CN113956337B

CN113956337B - 基因FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用

Info

Publication number: CN113956337B
Application number: CN202111131982.4A
Authority: CN
Inventors: 聂燕芳; 鄢甜甜; 李云锋; 赵雅丽; 李华平
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113956337A

Abstract

本发明提供了基因FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明通过敲除并回补基因FoUPE3，获得了Foc4敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3‑com。致病性测定表明，敲除突变体△FoUPE3的致病性显著降低，回补突变体△FoUPE3‑com的致病性则恢复到Foc4野生型水平。此外，敲除突变体△FoUPE3中5个镰刀菌酸合成关键基因的表达量显著下降，表明敲除FoUPE3基因影响了Foc4中镰刀菌酸的合成。本发明不仅有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，还为开发香蕉枯萎病菌的有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

基因FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病或香蕉黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)侵染香蕉维管束而导致的土传病害。根据Foc对香蕉品系致病性的不同，可将其分为3个小种：1号、2号和4号小种，其中以4号小种(Focrace 4，Foc4)危害最严重，几乎能侵染所有香蕉种类，开展Foc4致病相关基因的功能研究有助于全面了解Foc4的致病分子机理，并为香蕉枯萎病的综合防控提供理论依据。

例如中国专利CN110656116A公开了基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。其利用同源重组方法将基因FoCWM从香蕉枯萎病菌中敲除，获得了敲除突变体ΔFocwm；该突变体与其野生型相比，生长速率减慢，气生菌丝变得致密，穿透力减弱，并对细胞壁的完整性有重要作用。致病性试验表明基因FoCWM的缺失显著降低了香蕉枯萎病菌的致病力，证实基因FoCWM是香蕉枯萎病菌生长发育、维持细胞壁完整性和致病性所必需的，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

因此，致病相关基因的功能研究对于香蕉枯萎病的防控具有重要价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用。

本发明的第一个目的是提供基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用。

本发明的第二个目的是提供基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明的第三个目的是提供基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在调控香蕉枯萎病菌分泌镰刀菌酸方面的应用。

本发明的第四个目的是提供基因FoUPE3或蛋白FoUPE3作为杀菌剂靶标在防治香蕉枯萎病中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种防治香蕉枯萎病的产品。

本发明的第六个目的是提供一种防治香蕉枯萎病的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过对Foc4分泌蛋白质组学的研究，鉴定得到了一个未知蛋白(Uncharacterized protein)，命名为FoUPE3，其编码基因FoUPE3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，蛋白FoUPE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。生物信息学分析结果表明该蛋白含有信号肽、定位在胞外、无跨膜结构域、无GPI锚定位点，属于经典分泌蛋白；EffectorP3.0预测分析其为候选效应子。

经NCBI比对发现，FoUPE3的氨基酸序列与登录号为EXM08674.1的蛋白一致，但没有关于其功能的披露。本发明对该蛋白在Foc4中的生物学功能进行了探索，研究发现其与Foc4的致病力相关。

本发明通过构建基因FoUPE3的敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体△FoUPE3；通过构建基因回补载体，将其导入△FoUPE3原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体△FoUPE3-com。利用所获得的敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com进行测定发现：敲除突变体△FoUPE3的菌落生长速率、产孢量、细胞壁完整性、抗高渗透胁迫以及抗氧化胁迫等与Foc4野生型相比没有显著差异。致病性测定表明，敲除突变体△FoUPE3致病性显著降低；回补突变体△FoUPE3-com的致病性则恢复到Foc4野生型水平。此外，qRT-PCR分析发现，敲除突变体△FoUPE3中5个镰刀菌酸合成关键基因的表达量显著下降，表明香蕉枯萎病菌FoUPE3基因参与了香蕉枯萎病菌的致病过程。

因此，本发明申请保护基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用，所述基因FoUPE3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白FoUPE3的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

具体地，所述防治是通过阻断或抑制香蕉枯萎病菌基因FoUPE3的表达来实现的。所述阻断或抑制基因FoUPE3的表达的方法为通过基因编辑技术对基因FoUPE3进行编辑，敲除基因FoUPE3或阻断/抑制基因FoUPE3的表达。

本发明还申请保护基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

因基因FoUPE3或蛋白FoUPE3是通过调控香蕉枯萎病菌镰刀菌酸的分泌进而调控香蕉枯萎病菌致病力。因此，本发明还申请保护基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在调控香蕉枯萎病菌分泌镰刀菌酸方面的应用。

本发明还申请保护基因FoUPE3或蛋白FoUPE3作为杀菌剂靶标在防治香蕉枯萎病中的应用，所述作为杀菌剂靶标是指该杀菌剂能阻断或抑制香蕉枯萎病菌基因FoUPE3表达。

本发明提供了一种防治香蕉枯萎病的产品，其含有能阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoUPE3表达的试剂。

具体地，所述试剂包含能够阻断或抑制基因FoUPE3表达的反义RNA或siRNA。

本发明还申请保护所述产品在制备防治香蕉枯萎病的药物中的应用。

本发明还提供了一种防治香蕉枯萎病的方法，所述方法为喷施含有能阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoUPE3表达的试剂。

具体地，上述香蕉枯萎病菌为Foc4。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了基因FoUPE3或蛋白FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明通过构建基因FoUPE3的敲除载体以及基因回补载体并导入Foc4的原生质体，获得了Foc4的敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com。本发明发现：敲除突变体△FoUPE3的菌落生长速率、产孢量、细胞壁完整性、抗高渗透胁迫以及抗氧化胁迫等与Foc4野生型相比没有显著差异。而致病性测定结果表明，敲除突变体△FoUPE3致病性显著降低；回补突变体△FoUPE3-com的致病性则恢复到Foc4野生型水平。此外，qRT-PCR分析发现，敲除突变体△FoUPE3中5个镰刀菌酸合成关键基因的表达量显著下降，说明敲除FoUPE3基因影响了Foc4中镰刀菌酸的合成。本发明不仅有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，还为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1为香蕉枯萎病菌基因FoUPE3敲除载体的构建示意图。

图2为部分潮霉素抗性转化子hph基因的PCR扩增结果；其中，M为Marker1000；泳道1为Foc4野生型；泳道2-4分别为转化子1、6、8、9。

图3为部分潮霉素抗性转化子目的基因FoUPE3的PCR扩增结果；其中，M为Marker2000；泳道1为Foc4野生型；泳道2-4分别为转化子1、6、8、9。

图4为Foc4敲除突变体△FoUPE3的Southern blot分析，以FoUPE3基因部分片段为探针。

图5为Foc4敲除突变体△FoUPE3的Southern blot分析，以hph基因部分片段为探针。

图6为香蕉枯萎病菌基因FoUPE3回补载体的构建示意图。

图7为部分博来霉素抗性回补转化子目的基因FoUPE3的PCR扩增结果；其中M为Marker2000；泳道1-2分别为转化子1、2。

图8为敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com在PDA培养基上生长的菌落形态示意图。

图9为敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com对不同胁迫条件的敏感性测定，其中，△FoUPE3-com指△FoUPE3-6-com-1。

图10为敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com玻璃纸穿透能力分析；其中，△FoUPE3-com指△FoUPE3-6-com-1。

图11为敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com的致病性分析；其中，△FoUPE3-com指△FoUPE3-6-com-1。

图12为敲除突变体△FoUPE3中镰刀菌酸合成相关基因的qRT-PCR分析；*表示差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明所用供试菌株为香蕉枯萎病菌4号小种(Foc4)，保存于华南农业大学植物病理生理学研究室；供试植物为4叶期的巴西蕉(Cavendish，AAA)；宿主菌为大肠杆菌DH5α；克隆载体为pMD18-T vector；基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74；基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素基因)。

实施例1香蕉枯萎病菌FoUPE3基因的敲除

1、香蕉枯萎病菌FoUPE3上下游同源片段的扩增

本发明所述基因FoUPE3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白FoUPE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过同源重组的方式进行敲除，香蕉枯萎病菌FoUPE3基因敲除载体的构建示意图如图1所示。在FoUPE3基因的上游和下游各选取长度大小约为1000bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段)，并设计扩增引物，引物如表1所示。

表1 FoUPE3基因同源臂A片段和B片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			FoUPE3A-F	GCTCTAGAATGGAAAGACAACCCGCAACA	Xba I
FoUPE3A-R	GGAATTCTGATTGCTGACCGCAAGG	EcoR I
			FoUPE3B-F	CCGCTCGAGTAACAACCTCTCCCCATCACCT	Xho I
FoUPE3B-R	GGGGTACCCACATTCAAGATCCAACTACCCC	Kpn I

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4的基因组DNA；以提取所得基因组DNA为模板，用引物FoUPE3A-F和FoUPE3A-R进行PCR扩增，获得FoUPE3基因的同源臂A片段(FoUPE3-A)；用引物FoUPE3B-F和FoUPE3B-R进行PCR扩增，获得FoUPE3基因的同源臂B片段(FoUPE3-B)。

PCR反应体系如下所示：

PCR反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，56℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒对PCR扩增产物进行清洁回收。

2、FoUPE3基因敲除载体的构建

参考pMD18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将FoUPE3-A和FoUPE3-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoUPE3-A和pMD18T-FoUPE3-B。

具体为：取1μL pMD18-T克隆载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μL solution I，于16℃连接4～5h。取10μL连接产物快速加入解冻的100μL DH5α感受态细胞中，轻轻弹匀，冰浴30min。42℃水浴热激90s，迅速冰浴1～2min。加入800μL LB液体培养基，37℃、150rpm培养1h。再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀后涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8～12h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用XhoI、KpnI分别对pMD18T-FoUPE3-B和pCT74载体进行双酶切，回收B片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCT74-FoUPE3-B。按同样程序，用XbaI和EcoRI双酶切pMD18T-FoUPE3-A和重组质粒pCT74-FoUPE3-B，回收A片段和重组质粒。用T4 DNA连接酶将A片段与pCT74-FoUPE3-B连接，转化大肠杆菌DH5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoUPE3-KO。

3、Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到查氏培养基(硝酸钠3g，三水合磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.018g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L，pH为6.0)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用NCM培养基(葡萄糖10g，天冬氨酸4g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，200×铁盐5mL，定容至1L，pH 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为1×10⁶个/mL；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10:1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×10⁷个/mL。

4、Foc4原生质体的转化

用KpnI对载体pCT74-FoUPE3-KO进行单酶切，获得pCT74-FoUPE3-KO线性化片段。将5μg载体片段与200μL原生质体混匀；或将pCTZN-FoUPE3-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴15min；逐滴加入1mL PSTC转化缓冲液(40％PEG 4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5)，混匀后冰上放置15min；加入10mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6mL上清，用3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。

5、Foc4敲除突变体的PCR验证分析

本发明利用同源重组方法，将基因敲除载体转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了13个潮霉素阳性转化子。将所得转化子编号后，按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA FungalDNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，再利用A-hph基因特异性引物A-hph-F/A-hph-R，对其中部分潮霉素阳性转化子进行PCR验证分析。

A-hph-F：5′-GCCTGAAGAAGTTCTGCTACCGCCG-3′

A-hph-R：5′-TGGCAAACTGTGATGGACGACACCG-3′；

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，57℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

A-hph基因的扩增结果如图2所示，其中M为Marker 1000；泳道1为Foc4野生型；泳道2-4分别为转化子1、6、8、9。由图2可知，Foc4未扩增出选取的转化子A-hph基因条带，选取的转化子1、6、8、9扩增得到了大小相符的A-hph基因条带。

进一步利用FoUPE3基因特异性引物FoUPE3-F/FoUPE3-R，对上述PCR扩增到A-hph基因的转化子进行FoUPE3的PCR验证分析。

FoUPE3-F：5′-GTCCAGTGGTTGCCCTTTGA-3′

FoUPE3-R：5′-GCTCCTAAATTCTCTTTCTTACAGC-3′；

结果如图3所示，其中M为Marker 2000；泳道1为Foc4野生型；泳道2-4分别为转化子1、6、8、9。由图3可知，仅Foc4野生型扩增出了大小相符的FoUPE3基因条带，其余转化子均为扩增出FoUPE3基因条带。上述结果表明，本发明成功获得了Foc4敲除突变体△FoUPE3。

6、Foc4敲除突变体的Southern blot分析

本发明还对扩增到A-hph基因、同时没有扩增到FoUPE3基因的其中3个阳性转化子进行了Southern blot分析。按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection StarterKit(Roche公司)说明书进行Southern blot杂交。扩增探针所用引物如下所示，探针FoUPE3probe-F/FoUPE3 probe-R扩增目的基因探针，用引物hph-F/hph-R扩增hph基因探针。

FoUPE3 probe-F：5′-GACTATGACCAAGGCGGCAA-3′，

FoUPE3 probe-R：5′-GCCACTCCGTATTCCCTGTT-3′，

探针hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

探针hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

PCR反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，57℃反应30s，72℃反应30s，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

Southern blot分析结果分别如图4和5所示，其中图4是以FoUPE3基因部分片段为探针，图5是以hph基因部分片段为探针。由图4所知，以目的基因FoUPE3作为探针进行杂交的3个转化子均未有杂交条带。由图5可知，以hph为探针进行杂交，3个转化子均有单拷贝条带出现。上述结果进一步表明本发明成功获得了Foc4敲除突变体△FoUPE3。

实施例3香蕉枯萎病菌FoUPE3基因的回补

1、FoUPE3回补片段的扩增

香蕉枯萎病菌FoUPE3基因回补载体的构建如图6所示。在FoUPE3基因的上游选取长度为约1500bp的启动子序列，下游选取长度为约500bp的终止子序列，并设计扩增引物，引物如表2所示。

表2 FoUPE3基因回补片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			FoUPE3-com-F	CGGAATTCGCTTTTACCAGCCCCAGGAA	EcoRI
FoUPE3-com-R	GCTCTAGATCCAGCTCCTTGAGAATATCGC	XbaI

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取香蕉枯萎病菌基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoUPE3-com-F和FoUPE3-com-R进行PCR扩增，获得FoUPE3基因的回补片段(FoUPE3-com)。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，57℃反应30s，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2、FoUPE3基因回补载体的构建

用EcoRI和XbaI分别对FoUPE3-com和pCTZN载体进行双酶切，回收FoUPE3-com片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将FoUPE3-com片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCTZN-FoUPE3-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoUPE3-com。

3、Foc4敲除突变体原生质体的制备，参考实施例2。

4、Foc4敲除突变体原生质体的转化，参考实施例2，抗性筛选所用的抗生素为：用200μg/mL博来霉素替代150μg/mL潮霉素。

5、FoUPE3回补突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoUPE3-F/FoUPE3-R进行基因片段FoUPE3的PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，57℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

本发明利用随机插入的方法，将基因回补载体pCTZN-FoUPE3-com转化香蕉枯萎病菌△FoUPE3-6原生质体，获得了2个博来霉素阳性转化子。经基因组DNA提取，利用FoUPE3基因特异性引物，对所得阳性转化子进行了PCR验证分析，结果如图7所示，其中M为Marker2000；泳道1-2分别为转化子1和2。由图7可知，转化子均成功扩增出了大小相符的FoUPE3基因，表明成功获得了△FoUPE3-com。

实施例4Foc4敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com的菌落形态和生长速率测定

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4野生型、敲除突变体△FoUPE3(△FoUPE3-6)和回补突变体△FoUPE3-com(△FoUPE3-6-com-1)分别接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。在第5d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。结果如图8所示，与香蕉枯萎病菌野生型相比，△FoUPE3的菌落形态和生长速率没有明显区别，回补突变体△FoUPE3-com的菌落形态恢复至野生型水平。

(2)敲除突变体△FoUPE3产孢量的观察。将敲除突变体△FoUPE3接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，3d后统计产孢量。结果表明，突变体△FoUPE3的产孢量与野生型相比没有区别，回补突变体△FoUPE3-com的产孢量恢复至野生型水平。

实施例5Foc4敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com的抗胁迫分析

(1)高渗透压胁迫分析

将Foc4野生型、△FoUPE3(△FoUPE3-6)和△FoUPE3-com(△FoUPE3-6-com-1)分别接种在含有1mol/L NaCl和1mol/L山梨醇的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察菌落的生长情况。结果如图9所示，在含NaCl和山梨醇的PDA培养基中，△FoUPE3与野生型相比无明显差异，说明FoUPE3对Foc4抗高渗透压的能力没有影响。每个处理设置3个重复。

(2)氧化胁迫分析

将Foc4野生型、△FoUPE3(△FoUPE3-6)和△FoUPE3-com(△FoUPE3-6-com-1)分别接种在含有30mmol/L H₂O₂的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察菌落生长情况。结果如图9所示，在氧化胁迫条件下，突变体△FoUPE3的生长与野生型相比无明显差异。每个处理设置3个重复。

(3)细胞壁完整性分析

将Foc4野生型、△FoUPE3(△FoUPE3-6)和△FoUPE3-com(△FoUPE3-6-com-1)分别接种在含有0.05％SDS、200μg/mL CR(刚果红)、100μg/mL CFW(钙荧光白)的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察菌落生长情况。结果如图9所示，在含0.05％SDS、CR、CFW的PDA培养基中，与野生型相比，突变体△FoUPE3的生长与野生型无明显差异，说明敲除FoUPE3对Foc4的细胞壁完整性没有影响。每个处理设置3个重复。

上述结果表明，FoUPE3基因的缺失不影响香蕉枯萎病菌在不同胁迫条件下的菌落生长速率。

实施例6Foc4敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com玻璃纸穿透能力的测定

将Foc4野生型、△FoUPE3(△FoUPE3-6)和△FoUPE3-com(△FoUPE3-6-com-1)分别接种于覆盖一层再生纤维素膜(玻璃纸，购自Solarbio，型号YA0620)的PDA培养基中，于28℃培养箱培养3d后揭开玻璃纸，继续培养2d，观察培养基上是否能长出菌落。每个处理设置3个重复。结果如图10所示，△FoUPE3仍能穿透玻璃纸生长，表明FoUPE3基因的敲除不影响香蕉枯萎病菌穿透玻璃纸。

实施例7Foc4敲除突变体△FoUPE3和回补突变体△FoUPE3-com的致病性分析

取4叶期的巴西蕉伤根处理，用Foc4野生型、敲除突变体△FoUPE3(△FoUPE3-6)和回补突变体△FoUPE3-com(△FoUPE3-6-com-1)的分生孢子悬浮液(2×10⁵个/mL)分别浸根30min，再移栽于营养土中；置于25±1℃的植物培养室内光/暗12h/12h交替培养，25d后观察香蕉苗叶片和球茎的发病情况。分别以Foc4野生菌株和清水作为阳性和阴性对照。致病性分析结果如图11所示，由图可知，清水对照组的巴西蕉苗均未出现叶片黄化现象，且球茎没变色，植株生长健康；Foc4野生型接种后，香蕉整株上下部的叶片上都出现了明显黄化，40％以上的植株整株枯死；△FoUPE3接种后，香蕉枯萎病菌致病力显著下降。回补突变体△FoUPE3-com接种后，香蕉植株的上下部叶片也均出现大面积黄化，发病水平与野生型相近，表明FoUPE3基因可能在调控香蕉枯萎病菌致病力这一方面发挥着重要的作用。

实施例8敲除突变体△FoUPE3中镰刀菌酸合成相关基因的qRT-PCR分析

为进一步探究FoUPE3基因对Foc4致病力的影响，本发明分别对Foc4和△FoUPE3(△FoUPE3-6)中5个镰刀菌酸合成相关基因(FOIG_16450、FOIG_16451、FOIG_16452、FOIG_16453、FOIG_16454)的表达进行了qRT-PCR分析。用真菌RNA提取试剂盒(OMEGA Fungal RNAKit)，提取Foc4和敲除突变体△FoUPE3的基因组RNA；以该基因组RNA为模板，使用(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time)反转录试剂盒(RR047ATakara)进行反转录得到基因组cDNA。以Foc4中镰刀菌酸合成相关基因FOIG_16450(NCBI登录号：EXL90277.1)、FOIG_16451(NCBI登录号：EXL90278.1)、FOIG_16452(NCBI登录号：EXL90279.1)、FOIG_16453(NCBI登录号：EXL90280.1)、FOIG_16454(NCBI登录号：EXL90281.1)为目标进行qRT-PCR反应，采用Tubllin(FOIG_05875，NCBI登录号：EXM02915.1)作为内参基因，对Foc4及敲除突变体△FoUPE3中镰刀菌酸合成相关基因的表达量进行测定。

各基因的qRT-PCR引物如下所示：

FoTubllin-F：5′-CCTCGTCGATCTTGAGCCTG-3′

FoTubllin-R：5′-CTGGAAACCCTGGAGGCAAT-3′

qFOIG_16450-F：5′-CATCAACAGTCCCGCCAGTG-3′

qFOIG_16450-R：5′-CGGAGTTTGCGAGCGAAGATA-3′

qFOIG_16451-F：5′-CCTAGCCAAGCGACAAGTCC-3′

qFOIG_16451-R：5′-TGACTGTTCCATTCTCGGCG-3′

qFOIG_16452-F：5′-GCAAAGCAAAGGACAAAATGG-3′

qFOIG_16452-R：5′-GCAGCAGCCTCGTGGAAGAA-3′

qFOIG_16453-F：5′-CGAGA AGCCCCAGACACCAT-3′

qFOIG_16453-R：5′-TCCCCAAGCCCAACTACAGC-3′

qFOIG_16454-F：5′-TGCTACATCGCCCTCACCAAC-3′

qFOIG_16454-R：5′-CACAAGCGTAGGCTGCTCAAT-3′

qRT-PCR反应液的配制参考TransGen Biotech公司PerfectStart^TM Green qPCRSuperMix试剂盒(AQ601)的说明书进行，具体如下：

将上述qRT-PCR反应液充分混匀并离心后，按照TransGen Biotech公司PerfectStart^TM Green qPCR SuperMix试剂盒(AQ601)的说明书进行qRT-PCR反应，具体反应条件为：94℃反应30s；94℃反应5s，60℃反应30s，循环40次；95℃反应10s；65℃反应5s；95℃反应5s。qRT-PCR反应结束后，实验数据使用2^-ΔΔCt方法计算相对表达水平。

qRT-PCR分析结果如图12所示，由图可知，与野生型相比，敲除突变体△FoUPE3中5个镰刀菌酸合成相关基因的表达均显著降低，表明FoUPE3基因敲除是导致镰刀菌酸合成降低，进而导致Foc4致病力降低的原因之一。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 基因FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1288

<212> DNA

<213> 香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)

<400> 1

gtccagtggt tgccctttga gaactacgga acgtcgcaac gtcaagaggc cctcttcctg 60

caagcaaacc gtttctttct gcgactgttt ttgaaagaac agggcgcggc attactgaag 120

ggggaggaac catgagtctg atggatgtta gacctcatta aagagctcac ggactttcgc 180

agaacataaa acataacagg atataaatcc ggattcctcg gttcactagt cccgacgacc 240

cattagaccc ttgtagtaaa tctccacgat catggtcaca accaacagac aatacagtca 300

ctgaaccaac aatgttgtgt cggtctgtcg ataccaacaa agccaacttg ctgtacccag 360

gccagcagac aagactatga ccaaggcggc aaacaagaag cggtgcagac gagtgtataa 420

aagccccctt tgagccttcg tttcagcgct ctcaagatca accaacaatc gtcttctcgc 480

ctcaggacct tttgatcaaa tcttttattc tcctcctctt ctcctcaacc aacatgcaac 540

tctccaagtt cgttgttctt agcgtcaccg ccttgctctc cgccactgga gaagcatgca 600

agtgctacgg aactaagggc aacctcaaca acggcgcaac tcacaagtgc tgtaacgatt 660

accatggtgt ttactccggt aatgactgca aagctagctc catatctgag catctcagtg 720

ggttcgacag gtgctgcaag ggtcaaggct cggactgtga cttccctggt cgtgccgctg 780

ccctgggtca ggaaatgaga gttgttaagc acgtcgagat caagactgcc cttgccaagt 840

aaactaccgg cgacgagttg aggttggtca agtcttcctt agcatgcggg ttttgtgtga 900

tgttaacttg tataagatag caaccaagac atggggaaac agggaatacg gagtggcaaa 960

gagagattgg tcaatcttgg ccgtgtttcc tttggatcag gcactacttt tacctcccgg 1020

ccggagcata gagctttttc aacgcctcga cctaattcat atagtagata cttcctgacc 1080

tctagtgaag gaagcccttt gtgagacatg gtatagttga atatactgtt accaatcaga 1140

aactattacg tgaaaggaaa accaggacat tgtaataact gagcagtatt aagtagactc 1200

ctgcctgacg gagacgagct gtttctcaaa tctccggtat cgctgtaaga aagagaattt 1260

aggagcatgt acttgtaatc atctctac 1288

<210> 2

<211> 102

<212> PRT

<213> 香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)

<400> 2

Met Gln Leu Ser Lys Phe Val Val Leu Ser Val Thr Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Gly Glu Ala Cys Lys Cys Tyr Gly Thr Lys Gly Asn Leu Asn

20 25 30

Asn Gly Ala Thr His Lys Cys Cys Asn Asp Tyr His Gly Val Tyr Ser

35 40 45

Gly Asn Asp Cys Lys Ala Ser Ser Ile Ser Glu His Leu Ser Gly Phe

50 55 60

Asp Arg Cys Cys Lys Gly Gln Gly Ser Asp Cys Asp Phe Pro Gly Arg

65 70 75 80

Ala Ala Ala Leu Gly Gln Glu Met Arg Val Val Lys His Val Glu Ile

85 90 95

Lys Thr Ala Leu Ala Lys

100

Claims

1. 香蕉枯萎病菌基因FoUPE3的敲除载体在降低香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于，所述基因FoUPE3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 香蕉枯萎病菌基因FoUPE3的敲除载体在抑制香蕉枯萎病菌分泌镰刀菌酸方面的应用，其特征在于，所述基因FoUPE3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。