CN103387993B - 调控水稻花粉败育的生长素应答因子编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控水稻花粉败育的生长素应答因子编码基因及其应用。本发明将水稻生长素应答因子基因OsARF12或其突变型mOsARF12的双元表达载体经农杆菌介导，T-DNA插入并整合到水稻染色体上，获得OsARF12或mOsARF12高表达的水稻转化体。此两种转基因水稻出现花粉败育与充实率低下的表型，这一表型在转化mOsARF12突变体中表现更为明显，由此可创制水稻雄性不育系。

Description

调控水稻花粉败育的生长素应答因子编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及水稻转基因新品种培育，特别涉及一种介导水稻花粉败育的生长素应答因子在水稻雄性不育系创制方面的应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的大宗粮食作物之一，水稻高产与优质品种的培育成为保证我国粮食安全的重要战略举措。水稻的生殖发育是其生活史中最为关键和复杂的过程，成为水稻产量和品质形成的重要基础。水稻的生殖发育主要包括花器官的分化与形成、受粉、受精、种子形成及发育，且这一系统发育过程是以复杂的调控因子及其构成的信号分子网络为基础的。水稻雌雄器官的分化与形成构成生殖发育的核心事件，挖掘水稻雌雄器官发育的重要调控基因资源，构建水稻丰富的特异遗传杂交素材，成为利用转基因技术创制水稻新品种的重要前提，且已受到愈来愈广泛地关注。因此，水稻雌雄器官发育及其分子机理的研究，不仅可为认识水稻种子形成的分子机理奠定重要的理论基础，且可为创制水稻育种新素材与新种质材料提供技术保障。

植物生长素应答因子（Auxin Response Factor，ARF）是调节生长素响应基因表达的一类转录因子（Tiwari et al.,2003,the roles of auxin response factor domains in auxin-responsivetranscription.The Plant Cell 15(2):533-543）。ARF特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素应答元件（Auxin Response Element,AuxRE）TGTCTC序列区域结合，并且通过与Aux/IAA（auxin/indole acetic acid）蛋白异二聚化而行使转录调节功能。Aux/IAA是一类转录抑制因子，当植物体内存在合适的生长素浓度时，它被26S蛋白酶体介导的泛素化而降解，从而释放出ARF来激活生长素响应基因的表达。近年来的研究发现，ARF基因的转录受MicroRNA的调控，从而影响植物生长与发育相关生长素响应基因的表达（Guilfoyle et al.,2007，Auxin response factors.Current Opinion in Plant Biology 10,453-460.）。

研究表明，ARF转录因子由一个N端DNA结合域（DBD），一个具激活或抑制转录的功能域（AD或BD）以及一个C端结构域（CTD）构成。ARF转录因子的DNA结合域能特异地与AuxRE结合。水稻（Oryza sativa）基因组内含有25个ARF基因（OsARFs），分布于12条染色体中的10条上。对OsARF功能域中氨基酸序列的分析表明，25个OsARFs中9个被预测具有转录激活功能，它们分别是OsARF5、OsARF6、OsARF11、OsARF12、OsARF16、OsARF17、OsARF19、OsARF21和OsARF25，而其余的16个为转录抑制因子（Tiwari et al.,2003,the roles of auxin response factor domains in auxin-responsivetranscription.The Plant Cell 15(2):533-543）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种介导水稻花粉败育的生长素应答因子及其编码基因，以用于水稻雄性不育系的创制。

本发明的研究发现，在水稻幼苗、成叶以及生殖器官发育中，生长素应答因子OsARF12呈组成型的表达模式。然而，在水稻雌蕊发育中呈高表达的OsARF12，却在水稻雄蕊器官的花药发育中表达量较低。由此推测，OsARF12可能在水稻雄蕊器官的花药发育中发挥着非常关键的负调控作用。本发明利用植物双元载体过表达的技术方法，获得了野生型OsARF12及其突变型mOsARF12过表达转化体，发现转基因植株呈现花粉败育的表型。因此，利用OsARF12实施过表达转化，可创制水稻雄性不育系。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的巨大应用前景，有必要通过专利加以保护。

本发明所述的生长素应答因子基因来源于水稻（Oryza sativa），名称为OsARF12，编码序列表中的SEQ ID No：3所示的生长素应答因子12（OsARF12）。该蛋白具有转录激活功能，在水稻雌蕊发育中高表达，但在花药发育中表达量较低。

序列表中的SEQ ID No：3序列由822个氨基酸残基组成，具有一个N端DNA结合域（AA139-239），一个具激活转录的功能域（AA271-348）以及一个C端结构域（AA724-803）。

本发明的生长素应答因子基因OsARF12可以是所述生长素应答因子基因的cDNA序列，也可以是其基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID No：1所示的cDNA序列，以及根据密码子的简并性进行同义突变后得到的编码相同氨基酸序列的DNA序列。

本发明利用实时定量RT-PCR的方法，确定了水稻幼苗、成叶、雌蕊以及花药中均有OsARF12不同水平的表达。然而，在水稻雌蕊发育中，OsARF12的表达量最高，而在水稻花药发育中的表达量最低（图1）。通过生物信息学分析发现，OsARF12的mRNA序列中包括一个被miR167识别的位点（序列表中SEQ ID No：1第2299-2324位核苷酸残基：GATAGATCAGGCTGGCAGCTTGTATT）。因此，通过PCR定点突变的方法，我们获得了抗miR167剪切的突变型OsARF12（mOsARF12）（序列表中SEQ ID No：2第2299-2324位核苷酸残基：GATAGGTCTGGATGGCAATTGGTATT，其中下划线所示为突变碱基）。

基于上述OsARF12基因在水稻生长发育中的表达模式，本发明通过转基因技术在水稻中过表达野生型OsARF12和突变型mOsARF12，所获得的转基因水稻的花粉发育不正常，并失去育性。首先，将OsARF12和mOsARF12的序列分别插入到植物表达载体pTCK303中，并在其N端连入MYC标签蛋白，构建成为过表达双元载体Ubi::myc-OsARF12和Ubi::myc-mOsARF12。如图2A所示，OsARF12和mOsARF12特异片断由玉米泛素启动子（ZmUBi promoter）引导表达，并由Nos终止子结束基因的转录。之后，将上述双元载体以及作为转化对照的空载体pTCK303经农杆菌EHA105的介导，分别转化至水稻品种中花15号的胚性愈伤组织，并获得抗性愈伤，继而诱导获得抗性幼苗。经农杆菌介导，T-DNA插入并整合到水稻染色体上，获得OsARF12及mOsARF12高表达的水稻转化体。通过实时定量RT-PCR方法，对OsARF12和mOsARF12的表达水平进行了检测。结果显示，与对照相比，OsARF12在W1至W7几个转化子中的表达水平非常高；mOsARF12在M1至M7转化子中同样高表达（图2B），而且mOsARF12突变体的表达量更高。

对水稻myc-OsARF12和myc-mOsARF12过表达转化植株进行了表型分析。结果表明，相比对照植株，myc-OsARF12和myc-mOsARF12两种转化植株的分蘖数、株高、叶长、穗长和颖果数均未有明显改变，显示两种转基因植株的营养生长都正常。相对而言，myc-OsARF12和myc-mOsARF12两种转化植株的花形态结构与对照植株系花形态结构无明显差异。此外，通过对转基因水稻花粉粒的KI-I₂染色发现，myc-OsARF12及myc-mOsARF12过表达水稻植株的花粉粒体积小、不规则，且不能被染色（图3E、H和K）。转基因水稻花药发育后期组织切片染色结果显示，myc-OsARF12及myc-mOsARF12过表达水稻植株的药室内也存在许多染色浅、体积小，且不规则的花粉粒（图5）。转基因水稻成熟时农艺性状调查结构表明，myc-OsARF12及myc-mOsARF12过表达水稻植株的穗长比对照野生型植株稍短，结实率显著低下（图4）。

综上，将野生型OsARF12和突变型mOsARF12的过表达双元载体经农杆菌介导转入水稻中，可以获得营养生长正常，但雄性不育的遗传改造效果。该技术可为定向创制水稻雄性不育系，提供一种有效的方法。

附图说明

图1、水稻不同组织器官OsARF12mRNA的表达模式。利用实时定量PCR检测OsARF12在不同组织器官的相对表达水平，以Ubiquitin5(UBQ5)作为内参，标准偏差为n=4的PCR重复次数。

图2、野生型OsARFs（myc-OsARFs）和抗剪切突变形式（myc-mOsARFs）的双元表达载体构建示意图及其转基因水稻中表达状态。A为myc-OsARFs和myc-mOsARFs双元表达载体（pTCK-21i）的结构图，图中，UBi1 promoter region示玉米泛素基因启动子，Nos示终止子。B为myc-OsARFs和myc-mOsARFs转基因植株和对照转化植株中OsARF12的表达情况，图中，W1-W7示myc-OsARFs转化子，M1-M7示myc-mOsARFs转化子，EV示对照转化植株，UBQ5为内参。

图3、不同转基因植株的表型分析，其中：A、B和C分别是转有空载（A），myc-OsARF12（B）和myc-mOsARF12（C）的植株表型；D-F是转有空载的植株的花结构、KI-I₂花粉染色结果，以及成熟颖果的照片；G-I是Ubi::myc-OsARF12转基因植株的花结构、KI-I₂花粉染色结果，以及成熟颖果的照片；J-L是Ubi::myc-mOsARF12转基因植株的花结构、KI-I₂花粉染色的结果，以及成熟颖果的照片。图中白色标尺表示1mm，黑色标尺表示100μm。

图4、不同转基因系的统计学表型分析，包括不同转基因系的平均株高（A）、分蘖数（B）、穗长（C）及种子充实率（D）的统计结果。所示数据来源至少30个独立样本。抽穗期统计分蘖数。成熟期是统计株高，穗长以及种子充实率。误差棒表示标准偏差。^*P<0.05,^**P<0.01，与空载相比（Student’s t-test）。EV，空载。

图5、不同转基因系花粉形态学的观察：苏木精伊红染色后，空载(A)，Ubi::myc-ARF12(B)，以及Ubi::myc-mARF12(C)转基因水稻花药横切观察。单位标尺代表50μm。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。

植物材料：水稻粳稻品种中花15号（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua15）。

1、实验材料的获得和RNA的提取

■水稻不同组织与不同发育期颖果的取材方法

水稻不同组织的取材：幼苗材料取自两周的水稻幼苗，成叶和颖花取自处于抽穗时期的水稻植株，取材后液氮冷冻并保存于-80°C低温冰箱。

水稻不同发育期穗的取材：根据包裹在叶鞘内穗的长度划分颖花的发育时期（stage）：Stage 1，0-3cm；Stage 2，3-5cm；Stage 3，5-10cm；Stage 4，10-5cm；Stage 5，15-22cm；Stage 6，22-30cm，液氮冷冻并保存于-80°C低温冰箱。

水稻不同发育期颖果的取材：取Stage5和Stage6时期的穗，将尚未开花的颖花在解剖镜下用解剖针和镊子将颖壳、雌蕊和花药分离。

■玻璃制品、塑料制品和电泳槽的去RNA酶处理

RNA相关实验过程中所用的玻璃制品在使用前于180°C烘烤8小时。塑料制品，包括各种类型的枪头和离心管，用0.1%DEPC水浸泡过夜，高压灭菌后置于80°C干燥箱中干燥。用于RNA电泳的电泳槽经清洗后，用无水乙醇浸泡30分钟，然后用30%H₂O₂浸泡30分钟，最后用DEPC处理水冲洗。

■水稻不同器官和不同发育期颖果总RNA的提取

首先，用液氮预冷研钵和研磨棒，在液氮中将材料研磨成粉末。随后称取50-100mg研磨好的粉末加入含有1mL Trizol的1.5ml EP管中，剧烈震荡15秒。室温将管平放5分钟。室温12,000g离心2分钟，将上清转移至一新EP管中，在管中加入0.2mL氯仿，震荡混匀后于4°C 12,000g离心10分钟，取上清至一新EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20°C至少放置4小时。4°C 12,000g离心10分钟，弃上清。用1mL 75%乙醇洗沉淀，但不要使沉淀悬浮，4°C 12,000g离心1分钟，弃上清，室温风干10分钟。加适量DEPC处理水溶解RNA。

■RNA质量检测

在GBC Cintra 10e紫外分光光度计上测RNA样品在260nm和280nm的光吸收值，通过吸收值计算RNA样品的浓度和判断RNA样品的纯度。RNA光吸收值和浓度换算公式：1OD₂₆₀=40μg/mL。纯度判断方法：纯的RNA，其OD₂₆₀/OD₂₈₀为2.0，若污染了蛋白质或酚，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值明显低于此值。然后通过1.5％的MOPS琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

■RNA样品中少量DNA的去除

通过无RNase的DNase消化RNA样品中残留的DNA，反应体系包括：1×RQ1 RNase-freeDNase Buffer、RNase inhibitor 20unit、RQ1 RNase-free DNase  1μL、RNA样品50μg，用DEPC-H₂O补足体系至50μL。上述体系于37℃温育30min。DNA酶解反应结束后，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA样品。

2、OsARF12在水稻不同组织器官中的表达模式

■水稻不同组织器官中OsARF12的实时定量PCR

取材：水稻幼苗、成叶以及花器官。

实时定量RT-PCR：使用Trizol Plant试剂盒（Invitrogen）提取总RNA，去DNA后逆转录为cDNA，将cDNA稀释5倍并保存于-20℃待用。在8联定量PCR管中加入10μL 2×ABIpower SYBR green PCR master mix，上游引物（序列：5’-GTCGTTGGACATAACCCGGTTCTCT-3’，SEQ ID No：4）、下游引物（序列：5’-TCCCATCTTATGCACATCCTCAGGT-3’，SEQID No：5）（各10μM）和cDNA各1μL，加dd H₂O补足反应体系至20μL，混匀并短暂离心。将上述反应体系置于ABI 7500实时荧光定量PCR仪中，按标准流程进行PCR反应。循环条件为：50℃2min，94℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火及延伸1min，40个循环；最后添加一个溶解曲线测定循环。

反应结束后应用软件ABI 7500Software v2.0分析实验结果。以UBQ5（AK061988）的表达为内参。如图1所示，OsARF12在水稻幼苗（Seedling）、成叶（Leaf）、雌蕊（Pistil）以及花药（Anther）中均有不同水平的表达：在水稻雌蕊发育中，OsARF12的表达量最高，而在水稻花药发育中的表达量最低。

3、水稻OsARF12过表达转基因水稻的获得

■SuperScript II逆转录总RNA

该反应采用Oligo(dT)15作为逆转录引物，逆转录水稻总RNA中带有Poly(A)尾的所有mRNA。反应体系如下：

上述反应体系于42°C反应60min，85°C处理5min灭活逆转录酶，分装cDNA保存于-20°C。

■OsARF12开放阅读框（ORF）的克隆

根据NCBI数据库中水稻OsARF12编码序列的信息设计引物）。随后以SuperScript II逆转录所获得的水稻cDNA为模板，采用Pfx高保真DNA聚合酶扩增上述OsARF12的ORF序列。反应体系如下：

上游引物序列：5’-GAGGAGGAGGAGATGAGCTCGTCGT-3’，SEQ ID No：6；

下游引物序列：5’-GCCCAGAAATGGCACCATGTTCTCT-3’，SEQ ID No：7。

上述PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，68℃延伸2.5min，31个循环；68℃延伸8min；暂停于4℃。

电泳检测PCR产物条带大小及特异性，将目的条带切胶回收后克隆至pGEM-T载体，并命名为pT-OsARF12。将其转化大肠杆菌感受态并提质粒做双酶切检测，阳性质粒送至英骏公司测序验证。

以测序正确的pT-OsARF12质粒为模版，进行第二轮PCR，通过新设计的引物在OsARF12的ORF 5’端引入一个c-myc标签，引物序列如下：

上游引物：5’-TTTCTAGAATGGAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGATGAGCTCGTCGTCGGCGGCC-3’，SEQ ID No：8；

下游引物：5’-TTGGTACCTCAGGACAGATACCGTGGATC ATTTC-3’，SEQ ID No：9。

同样地，将扩增产物克隆至pGEM-T后转化大肠杆菌并提质粒做双酶切检测，阳性质粒送至英骏公司测序验证，并将其命名为pT-myc-ARF12。

为验证osa-miR167与OsARF12靶序列的互作位点，我们又通过多点突变的手段在OsARF12靶基因编码区（SEQ ID No：1）中与miR167互补的区域内引入6个核苷酸的突变，并且这些突变不会改变其蛋白编码序列（突变位点位于第2299-2324位核苷酸序列中：GATAGGTCTGGATGGCAATTGGTATT，其中下划线所示为突变后的碱基）。这样，发生多点突变的ARF 12mRNA就有抗miR167互作并剪切的能力并被命名为mOsARF12。同样，我们在mOsARF12的ORF 5’端引入一个c-myc标签，将扩增产物克隆至pGEM-T后转化大肠杆菌并提质粒做双酶切检测，阳性质粒送至英骏公司测序验证，并将其命名为pT-myc-mOsARF12。

■水稻转基因载体构建

分别以pT-myc-OsARF12和pT-myc-mOsARF12为模版，设计带有针对pTCK303载体多克隆酶切位点的引物（上游引物：5’-TTGGTACCATGGAGGAGCAGAAGCTG-3’，SEQ IDNo：10；下游引物：5’-TTACTAGTTCAGGACAGATACCGTGGATCATTTC-3’，SEQ ID No：11），通过Pfx高保真DNA聚合酶扩增myc-OsARF12以及myc-mOsARF12片段，将扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化并克隆至pGEM-T进行测序验证，将正确的基因片段亚克隆至双元表达载体pTCK303中，使其在该载体所带的玉米Ubiquitin启动子的驱动下表达，将其分别命名为：Ubi::myc-OsARF12和Ubi::myc-mOsARF12（见图2A）。

■水稻的基因转化

将上述以构建好的双元载体以及作为转化对照的空载体pTCK303分别转化至农杆菌EHA105中。将农杆菌菌液送至吉林省农科院委托进行水稻的基因转化。利用经组培诱导出的水稻粳稻品种中花15号的胚性愈伤组织，经农杆菌侵染法获得水稻抗性愈伤组织（选用50μg/mL Hyg筛选）。然后，将这些抗性水稻愈伤组织在抗性1/2MS培养基上诱导成苗。待抗性水稻幼苗长出3片叶时移栽至水桶中，常规田间管理。

4、转基因水稻的表观表型观察统计及细胞学变化

■转基因水稻的分子鉴定

待转基因水稻长出数个分蘖时，从每株水稻上取约0.1g的叶片组织，提取基因组DNA后，利用设计的转基因检测引物PCR扩增从pTCK303载体上Ubiquitin启动子下游至目的基因上游的片段。根据扩增产物的有无以及大小进一步筛选阳性转基因水稻植株。

待水稻进入抽穗期，取经PCR鉴定正确的水稻叶片提取其总RNA。对于Ubi::myc-OsARF12和Ubi::myc-mOsARF12的水稻RNA样品，利用Real-time RT-PCR实验检测OsARF12的mRNA水平。结果显示如图2B所示，与对照相比，OsARF12在W1至W7几个转化子中的表达水平非常高；mOsARF12在M1至M7转化子中表达量更高，可能是由于其mRNA不被miR167识别而剪切引起。

待水稻成熟后（抽穗两周后），分别统计空载对照，Ubi::myc-OsARF12和Ubi::myc-mOsARF12的水稻植株的分蘖数，测量每一个株系中最高分蘖的株高、穗长（每一种转基因品种的统计样本数大于30株），同时进行取材保存，并对明显的表型形状用NikonS10进行数码拍照。待水稻结实后统计空载对照及Ubi::myc-OsARF12和Ubi::myc-mOsARF12水稻植株的结实率。最终数据用SPSS软件进行统计学分析，同时用实体镜观察水稻花器官。

结果表明，相比对照植株，myc-OsARF12和myc-mOsARF12两种转化植株的分蘖数、株高、叶长、穗长和颖果数均未有明显改变，显示两种转基因植株的营养生长都正常（图3和图4）。相对而言，myc-OsARF12和myc-mOsARF12两种转化植株的花形态结构与对照植株系花形态结构无明显差异（图3D、G和J）。

此外，通过对转基因水稻花粉粒的KI-I₂染色发现，myc-OsARF12及myc-mOsARF12过表达水稻植株的花粉粒体积小、不规则，且不能被染色（图3E、H和K）。转基因水稻成熟时农艺性状调查结构表明，myc-OsARF12及myc-mOsARF12过表达水稻植株的穗长比对照野生型植株稍短，结实率显著低下（图4）

■水稻组织切片与苏木精-伊红染色

材料的固定：将新鲜的水稻材料置于含有FAA固定液的小玻璃瓶中室温抽气0.5-2小时，之后更换新鲜配置的固定液室温固定12小时以上。脱水：弃去固定液，采用30%、50%、70%、85%、90%、100%、100%、100%的乙醇依次进行梯度脱水处理，每步0.5-1小时。透明：采用25%二甲苯-75%乙醇、50%二甲苯-50%乙醇、75%二甲苯-25%乙醇、100%二甲苯、100%二甲苯依次进行透明处理0.5-1小时。浸蜡：将材料于50%二甲苯-50%石蜡中42℃过夜，然后更换100%纯蜡，60℃保温3天，期间更换6次纯蜡。包埋：将材料趁包埋后要迅速冷却材料，4℃短期保存。切片：将包埋好的材料修成小块，用石蜡切片机切8μm厚的蜡片。烤片：在载片上加几滴去离子水，蜡带置于水上，展开后吸干多余的水，于42℃烤片1天。脱蜡：按顺序将材料在100%二甲苯室温10分钟，100%二甲苯室温10分钟，50%二甲苯-50%乙醇室温2分钟。复水：将材料依次在100%乙醇、100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、10%乙醇、H₂O、H₂O中处理，室温下每步2分钟。苏木精-伊红染色：将材料在苏木精染液中孵育2-3分钟后，在清水漂洗载片至无色，将载片在酸性漂洗液中沾洗10次，然后在清水中沾洗10次，将载片在反蓝试剂中沾洗10次，然后用清水漂洗，伊红复染30-60秒，70%、95%、100%乙醇梯度脱水，中性树脂封片。

转基因水稻花药发育后期组织切片染色结果显示，myc-OsARF12及myc-mOsARF12过表达水稻植株的药室内存在许多染色浅、体积小，且不规则的花粉粒（图5B和C）。

Claims (6)

1.一种水稻生长素应答因子基因在水稻育种中的应用，通过转基因技术在水稻中过表达所述水稻生长素应答因子基因，从而创制水稻雄性不育系，所述基因编码序列表中SEQ IDNo：3所示氨基酸序列的蛋白质。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻生长素应答因子基因的序列是下列序列1)或2)：

1)序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，构建过表达所述水稻生长素应答因子基因的植物表达载体并转化水稻，获得雄性不育转基因水稻。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体中由玉米泛素启动子驱动所述水稻生长素应答因子基因的表达。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是双元表达载体，经农杆菌介导转入水稻中。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是pTCK303。