CN115094085B - 水稻工程繁殖系的快速创制方法及其应用 - Google Patents

水稻工程繁殖系的快速创制方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻工程繁殖系的快速创制方法，包括：将种子诱导愈伤组织，将负载野生型育性调控基因靶位点序列的基因编辑载体和负载有育性调控基因突变序列的互补载体共转化愈伤组织，并培养至收获T1代种子，育性调控基因突变序列为利用三联体密码子兼并性对野生型育性调控基因进行定点同义突变的碱基序列、且其不被上述基因编辑载体定点编辑；将T1代种子种下，将野生型育性调控基因定点编辑成功且互补载体转化成功的植株作为水稻工程繁殖系。本发明一是工程繁殖系创制流程简化，选育时间大大缩短，二是改变了以不育系幼穗诱导愈伤组织的方法，回归到以种子来诱导愈伤组织，突破了幼穗取材的时间限制，提高了实验的效率。

Description

水稻工程繁殖系的快速创制方法及其应用
技术领域
本发明属于水稻生产技术领域，涉及一种水稻工程繁殖系的快速创制方法及其应用。
背景技术
第三代杂交水稻育种技术以普通核不育系为遗传工具，进行杂交种的生产和杂种优势利用。普通核不育系育性稳定，不受外界环境条件影响，育性由单基因控制，配组自由，在一定程度上克服了三系杂交水稻和两系杂交水稻的缺点和不足。
发展和推广第三代杂交水稻育种技术，是杂交水稻未来的方向，是目前最好的杂种优势利用方式。普通核不育系种子的生产是通过工程繁殖系自交获得的。目前工程繁殖系的创制流程如下：构建育性基因(CYP703A3、EAT1、PTC1等)的CRISPR/Cas9定点编辑载体；定点编辑载体转化常规水稻获得不育纯合突变体；构建三元遗传互补载体(含育性恢复基因，荧光报告基因和花粉失活基因)；利用不育系幼穗诱导愈伤组织；利用农杆菌介导，把三元互补载体转化不育突变体，获得育性恢复的工程繁殖系，繁殖系自交可产生两种类型的种子：含荧光基因的繁殖系种子，不含荧光的不育系种子。不育系种子可直接用于水稻杂交种生产。目前的工程繁殖系创制相对耗时较长，并且通过幼穗诱导愈伤组织，取材时间受较大限制，严重影响了第三代杂交水稻的发展和推广。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种水稻工程繁殖系的快速创制方法。
本发明另有一个目的是提供水稻工程繁殖系在水稻育种中的应用。
为此，本发明提供的技术方案为：
水稻工程繁殖系的快速创制方法，包括如下步骤：
步骤一、将常规可育水稻种子或两系不育系种子诱导愈伤组织，
步骤二、通过农杆菌介导的方法，将负载野生型育性调控基因靶位点序列的基因编辑载体和负载有育性调控基因突变序列的互补载体共转化所述愈伤组织，并将共转化成功的愈伤组织继续培养至收获T1代种子，
其中，所述育性调控基因突变序列为利用三联体密码子兼并性对野生型育性调控基因进行定点同义突变的碱基序列、且其不被所述野生型育性调控基因靶位点序列的基因编辑载体定点编辑；
步骤三、将T1代种子种下并对T1代植株鉴定，将野生型育性调控基因定点编辑成功且互补载体转化成功的植株作为水稻工程繁殖系。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，所述野生型育性调控基因为细胞色素P450羟化酶基因CYP703A3，其为如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，
所述育性调控基因突变序列的表达盒为如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，步骤二中，获取所述育性调控基因的突变序列的方法包括如下步骤：
利用三联体密码子兼并性对野生型育性调控基因CYP703A3进行定点同义突变，使如SEQ ID NO:3所示的碱基序列突变为如SEQ ID NO:4所示的碱基序列，得到育性调控基因的突变序列。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，所述野生型育性调控基因的基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：
基于CRISPR/Cas9系统，以SEQ ID NO:3所示的碱基序列作为靶位点序列，设计出如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的一对引物对，
并将如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的一对引物对连接至所述基因编辑载体上，所述基因编辑载体负载有CRISPR/Cas9系统构件，所述一对引物对连接至所述CRISPR/Cas9系统的上游。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，所述基因编辑载体为pCBSG打靶载体，所述CRISPR/Cas9系统构件包括gRNA骨架元件和Cas9元件，
将如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的一对引物对经如下退火程序处理：95℃至16℃缓慢冷却，速度为0.1℃/s，
之后取退火产物与BsaI(NEB)消化的pCBSG打靶载体进行连接反应，连接至pCBSG载体上OsU6启动子元件与gRNA骨架元件之间。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，当采用常规可育水稻种子诱导愈伤组织时，所述互补载体上还负载有花粉致死基因和外源报告基因。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，当采用两系不育系种子诱导愈伤组织时，所述互补载体上还负载有花粉致死基因、外源报告基因和温敏不育基因。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，所述花粉致死基因为ZmAA1基因，所述外源报告基因为红色荧光蛋白标记基因，所述红色荧光蛋白标记基因的表达盒为如SEQ ID NO:17所示的碱基序列，所述花粉致死基因的表达盒为如SEQ ID NO:19所示的碱基序列。
优选的是，所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法中，所述温敏不育基因为TMS5基因，所述温敏不育基因的表达盒为如SEQ ID NO:18所示的碱基序列。
水稻工程繁殖系在水稻育种中的应用，所述水稻工程繁殖系由任一所述的方法获得。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明利用三联体密码子兼并性对育性基因靶位点序列进行定点同义突变，合成新的育性调控基因表达盒，并构建遗传互补载体；将遗传互补载体和基因编辑载体共转化水稻材料，通过T0代自交，在T1代即可获得稳定的繁殖系材料。本发明的方法相对原来的创制流程有显著的优势，一是工程繁殖系创制流程简化，选育时间大大缩短，二是改变了以不育系幼穗诱导愈伤组织的方法，回归到以种子来诱导愈伤组织，突破了幼穗取材的时间限制，提高了实验的效率。
基本概念
三联体密码
三联体密码指决定蛋白质中氨基酸顺序的核苷酸顺序，由3个连续的核苷酸组成的密码子构成。信使RNA在细胞中能决定蛋白质分子中的氨基酸种类和排列次序。信使RNA分子中的四种核苷酸(碱基)的序列能决定蛋白质分子中的20种氨基酸的序列。而在信使RNA分子上的三个碱基能决定一个氨基酸。三联体遗传密码具有简并性，编码同一氨基酸的几个三联体遗传密码中，一、二位碱基大多是相同的，只是第三位不同。例如ACU,ACC,ACA,ACG都是苏氨酸的密码子，UGU,UGC,UGA,UGG都是缬氨酸的密码子。这样如果密码子第三位碱基出现了点突变，并不影响所翻译出的氨基酸种类。同一氨基酸有多个密码子，在生物界中被使用的频率也是不一样的。
CYP703A3属于细胞色素P450羟化酶，在水稻花药表皮角质层和花粉外壁的发育过程中发挥重要作用，CYP703A3基因突变会导致水稻花药表面角质层和花粉外壁发育缺陷，角质单体和蜡组分的含量明显减少，花药发育异常，不能形成成熟花粉粒，表现雄性不育，本发明中以CYP703A3基因为靶标，通过基因组编辑技术，将温敏不育系改造成普通核不育材料，并通过互补载体恢复功能。
TMS5编码一个保守的RNA酶ZS1，tms5一个SNP的突变导致编码蛋白提前终止，使RNase ZS1功能丧失，从而造成温敏不育性状，该基因在水稻杂交育种中发挥着非常重要的作用，目前生产上广泛应用的温敏不育系都是由于TMS5基因天然突变创制的材料。本发明中四元互补载体上有TMS5完整表达元件，消除繁殖系的温敏不育性。
ZmAA1基因来源于玉米，编码一个α淀粉酶，在本发明中，利用花粉特异启动子PG47和信号肽序列，精准调控ZmAA1基因在水稻花粉表达，蛋白产物进入淀粉体影响花粉淀粉积累引起花粉败育，可防止转基因花粉逃逸。
红色荧光蛋白基因DsRed2在糊粉层特异启动子调控下，荧光蛋白在种子糊粉层累积，转基因种子带荧光，可通过色选机分选。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中的载体pCBSG质粒图谱。
图2为本发明其中一个实施例中育性调控基因突变序列的突变克隆测序结果。
图3为本发明其中一个实施例中pCAMBIA1300质粒图谱。
图4为本发明其中一个实施例中pJIT163质粒图谱。
图5为本发明其中一个实施例中三元互补载体3RA-M的连接结构示意图。
图6为本发明其中一个实施例中四元互补载体3RAT-M的连接结构示意图。
图7为本发明其中一个实施例中T0转基因水稻植株育性调控基因突变位点测序峰图。
图8为本发明其中一个实施例中繁殖系种子分型照片，其中，D、E、F中分别为A、B、C中的种子在荧光灯下的照片，A、D中包含两种类型，在荧光灯下可以发现有的种子有荧光，有的种子无荧光；B、E无荧光的种子为不育系种子，可以与恢复系配组生产杂交种；C、F有荧光的种子为繁殖系种子，可以自交繁殖不育系种子。
图9为本发明其中一个实施例中温敏不育系创制普通核不育系育性稳定性分析，其中：A，温敏不育系30度下表现不育；B，温敏不育系23.5度处理下育性部分恢复；C，以温敏不育系创制的繁殖系育性恢复；D，繁殖系分离的不育系表现为无花粉型不育；E，繁殖系分离的不育系23.5度低温处理育性稳定，表现为无花粉型不育。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明利用三联体密码子兼并性对育性基因靶位点序列进行定点同义突变，合成新的育性调控基因表达盒，并构建遗传互补载体；将遗传互补载体和基因编辑载体共转化水稻材料，通过T0代自交，在T1代即可获得稳定的繁殖系材料。新方法相对原来的创制流程有显著的优势，一是工程繁殖系创制流程简化，选育时间大大缩短，二是改变了以不育系幼穗诱导愈伤组织的方法，回归到以种子来诱导愈伤组织，突破了幼穗取材的时间限制，提高了实验的效率。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：实施例1：
育性调控基因CYP703A3基因编辑载体的构建
靶位点序列：GTT CAC CTT GCC TAT GGG TGC GG(PAM)(SEQ ID NO:3)
引物合成
Upper Primer:5’-TGGCGTTCACCTTGCCTATGGGTG-3’(SEQ ID NO:5)
Lower Primer:5’-AAACCACCCATAGGCAAGGTGAAC-3’(SEQ ID NO:6)
基因编辑载体构建：
退火和连接
将正向和反向引物溶于ddH2O至10μM，各取1μl加入8μl退火缓冲液(TE+50mMNaCl)中，用移液器混合。
在PCR仪上运行如下退火程序：95℃至16℃缓慢冷却，速度为0.1℃/s。
取1μl退火产物，与BsaI(NEB)消化的pCBSG载体进行10μl连接反应。pCBSG载体的质粒图谱如图1所示。
连接反应体系：
加入H2O至10μl，在25℃下连接2小时。
连接产物转化大肠杆菌，通过菌落PCR和测序验证载体pCBSG-03A3的连接。遗传互补载体的构建：
利用三联体密码子兼并性对育性调控基因CYP703A3进行定点同义突变，使序列GTTCACCTTGCCTATGGGTGCGG(SEQ ID NO:3)突变为GTGCATTTAGCTTACGGATGTGG(SEQ ID NO:4)，即对基因的编辑位点序列进行定点突变，形成基因CYP703A3-M，突变后的基因序列在靶位点序列发生了突变(如图2所示)，但是氨基酸编码没有变化。CYP703A3-M基因序列可以避开基因编辑载体的定点编辑，而编码的蛋白产物与野生型没有区别，可以保证基因的正常功能。合成突变后的CYP703A3-M基因序列通过常规酶切和同源重组方法构建三元遗传互补载体和四元遗传互补载体。
对靶位点序列进行定点突变：
GTT CAC CTT GCC TAT GGG TGC GG(PAM)(SEQ ID NO:3)
GTG CAT TTA GCT TAC GGA TGT GG(编码氨基酸没变)(SEQ ID NO:4)
构建三元互补载体，包含CYP703A3-M、花粉致死基因ZmAA1、红色荧光蛋白基因DsRed2。
载体构建流程：
1、DsRed2全长扩增(1860bp)
DsRed-F：GAATTCAACCGTCTCTTCGTGAGAATAACC(EcoRI)(SEQ ID NO:7)
DsRed-R：GGTACCCTTAAGAAACACACCTAGACTAGATTTG(KpnI)(SEQ ID NO:8)
通过PCR克隆到T载体上，测序后通过EcoRI和KpnI酶切连接到pCAMBIA1300(如图3示)上，获得载体pCAMBIA1300-DsRed。
已有的ZmAA1原始克隆载体为pUC57(由金斯瑞生物公司合成)上，基因本身5’端有一个SphI酶切位点，通过HindIII和SphI双酶切，把ZmAA1基因连接到载体pJIT163(如图4所示)上，即pJIT163-ZmAA1。
3、ZmAA1基因片段通过HindIII和XhoI部分酶切pJIT163-ZmAA1，HindIII和SalI酶切p1300-DsRed(XhoI和SalI为同尾酶)。回收ZmAA1片段连接到pCAMBIA1300-DsRed上，获得载体pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1。
4、以PUC57-CYP703A3-M质粒(由通用生物技术公司合成)为模板，利用引物：
03a3-inf-F:5-CCATGATTACgaattGGGATGGGTGTTTGACTCTG-3(SEQ ID NO:9)
03a3-inf-R:5-AGAGACGGTTgaattCCTGTGCTCACTCGGAAG-3(SEQ ID NO:10)
扩增CYP703A3-M基因全长序列，利用EcoRI单酶切载体pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1，使其线性化，利用同源重组方法，把育性基因CYP703A3-M全长插入载体中，获得三元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-M-DsRed-ZmAA1(3RA-M)，如图5所示。
构建四元互补载体，包含CYP703A3-M、花粉致死基因ZmAA1、红色荧光蛋白基因DsRed2、温敏不育基因TMS5四个表达盒。
载体构建流程：利用引物：
TMS5-HB-F：AGGTGTGTTTCTTAAGTGGTTCTACACTGCTACATC(SEQ ID NO:11)
TMS5-HB-R：CCGGGTACCCTTAAGACATTTGGACGACATAGAAG(SEQ ID NO:12)
扩增TMS5基因全长序列，利用Afl II单酶切三元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-M-DsRed-ZmAA1(3RA-M)，使其线性化，利用同源重组方法，把光温敏育性基因TMS5全长插入载体中，获得四元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-M-DsRed-TMS5-ZmAA1(3RAT-M)，如图6所示。
遗传转化：
利用常规可育水稻种子(II-32B)和两系不育系种子(爽1S)分别诱导愈伤组织。通过农杆菌介导用基因编辑载体pCBSG-03A3和三元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-M-DsRed-ZmAA1(3RA-M)共转化常规可育水稻种子诱导的愈伤组织，创制水稻工程繁殖系；基因编辑载体pCBSG-03A3和四元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-M-DsRed-TMS5-ZmAA1(3RAT-M)共转化两系不育系种子诱导的愈伤组织，创制水稻工程繁殖系。
各种水稻组织培养基配方
诱导培养基NB：
N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 0.1mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。
继代培养基J3：
MS大量盐分，10倍B5微量盐分，J3铁盐FeSO4·7H2O 41.8mg/L，Na2EDTA 55.9mg/L，DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。
共培养基NBM：
N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH5.6。
筛选培养基J3S：
继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L。
预分化培养基Y：
N6大量，CuSO4 3mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。
分化培养基D：
N6大量盐分，10倍B5微量盐分，D铁盐(FeSO4·7H2O)55.9mg/L，Na2EDTA 74.5mg/L，DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA 2mg/L，IAA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。
生根培养基R：
MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH6.0。
水稻种子消毒接种和愈伤组织诱导：
分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。
农杆菌侵染
划LB平板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50mL液体的共培养基(NBM+As0.1mM)中，调OD600＝0.5；从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。无菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天；3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。如图2所示。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S；结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。
T0转基因水稻植株分子鉴定
水稻DNA提取
取水稻幼嫩叶片，剪碎，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中；加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB缓冲液在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几下，20min后12000r/min，离心15min；小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；小心吸取上清液，加入0.7倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl去离子水(含RNase)中，于37℃处理15min，-20℃或者-70℃下保存备用。
通过PCR技术，利用红色荧光基因特异引物
Red-F:ATGGCCTCCTCCGAGAACGT(SEQ ID NO:13)
Red-R:CTACAGGAACAGGTGGTGGC(SEQ ID NO:14)
对获得的转基因再生植株进行分子鉴定，PCR扩增体系及程序如下：
ddH2O 35.5μl，总反应体积50μl。
反应程序：94℃预变性5min；PCR扩增：然后以94℃变性，40s；53℃退火，40s；72℃延伸，1min；共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR结果。
CYP703A3基因编辑位点分析：
通过PCR技术，利用CYP703A3基因靶位点特异引物
CYP703A3-3051-F：5’-TAACACAACGACACTCTCAG-3’(SEQ ID NO:15)
CYP703A3-3051-R：5’-AACTCCATTGCTTCACCAG-3’(SEQ ID NO:16)
扩增3051bp片段，送测序，根据测序结果分析突变情况，图7示部分样品测序结果。
T1转基因植株中基因编辑载体的分离和表型分析：
为了获得稳定的繁殖系，对T1代植株进行基因编辑载体和互补载体的鉴定，获得只含互补载体，不含基因编辑载体，靶基因CYP703A3突变纯合的植株，即是我们要的繁殖系。利用常规可育水稻或温敏不育系创制的繁殖系与野生型植株相比，基本农艺性状保持一致，收获的种子包含两种类型(如图8所示)，一种为不含荧光种子，植株不育，可用于杂交种生产；一种为有荧光种子，植株可育，可用于不育系种子的繁殖。利用温敏不育系创制的新型不育系，育性稳定，不受外界温度变化影响，即使在23.5℃低温处理下，不育系依然保持无花粉型不育(如图9所示)，而温敏不育系在低温处理后，育性出现波动，部分花粉恢复可育(如图9所示)。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 水稻工程繁殖系的快速创制方法及其应用
<130> 2021
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2210
<212> DNA
<213> 稻Oryza sativa L.
<400> 1
atggatcctt ttcttctttc catcatctta tgctcatgga tctttgttgt agtgtcctgg 60
aaaaagctca attgcatgag gcgaaggctt ccacctggac ctccaaggtg gccaatcttt 120
ggtaaccttc tccagttgag ccctcttccc cacaaagact tcgctcgatt ctgcaccaag 180
tatggccccc tggtctatct tcgtcttgga accatcgatg ccatcaccac tgatgaccct 240
gaagtcatcc gtgagatact catccggcaa gatgaggtat ttgcttcacg gcctcggacc 300
ttggccgctg ttcaccttgc ctatgggtgc ggtgatgtgg cccttgctcc gctggggccg 360
aactggaaga ggatgaggag ggtttgcatg gagcacttgc tgacaaccaa gcggcttgaa 420
tcttttgctg ctcaccgagc actggaggct gagcacctct gtcagtttgt gtgggctaaa 480
gcccagtcag ggaaacctgt gaatctcaga gaggttcttg gggccttctc gatgaacaac 540
gtgacaagga tgttgctagg gaaacagtac tttggtctgc agtcagcagg ccctggtgaa 600
gcaatggagt tcatgcacat cacccatgaa ctgttctggc tgctgggcct gatctatctt 660
ggggactact tgccagcctg gaggtggctt gatccatatg ggtgtgagaa gaagatgagg 720
gaggttgaga agaaggtgga cgacttccac cagaagatta ttgatgagca caggaaggct 780
agggaggcca agaagagtgc atcccttgat gatgataaca aagaagacat ggactttgtt 840
gatgtactgc tttctttgcc cggcgagaac ggaaaagagc acatggacga cgtcgagatc 900
aaagctttga tgcaggtatg tttactgttt ttgttattct agtctagttc taagttcatt 960
tgttttttaa ctaagccatc actgtgtttg ttgttatagt ctattcttga aattgaaatg 1020
atttgctagc tgccattatg tttgcaacaa atctagccac gttaatgtta tctcctttga 1080
gattcaacca atagatgact tggttctttt aaagaaaata ataaaaggga aggtaattaa 1140
agatctgttt tcacagcaga gtttttggtt cttctgttgt tatgagctat gtttgctttt 1200
cggattgaat ttatctgtta cttctggcaa accatgttat ttcatttcta gtgctacatg 1260
ttggaaccac agtgaagtga tggacagtac aaagtacaaa ctatcctttc ttgtcctgga 1320
gactacaaga aaattagaag taaagaaatg atagattttc tgaaagtaaa ctagaagaaa 1380
acatgttgaa caacctgtat tattcttcaa cattatgtgc atgctagcgc tactagtata 1440
caactgcatt tttcagtatc agaaatcttg cataagacat caaattagtc ataagcaatt 1500
ctgttctaag tagacaaaaa caaaactaat ccatgtacac aacacaggac atgattgctg 1560
ctgccaccga cacatcatcg gtgaccaacg agtgggtgat ggcggaggtg atcaagaacc 1620
cccgggtgct ccgcaagatc caggaggagc tcgacggcgt cgtcggccgc ggccgcatgg 1680
tggcggagtc ggacctcggc cagctgacct acctccggtg cgtcgtccgc gagtccttcc 1740
ggatgcaccc ggcggggcca ttcctgatcc cccacgagtc cctgaagccg acgacgatca 1800
tgggctacga catcccggcg cggacgagga tcttcatcaa cacccacgcg ctcggccgga 1860
acacccgcat ctgggacgac gtcgacgcgt tccggccgga gaggcacctg ccggcatcgg 1920
cggacggcgg ccgggtggag atcagccacc tgccggactt caagatcctc cccttcagcg 1980
ccggcaagcg caagtgcccc ggcgcgccgc tcggcgtcat cctggtgctc atggcgctcg 2040
ccaggctctt ccactgcttc gactggtcgc cgccggacgg cctccgcccc gacgacatcg 2100
acacccagga ggtgtacggc atgaccatgc ccaaggccaa gccgctcgtc gccgtcgcca 2160
cgccgcgcct gccgccgcag atgtacggtc gccatggcaa gcaagtttga 2210
<210> 2
<211> 4434
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 育性调控基因突变序列表达盒序列
<400> 2
gggatgggtg tttgactctg ccgttcacac ttctttggta tcgatgtatg caaaatgtgg 60
aaggttggct gaggcttatc atgttttctc aagcattagc aacccaagcc ttattgctat 120
taattctatg attacagcat ttgtgcaaca tggtttcgtt gaagatgcgc tgaaactatt 180
taccaaaatg caaaatgctg gatacaagcc taatcatgtt acatttttag gaattctgac 240
tggttgcgca cgtgctggtt ttgttcaaca aggttacaac tactttgaat caatgagacc 300
agtttatggt gtagagccaa accctgagca ctacacatgt atggttgatc ttttaggtcg 360
tgcaggcctc cttgctgaag cactggaaat gattaactca atgccccaga atgatcattc 420
tgatgcatgg gcagctttgc tcagtgctag tagtctccat tctaatctcg cttttgcaaa 480
aatagcagca cagaagcttc ttgagaagga tccttacgat gcaacggctt acacagtcct 540
gtcaaggatg ttctcctcag cagggatgga ggatgaagaa atgctaaaag ttgtacagct 600
atccaacttg gccagtaaga ggcctggtta tagccttatt atgcaggata aggccactga 660
aatataacac atactgagaa ccttctagtt gactagttct agatctctga ccgatgaaaa 720
caagaatgat catgttacat ggcactgcta aatgagaatt aggatggcat aaaaaagata 780
tcacatgact tgtacataat gcctaaaatg tggatatctg accaggtgct tggtgatatg 840
ctgttggccc agaactcgag atccattttt ctggcaggtc cttatttctt ataggattaa 900
gtttgtccat tttgatgcag ctgagttttc acccttaact atgaaatcat ctaacttgca 960
ctcttcaact accaaaatgg gcacaaataa ctccttttca ccacaaaaaa atgtcttatt 1020
tggccagaat aacactggtg gttttaaggg taggggttac actgattttg atagttaaag 1080
ggtgaacaat agatcctttc ttttctgagg gtaacaatta gatagtattg tagttcatga 1140
atttacagta tttgttattt aagacctgtc ataatcttta tattgattcc atcttctttt 1200
taaagtttag acagtaaatg gaagattgat acacggaatt catctgctac aggaaagcat 1260
tgaagaatag ttgtattgtt ggttgctgtt tgcttaaatt caagaacatt tatgcaggag 1320
attgtcttcc gatcatcaat tgatgaagaa gccagttcat gagtcatgtc tgcatgttat 1380
ttgtggtaga tgaagtagga gatgtattct aaatagctac catcaagata cagtcatgtt 1440
gacaggaaaa ggcagagcac caatcgtcaa tagtataatc ttgctcctga atgtcatcta 1500
tgcgttactt acagaaatgt gcaaaaaatg aattgcactg agcacattgc tgaataacag 1560
tatggaagag aacttttttt tgggtgagca catctgaaga gactttcttt tatattcatt 1620
ccctcttctt tttccttggc attttcagtg ctctgcatca caccatctgt catgtcaaga 1680
tcatgacgtt tattatatga tgttagttga gatgttgaac aatatagatc agcacaagaa 1740
tcatgaccag tctaattctg taaccaattc gcttcaactt tagtcacttg atttgcttta 1800
tcatagagct tgatgagatc ccataaatag gactataatt gccatctgtt tctgtaccat 1860
ggatcctttt cttctttcca tcatcttatg ctcatggatc tttgttgtag tgtcctggaa 1920
aaagctcaat tgcatgaggc gaaggcttcc acctggacct ccaaggtggc caatctttgg 1980
taaccttctc cagttgagcc ctcttcccca caaagacttc gctcgattct gcaccaagta 2040
tggccccctg gtctatcttc gtcttggaac catcgatgcc atcaccactg atgaccctga 2100
agtcatccgt gagatactca tccggcaaga tgaggtattt gcttcacggc ctcggacctt 2160
ggccgctgtg catttagctt acggatgtgg tgatgtggcc cttgctccgc tggggccgaa 2220
ctggaagagg atgaggaggg tttgcatgga gcacttgctg acaaccaagc ggcttgaatc 2280
ttttgctgct caccgagcac tggaggctga gcacctctgt cagtttgtgt gggctaaagc 2340
ccagtcaggg aaacctgtga atctcagaga ggttcttggg gccttctcga tgaacaacgt 2400
gacaaggatg ttgctaggga aacagtactt tggtctgcag tcagcaggcc ctggtgaagc 2460
aatggagttc atgcacatca cccatgaact gttctggctg ctgggcctga tctatcttgg 2520
ggactacttg ccagcctgga ggtggcttga tccatatggg tgtgagaaga agatgaggga 2580
ggttgagaag aaggtggacg acttccacca gaagattatt gatgagcaca ggaaggctag 2640
ggaggccaag aagagtgcat cccttgatga tgataacaaa gaagacatgg actttgttga 2700
tgtactgctt tctttgcccg gcgagaacgg aaaagagcac atggacgacg tcgagatcaa 2760
agctttgatg caggtatgtt tactgttttt gttattctag tctagttcta agttcatttg 2820
ttttttaact aagccatcac tgtgtttgtt gttatagtct attcttgaaa ttgaaatgat 2880
ttgctagctg ccattatgtt tgcaacaaat ctagccacgt taatgttatc tcctttgaga 2940
ttcaaccaat agatgacttg gttcttttaa agaaaataat aaaagggaag gtaattaaag 3000
atctgttttc acagcagagt ttttggttct tctgttgtta tgagctatgt ttgcttttcg 3060
gattgaattt atctgttact tctggcaaac catgttattt catttctagt gctacatgtt 3120
ggaaccacag tgaagtgatg gacagtacaa agtacaaact atcctttctt gtcctggaga 3180
ctacaagaaa attagaagta aagaaatgat agattttctg aaagtaaact agaagaaaac 3240
atgttgaaca acctgtatta ttcttcaaca ttatgtgcat gctagcgcta ctagtataca 3300
actgcatttt tcagtatcag aaatcttgca taagacatca aattagtcat aagcaattct 3360
gttctaagta gacaaaaaca aaactaatcc atgtacacaa cacaggacat gattgctgct 3420
gccaccgaca catcatcggt gaccaacgag tgggtgatgg cggaggtgat caagaacccc 3480
cgggtgctcc gcaagatcca ggaggagctc gacggcgtcg tcggccgcgg ccgcatggtg 3540
gcggagtcgg acctcggcca gctgacctac ctccggtgcg tcgtccgcga gtccttccgg 3600
atgcacccgg cggggccatt cctgatcccc cacgagtccc tgaagccgac gacgatcatg 3660
ggctacgaca tcccggcgcg gacgaggatc ttcatcaaca cccacgcgct cggccggaac 3720
acccgcatct gggacgacgt cgacgcgttc cggccggaga ggcacctgcc ggcatcggcg 3780
gacggcggcc gggtggagat cagccacctg ccggacttca agatcctccc cttcagcgcc 3840
ggcaagcgca agtgccccgg cgcgccgctc ggcgtcatcc tggtgctcat ggcgctcgcc 3900
aggctcttcc actgcttcga ctggtcgccg ccggacggcc tccgccccga cgacatcgac 3960
acccaggagg tgtacggcat gaccatgccc aaggccaagc cgctcgtcgc cgtcgccacg 4020
ccgcgcctgc cgccgcagat gtacggtcgc catggcaagc aagtttgagc taggcgtcgt 4080
gtggacaata atgcagacag gagaagccga tcgagctatg cagcttaacg taattaagag 4140
tgaattaatt ctacatgtat ctatcaaatc aatcacacat gtagacagtg acgatgaatg 4200
caagtgctga tgaatcaaag aaattaagca tcagctgatg aatctcactt tcttgctgaa 4260
ttccattcat ttcgttcaca cagtaggttc tttgagacta gatatcttct agtacgtgca 4320
aataatacgc atcgtgtact tcaaggttgt gataaatata tttcgtagca gaagctactt 4380
agctcgatag aattgatgat actagctata acttccgagt gagcacagga aaca 4434
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 稻Oryza sativa L.
<400> 3
gttcaccttg cctatgggtg cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 育性调控基因靶位点序列的同义突变序列
<400> 4
gtgcatttag cttacggatg tgg 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 打靶载体构建上游引物
<400> 5
tggcgttcac cttgcctatg ggtg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 打靶载体构建下游引物
<400> 6
aaaccaccca taggcaaggt gaac 24
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 红色荧光蛋白基因DsRed扩增上游引物
<400> 7
gaattcaacc gtctcttcgt gagaataacc 30
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 红色荧光蛋白基因DsRed2扩增下游引物
<400> 8
ggtaccctta agaaacacac ctagactaga tttg 34
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP703A3-M基因全长序列扩增上游引物
<400> 9
ccatgattac gaattgggat gggtgtttga ctctg 35
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP703A3-M基因全长序列扩增下游引物
<400> 10
agagacggtt gaattcctgt gctcactcgg aag 33
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMS5基因全长序列扩增上游引物
<400> 11
aggtgtgttt cttaagtggt tctacactgc tacatc 36
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMS5基因全长序列扩增下游引物
<400> 12
ccgggtaccc ttaagacatt tggacgacat agaag 35
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 红色荧光基因扩增特异上游引物
<400> 13
atggcctcct ccgagaacgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 红色荧光基因扩增特异下游引物
<400> 14
ctacaggaac aggtggtggc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用CYP703A3基因靶位点特异上游引物
<400> 15
taacacaacg acactctcag 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP703A3基因靶位点特异下游引物
<400> 16
aactccattg cttcaccag 19
<210> 17
<211> 1850
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 红色荧光蛋白基因表达盒序列，包括LTP2启动子和pinII终止子
<400> 17
aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc taaaaataag ccgatgagga taaataaaat 60
gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact catcaagagg atgcttttcc gatgagctct 120
agtagtacat cggacctcac atacctccat tgtggtgaaa tattttgtgc tcatttagtg 180
atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg ttttgacatt tcagttttgc cactcttagg 240
ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa aagcaaaaca attttatttt acttttacca 300
ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc cactctagaa attctgttta tgccacagaa 360
tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc caaggtgttc atggcatgga aatgtgacat 420
aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg tactcctcgt aacaagagac ggaaacatca 480
tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat cacctttgga tgatgcgcat gaatggagtc 540
gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca ctgagtccgg gcggcaacta ccatcggcga 600
acgacccagc tgacctatac cgaccggact tgaatgcgct accttcgtca gcgacgatgg 660
ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg catggcggca catggcgagc tcagaccgtg 720
cgtggcttgc tacaaatacg taccccgtga gtgccctagc tagaaactta cacctgcaac 780
tgcgagagcg agcgtgtgag tgtagccgag tagatccacc ggtcgccacc atggcctcct 840
ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc accgtgaacg 900
gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc cacaacaccg 960
tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccccc 1020
agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacaaga 1080
agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg 1140
tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac aaggtgaagt 1200
tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc atgggctggg 1260
aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag acccacaagg 1320
ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc tacatggcca 1380
agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac atcacctccc 1440
acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc caccacctgt 1500
tcctgtagcg gcccatggat attcgaacgc gtagacttgt ccatcttctg gattggccaa 1560
cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga catgctaatc actataatgt 1620
gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt actagttatc tgaataaaag agaaagagat 1680
catccatatt tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag 1740
atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta atcatatata attaatatca 1800
attgggttag caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc gaatgcggcc 1850
<210> 18
<211> 3814
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 温敏不育调控基因表达盒序列
<400> 18
tggttctaca ctgctacatc ttcgccaaca tgtcgacgga caacaccaac actcgcactg 60
gcactggaaa gcctcaacta gtacatgagc gttctcagga tatatgtcca ttcccttacc 120
gttaattatg ctgctagaag atttttctgt taatgcttat cgcaatgtta caattgcgct 180
actatgtgaa tgttatactt attttatgaa aagcatgctc atgctgagca ccatcactag 240
atcaattctc attacaaatg tcatgtttat tatcttgttg gtggacctgc agccaatttt 300
gggtcaagaa gagaacgagg tagcggagag gtttgaggtg atgttgtgtg gtggagaaat 360
gcgtgagatg aggattgtgt ccgatatttc acttcgcacc ggatgctcga tctgaagcat 420
ttttggattt gtgattctat tttgaacatt tgtgttgtgg tactgaaatt tccgagattt 480
cagaaaaact ttttaaaata atttgaacta attttagcca aatctaaaca aatttggacc 540
aaattcaaaa aaagagaaaa aatttgaaaa ttatgacgaa atattttggt gtccggtgag 600
ggtccgaaat ttcgggaatt ccgaacgaaa attataaaca ttgtgcatgg gagtataatt 660
acggggatgg gaatttatcc tcatgactcc ctgcctttca atacgctggg ggaattggga 720
ggaaattcat cttcacttaa aatctaattt ccttctatac tacgtaagac tatcggattg 780
aatccaataa acttctaaac tgcctaagat atctgtccaa aattagagat aaattagcaa 840
caccatacca aaccaaccaa aatgacaaat taattctcag tccaaaatta catgcatgga 900
cagtgcagca acaaccggca tccatgaatc cataaaccga gagtggccaa acagctgcta 960
cttcacctgc actgcaactt cttgcgaatc cttaaccctc tgaatctgat aggttgtcaa 1020
gataatcttg catttgtggc tttgacacga cgacgatgac gaacaccgcc tgattctgat 1080
ggagcagaag ctgccatttc ccgatgggca cagcaagcta ttcgaccgag gtatctctac 1140
cttcgatgcc gatgcaacct catgcaccgg caacaagcta gtcgtcggtg ccgaggagaa 1200
gcccttctca atgttgatat tattccaata tacacttata atcgataata ttataagcta 1260
atatattgac gtgcaattct tttacgcgtt cgcgaaaaac cggtaatgtt gtaaggaaat 1320
gcccccaaaa gctcccacgt gttcaccctt ccaacctctt acaggctaga tgttgaagaa 1380
gcatcctggg ccgttggata tcaatccaac ggctagcagt agtcgaccga gtagacattg 1440
acttgggccg tgcccggccc ggcccatcgt gcttcgtgcc aaaacgggcc gtgccgaacc 1500
aaccccccac cacggcggcg gcggcgccat ggcgaacagc ggcaagtcat cgccggcggc 1560
gacctccacc accgcgccgc caccgggtcg gccgaaggcg aaggcgccgc ccctcaccgt 1620
cgagggctac cccgtggagg gcatctccat cggcgggcag gagacctgcg tcatcttccc 1680
gacgctgagc gccgccttcg acatcggccg gtgcccgcag cgcgccgtct cgcaggagtt 1740
cctcttcatc tcccacgccc acctcgacca catcggcggc ctccccatgt acgtcgccac 1800
ccggggcctc taccggcagc gcccgcccac catcttcatc cccgcctgcc tcagggaccc 1860
cgtggagcgc ctcttcgagc tccaccgctc catggaccag tccgagctca gccacaacct 1920
cgtccccctc gagattggtc aggagcacga gctcaggagg gacctcaagg tgaaggcctt 1980
caagacctac cacgccattc ccagccaggt gaagggttca tcagttcttg gttgttctgg 2040
atgaattatt cttgattgat tgatttggtc ggaaatgtgt ggtgaatttg gttgagatgt 2100
gatgtgattg taggggtatg tgatatacac ggtgaagcaa aagctcaagc cagagtatct 2160
tggcctccct gggagcgaga tcaagcagct gaagctgtca ggtgtggagg tctgttgttg 2220
ttgttttttt ttttttttga tattgtggat gtctggatga aatggaatac aattcacaat 2280
ttagtgatgt tgttgatgct gtgcgtggtt ctgtttttca gattacgaat acattgacgg 2340
tgcctgagat tgcttttacc ggagatacga tggcagattt cattcttgat cctgataatg 2400
cggatgtttt gaaggcgaaa attcttgtag tggaggtatt gcttcttatc gtctatatgg 2460
ttaatttgtt gtcaattgtc attgttgcta ttcagcctga gaaaaaaaaa agagggaaac 2520
tgtttcttca agcacggata tcagtatatt accaagatta attttatcaa cagaaggaaa 2580
agcaacagcc tttgcttttc aggagagatt gattccaact ccatattaac tgataactga 2640
gtaccatttt ttcaaactaa aacctttgca gaaccaattg gcagcaatta gtgggaacta 2700
tgttgcctga agcatgtttc agtttccata ctgaatattt attgtccttc tcctgacgaa 2760
attttaatta tctccaaatt taacttagtg aactgtgttc tggaaattgc agagtacttt 2820
tgttgatgac tctgttacaa ttgagcatgc aagagaatat gggcacaccc atctgtttga 2880
ggttattccc aaattttgct tatttcatat ttctgtggaa gaaaaacatt tcacctagca 2940
ttgctaattt tgcccattat ctttttttta tgtatgcaga tactgaatca gtgtgacaaa 3000
cttgaaaaca aagctattct gctaatccac ttttctgctc gttataccgc agaggtgagc 3060
tatctctgtt gtaatccaat tttacttata tcattttatc ctgattcaat tagtaatctg 3120
tatgctttgt ttcaactctg tggatttatt ttttgtttca agcaagtttc accaatattg 3180
ttatttttta atgccatcat tatgagcagg caaaatgtgc ccacttttct tgtagcatcc 3240
tcctttcctc ttaaaagtac acatgtttgt gtttcattct ttacaaataa atacatttat 3300
cttcaatttt tttctcacca tcattaaaca tttcatcaca tccttttcag gaaattgata 3360
tagcaatcaa taagttgcca ccctctttca gaagtagagt tcatgcattg aaggaaggtt 3420
tctgacaaag atgaagtgat caatcagaaa tgaagcattc aaccttactc tcgatgcact 3480
catgtaccaa gaactctttt ttttttttgg gggggggggg gggggggggg atcgaatcct 3540
taactcttga gtcctgaaac atttctgtag caccccttca cacaccgaac attaacaata 3600
ttttacattt ttttggtcat tggtgatcgc aaagagcaat cgttacatcc atgctgtatt 3660
acattataca tagagatagt acatgttgtg gataatccct ggcccctctt gaaaatacga 3720
acataccaaa attcactcaa tttcaagaca aaattgacag gaaatttaac ctggctaccc 3780
ttccatttgt cacccttcta tgtcgtccaa atgt 3814
<210> 19
<211> 4680
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 花粉致死基因表达盒序列
<400> 19
agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatctgcacc ggacactgtc tggtggcata 60
ccagacagtc cggtgtgcca gatcagggca cccttcggtt cctttgctcc tttgcttttg 120
aaccctaact ttgatcgttt attggtttgt gttgaacctt tatgcacctg tggaatatat 180
aatctagaac aaactagtta gtccaatcat ttgtgttggg cattcaacca ccaaaattat 240
ttataggaaa aggttaaacc ttatttccct ttcaatctcc ccctttttgg tgattgatgc 300
caacacaaac caaagaaaat atataagtgc agaattgaac tagtttgcat aaggtaagtg 360
cataggttac ttagaattaa atcaatttat acttttactt gatatgcatg gttgctttct 420
tttattttaa cattttggac cacatttgca ccacttgttt tgttttttgc aaatcttttt 480
ggaaattctt tttcaaagtc ttttgcaaat agtcaaaggt atatgaataa gattgtaaga 540
agcattttca agatttgaaa tttctccccc tgtttcaaat gcttttcctt tgactaaaca 600
aaactccccc tgaataaaat tctcctctta gctttcaaga gggttttaaa tagatatcaa 660
ttggaaatat atttagatgc taattttgaa aatataccaa ttgaaaatca acataccaat 720
ttgaaattaa acataccaat ttaaaaaatt tcaaaaagtg gtggtgcggt ccttttgctt 780
tgggcttaat atttctcccc ctttggcatt aatcgccaaa aacggagact ttgtgagcca 840
tttatacttt ctccccattg gtaaatgaaa tatgagtgaa agattatacc aaatttggac 900
agtgatgcgg agtgacggcg aaggataaac gataccgtta gagtggagtg gaagccttgt 960
cttcgccgaa gactccattt ccctttcaat ctacgactta gcatagaaat acacttgaaa 1020
acacattagt cgtagccacg aaagagatat gatcaaaggt atacaaatga gctatgtgtg 1080
taatgtttca atcaaagttt cgagaatcaa gaatatttag ctcattccta agtttgctaa 1140
aggttttatc atataatggt ttggtaaaga tatcgactaa ttgttctttg gtgctaacat 1200
aagcaatctc gatatcaccc ctttgttggt gatccctcaa aaagtgatac cgaatgtcta 1260
tgtgcttagt gcggctgtgt tcaacgggat tatccgccat gcagatagca ctctcattgt 1320
cacataggag agggactttg ctcaatttgt agccatagtc cctaaggttt tgcctcatcc 1380
aaagtaattg cacacaacaa tgtcctgcgg caatatactt ggcttcggcg gtagaaagag 1440
ctattgagtt ttgtttcttt gaagtccaag acaccaggga tctccctaga aactgacaag 1500
tccctgatgt gctcttccta tcaattttac accctgccca atcggcatct gaatatccta 1560
ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat 1620
atctcatgat tcttttcacg gccctaaggt gaacttcctt aggatcggct tggaatcttg 1680
cacacatgca tatagaaagc atactatctg gtcgagatgc acataaatag agtaaagatc 1740
ctatcatcga ccggtatacc ttttggtcta cggatttacc tcccgtgtcg aggtcgagat 1800
gcccattagt tcccatgggt gtcctgatgg gcttggcatc cttcattcca aacttgttga 1860
gtatgtcttg aatgtacttt gtttggctga tgaaggtgcc atcttggagt tgcttgactt 1920
gaaatcctag aaaatatttc aacttcccca tcatagacat ctcgaatttc ggaatcatga 1980
tcctactaaa ctcttcacaa gtagatttgt tagtagaccc aaatataata tcatcaacat 2040
aaatttggca tacaaacaaa acttttgaaa tggttttagt aaagagagta ggatcggctt 2100
tactgactct gaagccatta gtgataagaa aatctcttag gcattcatac catgctgttg 2160
gggcttgctt gagcccataa agcgcctttg agagtttata aacatggtta gggtactcac 2220
tatcttcaaa gccgagaggt tgctcaacat agacctattc accccatttg atcacttttt 2280
tggtccttca ggatctaata gttatgtata atttagagtc tcttgtttaa tggccagata 2340
tttctaatta atctaagaat ttatgatatt ttttaatttt ttatcatgtc tgatgagaat 2400
taacataaag gctcaattgg gtcctgaatt aataatagag tgaaaattaa tccagaggct 2460
ctattagaac cttcaattag taataccaag atatatataa gatagtagag tatagtttaa 2520
atgttggcat tgttcattct ttcttttgtt atttaattta tgctttccac ggtggttagt 2580
ggttacttct gaagggtcca aataatgcat gaagagtttg aggacaagaa gtctgcccta 2640
aaaatagcga tgcaaaggca tggtgtccaa gccatacata tagcgcacta attttatcag 2700
cagaacaatg gtatttatag gtcctagtgc ccaggcaaca agagacacga ataaagcatc 2760
gatcacgaca catggcggcg acaatggcag tgacgacgat ggtgacgagg agcaaggaga 2820
gctggtcgtc attgcaggtc ccggcggtgg cattcccttg gaagccacga ggtggcaaga 2880
ccggcggcct cgagttccct cgccgggcga tgttcgccag cgtcggcctc aacgtgtgcc 2940
cgggcgtccc ggcggggcgc gacccgcggg agcccgatcc caaggtcgtc cgggcggcct 3000
gcggcctggt ccaggcacaa gtcctcttcc aggggtttaa ctgggagtcg tgcaagcagc 3060
agggaggctg gtacaacagg ctcaaggccc aggtcgacga catcgccaag gccggcgtca 3120
cgcacgtctg gctgcctcca ccctcgcact ccgtctcgcc acaaggctac atgccaggcc 3180
gcctatacga cctggacgcg tccaagtacg gcacggcggc ggagctcaag tccctgatag 3240
cggcgttcca cggcaggggc gtgcagtgcg tggcggacat cgtcatcaac caccggtgcg 3300
cggaaaagaa ggacgcgcgc ggcgtgtact gcatcttcga gggcgggact cccgacgacc 3360
gcttggactg gggccccggg atgatctgca gcgacgacac gcagtactcg gacgggacgg 3420
ggcaccgcga cacgggcgag gggttcgcgg cggcgcccga catcgaccac ctcaacccgc 3480
gcgtgcagcg ggagctctcc gcctggctca actggctcag gtccgacgcc gtggggttcg 3540
acggctggcg cctcgacttc gccaagggct actcgccggc cgtcgccaga atgtacgtgg 3600
agagcacggg gccgccgagc ttcgtcgtcg cggagatatg gaactcgctg agctacagcg 3660
gggacggcaa gccggcgccc aaccaggacc agtgccggca ggagctgctg gactggacgc 3720
gggccgtcgg cgggcccgcc atggcgttcg acttccccac caagggcctg ctgcaggcgg 3780
gcgtgcaggg ggagctgtgg cggctgcgcg acagctccgg caacgcggcc ggcctgatcg 3840
ggtgggcgcc cgagaaggcc gtcaccttcg tcgacaacca tgacaccggg tcgacgcaga 3900
agctctggcc gttcccatcc gacaaggtca tgcagggcta cgcctacatc ctcacccatc 3960
caggagtccc ctgcattttc tacgaccaca tgttcgactg gaacctgaag caggagatat 4020
ccacgctgtc tgccatcagg gcgcggaacg gcatccgcgc cgggagcaag ctgcggatcc 4080
tcgtggcgga cgcggacgcg tacgtggccg tcgtcgacga gaaggtcatg gtgaagatcg 4140
ggacaaggta cggcgtgagc agcgtggtcc cgtcggattt ccacccggcg gcgcacggca 4200
aggactactg cgtctgggag aaagcgagcc tccgcgtccc ggcggggcgc cacctctagc 4260
agctcagatt gctcagtctt gtgctgcatt gcaaacacag cagcacgaca ctgcataacg 4320
tcttttcctt gagatctgac aaagcagcat tagtccgttg atcggtggaa gaccactcgt 4380
cagtgttgag ttgaatgttt gatcaataaa atacggcaat gctgtaaggg ttgtttttta 4440
tgccattgat aatacactgt actgttcagt tgttgaactc tatttcttag ccatgccaag 4500
tgcttttctt attttgaata acattacagc aaaaagttga aagacaaaaa aaaaaacccc 4560
cgaacagagt gctttgggtc ccaagctact ttagactgtg ttcggcgttc cccctaaatt 4620
tctcccccta tatctcactc acttgtcaca tcagcgttct ctttccccta tatctccacg 4680

Claims (4)

1.水稻工程繁殖系的快速创制方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将常规可育水稻种子或两系不育系种子诱导愈伤组织；
步骤二、通过农杆菌介导的方法，将负载野生型育性调控基因靶位点序列的基因编辑载体和负载有育性调控基因突变序列的互补载体共转化所述愈伤组织，并将共转化成功的愈伤组织继续培养至收获T1代种子，所述野生型育性调控基因为细胞色素P450羟化酶基因CYP703A3，其为如SEQ ID NO: 1所示的碱基序列，所述育性调控基因突变序列的表达盒为如SEQ ID NO: 2所示的碱基序列，
其中，所述育性调控基因突变序列为利用三联体密码子兼并性对野生型育性调控基因进行定点同义突变的碱基序列、且其不被所述野生型育性调控基因靶位点序列的基因编辑载体定点编辑；
步骤三、将T1代种子种下并对T1代植株鉴定，将野生型育性调控基因定点编辑成功且互补载体转化成功的植株作为水稻工程繁殖系；
当采用常规可育水稻种子诱导愈伤组织时，所述互补载体上还负载有花粉致死基因和外源报告基因，
当采用两系不育系种子诱导愈伤组织时，所述互补载体上还负载有花粉致死基因、外源报告基因和温敏不育基因，
所述花粉致死基因为ZmAA1基因，所述外源报告基因为红色荧光蛋白标记基因，所述红色荧光蛋白标记基因的表达盒为如SEQ ID NO: 17所示的碱基序列，所述花粉致死基因的表达盒为如SEQ ID NO: 19所示的碱基序列，
所述温敏不育基因为TMS5基因，所述温敏不育基因的表达盒为如SEQ ID NO: 18所示的碱基序列。
2.如权利要求1所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法，其特征在于，所述野生型育性调控基因靶位点序列的基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：
基于CRISPR/Cas9系统，以SEQ ID NO:3所示的碱基序列作为靶位点序列，设计出如SEQID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的一对引物对，
并将如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的一对引物对连接至所述基因编辑载体上，所述基因编辑载体负载有CRISPR/Cas9系统构件，所述一对引物对连接至所述CRISPR/Cas9系统的上游。
3.如权利要求2所述的水稻工程繁殖系的快速创制方法，其特征在于，所述基因编辑载体为pCBSG打靶载体，所述CRISPR/Cas9系统构件包括gRNA骨架元件和Cas9元件，
将如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6所示的一对引物对经如下退火程序处理：95°C至16°C缓慢冷却，速度为0.1°C/s，
之后取退火产物与BsaI消化的pCBSG打靶载体进行连接反应，连接至pCBSG载体上OsU6启动子元件与gRNA骨架元件之间。
4.水稻工程繁殖系在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻工程繁殖系由如权利要求1至3任一所述的方法获得。
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