt 120

taacgagatc acaattctac cacgcttcag caaataattg ccctttgtaa ctctaatctt 180

aatatcctcc aaacgagaaa acatcacaaa aatggtcgcc atcaaaccac tcatcctcct 240

gggacttgcc gcaaatgcag ctgctgcagg tcacggccaa cagcatgcca atgcattgca 300

tgccaggcaa gactatggca agggcaaagg aggcggctcg aaatgcggca agctgaactt 360

tgtctttacg tacgtataaa agctgcacac acacacacac acacacacac acacacacac 420

acacacacac acatgatgcc tgcaggagac gacccctgtt cttgttttgc gggtcattga 480

cgaatatatg agctgacatt aacaatggca cagcggccta ccgtggaacc acccagcagt 540

ccaggctgca ggttttaacc cagcaatggt cgaggctgcc atcaagtttg atgtacagca 600

aatcgtgcaa gctggctata acataaaggg tgagtaaagt accgagactt tttttttttc 660

ttcttttttt tttgcgtcgg ccatatgcga atgatgcaac ttgctgacag cgccaaaaca 720

gccattcttg tgggccccga agaccccatc agcgacatcg cagaagagat ggacaacgtc 780

cccggggtca aggagtggac gggaacggga gtgggctacg ggctgcgcgg gcccaacagc 840

acggtgctga cggtcaggtt caccgacgtg atccagctct tccgggacaa ggagccaaac 900

gcacccatcc tgttcaacca ctcgcccacc accagcctgt gggccattca gcaaaagttc 960

ccgctgccgg ccgggaccaa ctgctcggcc gagggcaagc cgggcaagaa ctatggcatt 1020

gccgtccact gcagtgcttg tccgccgtca aactag 1056

<210> 2

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2蛋白质的氨基酸序列

<400> 2

Met Val Ala Ile Lys Pro Leu Ile Leu Leu Gly Leu Ala Ala Asn Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gly His Gly Gln Gln His Ala Asn Ala Leu His Ala Arg

20 25 30

Gln Asp Tyr Gly Lys Gly Lys Gly Gly Gly Ser Lys Cys Gly Lys Leu

35 40 45

Asn Phe Val Phe Thr Gly Leu Pro Trp Asn His Pro Ala Val Gln Ala

50 55 60

Ala Gly Phe Asn Pro Ala Met Val Glu Ala Ala Ile Lys Phe Asp Val

65 70 75 80

Gln Gln Ile Val Gln Ala Gly Tyr Asn Ile Lys Ala Ile Leu Val Gly

85 90 95

Pro Glu Asp Pro Ile Ser Asp Ile Ala Glu Glu Met Asp Asn Val Pro

100 105 110

Gly Val Lys Glu Trp Thr Gly Thr Gly Val Gly Tyr Gly Leu Arg Gly

115 120 125

Pro Asn Ser Thr Val Leu Thr Val Arg Phe Thr Asp Val Ile Gln Leu

130 135 140

Phe Arg Asp Lys Glu Pro Asn Ala Pro Ile Leu Phe Asn His Ser Pro

145 150 155 160

Thr Thr Ser Leu Trp Ala Ile Gln Gln Lys Phe Pro Leu Pro Ala Gly

165 170 175

Thr Asn Cys Ser Ala Glu Gly Lys Pro Gly Lys Asn Tyr Gly Ile Ala

180 185 190

Val His Cys Ser Ala Cys Pro Pro Ser Asn

195 200

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2-AF

<400> 3

ccgggccctg aaagcactag ctggggaa 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2-AR

<400> 4

ccctcgaggt cacatagggt caaagaagg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2-BF

<400> 5

cggaattcag gtctagatct aggattgga 29

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2-BR

<400> 6

ggactagtct gtgtttggtt acatcgca 28

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Com-MoUPE2-F

<400> 7

ggactagtgg ttgtatcccg tggctgg 27

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Com-MoUPE2-R

<400> 8

ataagaatgc ggccgcggat cctcggcaag gtgaga 36

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPH-F

<400> 9

ttctgcgggc gatttgtgta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPH-R

<400> 10

aaaaagcctg aactcaccgc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2-F

<400> 11

gctgtttcgc tgctttggtt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MoUPE2-R

<400> 12

tgaacaggat gggtgcgttt 20

Claims (13)

1.编码分泌蛋白MoUPE2的基因在降低稻瘟菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的分泌蛋白MoUPE2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述应用是通过阻断或抑制编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达来实现的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用为以下（1）～（4）中的至少一项：

（1）所述的编码分泌蛋白MoUPE2的基因在抑制稻瘟菌生长发育中的应用；

（2）所述的编码分泌蛋白MoUPE2的基因在延迟稻瘟菌分生孢子萌发中的应用；

（3）所述的编码分泌蛋白MoUPE2的基因在延迟稻瘟菌附着孢形成中的应用；

（4）所述的编码分泌蛋白MoUPE2的基因在破坏稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的编码分泌蛋白MoUPE2的基因在降低稻瘟菌抗高渗透压胁迫中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的高渗透压胁迫为NaCl和/或山梨醇高渗透压胁迫。

5.编码分泌蛋白MoUPE2的基因在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用，其特征在于：所述的防治是通过阻断或抑制编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达来实现的；

所述的分泌蛋白MoUPE2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.编码分泌蛋白MoUPE2的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，其特征在于：所述的植物病害是由稻瘟菌导致的稻瘟病；所述的分泌蛋白MoUPE2的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于：

所述编码分泌蛋白MoUPE2的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

8.一种治疗由稻瘟菌导致的植物稻瘟病的方法，其特征在于：包含阻断或抑制编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达；

所述的分泌蛋白MoUPE2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述编码分泌蛋白MoUPE2的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

10.阻断或抑制编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达的药剂在制备药物中的应用，其特征在于：

所述的药剂是编码分泌蛋白MoUPE2的基因的反义RNA或siRNA，所述药物用于控制由稻瘟菌导致的植物稻瘟病；

所述的分泌蛋白MoUPE2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：

所述编码分泌蛋白MoUPE2的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

12.一种降低稻瘟菌致病力的方法，其特征在于：所述方法是通过阻断或抑制编码分泌蛋白MoUPE2的基因的表达来实现的，所述的分泌蛋白MoUPE2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：

所述编码分泌蛋白MoUPE2的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

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