CN114774457B

CN114774457B - 基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉生长、抗氧化和致病力中的应用

Info

Publication number: CN114774457B
Application number: CN202210512254.6A
Authority: CN
Inventors: 孔广辉; 黄伟雄; 李雯; 周文喆; 宋雨; 马俊妮; 蔡旭敏; 习平根; 李敏慧; 姜子德
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN114774457A

Abstract

本发明提供了一种基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉生长、抗氧化和致病力中的应用。本发明通过试验证明，将基因PlRACK1的上下游序列分别扩增出来，再将NPTⅡ基因序列扩增出来，与PBSSK载体相连，同源重组后通过聚乙二醇介导的原生质体转化技术与CRISPR/Cas9敲除策略进行敲除。因为基因PlRACK1的缺失，所获得的突变体与野生型相比，荔枝霜疫霉生长速率显著减慢，荔枝霜疫霉致病力显著降低，使荔枝霜疫霉对氧化胁迫的耐受性显著降低。本发明证实基因PlRACK1是荔枝霜疫霉生长发育和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明荔枝霜疫霉的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉生长、抗氧化和致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉生长、抗氧化和致病力中的应用。

背景技术

荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)隶属于藻物界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)。由荔枝霜疫霉引起的荔枝霜疫病，在荔枝上危害最为严重，且尚未发现有效的抗病荔枝种植品种。研究表明，荔枝霜疫霉成功侵染荔枝主要依赖于一系列致病因子，因此，充分挖掘荔枝致病相关基因并开展功能研究，对有效控制荔枝霜疫霉的危害和选育抗病品种具有重要意义。

研究显示，信号转导与蛋白翻译对卵菌的生长发育、有性或无性生殖、致病力等生理过程起重要作用。RACK1(Receptor for activated C kinase 1)，是一种支架蛋白，通过和信号转导网络上的关键蛋白互作，从而参与到细胞的信号转导调节中；也与核糖体相互作用参与蛋白翻译。RACK1可以与活化的蛋白激酶C结合，形成RACK1/PKC复合体参与该通路的调控作用，可以与MAPK途径中的激酶相互作用参与信号调节，也可以与核糖体结合从而影响蛋白翻译。真菌的研究中发现，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，RACK1参与细胞壁完整性和应激反应以及蛋白翻译调节；在玉米黑粉菌(Ustilago maydis)中，RACK1的缺失会减缓细胞生长，并减弱其致病力；在稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中，RACK1的缺失会使分生孢子的产量减少，附着胞穿透能力减弱。

发明内容

为了克服现有防治荔枝霜疫霉技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。

本发明公开了荔枝霜疫霉一个新的未知蛋白基因PlRACK1的功能，基因PlRACK1为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白PlRACK1为SEQ ID No:2所示的蛋白质。本发明应用基于聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)介导的原生质体转化技术与CRISPR/Cas9敲除策略，通过构建pBSSK::PlRACK1、PYF2.3G-ribo-sgRNA敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化，利用同源重组的方法将基因PlRACK1从荔枝霜疫霉中敲除，获得敲除突变体；该突变体在荔枝霜疫霉生长发育过程中存在显著缺陷。致病性测定结果表明，敲除突变体对荔枝嫩叶(品种：妃子笑)的致病力显著降低。上述试验证明，荔枝霜疫霉PlRACK1基因为荔枝霜疫霉的致病相关基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉生长中的应用。

进一步，基因PlRACK1具有调控荔枝霜疫霉合成相关基因表达水平的作用。

本发明提供基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。

本发明提供基因PlRACK1在维持氧化胁迫环境下敏感性的应用。

本发明提供一种基因PlRACK1在防治荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病中的应用。

本发明再提供一种基因PlRACK1作为用于植物病害防治的药物靶标的应用，所述的植物病害是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。

本发明再提供一种治疗由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，包含阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因PlRACK1的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。

阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因PlRACK1表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。

其中，所述的荔枝霜疫霉基因PlRACK1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有调控荔枝霜疫霉致病力功能的类似物。

所述的基因PlRACK1，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有调控荔枝霜疫霉致病力功能的类似物。

含有上述荔枝霜疫霉基因PlRACK1的敲除载体、重组菌在该方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明通过试验证明，将基因PlRACK1的上下游序列分别扩增出来，再将NPTⅡ基因序列扩增出来，与PBSSK载体相连，同源重组后通过聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)介导的原生质体转化技术与CRISPR/Cas9敲除策略进行敲除。因为基因PlRACK1的缺失，所获得的突变体与野生型相比，荔枝霜疫霉生长速率显著减慢，荔枝霜疫霉致病力显著降低，荔枝霜疫霉对氧化胁迫的耐受性显著降低。本发明证实基因PlRACK1是荔枝霜疫霉生长发育和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明荔枝霜疫霉的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是荔枝霜疫霉PlRACK1基因同源重组的构建示意图。

图2是荔枝霜疫霉PlRACK1基因敲除转化子的定量PCR扩增结果图；其中，WT：荔枝霜疫霉野生型；T4、T15、T18分别表示基因PlRACK1的三个已敲除转化子。

图3是野生型WT、敲除突变体T4、T15、T18在CA培养基上的生长速率及菌落形态图，其中图3A为实验结果照片，图3B为统计结果。

图4是敲除突变体T4、T15、T18的致病性分析结果图，其中图4A为实验结果照片，图4B为统计结果。

图5是敲除突变体T4、T15、T18的对氧化胁迫的耐受性结果图，其中图5A为实验结果照片，图5B为统计结果。

具体实施方式

下面结合实际及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方法不限于此。

下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

试验材料

供试菌株、植物与载体

供试菌株为荔枝霜疫霉野生型菌株(Peronophythora litchii，Wild Type，简称WT)为常规的疫霉菌，可通过商业途径或自然界分离获得，大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株DH5α，可通过商业途径得到；供试接种植物材料是荔枝(妃子笑)嫩叶(采自华南农业大学园艺实习果园)；卵菌敲除及转化载体pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA(已在文献“Yufeng,Fang,Linkai,et al.Efficient Genome Editing in theOomycetePhytophthora sojaeUsing CRISPR/Cas9[J].Current Protocols inMicrobiology,2017”中公开)、pBSSK(已在文献“A CRISPR/Cas9-mediated in situcomplementation method for Phytophthora sojae mutants[J].Molecular PlantPathology,2021,22(3)”中公开，以上载体均由南京农业大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室惠赠)。

主要供试培养基

胡萝卜榨汁培养基(Carrot agar，CA)(1L)：胡萝卜300g榨汁，纱布过滤，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.5％(W/V)琼脂粉。

LB培养基(1L)：5g酵母提取物(Yeast extract)，10g胰蛋白胨(Tryptone)，10g氯化钠(NaCl)，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.5％(W/V)琼脂粉。

营养豌豆培养基(Nutrition Pea Broth，NPB)(1L)：新鲜豌豆120g加水煮20min后过滤。滤液中加入5g山梨醇(D-Sorbitol)，5g甘露醇(D-Mannitol)，5g葡萄糖，3g硝酸钾(KNO₃)，2g碳酸钙(CaCO₃)，2g酵母提取物，1g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，1g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.5g硫酸镁(MgSO₄)，0.1g氯化钙(CaCl₂)，2mL维生素混合液(Vitamin stock)和2ml痕量元素(Trace elements)，加ddH₂O定容至1L，121℃，灭菌20min。固体培养基则另加入1.5％(W/V)Difco Bacto Agar。

豌豆甘露醇培养基(Pea/0.5mol·L^-1Manitol，PM)(1L)：新鲜豌豆120g，加水煮20min后过滤。滤液中加入91g D-Mannitol，2g CaCO₃和1.32g CaCl₂，加ddH₂O定容至1L，121℃，灭菌20min。固体培养基则另加入1.5％(W/V)Difco Bacto Agar。

皮氏培养基(1L)：0.5g磷酸二氢钾，0.25g七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，1g L-天冬酰胺(L-asparagine)，1mg维生素B1(Vitamin B1)，0.5g酵母提取物，10mgβ-谷甾醇(β-sitosterol)和25g葡萄糖，加入ddH₂O定容至1L，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.5％(W/V)琼脂粉。

试验方法

CRISPR/Cas9技术相关载体的构建

(1)pYF2.3G-Ribo-sgRNA::PlRACK1的构建

根据设计sgRNA网站(http://grna.ctegd.uga.edu/)，选择PlRACK1基因上的靶向RNA(sgRNA)，交由生工生物合成后，参照表1配制sgRNA退火体系，金属浴37℃，30min。

sgRNA序列如下：

PlRACK1-sgRNA1-F：

CTAGCCACACGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCCGTGTGTCCGTCCTCCGTAA

PlRACK1-sgRNA1-R：

AAACTTACGGAGGACGGACACACGGACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCGTGTGG

PlRACK1-sgRNA2-F：

CTAGCCCGTCACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCTGACGGCTCGGTGCTCTTCT

PlRACK1-sgRNA2-R：

AAACAGAAGAGCACCGAGCCGTCAGACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTGACGGG

表1 sgRNA合成体系(Takara)

随后在上述体系内加入4μL 0.5mol·L^-1NaCl，混匀后于沸水浴煮沸2min，置于室温冷却3-4h，DNA片段退火形成双链。

PlRACK1基因上的靶向RNA(sgRNA)退火形成双链，与酶切后pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体(酶切体系见表2)用T4-DNA连接酶连接，连接体系如表3，反应条件为16℃，4h，置于冰上冷却，随后进行大肠杆菌转化。

表2 pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体双酶切体系(50μL)(NEB)

表3 pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体与双链sgRNA连接反应体系(10μL)(NEB)

(2)pBSSK::PlRACK1载体的构建

根据PlRACK1基因上游、下游各约1kb的序列以及NPTⅡ基因，设计扩增引物(PlRACK1-Left-F、PlRACK1-Left-R，PlRACK1-Right-F、PlRACK1-Right-R，NPTⅡ-F、NPTⅡ-R)。

PlRACK1-Left-F：

ACTAGTGGATCCCCCCATCGTCTTACTTGGTTTGAAC

PlRACK1-Left-R：

ATCTTGTTCAATCATGGATGAAGAGATTTTCCAAAGTG

PlRACK1-Right-F：

GACGAGTTCTTCTGAGCTTATCATCGAACTTCGTTGG

PlRACK1-Right-R：

GAATTCCTGCAGCCCCCAAGTGTTGAGACCGAGAC

NPTⅡ-F：

AAAATCTCTTCATCCATGATTGAACAAGATGGATTGCAC

NPTⅡ-R：

AGTTCGATGATAAGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC

用高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞)进行PCR扩增，以荔枝霜疫霉基因组DNA为模板扩增左右同源臂序列，从NPTⅡ抗性载体pYF2-PsNLS-hSpCas9上扩增NPTⅡ基因序列，具体PCR扩增体系如下表4：

表4 Phanta Max高保真酶PCR扩增体系(50μL)

扩增程序为：预变性95℃，3min，变性95℃，15s，退火56-72℃，15s，延伸72℃，30s/kb，进行34个循环，最后再延伸5min。目的条带经电泳检测后使用OMEGA公司的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收，具体步骤参考试剂盒的说明书。将得到的产物PlRACK1基因左右同源臂序列及NPTⅡ基因检测浓度后用定向无缝克隆试剂盒ClonExpress One StepCloning Kit(南京诺唯赞)与线性化的pBSSK载体(环状pBSSK载体由SmaⅠ限制性内切酶NEB酶切，反应条件为25℃，2h。酶切后产物使用OMEGA公司的PCR纯化试剂盒纯化回收)进行连接，连接体系如表5，得到pBSSK::PlRACK1。

表5 pBSSK::PlRACK1载体连接反应体系(10μL)

将构建好的pYF2.3G-Ribo-sgRNA::PlRACK1、pBSSK::PlRACK1、pYF2-PsNLS-hSpCas9进行大肠杆菌转化。

(3)大肠杆菌转化及验证

100μL分装的大肠杆菌感受态细胞DH5α冰上冻融，加入连接产物10μL，指尖轻拍混匀，冰上静置30min。42℃水浴热击90s，随后迅速置于冰上2min。650μL LB液体培养基加入管内，37℃，180rpm培养1h，此过程大肠杆菌恢复生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。将上述菌液4000rpm离心4min，吸取上清，剩余100μL LB培养基悬浮菌体，涂布于含终浓度100μg·mL^-1Amp的LB固体筛选平板上，37℃培养12～16h。

以大肠杆菌单菌落为模板，pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体的验证引物为M13F，RPL41-Pseq-F；pBSSK载体验证引物为M13F，M13R；其中M13F及M13R为通用引物，引物RPL41-Pseq-F的序列如下：

RPL41-Pseq-F：CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG

用Green Taq Mix(南京诺唯赞)进行菌落PCR验证，体系如下表6：

表6菌落PCR反应体系(20μL)

(模板用枪头或牙签蘸取少量单菌落加入即可)

PCR扩增程序为：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火60℃，30s，延伸72℃，30s/kb，进行30个循环，再延伸7min。扩增产物经凝胶电泳检测，分别选2个扩增条带符合目的片段大小的菌落，用含100μg·mL^-1Amp的LB液体培养基摇菌送测序。

(4)质粒DNA的大量提取

选择含有目的质粒的大肠杆菌单菌落进行摇菌，单菌落加入至含100μg·mL^-1Amp的LB液体培养基，37℃，200rpm，培养12h，加入至200mL含Amp的LB液体培养基中37℃，200rpm，培养14h。

使用TIANGEN公司的无内毒素质粒大量提取试剂盒(EndoFree Maxi PlasmidKit)提取PEG介导转化所需的3种质粒(pYF2-NLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA::PlRACK1、pBSSK::PlRACK1)。

实施例2

荔枝霜疫霉原生质体的制备及PEG介导的转化

荔枝霜疫霉野生型菌株WT在营养豌豆固体平板培养基上活化。取菌丝块放入锥形瓶中，加入50mL NPB液体培养基进行培养，共培养三瓶，于25℃黑暗培养3d，每隔12h摇晃一次。纱布过滤，收集菌丝，用镊子轻轻挤压后加入到含酶解液(酶解液的组成：称取0.15g溶壁酶(Lysing Enzymes，SIGMA)和0.06g纤维素酶(Cellulase，SIGMA)于灭菌烧杯中，超净台内加入10mL 0.8mol·L^-1Mannitol，8mL灭菌ddH₂O，800μL 0.5mol·L^-1KCl，800μL 0.5mol·L^-1MES-KOH和400μL 0.5mol·L^-1CaCl₂，充分溶解后转移至50mL离心管待用)的50mL离心管中，轻轻混匀后，25℃，40rpm，酶解40～45min。待菌丝酶解后，迅速用包有三层Miracloth滤布的50mL烧杯过滤菌丝，并将滤液转移至50mL圆底离心管中，4℃，1500rpm离心3min。弃上清，加入10mL W5 solution(W5 solution的组成称取7.8g Glucose，4.6g CaCl₂，2.25gNaCl，0.093g KCl，加入ddH₂O定容至250mL)重悬浮原生质体，再加入25mL W5 solution，上下颠倒轻轻混匀，4℃，1500rpm离心4min。弃上清，加入7mL W5 solution重悬浮原生质体，置于冰上放置30min。随后4℃，1500rpm离心4min，弃上清，加入6mL的MMg solution(MMgsolution的组成：甘露醇18.22g、MgCl₂·6H₂O0.76g、MES Buffer 2mL，加水定容至250mL)重悬浮原生质体，温室放置10min。

取6支灭菌50mL离心管置于冰上，向每个离心管中加入3种质粒：pYF2-NLS-hSpCas9，pYF2.3G-Ribo-sgRNA::PlRACK1，pBSSK::PlRACK1，各30μg，得到含原生质体的MMgsolution。向每个50mL离心管中加入1mL含原生质体的MMg solution，轻轻摇晃混匀，置于冰上10min。沿管壁向每个离心管加入580μL 40％聚乙二醇(PEG)溶液，连续加入3次。此过程中缓慢旋转离心管，使PEG与原生质体混匀，冰上放置20min。豌豆甘露醇培养液(PM)中1000:1加入100mg·mL^-1氨苄抗生素得到AmpPM。离心管依次加入2mL AmpPM，轻轻上下颠倒，冰上放置2min；离心管依次加入8mL AmpPM，并轻轻上下颠倒，冰上放置2min；最后各个离心管中依次加入10mL AmpPM，并轻轻上下颠倒，倾斜放置。25℃下黑暗培养14～16h，使原生质体再生。过夜培养后，显微镜下观察原生质体再生情况，随后2000rpm离心5min。各离心管弃上清至剩余5mL液体培养基，悬浮沉淀后加入30mL含30μg·mL^-1遗传霉素G418的豌豆甘露醇固体培养基，颠倒混匀后倒入2个9cm灭菌培养皿中，25℃黑暗培养2～3d。挑取单菌落对其进行编号命名，用于鉴定。

实施例3

验证和测定

(1)PlRACK1基因敲除转化子的荧光定量分析验证

将荔枝霜疫霉野生型WT与转化子的菌丝，用BBI公司的All-In-One DNA/RNAMini-Preps Kit试剂盒进行RNA提取，利用天根的FastKing cDNA第一链合成试剂盒进行基因组DNA去除和逆转录cDNA合成，以PlActin基因为内参基因设计定量引物PlActin-F、PlActin-R，以PlRACK1基因的CDS序列为目的基因设计定量引物PlRACK1-qPCR-F、PlRACK1-qPCR-R，通过使用SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒(TAKARA)进行实时荧光定量PCR，通过分析PlRACK1基因的表达，验证PlRACK1基因是否成功敲除。

将荔枝霜疫霉野生型WT与转化子用CTAB法进行基因组DNA提取，以基因组DNA为模板，设计基因组中PlRACK1左右同源臂片段外的引物RACK1-OUT-F、RACK1-OUT-R分别进行常规PCR扩增并送测序检测。

PlActin-F：TCACGCTATTGTTCGTCTGG

PlActin-R：TCATCTCCTGGTCGAAGTCC

PlRACK1-qPCR-F：GACCGTGAAGCTCTGGAACA

PlRACK1-qPCR-R：AGCTTGCAGTTGGACAGGTT

RACK1-OUT-F：ATCCAGCTACTGCACCTAATC

RACK1-OUT-R：CATTCACTCTAGCAGCGGAG

测序结果证明，PEG转化敲除成功，并获得三个PlRACK1基因敲除转化子，按照验证顺序从T1起进行编号，三个敲除成功的突变体分别命名为T4、T15、T18。

(2)敲除突变体生长速率的测定

荔枝霜疫霉野生型WT菌株以及PlRACK1基因敲除成功的突变体T4、T15、T18在无抗生素的CA平板转代2次，打孔取菌龄一致的9mm直径的WT和T4、T15、T18菌丝块，接种在15mL等量胡萝卜培养基平板(直径＝9cm)中央。设3个重复，25℃黑暗培养5d，测量菌落直径大小并计算生长速率并拍照。实验独立重复三次，用SPSS软件中的Duncan’s multiple rangetest进行菌株间的差异显著性分析。

生长速率(mm/d)＝第5天菌落直径/5天。

(3)敲除突变体致病性测定

取测定步骤(2)中转代培养得到的菌龄一致的9mm直径的WT和T4、T15、T18菌丝块，每组取5个置于2.5mL ddH₂O中，用涡旋振荡器震荡1min，使孢子囊充分从孢囊梗脱落，获得孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液置于16℃培养箱静置使游动孢子释放，显微镜下计数稀释至10个游动孢子/μL。荔枝(品种为妃子笑)嫩叶经ddH₂O浸泡后置于湿润滤纸上，每片嫩叶接种10μL游动孢子悬浮液，每个菌株重复接种10片叶龄相近嫩叶，于25℃保湿放置，48h后拍照并测量病斑直径。用SPSS软件中的Duncan’s multiple range test进行差异显著性分析。

(4)敲除突变体对氧化胁迫的耐受性测定

取测定步骤(2)中转代培养得到的菌龄一致的9mm直径的WT和T4、T15、T18菌丝块，接种于定量的皮式培养基中央，作为空白对照。实验组使用各添加1mM H₂O₂和2mM H₂O₂的皮式培养基也用相同的方法接上各菌株的菌丝块。在25℃下黑暗培养7天，对接种在空白对照和添加氧化胁迫物质的皮式平板的菌株，进行菌落生长直径测量和拍照，计算WT和T4、T15、T18敲除突变体在氧化胁迫下的生长抑制率，统计T4、T15、T18敲除突变体的抑制率是否较WT具有显著差异。

实施例4

结果与分析

(1)荔枝霜疫霉PlRACK1基因重组片段的构建

应用PCR技术分别克隆获得了PlRACK1基因同源臂Left、同源臂Right序列片段以及NPTⅡ基因序列片段，多片段连接至线性化PBSSK载体，成功得到了pBSSK::PlRACK1载体；双链合成获得了sgRNA，连接至线性化pYF2.3G-Ribo-sgRNA载体，成功得到了pYF2.3G-Ribo-sgRNA::PlRACK1载体。敲除示意图如图1。

(2)荔枝霜疫霉基因PlRACK1敲除突变体的筛选

用基因PlRACK1的实时荧光定量PCR引物PlRACK1-qPCR-F、PlRACK1-qPCR-R，以及PlActin基因为内参基因的实时荧光定量PCR引物PlActin-F、PlActin-R，通过实时荧光定量PCR，分析敲除转化子PlRACK1基因的表达情况，结果显示，T4、T15、T18三个转化子均不能对PlRACK1基因进行表达，说明T4、T15、T18为基因PlRACK1的敲除转化子(图2)，测序结果证实确已敲除。

(3)基因PlRACK1敲除突变体生长速率的分析

与荔枝霜疫霉野生型WT相比，敲除突变体T4、T15、T18在CA培养基中生长显著减慢(图3)。

(4)基因PlRACK1敲除突变体致病性分析

与荔枝霜疫霉野生型WT相比，敲除突变体T4、T15、T18，在接种相同浓度游动孢子悬浮液后，病斑直径显著减小，证明基因PlRACK1的缺失导致荔枝霜疫霉的致病力显著降低(图4)。

(5)基因PlRACK1敲除突变体对氧化胁迫的耐受性分析

将敲除突变体T4、T15、T18分别接种至添加1mM H₂O₂和2mM H₂O₂的皮式培养基，对其菌落直径进行统计并计算抑制率(图5)。结果表明，与野生型相比，在1mM H₂O₂和2mM H₂O₂的氧化胁迫环境条件下，突变体的被抑制率显著增加，说明敲除基因PlRACK1会导致荔枝霜疫霉的氧化胁迫耐受性降低。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。另外，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物靶标。本领域技术人员可以根据本说明书的指导与启示，开发用于防治植物病害、特别是荔枝霜疫病的药物。

上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方案，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 华南农业大学

<120> 基因PlRACK1在调控荔枝霜疫霉生长、抗氧化和致病力中的应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)

<220>

<223> PlRACK1基因

<400> 1

atggccgaga ccagcatcta cccgcgcgcc gagcttgacg gccacaacgg caaggccgtg 60

acggccatcg ccacgacccg cgagaacccg aacctgcttc tgactgcctc gcgcgacaag 120

tcgctacttg tgtggcagct ctcgaacgac ggcgaggagt acggctttgc ccgtcgtcgt 180

ctgcagggcc actcgcacta cgtcgaggac gtggtgatct cgtcggacgg tcagttcgct 240

ctgtccggct cgtgggacgg cacgctacgt ctgtgggacc tgaacacggg catcacgacg 300

cgccgcttcg tgggacacac caaggacgtg ctgtcggtgg ctttcagcgc tgacaaccgt 360

cagatcgtct cgggctcgcg tgacaagacc gtgaagctct ggaacactct gggtgagtgc 420

aagtacacca ttacggagga cggacacacg gagtgggtct cgtgcgtgcg cttcagcccg 480

tcgacggcca accccctcat tgtctcgtgt ggctgggaca aggtcgtcaa gatctggaac 540

ctgtccaact gcaagctccg caccaacctg ttcggccacg agggctacct taacacggtc 600

acagtgtctc ctgatggatc gatctgtgct tcgggtggta aggacggcac tgccaacctg 660

tgggacctga acgagggcaa gcgcctctac tcgcttgtgg ctggcgatgt catccacgct 720

ctcgtgttct cgcccaaccg ttactggctg tgcgctgcca ccacctcggg catcaagatc 780

tgggacctag agtcgaagat cgtggtgcac gacctgcagc cggaggttga ggagcccaag 840

ggcaagtacg ctcagccgcc tcactgcatc tcgctggcct ggtccgctga cggctcggtg 900

ctcttctcgg gctacacgga cggtatcgtc cgcgtgtggt cggtgggcaa ctaa 954

<210> 14

<211> 317

<212> PRT

<213> 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)

<220>

<223> PlRACK1蛋白

<400> 14

Met Ala Glu Thr Ser Ile Tyr Pro Arg Ala Glu Leu Asp Gly His Asn

1 5 10 15

Gly Lys Ala Val Thr Ala Ile Ala Thr Thr Arg Glu Asn Pro Asn Leu

20 25 30

Leu Leu Thr Ala Ser Arg Asp Lys Ser Leu Leu Val Trp Gln Leu Ser

35 40 45

Asn Asp Gly Glu Glu Tyr Gly Phe Ala Arg Arg Arg Leu Gln Gly His

50 55 60

Ser His Tyr Val Glu Asp Val Val Ile Ser Ser Asp Gly Gln Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ser Trp Asp Gly Thr Leu Arg Leu Trp Asp Leu Asn Thr

85 90 95

Gly Ile Thr Thr Arg Arg Phe Val Gly His Thr Lys Asp Val Leu Ser

100 105 110

Val Ala Phe Ser Ala Asp Asn Arg Gln Ile Val Ser Gly Ser Arg Asp

115 120 125

Lys Thr Val Lys Leu Trp Asn Thr Leu Gly Glu Cys Lys Tyr Thr Ile

130 135 140

Thr Glu Asp Gly His Thr Glu Trp Val Ser Cys Val Arg Phe Ser Pro

145 150 155 160

Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ile Val Ser Cys Gly Trp Asp Lys Val Val

165 170 175

Lys Ile Trp Asn Leu Ser Asn Cys Lys Leu Arg Thr Asn Leu Phe Gly

180 185 190

His Glu Gly Tyr Leu Asn Thr Val Thr Val Ser Pro Asp Gly Ser Ile

195 200 205

Cys Ala Ser Gly Gly Lys Asp Gly Thr Ala Asn Leu Trp Asp Leu Asn

210 215 220

Glu Gly Lys Arg Leu Tyr Ser Leu Val Ala Gly Asp Val Ile His Ala

225 230 235 240

Leu Val Phe Ser Pro Asn Arg Tyr Trp Leu Cys Ala Ala Thr Thr Ser

245 250 255

Gly Ile Lys Ile Trp Asp Leu Glu Ser Lys Ile Val Val His Asp Leu

260 265 270

Gln Pro Glu Val Glu Glu Pro Lys Gly Lys Tyr Ala Gln Pro Pro His

275 280 285

Cys Ile Ser Leu Ala Trp Ser Ala Asp Gly Ser Val Leu Phe Ser Gly

290 295 300

Tyr Thr Asp Gly Ile Val Arg Val Trp Ser Val Gly Asn

305 310 315

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-Left-F

<400> 2

actagtggat ccccccatcg tcttacttgg tttgaac 37

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-Left-R

<400> 3

atcttgttca atcatggatg aagagatttt ccaaagtg 38

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-Right-F

<400> 4

gacgagttct tctgagctta tcatcgaact tcgttgg 37

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-Right-R

<400> 5

gaattcctgc agcccccaag tgttgagacc gagac 35

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NPTⅡ-F

<400> 6

aaaatctctt catccatgat tgaacaagat ggattgcac 39

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NPTⅡ-R

<400> 7

agttcgatga taagctcaga agaactcgtc aagaaggc 38

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlActin-F

<400> 8

tcacgctatt gttcgtctgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlActin-R

<400> 9

tcatctcctg gtcgaagtcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-qPCR-F

<400> 10

gaccgtgaag ctctggaaca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-qPCR-R

<400> 11

agcttgcagt tggacaggtt 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RACK1-OUT-F

<400> 12

atccagctac tgcacctaat c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RACK1-OUT-R

<400> 13

cattcactct agcagcggag 20

<210> 15

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-sgRNA1-F

<400> 15

ctagccacac gctgatgagt ccgtgaggac gaaacgagta agctcgtccg tgtgtccgtc 60

ctccgtaa 68

<210> 16

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-sgRNA1-R

<400> 16

aaacttacgg aggacggaca cacggacgag cttactcgtt tcgtcctcac ggactcatca 60

gcgtgtgg 68

<210> 17

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-sgRNA2-F

<400> 17

ctagcccgtc actgatgagt ccgtgaggac gaaacgagta agctcgtctg acggctcggt 60

gctcttct 68

<210> 18

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlRACK1-sgRNA2-R

<400> 18

aaacagaaga gcaccgagcc gtcagacgag cttactcgtt tcgtcctcac ggactcatca 60

gtgacggg 68

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RPL41_Pseq_F

<400> 19

caagcctcac tttctgctga ctg 23

Claims

1.一种降低荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）致病力的方法，其特征在于：敲除荔枝霜疫霉基因PlRACK1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

敲除基因PlRACK1抑制荔枝霜疫霉生长。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

敲除PlRACK1增加荔枝霜疫霉氧化胁迫环境下敏感性。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：

所述的基因PlRACK1，其核苷酸序列为下列A、B之一：

A、编码SEQ ID NO：2 所示氨基酸序列的DNA 序列；

B、如SEQ ID NO：1 所示的DNA 序列。

5.一种权利要求1所述的基因PlRACK1作为用于植物病害防治的药物靶标的应用，其特征在于：

所述的植物病害是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。

6.一种防治荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，其特征在于：

包含阻断或抑制权利要求1所述基因PlRACK1的表达；所述的植物病害是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病；

所述的荔枝霜疫霉为Peronophythora litchii。

7.一种治疗由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，其特征在于：

包含阻断或抑制权利要求1所述基因PlRACK1的表达；

所述的荔枝霜疫霉为Peronophythora litchii。

8.阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因PlRACK1表达的药剂在制备用于控制由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病药物中的应用，其特征在于：

所述的药剂是权利要求1所述基因PlRACK1的反义RNA 或siRNA ，所述药物用于控制由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病；

所述的荔枝霜疫霉为Peronophythora litchii。