CN112813076B - 敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物及其在创制棉花无短绒突变体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物及其在创制棉花无短绒突变体中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明针对8个GhTSTs基因的保守区段设计的3条基因编辑用sgRNA，构建二套CRISPR‑Cas9载体，进行农杆菌介导的遗传转化，获得棉花无短绒突变体。因此，本发明提供了GhTSTs基因在创制棉无短绒突变体中的应用。同时本发明还提供了敲除GhTSTs基因的载体在创制棉花无短绒突变体中的应用。本发明确定了GhTSTs基因为创制棉花无短绒性状的靶点基因，并成功创建棉花无短绒突变体，为后续研究短绒发生和无短绒相关育种及筛选提供材料基础。

Description

敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物及其在创制棉花无短绒 突变体中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物及其在创制棉花无短绒突变体中的应用。
背景技术
棉花(Anemone vitifolia Buch)是重要的经济作物，在世界及我国国民经济中占有重要地位。棉纤维是纺织工业生产棉质产品不可缺少的原料，棉纺品涉及人们生活 的各个方面，包括衣着用棉纺品、装饰用棉纺品、工业用棉纺品等。在棉花产量中， 纤维约占40％，其余为棉籽。
棉纤维使用最为广泛的纤维材料。棉纤维是由受精胚珠的表皮细胞经伸长、加厚而成的种子纤维，可以分为长绒和短绒。它的主要组成物质是纤维素(cellulose)， 纤维素是大分子多糖组成。植物通过光合作用合成葡糖糖并进行有效分配，植物中含 有数量众多，功能丰富的糖转运子，分别为单糖转运子家族、蔗糖转运子家族和 SWEET转运子家族。在拟南芥中有53个单糖转运子及类似蛋白，分为7个小家族， 主要参与己糖、戊糖、四碳糖及多元醇在细胞内的转运；其中液泡糖转运子(TST) 家族含有3个成员。棉花中共有10个TST家族基因，但并没有利用对糖的调节来实 现无短绒突变体的研究。
目前，利用棉花无绒或短绒突变体，分离和筛选与棉花纤维发育相关的重要基因，从而揭示棉花纤维发育的分子机理。而棉花无绒或短绒突变体的获得一般通过育种筛 选获得，但该方法工作量大、耗时长，目标性不强。虽然转基因技术作为棉花遗传改 良快速有效的方法，目前，从棉花中已鉴定出了很多控制长纤维发育的关键基因，同 时还发现了控制棉纤维细胞伸长的激素调控途径，但是，对控制棉花无短绒性状的相 关基因报道很少，因此，开发一种与棉花无短绒性状相关的功能基因对创建棉花无短 绒突变体具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种GhTSTs基因在创制棉花无短绒突变体中的应用。
本发明提供了GhTSTs基因在创制棉花无短绒突变体中的应用。
优选的，所述GhTSTs基因为以下序列：
Gh_D13G0564、Gh_A13G0568、Gh_A04G1428、Gh_D04G1487、Gh_A01G0820、 Gh_D01G0848的DNA序列。
优选的，所述GhTSTs基因还包括以下序列：Gh_D02G1974和Gh_A03G1506。
本发明提供了一种用于敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物，所述sgRNA组 合物包括sgRNA1和以下sgRNA中的一种；sgRNA2和sgRNA3；
所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明提供了一种用于敲除棉花GhTSTs基因的重组载体，所述重组载体包括pRGEB32-GhTST12或pRGEB32-GhTST13；
所述pRGEB32-GhTST12为在骨架载体pRGEB32-7中插入所述sgRNA组合物的sgRNA1和sgRNA2；
所述pRGEB32-GhTST13为在骨架载体pRGEB32-7中插入所述sgRNA组合物的sgRNA1和sgRNA3。
本发明提供了一种敲除GhTSTs基因的试剂在创制棉花无短绒突变体中的应用。
优选的，所述敲除GhTSTs基因的试剂为所述sgRNA组合物或所述重组载体。
本发明提供了一种创建棉花无短绒突变体的方法，包括以下步骤：
1)构建含所述sgRNA组合物的重组载体；
2)将所述重组载体用农杆菌介导转入棉花中，得到转基因棉花；
3)将所述转基因棉花进行阳性检测，得到棉花无短绒突变体。
优选的，构建含所述sgRNA组合物的重组载体的方法包括构建 pRGEB32-GhTST12重组载体的方法或构建pRGEB32-GhTST13重组载体的方法；
所述构建pRGEB32-GhTST12重组载体的方法，包括以下步骤：
A.以pGTR4质粒为模板，分别采用pGREB32-7F/TSTs-1a引物对或 TSTs-1s/TSTs-2a引物对进行PCR扩增，得到两条PCR扩增产物；
B.以两条PCR扩增产物为模板，用infpRGEB32-7F/InfTSTs-2a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含2个gRNA的片段；
C.将所述含2个gRNA的片段与经BSAⅠ切得到的pRGEB32-7线性质粒连接， 得到pRGEB32-GhTST12；
所述构建pRGEB32-GhTST13重组载体的方法，包括以下步骤：
①以pGTR4质粒为模板，分别采用pGREB32-7F/TSTs-1a引物对或 TSTs-1s/TSTs-3a引物对进行PCR扩增，得到两条PCR扩增产物；
②以两条PCR扩增产物为模板，用infpRGEB32-7F/InfTSTs-3a引物对进行重叠 延伸PCR扩增，得到含2个gRNA的片段；
③将所述含2个gRNA的片段与经BSAⅠ切得到的pRGEB32-7线性质粒连接， 得到pRGEB32-GhTST13。
优选的，所述TSTs-1a的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述TSTs-1s的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述TSTs-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述infpRGEB32-7F的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述InfTSTs-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述TSTs-3a的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述InfTSTs-3a的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
所述pGREB32-7F的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
优选的，所述阳性检测的方法分别采用U6-7S/InfTMTs-2a引物对和 U6-7S/InfTSTs-3a引物对对转基因植物进行PCR扩增，得到目标扩增产物的转基因植 物为插入T-DNA片段，而无目标产物的转基因植物为未插入T-DNA片段；
所述U6-7S的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
本发明提供GhTSTs基因在创制棉花无短绒突变体中的应用。本发明实验证明， 通过CRISPR-Cas9技术敲除GhTSTs基因的8个相关基因片段，经阳性筛选，将阳性 转基因植物进行基因编辑效率分析以及纤维性状的观察，结果表明 pRGEB32-GhTST12敲除突变体成熟种子中编号1、21、28、48、49植株编辑效率低， 其成熟种子短绒与野生型一致；编号7、8、26、34、44、65植株编辑效率高，其成 熟种子短绒较少，有些种子无绒；pRGEB32-GhTST13敲除突变体成熟种子编号6、 14、15、40、50、54、76编辑效率低，其成熟种子短绒与野生型一致；编号11、16、 23、31、39、45、59、71植株编辑效率高，其成熟种子短绒较少，有些种子无绒。这表明以GhTSTs基因为靶点能够有效创制得到棉花无短绒突变体。
本发明提供了一种用于敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物，所述sgRNA包 括sgRNA1和以下sgRNA中的一种；sgRNA2和sgRNA3。所述gRNA1和gRNA2的 组合，可以同时敲除8个GhTSTs基因；gRNA1和gRNA3组合可以同时敲除6个GhTSTs 基因。包含gRNA1和gRNA2的pRGEB32-GhTST12转化棉花中，编号1、21、28、 48、49植株编辑效率低，其成熟种子短绒与野生型一致；编号7、8、26、34、44、 65植株编辑效率高，其成熟种子短绒较少，有些种子无绒突变体成熟种子。包含 gRNA1和gRNA3的pRGEB32-GhTST13转化棉花中，编号6、14、15、40、50、54、 76编辑效率低，其成熟种子短绒与野生型一致。编号11、16、23、31、39、45、59、 71植株编辑效率高，其成熟种子短绒较少，有些种子无绒。由此可见，本发明提供的 sgRNA组合物能有效创制短绒变少或无短绒棉花突变体。
附图说明
图1为本发明提供的pRGEB32-GhTST12突变体质粒载体的图谱；
图2为本发明提供的pRGEB32-GhTST13突变体质粒载体的图谱；
图3为本发明提供的pRGEB32-GhTST12转基因材料PCR阳性检测结果电泳图；
图4为本发明提供的pRGEB32-GhTST13转基因材料PCR阳性检测结果电泳图；
图5为本发明提供的pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13转基因材料编辑 效率分析结果图；
图6为本发明提供的pRGEB32-GhTST12敲除突变体成熟种子的短绒覆盖情况 图；
图7为本发明提供的pRGEB32-GhTST13敲除突变体成熟种子的短绒覆盖情况 图。
具体实施方式
本发明提供了GhTSTs基因在创制棉花无短绒突变体中的应用。
在本发明中，所述GhTSTs基因优选为以下Gh_D13G0564、Gh_A13G0568、 Gh_A04G1428、Gh_D04G1487、Gh_A01G0820、Gh_D01G0848、Gh_D02G1974、 Gh_A03G1506的核苷酸序列
本发明提供了一种用于敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物，所述sgRNA包 括sgRNA1和以下sgRNA中的一种；sgRNA2和sgRNA3；所述sgRNA1的核苷酸序 列如SEQ ID NO：1(ACTACGCGTGCTCCCTGTCT)所示；所述sgRNA2的核苷酸 序列如SEQ ID NO：2(CTTTTGGCAAGACTTTTGGA)所示；所述sgRNA3的核苷 酸序列如SEQ ID NO：3(AGTCTAATGCAATCAACTAC)所示。
本发明提供了一种用于敲除棉花GhTSTs基因的重组载体，所述重组载体包括pRGEB32-GhTST12或pRGEB32-GhTST13；所述pRGEB32-GhTST12为在骨架载体 pRGEB32-7中插入所述sgRNA组合物的sgRNA1和sgRNA2；所述 pRGEB32-GhTST13为在骨架载体pRGEB32-7中插入所述sgRNA组合物的sgRNA1 和sgRNA3。
在本发明中，构建含所述sgRNA组合物的重组载体的方法优选包括构建 pRGEB32-GhTST12重组载体的方法或构建pRGEB32-GhTST13重组载体的方法。所 述构建pRGEB32-GhTST12重组载体的方法，优选包括以下步骤：
A.以pGTR4质粒为模板，分别采用pGREB32-7F/TSTs-1a引物对或 TSTs-1s/TSTs-2a引物对进行PCR扩增，得到两条PCR扩增产物；
B.以两条PCR扩增产物为模板，用infpRGEB32-7F/InfTSTs-2a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含2个gRNA的片段；
C.将所述含2个gRNA的片段与经BSAⅠ切得到的pRGEB32-7线性质粒连接， 得到pRGEB32-GhTST12。
所述构建pRGEB32-GhTST13重组载体的方法，包括以下步骤：
①以pGTR4质粒为模板，分别采用pGREB32-7F/TSTs-1a引物对或 TSTs-1s/TSTs-3a引物对进行PCR扩增，得到两条PCR扩增产物；
②以两条PCR扩增产物为模板，用infpRGEB32-7F/InfTSTs-3a引物对进行重叠 延伸PCR扩增，得到含2个gRNA的片段；
③将所述含2个gRNA的片段与经BSAⅠ切得到的pRGEB32-7线性质粒连接， 得到pRGEB32-GhTST13。
在本发明中，重组载体构建中涉及的引物信息如表1所示。
表1各扩增引物的信息
Figure BDA0002979609480000051
Figure BDA0002979609480000061
在本发明中，pGREB32-7F、TSTs-1a引物对或TSTs-1s/TSTs-2a引物对或infpRGEB32-7F/InfTSTs-2a引物对进行PCR扩增时，反应体系优选如下：模板DNA 1 μL，10×buffer 2μL，dNTP 0.4μL，上下游引物各0.2μL，Taq聚合酶0.2μL，补ddH2O 至20μL；反应条件优选为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min， 28个循环；72℃延伸5min。
在本发明中，所述连接的连接体系优选为CE II Buffer 1μL，PCR产物2.52μL， 线性pGBKT7载体12μL，Exnase(Clontech)0.52μL。连接条件优选为37℃水浴30min， 冰上放置5min。
在本发明中，优选将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，阳性检测，从阳性克隆提取质粒得到重组载体。所述阳性检测优选采用U6-7S/InfTSTs-2a 或U6-7S/InfTSTs-3a进行PCR扩增检测。所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性 5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
本发明提供了一种敲除GhTSTs基因的试剂在创制棉花无短绒突变体中的应用。所述敲除GhTSTs基因的试剂优选为所述sgRNA组合物或所述重组载体。
采用所述sgRNA组合物或所述重组载体创建棉花无短绒突变体的方法，包括以 下步骤：
1)构建含所述sgRNA组合物的重组载体；
2)将所述重组载体用农杆菌介导转入棉花中，得到转基因棉花；
3)将所述转基因棉花进行阳性检测，得到棉花无短绒突变体。
本发明对所述重组载体用农杆菌介导转入棉花中的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。
在本发明中，所述阳性检测的方法优选分别采用U6-7S/InfTMTs-2a引物对和 U6-7S/InfTSTs-3a引物对对转基因植物进行PCR扩增，得到目标扩增产物的转基因植 物为插入T-DNA片段，而无目标产物的转基因植物为未插入T-DNA片段。所述U6-7S 的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：12所示。所述PCR扩增的反应条件优选如下：94℃ 预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
得到阳性转基因植株后，本发明优选对所述转基因植株采用高通量测序的方法来鉴定编辑效率。所述高通量测序的方法优选在靶标位点上下游各100bp范围内设计基 因特异的引物，在引物上加上扩增接头，通过第一轮PCR反应从转基因植株基因组 DNA中扩增靶标区域。以第一轮PCR产物作为模板，通过第二轮PCR扩增，在第一 轮PCR产物两端对每份样本加上不同的条码序列(barcode)以便对不同样本进行区 分，同时在第二轮PCR反应中引入第二代测序接头和索引序列(index)用于测序数据的 提取。
高通量测序过程中涉及Hi-TOM引物进行扩增，所述Hi-TOM引物如表2所示。
表2 Hi-TOM引物信息
引物名称 序列 序列编号 备注
GhT1-tom2-s aaagtatgccccttatggaccct SEQ ID NO：13 含sgRNA1上游100bp内序列
GhT1-tom2-a tcctcatcccattgttcatttct SEQ ID NO：14 含sgRNA1下游100bp内互补序列
GhT12-tom2-s atgttatggtctcctaatgtt SEQ ID NO：15 含sgRNA2上游100bp内序列
GhT12-tom2-a ccaaaaaccatgcaatatga SEQ ID NO：16 含sgRNA2下游100bp内互补序列
GhT13-tom3-s ttgcatagtcctttgatctca SEQ ID NO：17 含sgRNA3上游100bp内序列
GhT13-tom3-a ccaatacccatgctaccaact SEQ ID NO：18 含sgRNA3下游100bp内互补序列
在本发明中，所述基因编辑效率的计算方法优选：平均编辑效率(％)＝所有阳 性植株中发生编辑的reads数÷总reads数的比例×100％。
下面结合实施例对本发明提供的敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物及其在创制棉花无短绒突变体中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护 范围的限定。
实施例1
GhTSTs基因CRISPR载体的构建
(1)CRISPR敲除载体pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13的构建
棉花中共有10个GhTSTs基因，本发明创建两个分别针对多个TST基因敲除的CRISPR/Cas9载体，分别命名为pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13，参考基 因组序列和CRISPR-P网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/搜索靶标，其中 pRGEB32-GhTST12包含gRNA1和gRNA2，可以同时敲除8个GhTSTs基因； pRGEB32-GhTST13包含gRNA1和gRNA3，可以同时敲除6个GhTSTs基因，具体 情况见表3。
表3三种sgRNA靶向基因信息
Figure BDA0002979609480000081
根据3条sgRNA序列设计引物进行两次PCR扩增，引物序列见表1。
表1各扩增引物的信息
Figure BDA0002979609480000082
Figure BDA0002979609480000091
利用引物pGREB32-7F和TSTs-1a进行PCR1扩增，利用引物TSTs-1s和TSTs-2a 进行PCR2扩增，PCR模板均为pGTR4质粒，再以PCR1和PCR2产物为模板利用 infpRGEB32-7F和InfTSTs-2a进行重叠延伸PCR扩增，获得包含2个gRNA的片段。 PCR扩增反应体系：模板DNA1μL，10×buffer 2μL，dNTP 0.4μL，上下游引物各0.2 μL，Taq聚合酶0.2μL，补ddH2O至20μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min； 94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。利用BSAⅠ对 pRGEB32-7空载体37℃酶切6小时，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大 片段挖胶回收，利用Exnase酶将第二次PCR扩增的目的片段和线性化表达载体进行 In-fusion连接，连接体系为CE II Buffer 1μL，PCR产物2.52μL，线性pGBKT7载体 12μL，Exnase(Clontech)0.52μL。连接条件为37℃水浴30min，冰上放置5min，构 建完成的载体被命名为pRGEB32-GhTST12。图1为本发明提供的pRGEB32-GhTST12 质粒载体图谱，该载体骨架为pRGEB32-7用于在细菌中的抗性为卡那霉素，转基因 植株抗性为卡那霉素。
将上述引物TSTs-2a及InfTSTs-2a换成TSTs-3a和InfTSTs-3a，完成 pRGEB32-GhTST13载体的构建。图2为本发明提供的pRGEB32-GhTST13质粒载体 图谱，该载体骨架为pRGEB32-7用于在细菌中的抗性为卡那霉素，转基因植株抗性 为卡那霉素。
(2)载体转化大肠杆菌和农杆菌
用上述载体分别转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，培养12小时后挑取单克隆用 引物U6-7S和InfTSTs-2a或U6-7S和InfTSTs-3a对菌液进行PCR阳性检测，PCR反 应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环； 72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化质粒pRGEB32-GhTST12 和pRGEB32-GhTST13。
将pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13质粒载体分别转化农杆菌菌株 EHA105，分别挑取单克隆菌落接于含100mg/L壮观霉素的LB液体培养基和含100mg/L 卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇24h，分别用引物U6-7S和InfTSTs-2a 或U6-7S和InfTSTs-3a对菌液进行PCR阳性检测，PCR反应条件为：94℃预变性5min； 94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性菌液进行扩 繁后用于棉花的遗传转化。
实施例2
pRGEB32-GhTST12/GhTST13载体在棉花中的遗传转化
(1)农杆菌介导的棉花遗传转化
供试材料为陆地棉品系(YZ1)，选择饱满一致YZ1种子，剥去种皮，用0.1％升汞 溶液杀菌10～12min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，将种子置于MS培养基 表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4～5天。
将实施例2中EHA105菌株接种于2ml含100mg/L壮观霉素的LB液体和含100mg/L 卡那霉素的LB液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液分别接20ul于20ml含100mg/L 壮观霉素的新鲜液体LB和含100mg/L卡那霉素的新鲜液体LB中，于28℃震荡培养过 夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/L 乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基重新悬浮菌体，28℃振荡培养30min，用于侵染下胚 轴。
农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：
在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.7cm小段接入50ml无菌锥形瓶，分别加入活化好的含有目标载体pRGEB32-GhTST12和 pRGEB32-GhTST13的EHA105农杆菌菌液中，侵染10min，期间摇动数次；倒去菌液， 将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10～5min后接入不含抗生 素的2,4-D诱导培养基(具体成分见后面描述)上，在19℃黑暗条件下共培养48-60h； 共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2,4-D 的诱导培养基，在28℃弱光下培养；3周后转入含吲哚丁酸(IBA)诱导培养基连续继 代至出现胚性愈伤组织；将胚性愈伤陆续接入胚分化培养基(具体成分见后面描述) 继代至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(具体成分见后面描述)上萌 发，直至获得完整植株。
本实施例中所用的培养配方：
MGL培养基：胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4﹒7H2O 0.1g/L，KH2PO40.25g/L， 甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸馏水补充至1L。
2,4-D诱导培养基：以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。
IBA诱导培养基：以MS为基础培养基，添加IBA 0.5mg/L，KT 0.1mg/L，葡萄糖 30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH值至5.9。
胚分化培养基：以MS为基础培养基，添加1.9g/LKNO3，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH值至5.9。
生根培养基：以1/2MS为基础培养基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH值为5.9。
上述培养基配方中所述的基础MS培养基配方为:大量元素(KNO31.9g/L，NH4NO31.65g/L，KH2PO40.17g/L，MgSO4﹒7H2O 0.37g/L，CaCl2﹒2H2O 0.44g/L)，微量元 素(KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/LMnSO4﹒4H2O 22.3mg/L，ZnSO4﹒7H2O 8.6mg/L， Na2MoO4﹒2H2O0.25mg/L，CuSO4﹒5H2O 0.025mg/L，CoCl20.025mg/L)，铁盐(Na2﹒EDTA37.3mg/L，FeSO4﹒7H2O27.8mg/L)，有机成分(肌醇100mg/L，Gly 2mg/L， VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L)。
实施例3
pRGEB32-GhTST12/GhTST13转基因植株的分子鉴定
(1)转基因植株阳性检测
提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技 有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)， 以U6-7S和InfTMTs-2a或U6-7S和InfTSTs-3a进行PCR分别检测是否有相应T-DNA 插入。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28 个循环；72℃延伸5min。
图3为本发明提供的pRGEB32-GhTST12转基因材料PCR阳性检测结果电泳图；泳 道M表示Marker，WT表示野生型受体材料，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野 生型没有条带。突变体材料阳检PCR扩增引物为U6-7F和InfTSTs-2a。由图3可知，本 发明得到了多株含T-DNA序列的转基因棉花材料。
图4为本发明提供的pRGEB32-GhTST13转基因材料PCR阳性检测结果胶图；泳道 M表示Marker，WT表示野生型受体材料，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生 型没有条带。突变体材料阳检PCR扩增引物为U6-7F和InfTSTs-3a。由图4可知，本发 明得到了多株含T-DNA序列的转基因棉花材料。
(2)转基因植株的编辑效率检测
CRISPR-Cas9介导的转基因编辑植株采用高通量测序的方法来鉴定编辑效率。在靶标位点上下游各100bp范围内设计基因特异的引物，在引物上加上扩增接头，通过 第一轮PCR反应从转基因植株基因组DNA中扩增靶标区域。以第一轮PCR产物作 为模板，通过第二轮PCR扩增，在第一轮PCR产物两端对每份样本加上不同的条码 序列(barcode)以便对不同样本进行区分，同时在第二轮PCR反应中引入第二代测 序接头和索引序列(index)用于测序数据的提取。
所述Hi-TOM引物如表2所示。
表2 Hi-TOM引物信息
Figure BDA0002979609480000121
Figure BDA0002979609480000131
第二轮PCR完成后将不同的样品进行混合，用DNA纯化试剂盒对PCR产物进 行纯化，每100份单株的混合样品通过第二代测序平台测1G数据量，通过Hi-TOM 分析网站(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)对数据进行分析。将测定的序列与参考基因 组的序列进行比较，对最终的编辑效率进行评估。基因编辑效率的计算方法按照公式 I进行。
平均编辑效率(％)＝所有阳性植株中发生编辑的reads数÷总reads数×100％公式I
图5为本发明提供的pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13转基因材料编辑效 率分析，其中a为转基因材料靶标1、2和3Hi-Tom测序的二轮PCR；b为 pRGEB32-GhTST12转基因植株编辑效率检测结果，其中sgRNA1和sgRNA2中WT比例 标注H的为编辑效率低(≥80％)的植株，0表示靶标编辑100％的植株，数值表示百 分数。后续表型的分析选取野生型、编辑效率低(编号1、21、28、48、49)和编辑 效率高(编号7、8、26、34、44、65)的植株进行表型分析；c为pRGEB32-GhTST13 转基因植株编辑效率检测结果，其中靶标1和靶标3中WT比例标注H(>80％)的为编 辑效率低的植株，0表示靶标编辑100％的植株，数值表示百分数。后续表型的分析选 取野生型、编辑效率低(编号6、14、15、40、50、54、76)和编辑效率高(11、16、 23、31、39、45、59、71)的植株进行表型分析。
两种打靶方案的总体统计如表4所示。由图5可知，pRGEB32-GhTST12和 pRGEB32-GhTST13均能实现基因编辑，且阳性转基因植株的基因编辑效率较为理想， 能够得到大量转基因编辑植物。比较两种打靶方案，pRGEB32-GhTST13的基因编辑 效率高于pRGEB32-GhTST12的基因编辑效率，说明sgRNA1和sgRNA3组合的基因编 辑效率优于sgRNA1和sgRNA2组合。
表4 pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13转基因材料编辑效率统计
Figure BDA0002979609480000132
Figure BDA0002979609480000141
实施例4
pRGEB32-GhTST12和pRGEB32-GhTST13转基因植株种子纤维观察
将实施例3制备的转基因植株和野生型材料(WT)种植于试验田，待植株吐絮后，及时收获并采摘种子，轧花后将拍照观察，结果见图7和图6。与野生型比较，敲除多个GhTSTs基因可以产生无短绒突变体。
图6为本发明提供的pRGEB32-GhTST12敲除突变体成熟种子的短绒覆盖情况，其中WT表示野生型受体，编号1、21、28、48、49植株编辑效率低，其成熟种子短绒与 野生型一致。编号7、8、26、34、44、65植株编辑效率高，其成熟种子短绒较少，有 些种子无绒。
图7为本发明提供的pRGEB32-GhTST13敲除突变体成熟种子的短绒覆盖情况，其中wt表示野生型受体，编号6、14、15、40、50、54、76编辑效率低，其成熟种子短 绒与野生型一致。编号11、16、23、31、39、45、59、71植株编辑效率高，其成熟种 子短绒较少，有些种子无绒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润 饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物及其在创制棉花无短绒突变体中的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actacgcgtg ctccctgtct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttttggcaa gacttttgga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtctaatgc aatcaactac 20
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agacagggag cacgcgtagt tgcaccagcc gggaat 36
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actacgcgtg ctccctgtct gttttagagc tagaaata 38
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccaaaagtc ttgccaaaag tgcaccagcc gggaat 36
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagcatcaga tgggcaaaca aa 22
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctagctct aaaactccaa aagtcttgcc aaaag 35
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtagttgatt gcattagact tgcaccagcc gggaat 36
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttctagctct aaaacgtagt tgattgcatt agact 35
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagcatcaga tgggcaaaca aagcaccagt ggtctag 37
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtgccactc caaagacatc ag 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagtatgcc ccttatggac cct 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcctcatccc attgttcatt tct 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgttatggt ctcctaatgt t 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaaaaacca tgcaatatga 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgcatagtc ctttgatctc a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccaataccca tgctaccaac t 21

Claims (5)

1.GhTSTs基因在创制棉花无短绒突变体中的应用，所述GhTSTs基因为以下序列中的一种：Gh_D13G0564、Gh_A13G0568、Gh_A04G1428、Gh_D04G1487、Gh_A01G0820、Gh_D01G0848的DNA序列；
所述GhTSTs基因还包括以下序列中的一种：Gh_D02G1974和Gh_A03G1506；
所述创制棉花无短绒突变体的方法，采用敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物完成；
所述敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物，包括sgRNA1和以下sgRNA中的一种：sgRNA2和sgRNA3；
所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种敲除GhTSTs基因的试剂在创制棉花无短绒突变体中的应用，所述敲除GhTSTs基因的试剂为sgRNA组合物或重组载体；
所述sgRNA组合物，包括sgRNA1和以下sgRNA中的一种：sgRNA2和sgRNA3；
所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述重组载体包括pRGEB32-GhTST12或pRGEB32-GhTST13；
所述pRGEB32-GhTST12为在骨架载体pRGEB32-7中插入所述sgRNA组合物的sgRNA1和sgRNA2；
所述pRGEB32-GhTST13为在骨架载体pRGEB32-7中插入所述sgRNA组合物的sgRNA1和sgRNA3；
所述GhTSTs基因为以下序列中的一种：Gh_D13G0564、Gh_A13G0568、Gh_A04G1428、Gh_D04G1487、Gh_A01G0820、Gh_D01G0848的DNA序列；
所述GhTSTs基因还包括以下序列中的一种：Gh_D02G1974和Gh_A03G1506；
所述创制棉花无短绒突变体的方法，采用敲除棉花GhTSTs基因的sgRNA组合物完成。
3.一种创建棉花无短绒突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建含sgRNA组合物的重组载体；
2)将所述重组载体用农杆菌介导转入棉花中，得到转基因棉花；
3)将所述转基因棉花进行阳性检测，得到棉花无短绒突变体；
所述sgRNA组合物包括sgRNA1和以下sgRNA中的一种：sgRNA2和sgRNA3；
所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，构建含所述sgRNA组合物的重组载体的方法包括构建pRGEB32-GhTST12重组载体的方法或构建pRGEB32-GhTST13重组载体的方法；
所述构建pRGEB32-GhTST12重组载体的方法，包括以下步骤：
A.以pGTR4质粒为模板，分别采用pGREB32-7F/TSTs-1a引物对或TSTs-1s/TSTs-2a引物
对进行PCR扩增，得到两条PCR扩增产物；
B.以两条PCR扩增产物为模板，用infpRGEB32-7F/InfTSTs-2a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含2个gRNA的片段；
C.将所述含2个gRNA的片段与经BSAⅠ切得到的pRGEB32-7线性质粒连接，得到pRGEB32-GhTST12；
所述构建pRGEB32-GhTST13重组载体的方法，包括以下步骤：
①以pGTR4质粒为模板，分别采用pGREB32-7F/TSTs-1a引物对或TSTs-1s/TSTs-3a引物对进行PCR扩增，得到两条PCR扩增产物；
②以两条PCR扩增产物为模板，用infpRGEB32-7F/InfTSTs-3a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含2个gRNA的片段；
③将所述含2个gRNA的片段与经BSAⅠ切得到的pRGEB32-7线性质粒连接，得到pRGEB32-GhTST12。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述TSTs-1a的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述TSTs-1s的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述TSTs-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述infpRGEB32-7F的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述InfTSTs-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述TSTs-3a的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述InfTSTs-3a的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
所述pGREB32-7F的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
所述阳性检测的方法分别采用U6-7S/InfTMTs-2a引物对和U6-7S/InfTSTs-3a引物对对转基因植物进行PCR扩增，得到目标扩增产物的转基因植物为插入T-DNA片段，而无目标产物的转基因植物为未插入T-DNA片段；
所述U6-7S的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
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